KR20060031621A - 유동력 차별화 방법 - Google Patents

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잭 씨. 리페
로이드 제이. 위트만
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더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 네이비
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Abstract

본 발명은 타겟 분자가 친화력 코팅에 의해 기질 표면 상으로 특이적 분자 인식에 의해 포획되고, 이어서 타겟과의 제2의 특이적 분자 인식 반응을 사용하여 검출 가능한 마이크로미터-규모 입자에 의해 라벨링되는 생화학적 결합 분석의 성능을 개선시키기 위해 제어되는 유동력을 사용하는 방법을 개시한다. 특정 범위의 라벨 크기들 및 층류 조건들을 사용함으로써, 제어된 유동력은 이들의 결합 강도에 따라 표면에 결합된 분자들을 선택적으로 제거하기 위해 라벨 입자들에 인가될 수 있고, 그에 따라 보다 약하게 부착된 비특이적으로 결합된 라벨들에 대한 특이적으로 결합된 라벨들의 비율을 증가시킨다. 이 방법은 광범위한 라벨 유형들 및 연관된 검출 방법들에 의해 사용될 수 있고, 광범위한 범위의 결합 분석의 민감도 및 선택성을 개선시킬 수 있다.

Description

유동력 차별화 방법 {FLUIDIC FORCE DISCRIMINATION}
본 발명은 바운드 분자들에 마이크로미터-규모의 입자들을 부착시키고, 조절되는 층 유동력을 입자들에 인가함으로써 이들의 결합 강도에 따라 표면에 결합된 분자들을 선택적으로 제거하는 방법에 관한 것이다. 그러한 "유동력 차별화"(FFD)는 법의학, 농학, 의료 진단학, 식품 및 물 안전성 및 안티-테러리즘을 포함하는 많은 분야에서 생화학적 결합 분석들의 민감도 및 선택성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
면역 분석, DNA 혼성화 분석 및 수용체-기재 분석 등의 결합 분석은 착물 시료에 함유된 흔적량의 특이적 타겟 분자들을 검출하는데 널리 사용된다. 전형적으로, 고형 기질은 타겟에 대한 특이적 결합 친화력을 갖는 수용체 분자들로 코팅된다. 타겟을 함유하는 액체 시료가 기질에 도포될 때, 타겟 생체 분자들은 분자 인식에 의해 표면 상으로 포획된다. 이러한 포획은 항체-항원 등의 임의의 특이적 리간드-수용체 조합 또는 다핵산들(DNA, RNA 또는 PNA)의 상보적 서열들 등의 기타 특이적 결합 조합을 통해 수행될 수 있다.
포획된 타겟 분자들을 검출하는 통상의 시도는 관찰 가능한 신호를 발생시키는 라벨을 이들에 화학적으로 부착시키는 것이다. 예를 들면, 라벨은 방사선 활성 동위 원소, 효소, 형광 분자(들) 또는 자성 입자를 포함할 수 있다. 그 부착은 임의의 화학적 수단을 통해 이루어질 수 있지만, 보편적으로 공유 결합 또는 아민화된 정전기적 결합 등의 매우 강한 부착 화학에 의해서 또는 포획된 타겟 분자의 제2의 예상 부분에 대한 고친화도 분자 인식을 통해 이루어진다. 라벨은 시료 내의 타겟의 농축 척도로서 적절 수단에 의해 검출된다. 검출 방법은 광학, 전기, 자기, 방사선 활성, 전기 화학, 열적, 및 압전을 포함하는 형질 도입 메카니즘 범위에 기초하여 개발되고 있다. 일 실시예는 도 1에 예시되어 있으며, 그 경우 상이한 타겟들에 특이적인 다수의 포획 분자들은 라벨 입자들에 대한 내장형 센서들을 갖는 기질 상에 별개로 고정된다. 마이크로미터-규모 라벨들에 대해 이러한 예시는 정확한 척도가 아니고; 타겟 및 수용체 분자들은 전형적으로 라벨보다 10 내지 1000배 더 작음에 주의해야 한다.
라벨들을 사용하는 결합 분석들에 대한 많은 변종들이 있지만, 통상의 목표는 가능한 한 많은 민감도 및 선택성으로 타겟의 농도를 측정하는 것이다. 검출 가능한 신호를 발생시키기 위해 충분한 수의 라벨들이 존재하는 한, 결합 분석의 민감도 및 선택성은 표면에는 결합되지만, 포획된 타겟(때때로 "배경" 신호라 언급됨)에는 결합되지 않는 라벨들에 의해 제한될 수 있다. 그러한 라벨들은 시료 내에 역시 존재하는 분자들에 결합될 수 있고, 비교적 약하고, 비특이적 결합을 통해 표면에 결합된다. 대안으로, 라벨들은 부양 중량 및(또는) 비특이적 결합들에 의해 표면에 직접적으로 결합될 수 있다. 표면에 비특이적으로 결합된 라벨들을 선택적으로 제거하는 능력은 의도된 타겟이 갖는 신뢰도와 연관될 수 있는 라벨들의 최소수를 저하시키고, 포획된 타겟과 검출된 라벨들이 각각 잘못 연관될 가능성을 감소시킴으로써 결합 분석의 민감도 및 선택성을 크게 개선시킬 수 있다.
약하고 비특이적 결합들을 파괴하기에 충분한 힘을 라벨들에 가함으로써 결합 분석에서 표면에 대해 비특이적으로 결합된 라벨들을 선택적으로 제거할 수 있지만, 그 힘은 너무 작아서 특이적 분자 인식의 보다 강한 결합들에 의해 결합된 라벨들을 제거할 수는 없다. 비특이적 결합을 억제하기 위해 특별히 제조된 표면에 대해, 약 1pN의 힘이 이러한 목적으로 필요하다. 증가하는 강도의 특이적 결합들을 선택적으로 파괴할 목적으로 라벨 입자들에 대해 힘을 적용할 수 있고, 그에 따라 파열력을 측정하거나 또는 그 파열력에 기초하여 결합된 타겟을 식별한다. 10 pN을 초과하고 1nN 만큼의 힘이 이러한 목적으로 요구된다. 미합중국 특허 제5,981,397호 및 동 제6,180,418호는 비특이적으로 결합된 라벨들(BARC)을 선택적으로 제거하기 위해 자기 활성 비드들 및 자기력을 사용하는 것을 개시한다. 미합중국 특허 제6,086,821호 및 동 제6,368,553호는 분자 실체들 사이의 결합력을 측정하고, 시험 시료에서 분석물의 존재를 감지하기 위해 가변적인 힘을 제공하는 초음파 에너지의 사용을 기재한다.
많은 결합 분석들에서, 배경 신호를 감소시킬 목적으로 일부 유형의 헹굼 단계를 사용하는 것이 통상이다. 통상의 헹굼 방법들은 기계적 진탕의 존부 하에 흠뻑 적시고, 비-정상 흐름으로 분무하는 것을 포함한다. 이들 불량하게 조절된 상태들 하에, 보다 적은 입자들은 벽에서 미끄러짐-방지 조건들 때문에 매우 어렵게 제거된다. 충분히 큰 유동성 경계 치수들 및 흐름 속도들에 대해, 유체 관성은 입 자 제거를 증진시킬 수 있는 난류를 유도한다. 그러나, 충분히 작은 유체 경계 치수 및 속도에서, 유동은 속도 단독에 이해 결정되어, 표면으로부터 입자들을 용이하게 제거하지 못하는 정상 상태의 층류를 유도한다. 2개의 레지메들은 레이놀드 수를 특징으로 하고, Rs = ρdv/η, 여기서 ρ는 유체 밀도이고, d는 채널의 특징적 치수(부피/표면적)이고, v는 유속이고, η는 점성이다. 1mm 미만의 폭 및 1mm/s 미만의 속도를 갖는 입자들 또는 사슬들에 대해, R은 1 미만이고, 그 흐름은 분명히 층류이다. 층류와 난류의 시작점 사이의 분리선은 Rs-2000에 있다. 층류 조건들은 통상적으로 혈관들 및 많은 생체 센서 시스템들에 사용되는 마이크로유체 시스템들에서 발생한다.
벽에서 입자들에 대한 점성의 유체 역학적 힘들은 셀 접착을 이해할 목적으로 연구되고 있다. 예를 들면, 백혈구들의 이동은 혈관 벽을 따라 느리고 찰진 롤링 분리로서 (분자 제어를 통해) 발생한다. Chang 및 Hammer의 Langmutr, 1996, 12, 2271-2282는 결합 표면에 수직으로 접하는 유체 흐름에서 벽에 대한 분자 결합 입자들에 대한 레버 증식 모델 및 시뮬레이트된 힘들을 개발하였다. Zocchi는 수직 접경 흐름에서 4.5㎛-직경 입자들에 대한 수직력 성분들을 관찰하였다(Biophysical J., 2001, 81, 2946-2953). 그는 유동력의 레버 증식을 측정하고, 비오틴-스트렙타비딘 결합의 파열을 관찰하고, 그 결과를 셀 접착 분석의 해석에 적용하였다.
본 발명은 유동성 흐름을 드래그하는 힘을 사용하여 결합 분석에서 비특이적으로 결합된 마이크로미터-규모 입자 라벨들을 조건에 따라 제거하는 단순한 다목적 방법을 개시하며, 이를 유동력 차별화(FFD)라 칭할 것이다. FFD는 특정 범위의 라벨 크기 및 흐름 조건들을 사용함으로써 유일하게 달성될 수 있다. FFD는 광범위한 라벨 유형들 및 연관된 검출 방법들에 의해 사용될 수 있고, 광범위한 범위의 고형-페이스 결합 분석의 민감도 및 선택성을 개선시킨다. FFD는 또한 다수의 입자-라벨된 타겟들과 기질-결합 수용체들 사이의 결합을 파열시키는데 필요한 힘에 기초하여 상이한 타겟들을 식별하거나 또는 분리하기 위해 조절된 가변적인 힘을 인가하기 위해 사용될 수도 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 라벨 입자들에 대한 내장형 센서들을 갖는 기질 상에 개별적으로 고정된 상이한 타겟들에 대해 특이적인 포획 분자들을 나타내는 도면.
도 2는 분자 사슬 내의 레버 작용 및 그 결과의 인장 T를 나타내는 도면.
도 3은 본 발명의 분석에 사용된 비드들에 대한 배경 비율에 대한 신호 및 나머지 비드들에 영향을 미치는 비특이적으로 결합된 비드들에 대한 FFD의 작용을 나타내는 도면.
도 4는 본 발명의 실험 치수로 기재된 분석을 나타내는 도면(이 도면이 정확한 척도는 아님에 주의하자).
생체 분자 인식은 과학 문헌에서 널리 고찰되고 있다. 리간드 및 수용체라 는 용어들은 종종 항원-항체 등의 단백질 인식에 사용되지만, 여기 개시된 본 발명에서, 우리는 효소들 및 기질들, 킬레이터들 및 이온들, 및 다핵산 DNA, RAN 및 PNA의 상보적 스트랜드들의 특이적 분자 인식을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 광의의 정의를 취할 것이다.
본 발명은 비드들을 결합시키는 결합들을 선택적으로 파괴시키기 위해 표면에 결합된 입자들 또는 헤드들에 대한 수직 접경 층상 유동력을 사용한다. 특히, FFD는 보다 약하게 부착되고, 비특이적으로 결합된 비드들의 배경을 제거할 수 있다. 층류 하에, 입자에 대한 유속 및 연관된 점성의 유동력은 표면에서 크게 감소된다. 예를 들면 튜브 내의 층류에 대한 Navier-Stokes 식을 해결함으로써, 유체 채널을 가로질러 축상 유속의 포물선 변화를 유도한다. 그러나, 벽 근처에서, 속도는 0에서 벽으로부터 벗어난 거리 z로 선형으로 증가한다. 보다 큰 치수 용어들을 강하시킴으로써, 그 속도는 z<<R에 대해 v = 4 uz/R로 주어지고, 여기서 u는 채널의 평균 속도이고, z는 벽으로부터의 거리이고, R은 튜브 반경이다. 벌크 유체 흐름에서 정체 입자에 대한 힘은 Stokes 드래그 F1 = 6πηavc 로 주어지고, 여기서 a는 입자 반경이고, vc는 입자 중심에서 유속이다. 마찬가지로, 균일한 전단력을 갖는 벌키한 유체에서 토크는 Γk = 4πηa2vc 이다. 반-무한 유체에서 벽에서 정체 입자에 대한 정확한 층류 해법들은 Fs = 1.7005*6πηavc 및 Γk*0.94399*4πηa2vc를 제공한다. Goldman 등의 Chem. Engr. Sci. 1967, 22, 653-660 참조.
융통적인 분자 "사슬"에 의한 표면에 대한 입자 결합에 대해, 이러한 스톡스 힘의 레버 증식 및 입자에 대해 작용하는 해리된 토크가 존재할 수 있다. 분자 사슬에서 레버 작용 및 결과의 인장 T는 도 2에 예시된다. 여기서 사슬은 굽혀지거나 또는 선회하고, 이어서 입자는 사슬/벽 부착 지점 위의 h의 최고 차이에서 하류로 활주 접촉을 가능케 한다. 최고 h는 벽 및 비드의 표면 거칠기에 따라 변화한다. 마이크로미터 범위의 반경 a의 비드 및 훨씬 더 작은 길이 l~10nm의 생체 분자 사슬에 대해, 사슬 부착과 비드 접촉 사이의 각 θ는 작고, 사슬의 각도 φ는 90도에 근접한다. 이러한 경우에, 탄젠트 힘 밸런스는 F = Tcosφ이고, 수직력 밸런스 N = Tsinφ이고, 여기서 N은 표면이 비드에 대해 발휘하는 힘이다. 입자 중심에 관한 토크 밸런스는 Γ=-aTcos(φ+θ)이다. 기하학적 조건 (L-h)sinφ= aθ2/2, 작은 θ 및 90도에 가까운 φ에 의해, 분자 사슬에 대한 인장은 다음 식이다.
Figure 112005072312105-PCT00001
1.4㎛ 반경 비드 및 10nm 사슬에 대해, 인장은 약 10배의 순수한 탄젠트 유동력의 레버 증식을 생성한다. 전체적으로, 선속 구배, 스톡스 선형 입자 크기 의존성, 및 레버 작용이 주어짐으로써, 그 인장은 a2.5에 비례한다. 비드 중심에서 속도가 100㎛/s인 벽에서 완만한 1.4㎛ 반경 비드에 대해, 정확한 스톡스 힘은 4.5pN이고, 전체적으로 증폭된 인장(10nm 사슬로부터 토크를 포함함)은 51pN이다. 이러한 힘은 동일한 크기의 상용 영구 자석 입자에 대해 큰 자기장 NdFeB 자석에 의해 발휘되는 수직력 ~0.3 pN보다 100배 이상 크다. Edelstein 등 Biosensors and Bioelectronics, 2000, I4, 805-813. 다수의 각 사슬 파열력이 1개 이상의 사슬과 결합된 비드들을 제거하기 위해 필요하지만, 비드 및(또는) 기질에 대한 결합 부위들의 밀도는 다수의 비드-표면 결합들의 확률을 크게 감소시키기 위해 조절될 수 있음에 주의하자.
생체 분자 결합 및 일반적인 화학적 결합들에 대한 힘의 적용은 해리에 대한 에너지 장벽을 감소시킨다. 따라서, 화학적 결합들의 열적으로 활성화된 해리 속도는 Bell에 의해 Science 1978, 200, 618-627에서 최초로 고찰된 바와 같이, 결합에너지에 의해 기하급수적으로 감소하지만, 외부 힘의 적용에 의해 기하급수적으로 증가한다. 해리 상수 k는 아래와 같이 주어진다.
Figure 112005072312105-PCT00002
여기서, vc는 시도 횟수이고, Eb는 결합 에너지이고, F는 결합에 대한 힘 또는 인장 T이고, x는 해리 장벽의 상단에서 전이-상태에 대한 결합 길이 지수("배리어 길이"라 칭하고 전형적으로 0.1 내지 1.5nm임), kT는 열 에너지(25℃에서 4.1pNㆍnm)이다. 따라서, 해리 속도는 ~100 pN의 힘을 적용함에 따라 ~100배 증가될 수 있다(x-0.2 nm로 추정). 그러한 효과들은 원자력 현미경에 의해 기계적으로 인가된 힘들을 사용하여 실험적으로 관찰되고 있다. Lee 등의 Langmuir, 1994, 10, 354-357; Merkel 등, Nature, 1999, 397, 50-53; Evans, Annu, Rev. Biophyis. Biomol. Struct. 2001, 30, 105-128 참조.
입자들의 층상의 유동력 제거는 종래의 헹굼 방법들보다 훨씬 더 균일하고 조절된 유동력을 가능케 한다. 현저하게는, 그 힘들은 특이적 입자 크기 및 유동 조건들(유동률 및 채널 기하학)의 선택에 의해 조절될 수 있다. 입자-라벨된 결합 분석들에 대해, 비특이적으로 결합된 입자들을 선택적으로 제거하기 위해 FFD를 사용하고, 그에 따라 보다 적은 수의 특이적으로 결합된 라벨들이 신뢰할 수 있게 검출되게 함으로써 다른 차별화 방법들에 비해 많은 장점을 갖는다. 특히, 가장 민감한 분석 시도들의 다수는 유동 시스템을 포함하기 때문에, FFD는 유체들의 적절한 디자인에 의해 용이하게 구현될 수 있고, 따라서, 외부 헹굼에 대한 요건들을 제거하고, 분석 시간을 감소시키고, 분석 프로토콜을 단순화시킨다. FFD의 현저한 장점은 그것이 형광, 발광, 빛-산란, 자성 또는 방사선 활성을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 적절한 크기 및 기능성의 임의의 유형의 입자 라벨에 의해 사용될 수 있다는 것이다.
자기력 차별화 방법들과 비교한 바, FFD는 영구 자석 비드들 또는 외부 자기장 소스를 필요로 하지 않는다. 또한, 현재 입수할 수 있는 상용 영구 자석 입자들은 특이적 리간드-수용체 결합들 사이의 힘 차별화에 불충분한 -1pN 범위에서 힘들을 유일하게 발생시킬 수 있다. 초음파 힘 차별화와 비교한 바, FFD는 초음파 에너지를 발생시키는 별개의 장치를 필요로 하지 않고, 벽에 따른 위치의 함수로서 로컬 초음파 힘의 크기의 변화를 유발하는 내부 유동 셀 음향 반사들과 연관된 잠재적인 문제점들을 피하게 된다.
실험 입증 - 마이크로비드 라벨들에 의한 DNA 혼성화 분석
FFD의 초기 관찰은 Dynal M280 마이크로비드 라벨들을 사용하여 이루어졌다 (노르웨이 오슬로, Dynal). 기질은 실리콘 웨이퍼 상에 제조된 마이크로센서 칩이고, 40nm-두께 금 필름으로 커버되었다. 골드 코팅은 티올(S-Au) 결합들을 사용하는 생체 분자들의 공유 부착에 필요하다. 금으로 코팅된 후, 칩들은 건조한 질소 챔버 내에 저장되었다. 칩 표면들은 에탄올 및 증류수로 헹굼으로써 사용전에 코팅되었다.
250㎛ 직경의 단일-스트랜드된 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오티드 수용체들 (400mM 인산 칼륨 중에서 10μM, pH 7.0)의 스폿들은 Rapidograph® 펜 팁들을 사용하여 표면 상으로 침착되었다. Sheehan 등의 Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18,000 참조. 2개의 알칸티올-종료된 ssDNA 포획 수용체들이 실험을 위해 사용되었다. ssDNA 타겟에 상보적인 25-염기-길이 ssDNA 서열인 양성 포획 수용체는 6개의 추가의 아데닌 뉴클레오티드들 및 티올에 의한 3개의 알칸 스페이서들에 의해 3' 말단 상에서 종료되었다. 음성 포획 수용체는 3' 말단에서 3 알칸 스페이서들 및 티올에 의해 타겟에 상보적이지 않은 24-염기 길이 ssDNA 였다. 스포팅 후, 칩은 37℃에서 습한 챔버 내에서 8시간 동안 정치되어 ssDNA가 Au 표면 상으로 고정되게 하였다 (습한 챔버 내에서의 체류 시간이 임계적인지 여부는 분명치 않다).
투명한 탄성체인 PDMS(폴리디메틸실록산)로 제조된 유동 셀은 양면 접착제 테잎에 의해 칩 표면에 부착됨으로써 유체는 칩 표면과 직접적으로 접촉하는 셀을 통해 흐를 수 있다. 유동 셀은 흐름에 대해 100㎛ 높이 x 수직으로 2.89mm 폭의 단면적 및 흐름 방향으로 4.4mm 길이를 갖는다. 칩 및 유동 셀은 유동 셀 내에서 및 표면 상에서 개별적인 비드들의 존재 및 흐름을 직접적으로 관찰하기에 충분한 크기로 직립 현미경 상에 설치되었다. 현미경은 디지털 이미지 기록을 위해 컴퓨터에 접속되는 비디오 카메라를 장착하였다. 시약들은 연동하는 롤러 펌프에 의해 제어되는 속도로 유동 셀을 통해 펌핑되었다.
티올화된 PEG (5000 MW 폴리에틸렌 글리콜, 앨리바마주 헌츠빌 쉬어워터)는 탈이온수(DI) mL당 10mg의 농도로 유동 셀 중에서 표면 상으로 도입되고 1시간 동안 정치되었다. PEG는 DNA의 포획 수용체 스폿들 사이에 비-부착 영역을 형성하였다. PEG의 적용은 분석에 불필요하지만, 의도된 포획 스폿들 외부의 타겟 ssDNA 및 비드 라벨들의 비특이적 결합을 감소시키고, 그에 따라 포획 스폿들 내에서 결합하기 유효한 타겟 ssDNA 및 비드 라벨들의 수를 증가시킨다.
0.25% 도데실 황산 나트륨(SDS)에 의한 2x SSC 완충액(0.3M NaCl, 30mM 시트르산 황산, pH 7.0)이 도입되고 30분간 정치되었다. 여기서 및 후속 단계들에서 사용된 염 및 세정 완충액들은 혼성화 효율을 증진시키고, 소수성 응집을 감소시켰다.
양성 포획 수용체 ssDNA에 상보적인 타겟 ssDNA (0.25% SDS에 의한 2x SSC에서 100pM)는 혼성화를 허용하기 위해 15분 동안 2μL/분의 속도로 표면 상으로 유동되었다. 타겟 ssDNA 분자들은 비오티닐화됨으로써 혼성화를 통해 포획되기 시작한 후 스트렙타비딘-코팅된 바이크로비드들(하나의 마이크로비드/DNA)에 의해 직접 적으로 라벨링될 수 있다. ssDNA 타겟은 6개의 아데닌 뉴클레오티드들 및 비오틴 분자들에 의해 3' 말단 상에서 종결되는 포획 수용체에 상보적인 25-염기-길이 서열로 구성되어 있다. 혼성화된 타겟-포획 DNA 분자는 비오틴에 대한 Au-S 결합으로부터 약 12 nm 길이였다.
2.8㎛ 직경의 스트렙타비딘 코팅된 Dynal M280 마이크로비드 라벨들은 0.125% SDS에 의한 1x SSC 중에서 7x106 비드들/cm3 이하의 농도를 갖는 분획으로부터 도입되었다. 10μL/분의 유동률에서 유동의 10초에 이어 비드들이 정착되도록 0 유동률에서 50초의 시작/종료 주기들은 주기당 약 200 비드/200㎛ 직경의 원형 스폿들로 침착되었다. 15회의 1분 주기 후, 약 1200개의 비드들이 200㎛ 직경 포획 스폿 내에 있었다.
이어서, FFD는 도 3에서 플롯된 바와 같이 보다 약하게 부착되고, 비특이적으로 결합된 비드들을 선택적으로 제거하기 위해 사용되었다. 0.125% SDS에 의한 1x SSC 완충액이 다음 유동률: 즉, 10, 40, 60 및 110 μL/분 각각으로 3분 동안 셀을 통해 유동되었다. 각각 3분의 기간 후, 유동은 정지되었고, 비드들의 수는 양성 및 음성 포획 수용체들을 함유하는 200㎛ 직경 스폿들 및 포획 스폿들 사이의 PEG 코팅된 금 상의 등가의 영역 내에서 카운트되었다. 사용된 유동 셀 단면적에 대해 10nm 사슬들 및 평활한 표면들을 가정하면, 이들 유동률들은 48, 193, 290 및 532 ㎛/s의 각각의 마이크로비드의 중심에서 각각의 유체 속도; 34, 138, 207, 380s-1의 전단력; 2.1, 8.6, 13 및 24pN의 산출된 스톡스 힘 Fs; 약 25, 99, 149 및 273 pN의 사슬 인장(토크 포함)을 발생시킨다. 도 3에 나타낸 바와 같이, PEG-코팅된 표면 주변 상에 또는 음성 스폿에 대해 비특이적으로 결합된 수에 비교한 바 양성 포획 스폿에 대해 특이적으로 결합된 비드들의 상대적인 수는 유동률이 60㎛/분으로 증가함에 따라 증가한다. 그 증가는 음성 스폿 및 PEG-코팅된 영역에 대해 결합된 비드들의 수의 상대적으로 큰 감소, 즉 비특이적 교차부들에 의해 결합된 것들에 의해 유발된다. 양성 스폿에서 비드들의 수의 감소는 많은 효과들에 기여할 수 있다. 먼저, 타겟 ssDNA를 포획하지 않은 ssDNA 수용체들에 비특이적으로 결합한 일부 비드들(그의 제거가 바람직한 비드들)이 존재할 수 있고, 이는 보다 느린 유동률/힘에서 나올 것으로 기대된다. 유동률 및 힘이 증가함에 따라, 일부 비오틴-스트렙타비딘 결합들 역시 파열될 수 있다. 기계적 AFM 힘들 하에, 이들 결합들은 약 200pN에서 파열한다. DNA에서 훨씬 더 강한 Watson-Crick 염기-쌍들의 전단 파열은 이들 조건들하에서는 쉽지 않다(대응하는 AFM 파열력은 >1nN이다.).
충분히 큰 유동률 또는 비드 직경 또는 충분히 짧은 분자 사슬이 주어짐으로써, FFD는 원칙적으로 임의의 화학적 결합을 파괴하기에 충분한 힘을 발생시킬 수 있다. 가장 실질적인 용도들에서, FFD는 결합 강도의 차이가 힘-시간 배리어 길이의 변화보다 더 큰 한은 다수의 상이한 결합 강도에 의해 표면에 대한 분자 결합의 필요한 파열력 개체군들에 따라 식별하거나 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 힘의 변화는 근처의 상류 비드에 의해 하나의 비드를 가로질러 유동의 거칠기 또는 쉐도우잉에 의해 유발되는 것들을 포함할 수 있다. 많은 생물학적인 거대 분자들 등의 다수의 잠재적인 에너지 월들을 포함하는 해리 에너지를 갖는 분자들에 대해, 펄스된 흐름을 사용하는 FFD는 다수의 에너지 장벽들을 가로지르는데 필요한 시간이 상대적으로 길기 때문에 강력히 결합된 것들보다 더 약하게 결합된 마이크로-입자 라벨들의 상대적으로 많은 수를 제거할 가능성이 있다. FFD는 또한 제거되어야 할 유형들에 대해서만 마이크로입자 라벨들을 선택적으로 부착시킴으로써 다수의 분자들의 초기 혼합물에 의해 표면으로부터 특이적 유형 또는 유형들의 분자들을 갖는 표면을 제조하는 단계로서 사용될 수 있다. FFD 후, 화학적 방법들(예, pH의 변화)은 라벨을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, FFD는 일부 분획에 라벨들을 랜덤하게 부착시키고, FFD에 의해 이들을 제거하고, 이어서 라벨들을 제거함으로써 표면 상의 분자들의 밀도를 조절하기 위해 사용될 수 있다.
FFD에 대한 다음 요건들은 생체 분자 결합 분석에서 그의 사용에 초점을 맞추지만, 유사한 요건들이 광범위한 범위의 잠재적인 용도들에 적용된다.
FFD는 분자 인식에 기초하여 광범위한 결합 분석에 적용될 수 있다. 주요 실시예들은 본원에 개시된 실험 입증 및 항원-항체 면역학 분석들에서와 같이 타겟 ssDNA와 그의 상보 서열의 혼성화이다. 타겟이 개별적으로 (예, 비오틴에 의해) 기능화되는 요건을 제거하기 위해, 결합 분석들은 "샌드위치" 고조로 수행될 수 있다. 예를 들면, 혼성화 분석을 위해, 표면 상의 포획 ssDNA는 타겟보다 짧게 만들어질 수 있음으로써 라벨이 유리 말단에 상보적인 다른 ssDNA 프로브를 통해 포획된 타겟의 유리 말단에 부착될 수 있다. 마찬가지로, 면역 분석에서, 라벨은 타겟 항원(에피토프)의 제2의 노출된 영역에 특이적인 제2 항체를 통해 부착될 수 있다. 결합 분석업계의 숙련자라면 표면 상에 포획된 타겟 종들에 마이크로입자 라벨을 부착시키는 많은 방법들이 있음을 알 것이다.
임의의 표면 물질은 그것이 결합 분석에 적절한 한은 FFD에 사용될 수 있다. 결합 분석업계의 숙련자라면 다수의 기질들 및 상기 기질 표면들에 유용한 포획 분자들을 부착시키는 대응하는 화학적 방법들이 있음을 알 것이다.
FFD는 기질 표면이 편평하고 평활하고, 비드 반경과 거의 동일한 표면을 따라 공간적 거리 상으로 사슬 길이 L보다 작은 높이 편차 h를 가질 때 가장 균일한 힘을 생성할 것이다. 평활성은 입자 라벨들 사이의 인장 및 제거율의 편차를 감소시킨다. 예를 들면, 2.8㎛ 직경의 비드들 및 10nm 길이의 전형적인 생체 분자 사슬들에 대해, 표면의 1.4㎛ 영역에 걸쳐 2nm 미만의 h는 12% 미만의 인장 편차를 보장할 것이다. FFD에 대한 요건은 아니지만, 이러한 평활성의 유리한 레벨은 기질 제조 업계의 숙련자들이 얻는데 어렵지 않다.
FFD에 대한 요건들은 생체 분자 결합 분석들에서 통상적으로 사용된 (또한 상업적으로 입수할 수 있는) ~1㎛ 규모의 비드들 및 마이크로유체 시스템들에 전형적으로 사용되는 ~ 100㎛ 규모 채널들의 조합물과 잘 매치된다. FFD에 유용한 가장 작은 비드 크기는 최대 유속에 의해 결정되고, 이는 다시 마이크로유체 시스템에서 허용되는 최대 압력이나 또는 궁극적으로 제어 가능한 층류(난류 아님)에 대해 약 2000의 최대 레이놀즈 수에 의해 구속된다. 압력 제한은 작은 높이(<130㎛) 채널들에 대한 비드 크기를 전형적으로 제한할 수 있고, 단, 높은 유동률에서 난류의 생성은 보다 큰 채널들의 비드 크기를 제한한다. 이를 정량화하기 위해, 비드 중심 높이 a에서 속도는 높이 s, 폭 w, 길이 l, 및 부피 흐름 Q와 같은 높은 애스펙트비의 직사각형 유동 셀을 통해 다음 식에 의한 양호한 근사치로 a<<h 및 w>>s에 대해 주어진다.
Figure 112005072312105-PCT00003
압력 구동 흐름에 대해, Q는 다음과 같이 기입될 수 있다.
Figure 112005072312105-PCT00004
여기서, P는 셀 길이에 따른 압력차이고, η는 점도이다. 인장, 정확한 스톡스 힘 및 정확한 토크에 대한 상기 표현들로부터, 길이 L의 사슬에 대해 주어진 인장을 생성하는데 필요한 비드 반경은 다음 식으로 주어진다.
Figure 112005072312105-PCT00005
a<<R인 반경 R의 시험관에 대한 식은 R을 s로 대체한 것을 제외하고는 동일하다.
도 3의 데이터는 배경 라벨 결합에 대한 양성 라벨 결합의 가장 큰 비율이 60μL/분의 유동률로 우리 실험에서 발생하는 것을 보여준다. 사용된 2.8㎛-직경 비드들에 대해, 이러한 유동률은 약 10pN의 h=0에 의해 10nm 사슬 상의 인장력으로 전이된다. 보다 작은 비드들은 동일한 인장력을 달성하기 위해 보다 큰 압력, 보다 큰 유동 셀 높이 또는 보다 짧은 사슬을 필요로 할 것이다. 예를 들면, 우리 실험의 유동-셀 (현재 전형적인 마이크로 유체 치수를 가짐)에 의해, 압력을 1기압 의 실제 마이크로유체 압력 한계까지 5500배 증가시킴으로써 90nm-직경 비드들에 대해 유사한 인장력들을 발생시킬 수 있다. 그러나, 이들 조건들은 330ml/분의 실질적이지 못한 유동률을 필요로 할 것임에 주의하자.
보다 높은 압력 및 유동률이 실시되는 경우, 작은 채널 높이에 대해 입자 크기 제한은 층류에 대한 요건에 의해 주어진다.
Figure 112005072312105-PCT00006
실험 시험의 경우에 150 pN 이하의 인장 및 유동 셀 치수들에 대해, 이는 56nm 미만의 직경의 비드들에 대한 요건에 대응한다. 나노미터-규모 비드들은 일반적으로 마이크로미터-규모 라벨들보다 검출하기가 더 어려운 것에 주의하자. 반대로, 10㎛를 초과하는 직경의 비드들은 일반적으로 용이하게 검출되지만, 라벨들/표면적의 감소는 결합 분석에서 동력학적 범위를 감소시킨다. 또한, 비드들이 클수록 힘 차별화를 달성하는데 훨씬 더 작은 유동률을 요하고, 라벨들을 도입하는데 필요한 시간(및 전체적인 결합 분석)을 크게 증가시키고, 이는 바람직하지 못한 효과이다.
상세히 제공된 실시예들은 직사각형 유체 채널들을 사용하였지만, 이것이 FFD에 대한 요건은 아니다. 유동 셀은 다양한 봉입된 형태들을 취할 수 있고, 유동은 심지어 개방된 채널에서도 이루어질 수 있다. 요구되는 유동 조건들은 고정된 유체 부피를 통해 기질을 이동시킴으로써 달성될 수도 있다. 기질 표면을 가로지르는 직사각형 흐름 대신에, FFD는 비드들이 표면에 결합되는 다공성 멤브레인을 통해서 및 그에 수직인 유체 흐름에 의해 달성될 수도 있다 (이러한 수직력에 대해 분자 사슬들에 대한 힘들의 레버 증폭은 없을 수도 있음).

Claims (28)

  1. A. 결합 분석에 의해 측정되어야 할 시료 내의 분자에 결합될 수 있는 검출 가능한 마이크로미터-규모 입자 라벨로 결합 분석에서 시료가 노출되는 포획 표면을 처리하는 단계; 및
    B. 비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 제거하기 위해 유동력 차별화 시스템을 사용하는 단계로서, 상기 유동력 차별화 시스템은 층류 시스템을 포함하고, 상기 층류 시스템은 비특이적으로 결합된 입자들에 대한 특이적으로 결합된 입자들의 바람직하게 보다 높은 비율을 확립하기에 충분한 유동률로 일정 시간 동안 작동하고, 상기 마이크로미터-규모 입자 라벨들은 검출 수단에 의해 검출되는, 사용단계;
    를 포함하는 결합 분석에서 비특이적으로 결합된 마이크로미터-규모 입자 라벨들을 제어 가능하게 제거하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유동력은 상기 마이크로-입자 라벨들이 결합되는 표면에 수직으로 접하게 작동되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유동력은 상기 마이크로-입자들이 결합되는 표면 상의 다공성 기질을 통해 수직으로 작동되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 층상 유동 흐름은 비특이적으로 결합된 입자들의 보다 큰 제거를 실시하기 위해 일정 기간 또는 시간들 동안 보다 낮은 흐름이나 또는 유동하지 않은 상태에서 보다 많은 흐름으로 펄스되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마이크로-입자들은 약 50nm 내지 약 10㎛의 크기 범위의 마이크로-입자들을 포함하는 것인 방법.
  6. A. 고형 기질을 선택하는 단계;
    B. 상기 기질 상으로 선택된 수용체를 결합시키는 단계;
    C. 상기 기질 상으로 리간드를 인가함으로써, 상기 리간드가 상기 선택된 수용체와 특이적으로 결합하게 하는 단계;
    D. 적어도 상기 리간드 중의 하나 또는 리간드와 마이크로미터-규모 입자 라벨에 특이적으로 결합하는 중재 수용체에 특이적으로 결합하도록 선택된 마이크로미터-규모 입자 라벨로 상기 기질을 처리하는 단계; 및
    E. 비특이적으로 결합된 마이크로미터-규모 입자 라벨들을 제거하기 위해 유동력 차별화 시스템을 사용하는 단계로서, 상기 유동력 차별화 시스템은 비특이적으로 결합된 라벨들에 대해 특이적으로 결합된 라벨들의 비율이 목적하는 정도로 증가할 때까지의 유동률로 글러한 시간 동안 상기 마이크로미터-규모 입자 라벨들에 대해 작동하는 유동력을 드래그하는 힘을 특징으로 하는 층류 시스템을 포함하고, 상기 마이크로미터-규모 입자 라벨들은 검출 수단에 의해 검출되는, 사용단계;
    를 포함하는 결합 분석에서 비특이적으로 결합된 마이크로미터-규모 입자 라벨들을 제어 가능하게 제거하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 고형 기질은 자기 저항 자기장 센서들의 배열을 혼입한 비드 배열 카운터(BARC) 마이크로칩인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 기질은 알루미나, 실리콘, 실리카 또는 강성 중합체의 고형 또는 다공성 기질중의 적어도 하나의 형태의 힘 차별화 분석 센서인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 수용체-리간드 쌍들은 항체-항원, 효소-기질, 킬레이터-이온 또는 다핵산-상보적 스트랜드의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 2개 이상의 수용체들은 상기 기질에 결합되고, 1개 이상의 수용체들은 타겟 리간드 쪽으로 반응에 대해 양성적이고 1개 이상의 수용체들은 그 반응에 대해 음성적인 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 마이크로미터-규모 입자 라벨들은 자기, 유전체, 방사선 활성, 형광, 발광 또는 빛의 산란으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 검출 수단들은 자기, 전기, 핵-방사선, 광학, 전기 화 학, 열 및 압전으로 구성된 센서들의 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. A. 분석 시스템에서 수용체 분자에 결합될 수 있는 기질을 선택하는 단계;
    B. 상기 기질을 상기 수용체 분자와 반응시키는 단계로서, 상기 분자는 상기 기질에 결합되는, 반응 단계;
    C. 리간드 분자를 함유하는 시료와 상기 기질을 반응시키는 단계로서, 상기 리간드 분자는 리간드-수용체 쌍을 형성하기 위해 상기 수용체 분자와 결합하고, 상기 리간드 분자는 검출될 수 있는 마이크로-입자에 의해 라벨링된, 반응 단계; 및
    D. 층류 시스템에서 유동력 차별화 방법을 적용시키는 단계로서, 상기 리간드-수용체 쌍들은 분리되어 파괴도는, 적용 단계;
    를 포함하는 결합 분석 측정 시스템들에서 리간드-수용체 쌍들을 식별하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 리간드-수용체 결합을 파괴하기 위해 상기 유동력 시스템에 의해 상기 기질에 인가된 유동률은 여러 리간드-수용체 결합 쌍들을 식별하기 위해 사용된 것인 방법.
  15. A. 1개 이상의 유형의 수용체 분자들에 결합될 수 있는 기질을 선택하는 단계;
    B. 상기 기질을 상기 수용체 분자들과 반응시키는 단계로서, 상기 수용체는 상기 기질에 결합되는, 반응 단계;
    C. 상기 기질을 1개 이상의 상보적 리간드들과 반응시키는 단계로서, 상기 리간드들은 이들의 상기 상보적 수용체 분자들과 결합하여 리간드-수용체 쌍들을 형성하고, 상기 리간드 분자들은 마이크로-입자들로 라벨링된, 반응 단계; 및
    D. 유동력 차별화 방법을 상기 기질에 적용시키는 단계로서, 상기 상보적 리간드-수용체 쌍들의 가장 약한 결합들은 파괴되고, 방출된 리간드들 및 비드들은 기질 및 기질에 부착된 리간드들로부터 유동 수단 또는 기타 수단에 의해 분리될 수 있는, 적용 단계;
    를 포함하는 유동력 차별화에 의해 리간드들의 개체군들을 분리하거나 또는 분류하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유동력 시스템에 의해 적용된 유동률은 목적하는 유형의 선택된 수의 리간드들을 제거하기에 충분한 크기로 및 충분한 시간 동안 적용되어, 나머지 리간드들의 목적하는 표면 밀도를 갖는 기질을 제조하는 것인 방법.
  17. A. 1개 이상의 유형의 수용체 분자들에 결합될 수 있는 기질을 선택하는 단계;
    B. 상기 기질을 1개 이상의 상기 분자들과 반응시키는 단계로서, 상기 분자들은 상기 기질에 결합되고, 상기 분자는 검출될 수 있는 마이크로-입자로 라벨링 된, 반응 단계; 및
    C. 층류 시스템에서 유동력 차별화 방법을 적용시키는 단계로서, 상기 분자 결합은 분리되어 파괴된, 적용 단계;
    를 포함하는 분석 측정 시스템들에서 분자 결합들을 식별하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 분자 결합들을 파괴시키기 위해 상기 유동력 시스템에 의해 상기 기질에 인가된 유동률은 그 결합들을 식별하기 위해 사용되는 것인 방법.
  19. A. 1개 이상의 유형의 수용체 분자들에 결합될 수 있는 기질을 선택하는 단계;
    B. 상기 기질을 상기 분자들과 반응시키는 단계로서, 상기 분자들은 상기 기질에 결합되고, 상기 분자들은 마이크로-입자로 라벨링된, 반응 단계; 및
    C. 유동력 차별화 방법을 상기 기질에 적용시키는 단계로서, 가장 약한 상기 분자 결합의 결합들은 파괴되고, 방출된 분자들은 기질들 및 기질에 부착된 분자들로부터 유동 수단 또는 기타 수단에 의해 분리될 수 있는, 적용 단계;
    를 포함하는 분석 측정 시스템들에서 분자 결합들을 식별하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 유동력 시스템에 의해 인가된 유동률은 목적하는 유형의 선택된 수의 제2 결합 부재들을 제거하기에 충분한 크기로 및 그 시간 동안 인가되어, 나머지 제2 결합 부지들의 목적하는 표면 밀도를 갖는 기질을 제조하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 소정의 시간 동안 주기들로 흐름 셀을 통해서 및 이어서 소정의 시간 동안 제로 흐름 속도로 유체를 유동시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 유체를 유동시키는 단계는 복수개의 입자-라벨된 타겟들과 기질-결합된 수용체들 사이의 결합들을 파열시키도록 조절된 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 유동 셀을 통한 유체의 부피 흐름은
    Q = s3WP/12ηl
    (여기서, Q는 유체의 부피 흐름이고;
    s, w, l은 유동 셀의 높이, 폭 및 길이를 각각 나타내고;
    P = 유동 셀 길이를 가로질러 차별적인 압력;
    η= 유동 셀을 통해 흐르는 유체의 점도)로 제공되는 것인 방법.
  24. 타겟 분자에 결합될 수 있는 검출 가능한 입자 라벨로 포획 표면을 처리하는 단계;
    비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 제거하기 위해 유동력 차별화 시스템을 사용하는 단계로서, 상기 유동력 차별화 시스템은 층류 시스템을 포함하고, 이 층류 시스템은 비특이적으로 결합된 입자들에 대한 특이적으로 결합된 입자들의 높은 비율을 확립하기 위해 소정의 유동률로 소정의 시간 동안 오퍼레이팅되는, 사용 단계; 및
    포획 표면으로부터 비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 해리시키기 위해 조절되는 가변적인 힘의 적용을 인에이블시키도록 구성된 유동력 차별화 시스템을 통해 유체를 유동시키는 단계를 포함하는, 결합 분석에서 비특이적으로 결합된 입자 라벨들을 제거하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유동력 차별화 시스템은 유동 셀을 포함하고, 상기 유동 셀은 비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 해리시키기 위해 유체의 흐름을 인에이블시키는 포획 표면에 부착되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 유동 셀을 통한 유체의 부피 흐름은
    Q = s3WP/12ηl
    (여기서, Q는 유체의 부피 흐름이고;
    s, w, l은 유동 셀의 높이, 폭 및 길이를 각각 나타내고;
    P = 유동 셀 길이를 가로질러 차별적인 압력;
    η= 유동 셀을 통해 흐르는 유체의 점도)로 제공되는 것인 방법.
  27. 타겟 분자에 결합될 수 있는 검출 가능한 입자 라벨로 포획 표면을 처리하는 단계;
    고정된 유체 부피를 갖는 유동력 차별화 시스템에 기질을 제공하는 단계; 및
    비특이적으로 결합된 검출 가능한 레벨들을 해리시키기 위해 유체 부피 내에서 기질을 이동시키는 단계로서, 기질의 이동은 포획 표면으로부터 비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 해리시키기 위해 조절되는 가변적인 힘들을 발생시키기 위해 소정의 속도로 소정의 시간 동안 수행됨으로써, 비특이적으로 결합된 입자들에 대한 특이적으로 결합된 입자들의 높은 비율을 확립하는, 이동 단계;
    를 포함하는, 결합 분석에서 비특이적으로 결합된 입자 라벨들을 제거하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 기질을 이동시키는 단계는 유체 부피 내에서 소정의 시간 동안 기질을 이동시키고, 이어서 비특이적으로 결합된 검출 가능한 라벨들을 해리시키기는 힘을 갖는 층류 조건들을 발생시키기 위해 소정의 시간 동안 기질의 이동을 정지시킴으로써 수행되는 것인 방법.
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