KR20060029680A - 인간 ＥＮａＣ을 발현하는 난모세포를 사용하는 개선된전기생리학적 분석법 및 세포막 전위 보고 색소를 사용하는분석법에서의 ＥＮａＣ 증강인자의 효과를 개선하기 위한페나밀의 용도 - Google Patents

인간 ＥＮａＣ을 발현하는 난모세포를 사용하는 개선된전기생리학적 분석법 및 세포막 전위 보고 색소를 사용하는분석법에서의 ＥＮａＣ 증강인자의 효과를 개선하기 위한페나밀의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 한 측면은, 인간 신장 c-DNA 라이브러리로부터 클론되고 인간의 미각 조직을 포함한 다른 조직에서도 발현되는 인간 상피 나트륨 채널 (hENaC)의 프로파일링 및 스크리닝을 위한, 포유류 세포 기반 고처리량 분석법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 ENaC 조절제, 바람직하게는 ENaC 증강인자의 동정을 위한, 양서류 난모세포 기반의 중간처리량 전기생리학적 분석법에 관한 것이다. 세포 기반 ENaC 분석법에서 ENaC의 기능을 조절하는 화합물은 인간에 있어서 짠맛에 영향을 미치는 것으로 기대된다. 본원에 기술한 분석법은 기존의 세포 발현 시스템에 대해 장점을 갖는다. 포유류 세포의 경우, 이러한 분석법은 표준 96공 또는 384공 배양판에서 고처리량 방식으로 실시될 수 있는데, ENaC 기능을 억제하는 화합물, 바람직하게는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체를 사용함으로써 향상된 분석 결과가 얻어진다. 본 발명의 난모세포 전기생리학적 분석법 (이전극 전압고정법)의 경우, 이들 분석법은 인간 ENaC을 특이적으로 조절하는 화합물의 동정을 용이하게 한다. 본 발명의 분석법은 인간 hENaC 기능을 용이하게 하거나 (향상시키거나) 억제하는 화합물을 검출하는 데 유용한 확실한 선별법을 제공한다. 이로써 인간 ENaC 채널 활성을 향상시키거나 차단하는 화합물은 인간에 있어서 짠맛을 조절하게 된다.
상피 나트륨 채널, 증강인자, 난모세포, 페나밀, 분석법

Description

인간 ＥＮａＣ을 발현하는 난모세포를 사용하는 개선된 전기생리학적 분석법 및 세포막 전위 보고 색소를 사용하는 분석법에서의 ＥＮａＣ 증강인자의 효과를 개선하기 위한 페나밀의 용도{IMPROVED ELECTROPHYSIOLOGICAL ASSAYS USING OOCYTES THAT EXPRESS HUMAN ENaC AND THE USE OF PHENAMIL TO IMPROVE THE EFFECT OF ENaC ENHANCERS IN ASSAYS USING MEMBRANE POTENTIAL REPORTING DYES}
본 출원은, 그 내용 전체가 모두 본원에 참조로써 도입된 2003년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 연재 제 60/485,745 호, 2001년 5월 1일에 출원된 미국 가출원 연재 제 60/287,413 호, 및 2002년 4월 29일에 출원된 미국 실용신안 출원 연재 제 10/133,573 호의 우선권을 주장한다.
본 발명은, ENaC 기능을 조절하는 화합물, 바람직하게는 ENaC 증강인자를 선별하는 세포 기반 분석의 효능이, ENaC 기능을 적어도 부분적으로라도 억제하는 화합물, 바람직하게는 페나밀 (phenamil)과 같은 아밀로라이드 유도체를 추가적으로 사용함으로써 개선된다는 발견에 관련된다. 본 발명은 또한, 기능성 인간 ENaC 나트륨 채널을 발현하는 난모세포 (oocyte), 바람직하게는 개구리 난모세포를 이용하여 인간 ENaC 조절제를 동정하는 개선된 전기생리학적 분석법에 관한 것이다.
본 발명은 부분적으로는, 미각 조절 화합물의 프로파일링, 스크리닝 및 동정을 위해 아밀로라이드 (amiloride) 민감성 나트륨 채널을 발현하는 재조합 숙주 세 포를 사용하는 신규한 세포 기반 분석법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 기능성 인간 상피 나트륨 채널 (human epithelial sodium channel; hENaC)을 발현하는 시험 세포, 바람직하게는 양서류 난모세포 또는 포유류 세포를 이용하는 분석법, 및 hENaC 기능을 증강시키거나 차단하는 화합물의 동정을 위한, 고처리량 또는 중간처리량 세포 기반 분석법, 바람직하게는 전기생리학적 분석법에서의 이들 시험 세포의 용도에 관한 것이다.
아밀로라이드-민감성 상피 나트륨 채널 (ENaC)은 혀에 있는 미뢰 (taste bud) 세포의 첨막 (apical membrane)을 통과하는 나트륨 유입을 매개한다 (Heck 등, Science (1984) 223:403-405). 나트륨 수송에 관련된 이온 채널의 ENaC/디제네린 (degenerin) 상위군의 일원인 ENaC은, 용상, 엽상 및 성곽 유두를 비롯하여 미각 조직의 혀 상피에서 RNA 및 단백질 수준으로 발현되는, 3 종의 부분적으로 동족인 α, β 및 γ 서브유닛으로 구성되어 있다 (Li 등, Proc . Natl . Acad . Sci . (1994) 91:1814-1818); Kretz 등, J. Histochem . Cytochem (1999) 47(1):51-64; Lin 등, J. Comp. Neurol . (1999) 405:406-420; Xiao-Jiang 등, Mol . Pharmacol . (1995) 47:1133-1140).
아밀로이드-민감성 상피 나트륨 채널 (ENaC) 채널 서브유닛을 코딩하는 상보성 DNA (cDNA)가 신장 세포로부터 단리되었고 포유류 세포주에서 발현되었다. 이 시스템에서 발현된 채널은 원위 신장 나트륨 채널과 유사한 특성, 즉 높은 나트륨 선택성, 낮은 전도도 및 아밀로라이드 민감성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 천연 발생 ENaC 채널의 한 형태는 알파 (OMIM 등재번호 600228), 베타 (OMIM 등재번호 600760) 및 감마 (OMIM 등재번호 600761)의 유사 구조를 갖는 세 가지 서브유닛으로 이루어져 있다. 각각의 서브유닛은 2 개의 막횡단 연장 영역 (transmembrane spanning domain), 세포내 아미노 말단 및 카복시 말단, 및 시스테인-풍부 세포외 영역을 함유하는 것으로 예측된다. 상기 세 개의 서브유닛은 아미노산 서열이 32 내지 37% 일치한다. 교대접합된 (alternatively spliced) 형태의 알파-ENaC이 또한 동정되었는데, 이는 아밀로라이드-민감성 나트륨 채널의 정제 시 복수 종의 단백질이 관찰되는 원인이 될 수 있는 상기 채널의 알파 서브유닛의 이질성을 나타낸다 (본원에 참고문헌으로서 도입된 미국특허 제 5,693,756 호 참조).
ENaC 나트륨 채널 기능의 억제제인 아밀로라이드는 다수의 비포유류 뿐만 아니라 인간을 포함한 포유류 종에서 염화나트륨에 대한 미각 반응을 감쇠시키는 것으로 알려져 있다 (Halpern, Neuroscience and Behavior Reviews (1998) 23:5-47 및 거기에 인용된 모든 참고문헌; Liu 등, Neuron (2003) 39:133-146; Zhao 등, Cell (2003) 115:255-266). 인간에서는 아밀로라이드가 ENaC 기능을 특이적으로 억제하는 농도로 사용되는 경우 염화나트륨의 강도를 15 내지 20%나 감소시키는 것으로 보고되고 있다 (Halpern, Neurosciences and Behavior Reviews (1998) 23:5-47 및 거기에 인용된 모든 참고문헌; Feldman 등 J. Neurophysiol . (2003) 90(3):2060-2064). 따라서 ENaC 채널을 통한 나트륨 이온의 수송을 증가시키는 화합물은 전반적 염분 맛 증강인자로서 기능할 수 있으며, 본 출원인의 이전 특허출원에서 제시된 바와 같이 인간의 염분 맛 감지를 증대시킬 수 있다 (PCT WO 02/087306 A2). 또한, 발표된 전기생리학적 데이터 및 인간 ENaC가 미뢰 세포에서 발현된다는 발견에 근거하여, ENaC에 의해 매개되는 짠맛 전달 (transduction)의 모델이 구축되었다. 이와 같이, 짠맛 감지를 자극하거나 차단하는 물질의 동정에 있어서 ENaC의 용도가 제시되었다 (미국특허 제 5,693,756, 상동, 및 PCT WO 02/087306 A2 참조).
ENaC의 생리학적 특성화에서 흔히 사용되는 세포 기반 기능성 발현 시스템은 제노푸스 라에비스 (Xenopus laevis) 난모세포 (oocyte) 및 배양된 포유류 세포주이다. 상기 난모세포 시스템은 포유류 세포에 비해, 복수의 mRNA를 직접 주입할 수 있고, 높은 수준으로 단백질을 발현하며 ENaC의 과잉발현에 고유한 유해 효과를 조절할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 상기 시스템의 단점은, 제노푸스 난모세포에서의 전기생리학적 기록이 다수의 화합물을 스크리닝하는 데에는 다루기 쉽지 않으며 제노푸스 난모세포는 포유류가 아닌 양서류 시스템이란 것이다. 상기 채널을 안정적으로 발현하는 포유류 세포주 (HEK293 및 MDCK)에서의 설치류 ENaC의 전기생리학적 특성에 대한 연구가 문헌에 보고되었다. 이들 연구에서는 포유류 세포주가 사용된 반면, 채널 기능 분석법에는 단조로운 전기생리학적 기법이 사용되었다. 그러한 접근법에서는 화합물의 고처리량 스크리닝이 이루어지지 않는다. 따라서 해당 분야에서는, 고처리량 스크리닝에 적용하기 쉬운 염분 맛 증강인자 동정법이 요구된다.
염분 맛 증강인자의 개발은 다수의 선행 과학문헌 및 특허의 주제가 되어왔다. 그러나 염분 맛 지각에 관련된 ENaC 나트륨 채널의 직접적인 조절은 인간의 짠맛을 증강시키는 접근법으로서는 신규하고 독특한 것이다. 이전에 보고된 염분 증강 화합물의 일부 예 및 이들의 특성에 대해 하기에 기술한다.
일부 단백질 분해된 단백질, 펩타이드, 아미노산 및 아미노산 에스터는 염분 증강인자로서 기능하는 것으로 보고되고 있다 (Tamura 등, Argic . Biol . Chem . (1989) 53(6):1625-1633, 1989; 미국특허 제 5,711,985 호). 그러나 이들 작용제는 30 내지 60 mM의 고농도가 필요하며, 짠맛을 양성적으로 조절하기 위해 염산이 보충되어야 한다. 또한, 이들 화합물의 합성에 따른 비용 및 어려움으로 인해 일반 대중에 대한 염분 증강인자로서의 대규모 상업적 사용이 금해지고 있다.
연방정부에 의해 GRAS (generally regarded as safe; 일반적으로 안전한 것으로 인정되는) 화합물로 분류된 암모늄염인 염화콜린이 인간 및 설치류에서 염분 증강인자로서 기능하는 것으로 보고되었다. 인간에서는, 염화콜린이 묽은 염 용액 (50 mM 미만의 NaCl)의 짠 정도 (saltiness)를 두 배가량 증가시키고, 삶은 완두콩 및 캠벨 저염 토마토 수프 모두에 대한 선호도 또는 즐기는 비율 (hedonic ratio)을 증가시키는 것으로 보고되고 있다 (Locke 등, Physiology & Behavior (1994) 55(6):1039-1046; 미국특허 제 5,260,091 호; 미국특허 제 5,260,049 호). 그러나 상기 기술한 펩타이드 및 아미노산과 유사하게, 염화콜린은 짠맛을 증강시키기 위해 상당한 농도 (mM 범위)가 필요하다.
ENaC 기능을 차단하지는 않으나 대신에 나트륨-양성자 교환을 차단하는 아밀로라이드의 유도체를 비롯하여, IAA-94 및 안트라닐산과 같은 염화물 채널 차단제는, 설치류 모델 시스템에서 염분 소비량의 간접적 척도인 유체 섭취량을 증가시키 는 것으로 보고되고 있다 (미국특허 제 5,260,091 호). 그러나 이들 작용제를 인간의 염분 증가인자로서 활용하는 것은 보고되지 않았다.
염화세틸피리디늄 (CPC)이 랫트에 있어서 염분에 대한 아밀로라이드-비민감성 신경반응을 증가시키고, 인간에 있어서 저농도 (높은 μM 범위)로 사용될 때 저염 캠벨 토마토 수프의 짠 정도를 50%나 증강시키는 것으로 보고되었다 (DeSimone 등, J. Neurophysiol. (2001) 86:2638-2641; 미국특허 제 4,997,672 호). 그러나 CPC는 세정제 (detergent)이며, 그 구조로 인해 세포의 지질 이중층에 끼어들기 쉬워서, 지질 항상성을 방해함으로써 비특이적으로 염분 미각 세포를 활성화시킨다. 실제로, 임계 미셀 농도를 초과하는 고농도의 CPC (낮은 mM 범위)는, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화암모늄을 포함한 다수의 짠맛 화합물에 대한 랫트의 신경 반응을 실제로 억제하여, 관찰된 CPC 효과가 비특이적일 수 있다는 보고를 추가로 실증한다.
두 개의 글루코스 분자로 구성된 이당류인 트레할로스는 염화나트륨 용액의 짠 정도를 1.2 내지 2 배나 증가시키는 것으로 보고되고 있다 (미국특허 제 6,159,529 호). 펩타이드 및 염화콜린과 유사하게, 상기 당은 짠 정도를 증강시키기 위해 높은 수준 (1.5 내지 12%)으로 필요하므로, 관찰된 효과가 비특이적이고 과삼투압 (hyperosmolarity)으로 인한 미각 세포 체적 변화 (세포 수축)에 기인할 수 있다는 것으로 추정된다. 또한 트레할로스 및 기타 상술한 염분 증강인자가, 짠맛을 증강시키고 단맛, 쓴맛, 신맛 및 고소한 맛을 포함한 기타 맛을 조절하지는 않는다는 특이성을 갖는다는 점에 대해서는 언급되지 않았다.
가열된 설탕/아미노산 혼합물에서 부산물로 형성되는 아미노산 알라닌의 유도체인 알라피리데인은 염화나트륨 검출에 대한 한계치를 5 배 감소시키는 것으로 보고되고 있다 (Soldo 등, Chemical Senses (2003) 28:371-379, 2003; Ottinger 등, J. Agric Food Chem (2003) 51:1035-1041, 2003). 그러나 알라피리데인은 전반적 미각 증강인자로서 기능하며 짠맛을 비롯한 단맛 및 고소한 맛에 대한 검출 한계치를 낮추는 것으로 보고되었다. 또한 더 높고 더 생리학적으로 관련된 염분 농도에서의 짠맛에 대한 알라피리데인의 효과는 개시되지 않았다. 따라서 알라피리데인의 효과는 검출 한계치 수준 근처의 낮은 염분 농도로 맛보는 경우에만 부각될 수 있다.
항생제인 노보바이오신 (novobiocin) 또한 랫트에 있어서 염화나트륨에 대한 신경 반응을 증강시키는 것으로 보고되고 있다 (Feigin 등, Am. J. Physiol . (1994) 266:C1165-C1172). 그러나 불리하게도 노보바이오신은 지질 이중층에 아밀로라이드-비민감성 양이온-선택적 이온 채널을 형성하는 것으로 보고되어, 이 작용제가 세포막에 구멍을 뚫고, 아마도 CPC와 유사하게, 비특이적으로 미각 세포 활성을 증가시키는 것으로 추정된다. 인간의 염분 맛 지각에 대한 노보바이오신의 효과는 보고되지 않았다.
아드레날린 및 무스카린 수용체를 조절하는 항세동성 (anti-fibrillary) 약물인 브레틸륨 토실레이트는 설치류 및 인간에 있어서 단맛, 신맛 또는 쓴맛에 영향을 미치지 않으면서 짠맛을 특이적으로 강화시키는 것으로 보고되었다 (Schiffman 등, Physiology & Behavior (1986) 36:1129-1137). 그러나 브레틸륨 토실레이트의 중대한 단점은, 짠맛을 양성적으로 조절하는 데 비교적 높은 농도 (mM 범위)가 필요하다는 것 외에도, 상기 화합물이 심장병 환자의 치료에 사용되는 치료제라는 것이다. 따라서 상기 화합물은 일반 대중에 대한 사용은 적합하지 않다.
낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절제 및 설포닐우레아 수용체를 포함한 ATP-결합 카세트 (ATP-binding cassette; ABC) 단백질 상위군 구성원의 억제제인 글리벤클라마이드 (glybenclamide)는, 각각의 ENaC 채널이 열리는 확률을 두 배로 증가시킴으로써 아밀로라이드-민감성 ENaC 나트륨 전류를 증가시키는 것으로 보고되고 있다 (Chraibi 등, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1999) 290:341-347, 1999; Schnizier 등, Biochemica et Biophysica Acta (2003) 1609:170-176). 그러나 글리벤클라마이드는 ABC 단백질 기능을 조절하기 때문에, 글리벤클라마이드 효과는 ABC 단백질에 의한 ENaC 활성의 간접적 조절로 인한 것이고, ENaC 채널 기능의 직접적 조절에 기인한 것은 아닌 것으로 추정된다. 또한 글리벤클라마이드는 인간의 짠맛 지각을 증강시키는 것으로 입증되지 않았고, 글리벤클라마이드는 짠맛 증강인자로 제시되지도 않았다.
따라서 상기 기재를 기초로, ENaC 및 짠맛을 특이적으로 조절하는 화합물이 개선된 짠맛 조절제라는 것을 확인하는 개선된 방법이 필요하다는 것이 명백하다. 바람직하게는, 그러한 방법은 고처리량 또는 중간처리량 방법을 포함하고, 인간 ENaC 기능에 대해 직접적인 효과를 갖는 화합물을 선별할 것이다.
발명의 개요
본 발명은, ENaC을 조절하는 화합물을 동정하는 분석법에 대한 선행기술의 문제점을 해결한다. 구체적으로, 본 발명은 ENaC을 조절하고 그에 따라 짠맛을 조절하는 화합물을 동정하기 위해 기능성 인간 ENaC를 발현하는 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 난모세포를 활용하는 세포 기반 분석법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 나트륨 채널, 더욱 특히 아밀로라이드-민감성 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 프로파일링 및 스크리닝을 위한 난모세포 및 포유류 세포 기반 분석법, 바람직하게는 고처리량 또는 중간처리량 분석법을 제공하는데, 상기 분석법은 선택적으로 ENaC 기능을 부분적으로 또는 전체적으로 억제하는 화합물, 바람직하게는 아밀로라이드 또는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체의 첨가를 포함할 수 있다. 특히 페나밀의 사용은 ENaC 기능을 조절 (향상 또는 억제)하는 화합물을 동정하기 위한 분석법 중에, 바람직하게는 고처리량 또는 중간처리량 분석 중에 시그널 강도를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 그러한 방법은 ENaC 활성을 기능적으로 특성화하거나 짠맛 지각을 향상시키거나 차단하는 화합물 (본원에서는 짠맛 조절제라 한다)을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
따라서 첫 번째 측면으로, 본 발명은 기능성 hENaC을 발현하는 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 양서류 난모세포를 제공한다. 바람직한 일구현예에서는, 이들 세포가 hENaC의 세 서브유닛 모두 (알파 또는 델타, 베타 및 감마)를 일시적으로 또는 안정적으로 발현하거나, 하나 이상의 서브유닛 또는 그의 기능성 키메라, 변형체 또는 조각을 일시적으로 또는 안정적으로 발현할 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 포유류 세포는 기능성 hENaC를 발현할 수 있는 포유류 세포는 어느 것이나 포함하며, 예를 들면 COS, CHO, MDCK, HEK293, HEK293T, NIH3T3, Swiss3T3 및 BHK 세포를 포함한다. 그러나 상기 바람직한 구현예에서는 본 발명은 기능성 hENaC를 발현하는 HEK293T 세포를 제공한다. 본 발명에 유용한 난모세포는 바람직하게는 양서류 난모세포, 예를 들면 제노푸스 난모세포를 포함한다.
두 번째 측면으로, 본 발명은 ENaC 기능을 향상시키거나 차단하는 화합물, 예를 들면 유기 소분자, 항체, 펩타이드, 환상 펩타이드, 지질 및 핵산을 포함하는 화합물을 동정하기 위해 기능성 ENaC, 바람직하게는 hENaC를 발현하는 포유류 세포 또는 양서류 난모세포를 이용하는 세포 기반 분석법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 분석법은 하나 이상의 ENaC 조절제로 추정되는 화합물의 첨가 또는 사용 전에 ENaC 기능을 부분적으로 억제하는 농도로 공지의 ENaC 억제제를 첨가하는 것을 포함할 것이다.
바람직하게는 상기 분석법은 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 추정 (putative) 조절제의 프로파일링 및 스크리닝을 위한 포유류 세포 또는 난모세포 기반 분석법, 바람직하게는 고처리량 또는 중간처리량 분석법에 있어서, (i) 나트륨을 함유하는 완충제의 존재 하에서, 세포막 전위 형광 색소 또는 나트륨-민감성 형광 색소가 부하된 ENaC를 발현하는 시험 세포와, 하나 이상의 조절제로 추정되는 화합물을 접촉시키는 단계; (ii) 상기 하나 이상의 조절제로 추정되는 화합물의 첨가 전에, 상기 숙주 세포를, ENaC 기능을 억제하는 것으로 공지된 화합물, 바람직하게는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체와, ENaC 기능이 적어도 부분적으로라도 억제되는 농도로 접촉시키는 단계; 및 (iii) 공지된 ENaC 억제제 화합물의 첨가 후에 추정 조절제 및 나트륨과 접촉된 세포에서의 막전위 색소 (membrane potential dye) 또는 나트륨-민감성 색소의 형광발광 변화를, 나트륨만으로 접촉된 세포에서의 막전위 색소 또는 나트륨-민감성 색소의 형광발광 변화와 비교하며 관찰하여, ENaC 조절 정도를 구하는 단계를 포함하는 분석법을 포함할 것이다.
본 발명의 또다른 바람직한 측면으로는, 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 활성을 관찰하는 방법으로서, (i) 기능성 ENaC으로 트랜스펙션되거나 형질변환된 시험 세포, 예를 들면 포유류 세포를 제공하는 단계; (ii) 멀티-웰 플레이트의 웰에 상기 시험 세포를 접종하고 약 70% 이상의 융합 (confluence)에 이르기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; (iii) 상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 접종된 시험 세포에 세포막 전위 형광 색소 또는 나트륨-민감성 형광 색소를 색소-부하하는 단계; (iv) 상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 색소-부하된 시험 세포를 하나 이상의 추정 조절제 화합물과 접촉시키는 단계; (v) 상기 하나 이상의 추정 조절제 화합물의 첨가 전에, 상기 숙주 세포를, ENaC 기능을 부분적으로 억제하는 화합물, 예를 들면 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체와 추가 접촉시키는 단계; 및 (vi) 형광 플레이트 판독기를 사용하여 형광발광 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, (i) 적당한 세포, 예를 들면 HEK293T 세포 또는 또다른 포유류 세포주가, 기능성 인간 ENaC을 생성하는 데 필요 한 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열로 형질변환되거나 트랜스펙션되고; (ii) 상기 세포는 바람직하게는 약 80% 융합에 이르도록 멀티-웰 플레이트, 예를 들면 384공 플레이트 상에 접종되고; (iii) 상기 접종된 시험 세포는 CC2-DMPVE 또는 DiSBAC2(3)과 같은 세포막 전위 민감성 색소로 부하되고; (iv) 상기 색소-부하된 세포는 이어서 하나 이상의 추정 ENaC 조절제 화합물과 접촉되고; (v) 상기 색소-부하된 세포는, 바람직하게는 상기 하나 이상의 ENaC 조절제 화합물과 접촉되기 전에, 일정량의 하나 이상의 공지 ENaC 억제제와 적어도 부분적인 ENaC 억제가 이루어지는 농도로 추가 접촉되며; 그리고 (iv) 전압 강도 플레이트 판독기, 예를 들면 VIPRII (Aurora Biosciences)를 사용하여 세포 형광발광의 변화가 관찰된다.
본 발명의 또다른 측면으로는, 짠맛 조절제 화합물을 동정하는 방법으로서, (i) 기능성 인간 ENaC로 트랜스펙션되거나 형질변환된 시험 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 시험 세포를 멀티-웰 플레이트의 웰에 접종하고 약 70% 이상의 융합, 더욱 바람직하게는 약 80%의 융합에 이르기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; (iii) 상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 접종된 시험 세포에 막전위 색소를 색소-부하하는 단계; (iv) 상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 색소-부하된 시험 세포를 하나 이상의 추정 조절제 화합물과 접촉시키는 단계; (v) 바람직하게는 상기 하나 이상의 추정 조절제 화합물의 첨가 전에, 상기 색소-부하된 시험 세포를 공지의 ENaC 억제제 화합물, 예를 들면 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체와, 적어도 부분적으로라도 ENaC 기능을 억제하는 농도로 추가 접촉시키는 단계; (vi) 형광 플레이트 판독기를 사용하여 조절제/ENaC 상호작용으로 인한 막전위 색 소의 형광발광 변화를 관찰하는 단계; 및 (vii) 관찰된 형광발광의 변화를 근거로, 하나 이상의 추정 조절제를 짠맛 조절 화합물로 동정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, (i) 적당한 세포, 예를 들면 HEK293T 세포가, 기능성 인간 ENaC를 생성하는 데 필요한 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열로 형질변환되거나 트랜스펙션되고; (ii) 상기 세포는 멀티-웰 플레이트, 예를 들면 384공 플레이트 상에, 바람직하게는 약 80%의 융합에 이르도록 접종되고; (iii) 상기 접종된 시험 세포는 CC2-DMPVE 또는 DiSBAC2(3)과 같은 세포막 전위 민감성 색소가 부하되고; (iv) 상기 색소-부하된 세포는 이어서 하나 이상의 추정 ENaC 조절제 화합물과 접촉되고; (v) 바람직하게는 그 전에, 상기 색소-부하된 세포가 ENaC 기능을 억제하는 것으로 공지된 화합물, 예를 들면 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체와, 적어도 부분적으로라도 ENaC 기능을 억제하는 농도로 접촉되고; (vi) 전압 강도 플레이트 판독기, 예를 들면 VIPRII (Aurora Biosciences)를 사용하여 세포 형광발광의 변화가 관찰되며; 그리고 (vii) 짠맛을 조절하는 화합물이 형광 강도의 변화에 근거하여 선택된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 인간 ENaC 조절제 화합물이, 기능성 인간 ENaC 나트륨 채널을 발현하는 난모세포, 바람직하게는 양서류 난모세포 (개구리)에서의 거시적 전류에 대한 상기 화합물의 (억제적 또는 향상적) 효과에 근거하여 동정되는 전기생리학적 분석법, 바람직하게는 이전극 전압고정법 (two-electrode voltage clamp assay)이 제공된다. 이들 분석법은 ENaC 조절제를 동정 하는 일부 기타 세포 기반 분석법에 비해 개선된 것인데, 부분적인 이유로는 난모세포가 적은 수의 내재 이온 채널을 발현하고; 따라서 상기 난모세포 발현 시스템은 적은 배경전류 하에 또는 배경전류 없이 ENaC 나트륨 채널 전류를 직접 측정할 수 있게 하기 때문이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 이들 전기생리학적 분석법은 상기 난모세포를 ENaC의 적어도 부분적인 억제제, 예를 들면 아밀로라이드 또는 아밀로라이드 유도체와, 대조군으로서 또는 나트륨 채널 세포 전류의 측정가능한 변화를 향상시키기 위해 추가 접촉시킨다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 인간 ENaC 알파, 베타 및 감마 또는 델타, 베타 및 감마 서브유닛을 발현하는, 인간 ENaC 나트륨 채널을 기능적으로 발현하는 개구리 난모세포가 제공된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 본 발명에 따른 세포 기반 분석법에 사용되는 ENaC가 천연 발생 인간 ENaC 서브유닛, 하나 이상의 교대접합된 인간 ENaC 서브유닛, 또는 그의 기능성 변형체로 구성될 수 있다. 대안적으로는, 상기 ENaC는 천연 발생 인간 ENaC의 하나 이상의 알파 서브유닛, 또는 그의 교대접합된 변형으로 구성될 수 있다. 또다른 구현예에서는, 델타 서브유닛 (유전자은행 가맹번호 U38254와 같은 것; J Biol Chem, 270(46):27411-4 (1995) 참조) 또는 그의 변형체가 알파 서브유닛을 대체할 수 있다.
바람직하게는, 이들 서브유닛은 하기에 개시된 서열번호 1, 2, 3 및 7에 의해 코딩된다. 본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면은 하기의 발명의 상세한 설명, 도면 및 청구범위를 통해 당업자에게 자명해질 것이다.
본 발명은, 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 프로파일링 및 스크리닝을 위한, 기능성 hENaC 발현 시험 세포, 바람직하게는 재조합 포유류 세포 또는 양서류 난모세포를 포함하는 분석 시스템을 비롯하여, 포유류 세포 기반 및 양서류 난모세포 기반 분석법, 바람직하게는 고처리량 또는 중간처리량 분석법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ENaC 조절제를 선별하는 세포 기반 분석법에서 사용될 수 있는 hENaC의 α, β 및 γ 서브유닛을 발현하는 인간 세포주, 예를 들면 HEK293T 세포, 및 양서류 난모세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 ENaC 활성을 기능적으로 특성화하는데 사용되고 짠맛 지각을 향상시키거나 차단하는 화합물 (본원에서는 짠맛 조절제라 한다)을 동정하는 데 사용되는, 델타, 베타 및 감마 서브유닛으로 이루어진 기능성 ENaC을 발현하는 포유류 세포 및 양서류 난모세포를 제공한다. 이들 화합물은 짠맛을 향상, 조절, 억제 또는 차단하기 위해 식품, 의약품 및 음료의 성분으로서 사용될 수 있다.
그러나 본 발명을 더욱 상세히 기술하기에 앞서, 하기 정의가 제공된다. 다르게는, 기술적 용어 및 구절은 당업계에서 사용되는 대로, 통상의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
정의
본원에서 사용된 "짠맛" 또는 "짠맛 지각"은 염분 맛 자극에 대한 대상의 지각 또는 반응을 의미한다. 위에서 언급한 바와 같이, hENaC는 짠맛 지각, 특히 인간 대상에 있어서 "짠맛"을 이끌어내는 염과 관련된 것으로 여겨진다. 그러한 자극은 기능성 ENaC, 바람직하게는 hENaC에서 반응을 이끌어내는, NaCl과 같은 화합물을 포함한다.
용어 "ENaC" 서브유닛 단백질 또는 그의 조각, 또는 "ENaC" 단백질 또는 그의 조각의 세 서브유닛 중 하나를 코딩하는 핵산은: (1) 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200 또는 500 또는 그 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐, 서열번호 1; 2 또는 3에 포함된 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 약 80% 초과의 아미노산 서열 동질성, 85%, 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동질성을 갖는 아미노산 서열을 가지거나; 또는 (2) 서열번호 1, 2 또는 7에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 면역원 또는 그의 면역원적 조각, 및 그의 보존적으로 수식된 변형체에 대해 생성된 항체, 예를 들면 폴리클로날 항체에 특이적으로 결합하거나; 또는 (3) 엄격한 교잡반응 (hybridization) 조건 하에서 ENaC 단백질, 예를 들면 서열번호 1, 2, 3 또는 7, 또는 그의 보체, 및 그의 보존적으로 수식된 변형체를 코딩하는 핵산 서열에 해당하는 안티센스 가닥으로 특이적으로 교잡반응시키거나; 또는 (4) 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 그 이상의 핵산의 영역에 걸쳐, 서열번호 1, 2, 3 또는 7 또는 그의 보체에 대해 약 80% 초과의 서열 동질성, 85%, 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 핵산 서열 동질성을 가지거나; (5) 나트륨 전도도 분석에 있어서 HEK 세포에서 발현되고 이전극 전세포 전기생리학 (two-electrode whole cell electrophysiology)을 사용함으로써, 또는 나트륨 또는 리튬에 대한 반응으로서 막전위 색소의 형광발광의 변화에 의해 시험하는 경우, 본원에 기술한 hENaC에 기능적으로 대등하다.
기능적으로 대등한 ENaC 단백질에는, 일차 서열이 아래 동정된 것들과는 다르지만 기능성 분석법, 예를 들면 아래 기술한 나트륨 전도도 분석법에 의해 구해진 대등한 기능을 갖는 ENaC 서브유닛이 포함된다.
"기능적 효과를 결정"한다는 것은, 간적접으로 또는 직접적으로 ENaC 폴리펩타이드의 영향 하에, 예를 들면 기능적, 물리적 및 화학적 효과 하에 있는 파라미터를 증가시키거나 감소시키는 화합물의 효과를 분석하는 것을 의미한다. 그러한 기능적 효과에는 이온 흐름의 변화, 세포막 전위, 전류 진폭, 및 전압 게이팅 (voltage gating)을 비롯하여, 임의적 마커 유전자의 유전자 발현의 변화와 같은 기타 생물학적 효과 등이 포함된다. 이온 흐름은 채널을 통해 통과하는 임의의 이온, 예를 들면 나트륨 또는 리튬, 및 방사성 동위원소와 같은 그 유사체를 포함한다. 그러한 기능적 효과는 당업자에게 공지된 임의 수단에 의해, 예를 들면 이전극 전기생리학 또는 전압-민감성 색소를 사용하거나, 또는 분광적 특성 (예를 들면, 형광발광, 흡수, 굴절률 지수), 유체역학적 (예를 들면, 모양), 크로마토그래피적, 또는 용해도 물성과 같은 파라미터의 변화를 측정함으로써, 측정될 수 있다. 바람직하게는 ENaC 기능은 이전극 전세포 전기생리학을 사용하여, 또는 나트륨 또는 리튬에 대한 반응으로서 막전위 색소의 형광발광의 변화를 관찰함으로써 평가될 것이다.
ENaC 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열의 "억제제", "활성화제" 및 "조절제"는 ENaC 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열의 세포 기반 분석법을 사용하여 동정된, 활성화, 억제 또는 조절 분자를 가리키는 것으로 사용된다. 억제제는, 예를 들면 ENaC 단백질에 결합하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 활성을 차단하거나, 상기 단백질의 활성 또는 발현을 감소, 방지, 활성화 지연, 불활화, 탈감작 또는 하향 조절 (down regulate)하는 화합물이다.
"활성화제"는 ENaC 단백질 활성을 증가, 시작, 활성화, 촉진, 활성화 증강, 감작, 효현 (agonize) 또는 상향 조절 (up regulate)하는 화합물이다. 억제제, 활성화제 또는 조절제는 ENaC 단백질의 유전적으로 수식된 변형, 예를 들면 변화된 활성을 갖는 변형을 비롯하여, 천연 발생 및 합성 리간드, 안타고니스트, 아고니트스, 펩타이드, 환상 펩타이드, 핵산, 항체, 안티센스 분자, 리보자임, 유기 소분자 등을 또한 포함한다. 억제제 및 활성화제에 대한 상기와 같은 분석법에는, 예를 들면 세포, 세포 추출물 또는 세포막에서 ENaC 단백질을 발현하고, 추정 조절제 화합물을 가하고, 경우에 따라서는 그 전에, 상기 ENaC 단백질을 공지 ENaC 억제제와, 부분적 ENaC 억제제를 결과로 하는 농도에서 접촉시킨 후, 상기 기술한 바와 같이 회전 화합물의 활성에 대한 기능적 효과를 결정하는 것을 포함한다.
잠재적 활성화제, 억제제 또는 조절제로 처리된 ENaC 단백질을 함유하는 샘플 또는 분석법은, 활성화, 억제 또는 조절의 정도를 검사하기 위해 억제제, 활성화제 또는 조절제 없이 대조 샘플과 비교된다. 상기 분석법의 한 구현예에서는, 화합물을, 준최적의 (suboptimal) 나트륨 농도가 제공된 세포의 반응에 대한 상기 화합물의 효과에 대해 시험한다. 준최적 농도의 나트륨으로 처리되나 화합물은 빠진 대조군 세포는 통상 최대 반응의 10 내지 20%를 나타낸다. 상기 10 내지 20% 초과의 준최적 나트륨 농도의 반응을 증가시키는 화합물이 추정 ENaC 증강인자이다. 반대로, 상기 반응을 10% 미만으로 감소시키는 화합물은 추정 ENaC 증강인자이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시험 화합물" 또는 "시험 후보" 또는 "조절제" 또는 그의 문법적 대등물은 ENaC 활성을 조절하는 능력에 대한 시험대상이 될, 천연 발생 또는 합성의 임의 분자, 예를 들면 단백질, 올리고펩타이드 (예를 들면, 약 5 내지 약 25 개 아미노산의 길이, 바람직하게는 12, 15 또는 18 개 아미노산의 길이), 유기 소분자, 다당류, 지질 (예를 들면 스핑고지질), 지방산, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 등을 말한다. 시험 화합물은, 충분한 범위의 다양성을 제공하는 조합 또는 랜덤화된 라이브러리와 같은 시험 화합물의 라이브러리 형태일 수 있다. 시험 화합물은 선택적으로 융합 상대, 예를 들면 목표 화합물, 구제 화합물, 이량체화 화합물, 안정화 화합물, 호출가능 (addressable) 화합물 및 기타 기능성 모이어티에 선택적으로 연결된다. 통상적으로, 유용한 특성을 갖는 새로운 화학적 개체는, 몇 가지 바람직한 특성 또는 활성, 예를 들면 증강 활성을 갖는 시험 화합물 ("리드 (lead) 화합물"이라 함)을 동정하고, 리드 화합물의 변형체를 생성하고, 이들 변형체 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 생성된다. 바람직하게는 고처리량 스크리닝 (HTS) 방법이 그러한 분석에 사용된다.
"유기 소분자"는 분자량이 약 50 달톤 초과 약 2500 달톤 미만, 바람직하게는 약 2000 달톤 미만, 바람직하게는 약 100 내지 약 1000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 500 달톤인 천연 발생 또는 합성 유기 분자를 가리킨다.
"생물학적 샘플"은 생검 및 부검 샘플과 같은 조직의 부분, 및 조직학적 목적으로 취해진 냉동 부분을 포함한다. 그러한 샘플에는 혈, 타액, 조직, 배양 세포, 예를 들면 일차 배양, 외식체 (explant), 및 형질변환된 세포, 대변, 소변 등이 포함된다. 생물학적 샘플은 토상 진핵 생물, 가장 바람직하게는 영장류, 예를 들면 침팬지 또는 인간; 소; 개; 고양이; 설치류, 예를 들면 기니피그, 랫트, 마우스; 토끼와 같은 포유류; 또는 조류; 파충류; 또는 어류로부터 수득된다.
"ENaC 활성을 억제하는 화합물"은 상기 화합물이 기능성 ENaC와 접촉될 때 나트륨 채널 활성을 억제하는, 바람직하게는 가역적으로 억제하는 화합물을 가리킨다. 그러한 화합물의 바람직한 예는 페나밀, 벤자밀, 31,41-디클로로벤자밀, 에틸이소프로필아밀로라이드; 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀, 5-(N-메틸-N-과니디노카보닐메틸)아밀로라이드; 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드; 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA); 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀, 21,41-디메틸벤자밀; 21,31-벤조벤자밀; 등과 같은 아밀로라이드 및 아밀로라이드 유도체이다.
"아밀로라이드 유도체"는 ENaC 기능을 억제하는 아밀로라이드와 유사한 구조를 갖는 화합물을 가리킨다. 전형적으로 그러한 유도체는 과니딘 치환기 상에 치환되거나 (예를 들면, 페나밀), 5-N 위치상에 치환된다 (예를 들면, 에틸이소프로필아밀로라이드).
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 용어 "동일 (identical)" 또는 퍼센트 "동질성 (identity)"은, 하기한 초기설정 (default) 파라미터로 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리듬을 사용하여 측정하거나, 수작업 정렬 및 육안 검사에 의해 측정했을 때 (예를 들면, NCBI 웹사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov) 참조), 둘 이상의 서열 또는 준서열 (subsequence)이 동일하거나 특정 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 동일 (즉, 비교창 (comparison window) 또는 지정된 영역에서 비교 및 최대 일치하도록 정렬되는 경우, 특정 영역 (예를 들면, 서열번호 1, 2, 3 또는 7의 뉴클레오타이드 서열)에서 약 80% 동질성, 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동질성))한 것을 가리킨다. 그러한 서열은 "실질적으로 동일"하다고 한다. 이러한 정의는 또한 시험서열의 보체를 가리키거나 그에 적용될 수도 있다. 상기 정의는 또한 결실 및/또는 추가가 있는 서열을 비롯하여 치환이 있는 것들도 포함한다. 하기한 바와 같이, 바람직한 알고리듬은 갭 (gap) 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 약 25 개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 더욱 바람직하게는 50 내지 100 개 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 길이인 영역에 걸쳐 동질성이 존재한다.
서열 비교에 있어서, 통상 하나의 서열이 시험서열과 비교되는 참조서열로서 작용한다. 서열 빅 알고리듬을 사용하는 경우, 시험서열 및 참조서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 부서열 좌표(subsequence coordinate)가 지정되고, 서열 알고리듬 프로그램 파라미터가 지정된다. 바람직하게는, 초기설정 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리듬이 프로그램 파라미터를 기초로 참조서열에 비교하여 시험서열의 백분율 서열 동질성을 산출한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "비교창"에는, 한 서열과 동일한 수의 인접한 위치를 갖는 참조서열이 최적으로 정렬된 후 상기 서열이 상기 참조서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600, 보통 약 50 내지 약 200, 더욱 보통 약 100 내지 약 150 개로 이루어진 군으로부터 선택된 다수의 인접한 위치 중 하나의 분절 (segment)을 가리킨다. 비교용 서열 정렬의 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들면 Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482 (1981)의 국부적 상동성 알고리듬에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리듬에 의해, Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)의 유사성 탐색 방법에 의해, 이들 알고리듬의 컴퓨터화된 이행 (Genetics Computer Group (575 Science Dr., Madison, WI)의 Wisconsin Genetics Software Package 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수작업 정렬 및 육안 검사 (예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등 편저, 1995 보충서) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동질성 및 서열 유사성을 구하기에 적당한 알고리듬의 바람직한 일례는 Altschul 등, Nuc . Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul 등, J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)에 각각 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기재한 파라미터로써, 본 발명의 핵산 및 단백질의 퍼센트 서열 동질성을 구하는 데 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개되어 있다. 상기 알고리듬은 먼저, 문의 서열에 있어서 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 단어와 정렬된 경우 몇몇 양수 값을 갖는 한계치 스코어 T와 일치하거나 이를 만족시키는, 길이 W의 짧은 단어를 동정함으로써, 고득점 서열 짝 (high scoring sequence pairs; HSPs)을 동정하는 것을 포함한다. T는 이웃하는 단어 스코어 한계치 (Altschul 등, 상동)라 한다. 이들 이웃하는 단어의 초기 적중은 이들을 함유하는 HSP의 더 긴 것을 찾기 위한 탐색을 개시하는 시드 (seed)로서 작용한다. 단어 적중률은 각 서열을 따라 양방향으로, 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 확장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오타이드 서열에 대해서는 파라미터 M (일치하는 잔기 짝에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (불일치 잔기 짝에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)를 사용하여 산출한다. 아미노산 서열에 대해서는, 누적 스코어를 산출하는 데 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)가 사용된다. 각 방향에서의 단어 적중률의 확장은, 누적 정렬 스코어가 최대 수득치로부터 일정량 X 만큼 떨어졌을 때; 누적 스코어가 하나 이상의 음수-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 될 때; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 다다랐을 때, 중단된다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X 는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열용)은 단어길이 (W)가 11, 기대치 (E)가 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 초기설정로 사용한다. 아미노산 서열에 대해서는, BLASTP 프로그램은 단어길이 (W)가 3, 그리고 기대치 (E)가 10인 것을 초기설정로 사용하며, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989) 참조)는 정렬 (B)이 50, 기대치 (E)가 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 가리키는 데 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 해당 천연 발생 아미노산의 인위적인 화학적 모사체인 아미노산 중합체에 적용되고, 또한 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산을 비롯하여, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 가리킨다. 천연 발생 아미노산은 유전암호에 의해 코딩된 것들뿐만 아니라, 나중에 수식된 아미노산, 예를 들면 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 갖는 화합물, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기에 결합되는 α 탄소, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 가리킨다. 그러한 유사체는 수식된 R 기 (예를 들면, 노르류신) 또는 수식된 펩타이드 주쇄를 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적 화학 구조와는 상이하나, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 가리킨다.
아미노산은 본원에서 일반적으로 알려진 세 글자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 한 글자 기호로 표기될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 일반적으로 허용되는 한 글자 암호로 표기될 수 있다.
"보존적으로 수식된 변형체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해서는, 보존적으로 수식된 변형체가 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 가리킨다. 유전암호의 축퇴 (degeneracy)로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변화시키지 않으면서 상기 해당 코돈 중 어느 것으로 바뀔 수 있다. 그러한 핵산 변동은 보존적으로 수식된 변동의 일종인 "침묵 변동 (silent variation)"이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변동을 기재한다. 당업자는 핵산 내 각 코돈 (보통 메티오닌을 위한 단 하나의 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판을 위한 단 하나의 코돈인 TGG 제외)은 수식되어 기능적으로 동일한 분자를 수득하게 할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변동은 각 기재된 서열 내에서 발현 생성물에 대해서는 함축적이지만 실제 프로브 (probe) 서열에 대해서는 그렇지 않다.
아미노산 서열에 대해서는, 당업자는 코딩된 서열 내 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 추가 또는 결실시키는, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 추가가, 그러한 변경이 한 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키게 되는 "보존적으로 수식된 변형체"임을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 공지되어 있다. 그러한 보존적으로 수식된 변형체는 본 발명의 다형성 변형체 (polymorphic variant), 종간 동족체, 및 대립유전자에 부가적이며 이들을 제외하지 않는다.
하기의 8 개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글라이신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 사이토신 (C), 메티오닌 (M) (예를 들면, Creighton, Proteins (1984) 참조). 앞서 언급했듯이, 본 발명은 적절한 분석법, 예를 들면 하기에 상세히 기술한 전(全)세포 나트륨 전도도 분석법을 사용하는 분석법에서 기능적으로 대등한, 본 출원서에 개시된 것과는 상이한 일차 서열을 갖는 ENaC 서브유닛 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 포함한다.
폴리펩타이드 구조와 같은 거대분자 구조는 다양한 수준의 조직의 견지에서 기술될 수 있다. 이러한 조직에 대한 일반적 논의에 대해서는, 예를 들면 Alberts 등, Molecular Biology of the Cell (제 3 판, 1994) 및 Cantor 및 Schimmel, Biophysical Chemistry Part 1: The Conformation of Biological Macromolecules (1980) 참조. "일차 구조"는 특정 펩타이드의 아미노산 서열을 가리킨다. "이차 구조"는 폴리펩타이드 내에 국부적으로 배열된 3차원 구조를 가리킨다. 이러한 구조는 흔히 영역 (domain)으로 알려져 있고, 예를 들면 막횡단 영역, 공극 영역 및 세포질 꼬리 영역이 있다. 영역은 폴리펩타이드의 치밀한 단위를 형성하고 통상 15 내지 350 개의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩타이드의 부분이다. 예시적인 영역에는 세포외 영역, 막횡단 영역 및 세포질 영역이 포함된다. 전형적인 영역은 α-병풍 및 β-나선의 확장물과 같은 더 작은 조직의 부분으로 이루어져 있다. "3차 구조"는 폴리펩타이드 단량체의 완전한 3차원 구조를 가리킨다. "4차 구조"는 독립적 3차 단위의 비공유적 회합에 의해 형성되는 3차원 구조를 가리킨다. 비등방성 항목은 에너지 항목으로도 알려져 있다.
특정 핵산 서열은 또한 "접합 변형체 (splice variant)"를 함축적으로 포함한다. 유사하게, 핵산에 의해 코딩된 특정 단백질은 상기 핵산의 접합 변형체에 의해 코딩된 임의 단백질을 함축적으로 포함한다. 명칭에서 알 수 있듯이, "접합 변형체"는 유전자의 교대접합의 생성물이다. 전사 후에, 초기 핵산 전사체는 상이한 (대안적) 핵산 접합 생성물이 상이한 폴리펩타이드를 코딩하도록 접합될 수 있다. 접합 변형체의 생성에 대한 메커니즘은 다양하지만, 엑손의 교대접합을 포함한다. 대안적으로, 연속판독 전사 (read-through transcription)에 의해 동일한 핵산으로부터 유래하는 폴리펩타이드도 또한 상기 정의에 포함된다. 접합 생성물의 재조합 형태를 포함하는, 접합 반응의 임의 생성물이 상기 정의에 포함된다.
ENaC 핵산 서열 또한, 본원에 기재된 나트륨 전도도 분석법에 있어서 적절한 분석법을 사용하여 분석하는 경우, 본원에 개시된 ENaC 폴리펩타이드와 기능적으로 대등한 ENaC 서브유닛을 코딩하는 단일 뉴클레오타이드 다양체를 포함한다.
막횡단 전위 색소 또는 전압-민감성 색소는 세포막 비극성화 시 형광발광 특성이 변화하는 분자 또는 분자의 조합을 가리킨다. 이러한 색소는 세포 내에 발현되는 ENaC와 같은 이온 채널 활성의 변화를 검출하는 데 사용될 수 있다.
"라벨" 또는 "검출가능 모이어티 (moiety)"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 기타 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 라벨에는 32P, 형광 색소, 전자 조밀 시약 (electron-dense reagent), 효소 (예를 들면, ELISA에서 보통 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌 (digoxigenin), 또는 예를 들면 펩타이드 내에 방사성 라벨을 혼입시켜 검출가능하게 되거나 펩타이드와 특이적으로 반응성이 있는 항체를 검출하는 데 사용될 수 있는 합텐 및 단백질이 포함된다.
예를 들면, 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 대해 사용되는 경우의 용어 "재조합"은 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 자연적 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 수식되어진 것, 또는 상기 세포가 그렇게 수식되어진 세포로부터 유래한 것을 나타낸다. 따라서 예를 들면, 재조합 세포는 세포의 자연적인 (비-재조합적) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 다르게는 비정상적으로 발현되거나 불충분하게 발현되거나 전혀 발현되지 않는 자연적 유전자를 발현한다. 본 발명에서는 상기 용어는 통상 하나 이상의 ENaC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열로 트랜스펙션된 세포를 가리킨다.
핵산의 부분에 대해 사용되는 경우의 용어 "이종 (heterologous)"은 상기 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계에 있는 것으로 발견되지 않는 둘 이상의 준서열로 이루어진 것을 나타낸다. 예를 들면, 상기 핵산은 통상 관련없는 유전자로부터의 둘 이상의 서열이 배열되어 새로운 기능성 핵산을 만들어내도록 재조합적으로 생성되며, 예를 들면 하나의 원으로부터의 프로모터 및 또다른 원으로부터의 코딩 영역을 갖는 것이다. 유사하게, 이종 단백질이란 상기 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계에 있는 것으로 발견되지 않는 둘 이상의 준서열로 이루어진 것을 나타낸다 (예를 들면, 융합 단백질). 유전자, cDNA, mRNA 또는 단백질의 세포 발현에 대해 사용되는 경우의 용어 "이종"은 상기 유전자, cDNA, mRNA 또는 단백질이 세포 내에서 정상적으로 발현되지 않거나 세포의 원래 원과는 다른 종에서 유래한 것을 나타낸다.
"엄격한 교잡반응 조건"이란 구절은, 통상 핵산의 복합 혼합물 중에서 프로브가 그 목표 준서열과는 교잡반응 하지만 다른 서열과는 하지 않는 조건을 가리킨다. 엄격한 조건은 서열에 의존적이며 상이한 상황에서는 달라질 것이다. 서열이 길어질수록 교잡반응은 더 높은 온도에서 특이적으로 일어난다. 핵산의 교잡반응에 대한 방대한 지침서가 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)에 나온다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서의 특정 서열의 열적 용융점 (Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮은 온도로 선택된다. 상기 Tm 은, 목표에 대해 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태의 목표 서열 (목표 서열이 과량으로 존재하는 경우, Tm 에서는 프로브의 50%가 평형 상태이다)과 교잡반응하는 온도 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)이다. 엄격한 조건은 또한 폼아마이드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 이루어질 수도 있다. 선택적 또는 특이적 교잡반응에 있어서는, 양성 시그널이 배경 교잡반응의 적어도 두 배, 바람직하게는 배경 교잡반응의 10 배이다. 예시적인 엄격한 교잡반응 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 폼아마이드, 5×SSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS로 세정. 상기 세정 및 교잡반응 단계는 일반적으로 1/2, 1, 2, 5, 13, 15, 30, 60 분 또는 그 이상, 더욱 통상적으로는 약 30 초 내지 2 분간 수행된다.
엄격한 조건 하에서 서로 교잡반응하지 않는 핵산이라도, 이들이 코딩하는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하면 상기 핵산도 실질적으로 동일하다. 이는, 예를 들면 핵산의 사본이 유전암호에 의해 허용되는 최대한의 코돈 축퇴를 사용하여 생성되는 경우 일어난다. 그러한 경우, 핵산은 통상 온화하게 엄격한 (moderately stringent) 교잡반응 조건 하에서 교잡반응한다. 예시적인 "온화하게 엄격한 교잡반응 조건"에는 37℃에서의 40% 폼아마이드, 1 M NaCl, 1% SDS 완충제 중의 교잡반응 및 45℃에서의 1×SSC로의 세정이 포함된다. 양성 교잡반응은 배경의 적어도 두 배이다. 당업자는 대안적인 교잡반응 및 세정 조건이 유사한 엄격성 정도의 조건을 제공하는 데 이용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 교잡반응 파라미터를 결정하기 위한 부가적 지침서가 다수의 참고문헌, 예를 들면 Ausubel 등 편저, Current Protocols in Molecular Biology 에 제공된다.
PCR에 있어서는, 약 36℃의 온도가 저엄격성의 증폭에 통상적이나, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃에서 변화할 수 있다. 고엄격성의 PCR 증폭에 있어서는, 약 62℃의 온도가 통상적이나, 고엄격성의 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃의 범위일 수 있다. 고엄격성 및 저엄격성의 증폭 모두에 대해 통상적인 사이클 조건으로는 90℃ 내지 95℃에서 30 초 내지 2 분간의 변성 단계, 30 초 내지 2 분간의 어닐링 단계, 및 약 72℃에서 1 내지 2 분간의 확장 단계가 포함된다. 저엄격성 및 고엄격성의 증폭 반응에 대한 프로토콜 및 지침서가, 예를 들면 Innis 등 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. 에 제공된다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 조각으로부터의 골격구역 (framework region)으로 이루어진 폴리펩타이드를 가리킨다. 발견된 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변구역 (constant region) 유전자를 비롯하여, 수천 개의 면역글로불린 가변 구역 (variable region) 유전자가 포함된다. 가벼운 사슬 (light chain)은 카파 또는 람다로 분류된다. 무거운 사슬 (heavy chain)은 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이들은 다시 각각 면역글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 통상 항체의 항원 결합 구역이 특이성 및 결합 친화도에 있어 가장 중요하다.
특히, 상기와 같은 항체는 본원에 개시된 ENaC에 특이적으로 결합하는 것, 또는 상기와 같은 ENaC 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 혼합물을 포함한다.
항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합함" 또는 "특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성이 있는"이란 구절은, 단백질 또는 펩타이드를 가리키는 경우, 종종 불균일한 단백질 및 기타 생물질 집단에서 일정 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 가리킨다. 따라서 지정된 면역측정법 조건 하에서는 명시된 항체가 특정 단백질에 배경에 비해 적어도 두 배로, 보다 통상적으로는 배경에 비해 10 내지 100 배 이상으로 결합한다. 그러한 조건 하에서의 항체로의 특이적 결합은 특정 단백질에 대해 특이성을 갖도록 선택된 항체를 필요로 한다. 예를 들면, ENaC 서브유닛 단백질로 되는 다클론 항체, 예를 들면 서열번호 1, 2, 3 또는 7에 의해 코딩되는 ENaC 알파, 베타, 감마 또는 델타 서브유닛, 다변형 변형체, 대립유전자, 오르토로그 (ortholog) 및 보존적으로 수식된 변형체, 또는 접합변형체 또는 그의 일부가, ENaC 서브유닛 단백질, 즉 ENaC 알파, 베타, 감마 또는 델타 서브유닛, 예를 들면, 서열번호 4, 5, 6 또는 8에 포함된 아미노산 서열과는 특이적으로 면역반응성이 있지만 다른 단백질과는 없는 다클론성 (polyclonal) 항체만을 수득하도록 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다른 분자와 교차반응하는 항체를 제거함으로써 이루어질 수 있다. 다양한 면역측정법 형식이 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성이 있는 항체를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 고체상 ELISA 면역측정법이 일정 단백질과 특이적으로 면역반응성이 있는 항체를 선택하는 데 관례적으로 사용된다 (예를 들면, 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역측정법 형식 및 조건에 대한 설명으로서, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) 참조).
ENaC 활성을 조절하는 단백질에 대한 분석법
고처리량 또는 중간처리량 기능성 게놈 분석법이 짠맛을 차단, 억제, 조절 또는 증강시키는 ENaC의 조절제를 동정하는 데 사용될 수 있다. 그러한 분석법으로는, 예를 들면 세포주 또는 일차 세포 또는 난모세포를 사용하여 세포 표면 마커 발현의 변화, 세포내 이온 변화 또는 세포막 전류 변화를 관찰할 수 있다. 통상, 세포는 cDNA 또는 (핵산에 의해 코딩되는) 랜덤 펩타이드 라이브러리와 접촉된다. 상기 cDNA 라이브러리는 센스, 안티센스, 전장 및 절단 cDNA로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 라이브러리는 핵산에 의해 코딩된다. 이어서, 세포의 표현형에 대한 cDNA 또는 펩타이드 라이브러리의 효과가 상기한 분석법을 사용하여 관찰된다. cDNA 또는 펩타이드의 효과는, 예를 들면 테트라사이클린 프로모터로부터의 발현과 같은 핵산의 조절가능한 발현을 사용하여 확인 및 체세포 돌연변이로부터 구분될 수 있다. 펩타이드를 코딩하는 cDNA 및 핵산은 당업자에게 공지된 기법을 사용하여, 예를 들면 서열 태그 (tag)를 사용하여 구조될 수 있다.
cDNA (예를 들면, 서열번호 1, 2 또는 7)에 의해 코딩된 펩타이드 또는 단백질과 상호작용하는 단백질은 효모 2-하이브리드 시스템, 포유류 2-하이브리드 시스템 또는 파지 제시 선별 (phage display screen) 등을 사용하여 단리될 수 있다. 그렇게 동정된 목표는 이러한 분석법에서, 그 구성원이 또한 약물 개발을 위한 목표가 되는, ENaC 채널과 상호작용할 수 있는 부가적 성분을 동정하는 데 미끼로서 또한 사용될 수 있다 (예를 들면 Fields 등, Nature 340:245 (1989); Vasavada 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 88:10686 (1991); Fearon 등, Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 89:7958 (1992); Dang 등, Mol . Cell. Biol . 11:954 (1991); Chien 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 9578 (1991); 및 미국특허 제 5,283,173 호, 제 5,667,973 호, 5,468,614 호, 제 5,525,490 호 및 제 5,637,463 호 참조).
ENaC 단백질을 발현하는 적당한 세포 및 세포주로는, 예를 들면 신장 상피세포, 폐 상피세포, 미각 상피세포 및 기타 포유류, 바람직하게는 인간의 상피세포, 및 난모세포, 바람직하게는 양서류 난모세포, 가장 바람직하게는 제노푸스 난모세포가 포함된다.
ENaC 단백질을 코딩하는 핵산의 단리
본 발명은 부분적으로는 재조합 유전학 분야에서 관례적인 기법에 의존한다. 본 발명에서 사용되는 일반적 방법을 기술하는 기본적 문헌에는 Sambrook 및 Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (제 3 판, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등 편저, 1994)가 포함된다.
서열번호 1, 2, 3 또는 7에 의해 코딩되는 아미노산 서열 및 기타 ENaC족 구성원과 실질적으로 동일한 ENaC 서브유닛, 다변형 변형체, 오르토로그 및 대립유전자를 코딩하는 핵산은 엄격한 교잡반응 조건 하에서 ENaC 핵산 프로브 및 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 대안적으로는, 인간 ENaC 또는 그의 일부에 대하여 만들어진 항혈청 또는 정제된 항체를 사용하여 발현된 동족체를 면역학적으로 검출함으로써 ENaC 서브유닛 단백질, 다변형 변형체, 오르토로그 및 대립유전자를 클론하는 데에 발현 라이브러리가 사용될 수 있다.
cDNA 라이브러리를 만들기 위해서는, ENaC RNA가 풍부한 원을 선택해야 한다. 이어서 증식, 스크리닝 및 클로닝을 위해, 역전사효소를 사용하여 mRNA가 cDNA로 만들어지고, 재조합 벡터 내로 결찰되고, 재조합 숙주로 트랜스펙션된다. cDNA 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들면, Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook 등, 상동; Ausubel 등, 상동).
게놈 라이브러리에 대해서는, DNA가 조직으로부터 추출되고, 기계적으로 전단되거나 효소에 의해 소화되어 약 12 내지 20 kb의 조각을 수득한다. 이어서 상기 조각은 기울기 원심분리에 의해 원치않는 크기의 것으로부터 분리되고 박테리오파지 람다 벡터 (bacteriophage lambda vector)에 구축된다. 이들 벡터 및 파지는 시험관내에서 포장된다. 재조합 파지는 Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977)에 기재된 바와 같이 플레이크 교잡반응 (plaque hybridization)에 의해 분석된다. 콜로니 교잡반응 (colony hybridization)은 일반적으로 Grunstein 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 72:3961-3965 (1975)에 기재된 바와 같이 수행된다.
대안적으로, 인간 ENAC 서브유닛을 코딩하는 ENaC cRNA는 T7 RNA 중합체를 사용하여 α, β, γ 또는 Δ 인간 ENaC DNA 플라스미드로부터 생성되어, 적절한 제한효소로써 선형화된 DNA로부터 cRNA를 시험관내 전사하고, 결과로 얻어진 cRNA를 적절한 세포, 예를 들면 난모세포, 바람직하게는 개구리 난모세포 내로 미세주입할 수 있다.
ENaC 서브유닛 핵산 및 그의 오르토로그, 대립유전자, 돌연변이, 다형성 변형체 및 보존적으로 수식된 변형체를 단리하는 대안적인 방법은 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 사용 및 RNA 또는 DNA 템플리트의 증폭을 조합한다 (미국특허 제 4,683,195 호 및 제 4,683,202 호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis 등 편저, 1990) 참조). 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및 라이게이즈 (ligase) 연쇄 반응 (LCR)과 같은 방법이 mRNA로부터, cDNA로부터, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 인간 ENaC의 핵산 서열을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 축퇴성 (degenerate) 올리고뉴클레오타이드가 본원에 제공된 서열을 사용하여 ENaC 동족체를 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 제한 엔도누클리에이즈 부위가 프라이머 내로 도입될 수 있다. 중합효소 연쇄반응 또는 기타 시험관내 증폭 방법 또한, 예를 들면 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클론하는 데, 생리학적 샘플에서 ENaC를 코딩하는 mRNA의 존재를 검출하거나 핵산 시퀀싱이나 기타 목적을 위한 프로브로서 사용할 핵산을 만드는 데 유용할 수 있다. PCR 반응에 의해 증폭된 유전자는 아가로스 젤로 정제되고 적절한 벡터 내로 클론될 수 있다.
ENaC 서브유닛의 유전자 발현은 당업계에서 공지된 기법, 예를 들면 mRNA의 역전사 및 증폭, 총 RNA 또는 폴리 A+ RNA의 단리, 노던 블로팅, 도트 블로팅, 제자리 교잡반응, RN에이즈 보호, 고밀도 폴리뉴클레오타이드 배열 기술 등에 의해 분석될 수 있다.
ENaC 서브유닛 단백질을 코딩하는 핵산은 고밀도 올리고뉴클레오타이드 배열 기술 (예를 들면, GeneChip™)과 함께 본 발명의 ENaC 단백질, 오르토로그, 대립유전자, 보존적으로 수식된 변형체, 및 다형성 변형체를 동정하는 데 사용될 수 있다. 동정되는 동족체가 T 세포 활성화 및 이동의 조절에 관련된 경우, 이들은 GeneChip™과 함께 생물학적 샘플의 질병 검출에서 진단도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, Gunthand 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:869-876 (1998); Kozal 등, Nat. Med. 2:753-759 (1996); Matson 등, Anal. Biochem. 224:110-106 (1995); Lockhart 등, Nat. Biotechnol. 14:1675-1680 (1996); Gingeras 등, Genome Res. 8:435-448 (1998); 및 Hacia 등, Nucleic Acids Res. 26:3865-3866 (1998) 참조.
ENaC 서브유닛, 바람직하게는 인간 ENaC 서브유닛을 코딩하는 유전자는 통상 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포내로의 형질변환 전에 중간체 벡터내로 클론된다. 이러한 중간체 벡터는 통상 원핵세포 벡터, 예를 들면 플라스미드 또는 셔틀 벡터이다.
1. 원핵생물 및 진핵생물에서의 발현
hENaC 서브유닛을 코딩하는 cDNA와 같은 클론된 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위해서는, 통상 hENaC 서브유닛 핵산 서열을, 직접 전사에 대한 강한 프로모터, 전사/번역 종지자, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 라이보솜 결합 부위를 함유하는 발현 벡터로 서브클론한다. 적당한 박테리아 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들면 [Sambrook 등, 및 Ausubel 등, 상동]에 기재되어 있다. ENaC 서브유닛 단백질을 발현하기 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들면 대장균, 바실루스 종 및 살모넬라 (Palva 등, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach 등, Nature 203-543-545 (1983))에서 찾을 수 있다. 그러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모, 제노푸스 난모세포 및 곤충 세포를 위한 진핵 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로도 입수가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 난모세포 발현 시스템이 기능성 인간 ENaC를 발현하고 ENaC 채널을 통한 나트륨 수송에 대한 특정화합물의 효과를 검사하는 데 사용된다. 제노푸스 난모세포 발현 시스템은 앞서 ENaC를 포함한 이온 채널의 발현 및 기능 연구에 사용되어 왔다 (Dascal, CRC Crt . Rev. Biotech. (1987) 22(4): 317-387; Wanger 등, Cellular Physiology and Biochemistry (2000) 10:1-12; 및 Canessa 등, Nature (1994) 367: 463-467). 또다른 구현예에서는, 레트로바이러스 발현 시스템이 본 발명에 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서는, pcDNA3 및 그의 유도체와 같은 상업적으로 입수가능한 플라스미드 기반 벡터와 함께 일시발현 (transient expression) 시스템이 활용될 수 있다.
이종 핵산의 발현을 이끄는 데 사용되는 프로모터의 선택은 특정 용도에 의존한다. 상기 프로모터는 바람직하게는 이종 전사 출발 부위로부터, 자연적 환경 하에서의 전사 출발 부위로부터의 거리와 대략 동일한 거리에 위치한다. 그러나 당업계에 공지된 바와 같이, 상기 거리의 일부 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 허용될 수 있다.
프로모터 외에도, 발현 벡터는 통상 숙주 세포에서의 ENaC 서브유닛을 코딩하는 핵산의 발현에 필요한 모든 부가적 요소를 함유하는 전사 단위 또는 발현 카셋트 (cassette)를 함유한다. 따라서 통상적인 발현 카셋트는 ENaC 서브유닛(들)을 코딩하는 핵산 서열에 사용가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터, 및 전사물의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결에 필요한 시그널을 함유한다. 카셋트의 부가적 요소에는 증강인자 및, 게놈 DNA가 구조적 유전자로서 사용될 경우, 기능성 접합 공여자 (splice donor) 및 수용자 (acceptor) 부위를 갖는 인트론이 포함될 수 있다.
프로모터 서열 외에도, 발현 카셋트는 또한 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조 유전자의 아래쪽에 전사 종결 구역을 함유해야 한다. 상기 종결 구역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.
유전자 정보를 세포 내로 이송하기 위해 사용되는 특정 발현 벡터는 특별히 중요하지는 않다. 진핵 또는 원핵세포 내 발현에 사용되는 통상적인 벡터는 어느 것이나 사용할 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터에는 pBR322 기반 플라스미드, pSKF, pET23D와 같은 플라스미드, 및 MBP, GST, 및 LacZ와 같은 융합 발현 시스템이 포함된다. 편리한 단리 방법을 제공하기 위해 에피토프 태그 (epitope tag)를 또한 재조합 단백질, 예를 들면 c-myc에 부가할 수도 있다. 서열 태그가 핵산 구조를 위한 발현 카셋트에 포함될 수도 있다. 형광 단백질, 녹색 또는 적색 형광 단백질, β-gal, CAT 등과 같은 마커가 벡터 전달용 마커로서 벡터에 포함될 수 있다.
진핵세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 통상 진핵세포 발현 벡터, 예를 들면 SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 Epstein-Barr 바이러스로부터 유래한 벡터에 사용된다. 기타 예시적인 진핵세포 벡터에는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 (baculovirus) pDSVE, 및 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방암 바이러스 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵세포 내 발현에 효과적으로 나타난 기타 프로모터들의 지도 하에 단백질의 발현을 허용하는 기타 벡터는 어느 것이나 다 포함된다.
진핵세포 벡터로부터의 단백질의 발현은 또한 유도성 프로모터를 사용하여 조절될 수 있다. 유도성 프로모터로는, 발현 수준이 테트라사이클린 또는 에크디손 (ecdysone)과 같은 유도제의 농도에 연관되는데, 이들 작용제에 대한 반응 요소가 프로모터 내로 도입됨에 따라 그렇게 된다. 일반적으로, 유도체의 존재 하에서만 높은 수준의 발현이 유도성 프로모터로부터 수득되며; 기본 발현 수준은 최소이다.
한 구현예에서는, 본 발명의 벡터가 조절성 프로모터, 예를 들면 tet-조절 시스템 및 RU-486 시스템을 가질 수 있다 (예를 들면, Gossen & Bujard, PNAS 89:5547 (1992); Oligino 등, Gene Ther . 5:491-496 (1998); Wang 등, Gene Ther . 4:432-441 (1997); Neering 등, Blood 88:1147-1155 (1996); 및 Rendahl 등, Nat. Biotechnol . 16:757-761 (1998) 참조). 이들은 소분자에 후보 목표 핵산의 발현에 대한 제어를 부여한다. 이러한 유익한 특징은 원하는 표현형이 체세포 돌연변이보다는 트랜스펙션된 cDNA에 의한다는 것을 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 발현 시스템은 티미딘 키네이즈 및 디하이드로폴레이트 환원효소와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커를 갖는다. 대안적으로는, 유전자 증폭에 관련되지 않은 고수율 발현 시스템이 또한 적당하며, 곤충세포 내 배큘로바이러스 벡터를 폴리헤드린 프로모터 또는 기타 강한 배큘로바이러스 프로모터의 지도 하에 ENaC를 코딩하는 서열과 함께 사용하는 것 등이다.
발현 벡터에 통상 포함되는 요소는 대장균에서 기능하는 레플리콘 (replicon), 재조합 플라스미드를 도입시키는 박테리아의 선택을 허용하도록 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 진핵세포 서열의 삽입을 허용하도록 플라스미드의 비필수적 영역 내에 독특한 제한 부위를 포함한다. 특정 항생제 내성 유전자의 선택은 그리 중요하지 않으며, 당업계에 공지된 다수의 내성 유전자는 어느 것이나 적당하다. 원핵세포 서열을 선택하는 것이 바람직한데, 필요에 따라 이들이 진핵세포 내 DNA의 복제를 방해하지 않도록 하기 위해서다.
ENaC 단백질을 다량 발현하는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 제조하는 데 표준 트랜스펙션 방법이 사용될 수 있으며, 상기 단백질은 표준 기법을 사용하여 정제된다 (예를 들면, Colley 등, J. Biol . Chem . 264:17619-17622 (1989); Methods in Enzymology 제 182권 중에서 Guide to Protein Purification, (Deutscher 편저, 1990) 참조). 진핵세포 및 원핵세포의 형질변환은 표준 기법에 따라 수행된다 (예를 들면, Morrison, J. Bac . 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu 등 편저, 1983) 참조). 대안적으로는, 본 발명의 바람직한 구현예에서는, 인간 ENaC 서브유닛을 발현하는 난모세포가 상기 서브유닛을 코딩하는 cRNA의 미세주입에 의해 제조된다.
외래 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포 내로 도입하는 공지된 절차는 어느 것이나 사용될 수 있다. 여기에는 인산칼슘 트랜스펙션, 폴리브렌 (polybrene), 원형질체 (protoplast) 융합, 전기천공법 (electroporation), 유전자총 (biolistics), 리포솜, DNA 트랜스펙션용으로 최적화된 지질, 미세주입, 플라스마 벡터, 바이러스 벡터, 및 클론된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하는 기타 공지된 방법은 어느 것이나 포함된다 (예를 들면 Sambrook 등, 상동 참조). 필요한 것은 다만 사용되는 특정 유전공학적 절차가 하나 이상의 ENaC 서브유닛 유전자를 숙주 세포, 바람직하게는 기능성 ENaC를 발현할 수 있는 포유류 세포 내로 성공적으로 도입할 수 있느냐이다.
발현 벡터가 세포 내로 도입된 후에는, 트랜스펙션된 세포가 ENaC 서브유닛(들)의 발현에 좋은 조건 하에 배양된다. 한 구현예에서는, 상기 세포가 지질 기반 트랜스펙션을 사용하여 hENaC 유전자 세 개 모두로써 일시적으로 트랜스펙션되고, ENaC 조절제에 대한 선별을 수행하기 전에 24 내지 48 시간 동안 배양된다.
앞서 언급하였듯이, 본 발명의 바람직한 구현예는 난모세포 발현 시스템을 포함한다. 상기 방법에는 일반적으로 개구리 외과처치, 난모세포 단리, cRNA 제조 및 난모세포 미세주입이 포함된다. 개구리 외과처치 및 난모세포 단리를 위한 일반적 절차는 당업계에 통상적으로 공지되어 있다 (Marcus-Sekur 등, Methods in Enzymol . 152:284-288 (1987); Goldin, Methods in Enzymol . 207:266-279 참조). 마찬가지로, cRNA 제조 방법 또한 공지되어 있으며, 예를 들면 Swansen 등, Meth . Enzymol. 207:310-319 (1912), Golden 등 Meth . Enzymol. 217:279-297 (1992)에 보고되어 있다. 수득된 cRNA는 이어서 표준 방법에 따라 개구리 난모세포 내로 미세주입된다 (Molten 등, Meth . Enzymol. 254:458-466 (1975); Hitchcock 등, Meth . Enzymol. 152:276-284 (1987) 참조).
ENAC 단백질의 조절제에 대한 분석법
A. 분석법
ENaC 단백질의 조절은 다양한 분석법; 바람직하게는 상술한 세포 기반 모델을 사용하여 평가될 수 있다. 그러한 분석법은 짠맛 지각을 조절, 차단, 증강 또는 억제하는 ENaC의 억제제 및 활성화제에 대한 시험에 사용될 수 있다.
바람직하게는, ENaC는 세 개의 서브유닛, 알파 (또는 델타), 베타 및 감마로 이루어질 것이며, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3 또는 7에 의해 코딩되는 인간 ENaC 서브유닛 또는 인간 오르토로그 또는 그의 보존적으로 수식된 변형체로 이루어질 것이다. 대안적으로는, 분석하는 ENaC는 비-인간 상피 세포로부터 유래할 것이다. 일반적으로 각각의 서브유닛의 아미노산 서열 동질성은 서열번호 1, 2, 3 또는 7에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대해 80% 이상, 바람직하게는 85% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다.
ENaC 단백질 또는 ENaC 단백질을 발현하는 세포로 이루어진, 재조합 또는 천연 발생인 후보물질의 효과 측정은 본원에 기재된 바와 같이 다양한 분석법을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 ENaC 조절이 가능한 분자를 동정하기 위해, 기능성 ENaC를 발현하는 양서류 난모세포 또는 포유류 세포 내 ENaC 활성에 대한 다양한 후보 조절제의 효과를 검출하기 위한 분석이 수행된다. 바람직하게는, 그러한 분석법은, 하나 이상의 추정 ENaC 조절제, 예를 들면 ENaC 증강인자의 첨가 전에, 먼저 ENaC를 공지된 ENaC 억제제와 접촉시킨다. 바람직하게는, 상기 억제제는 아밀로라이드 또는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체이다.
ENaC 단백질의 채널 활성은 패치-클램프 (patch-clamp) 기법, 전세포 전류 측정, 방사성 표지된 이온 흐름 분석법, 및 전압-민감성 색소 (예를 들면, Vestergarrd-Bogind 등, J. Membrane Biol. 88:67-75 (1988); Daniel 등, J. Pharmacol . Meth . 25:185-193 (1991); Hoevinsky 등, J. Membrane Biol. 137:59-70 (1994) 참조) 및 이온-민감성 색소를 사용한 형광발광 분석법을 포함하여, 이온 흐름의 변화를 측정하는 다양한 분석법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, ENaC 단백질의 하나 이상의 서브유닛 또는 그의 동족체를 코딩하는 핵산이 제노푸스 난모세포 내로 주입될 수 있다. 이어서 세포막 전류의 변화를 측정함으로써 채널 활성을 평가할 수 있다. 전기생리학적 측정을 수득할 수 있는 한 수단은 패치-클램프 기법, 예를 들면 "세포-부착" 방식, "인사이드-아웃 (inside-out)" 방식 및 "전(全)세포" 방식 (예를 들면, Ackerman 등, New Engl .. J. Med . 336:1575-1595 (1997) 참조)을 사용하여 전류를 측정하는 것이다. 전세포 전류는 Hamil 등, Pflugers Archiv. 391:185 (1981)에 기재된 것과 같은 표준 방법론을 사용하여 측정할 수 있다.
채널 활성은 또한 예를 들면 이온 민감성 색소를 사용하여 세포내 이온 수준의 변화를 측정함으로써 평가할 수 있다.
ENaC 폴리펩타이드의 활성 또한 기능적, 화학적 및 물리적 효과를 측정하기 위한 다양한 기타 분석법, 예를 들면 ENaC 폴리펩타이드와, 펩타이드, 유기 소분자 및 지질을 포함한 다른 분자와의 결합 측정; ENaC 단백질 및/또는 RNA 수준 측정, 또는 ENaC 폴리펩타이드의 기타 측면, 예를 들면 전사 수준, 또는 ENaC 활성에 영향을 미치는 생리학적 변화 측정을 사용하여 평가할 수 있다. 온전한 세포 또는 동물을 이용하여 기능적 결과를 측정하는 경우, 세포 증식의 변화 또는 pH 변화, 또는 IP3, cGMP 또는 cAMP와 같은 세포내 제 2 메신저, 또는 포스포라이페이즈 (phospholipase) C 신호경로의 성분 또는 조절제의 변화와 같은 다양한 효과를 측정할 수도 있다. 그러한 분석법은 활성화제 및 억제제 모두에 대해 시험하도록 사용할 수 있다. 이와 같이 동정된 조절제는, 예를 들면 식품, 음료 및 의약품 중 향미제로서 유용하다.
세포 기반 분석법
또다른 구현예에서는, 하나 이상의 ENaC 서브유닛 단백질이 세포 내에서 발현되고, ENaC 조절제를 동정하기 위해 기능적, 예를 들면 물리적 및 화학적 또는 표현형 변화를 분석한다. ENaC 단백질을 발현하는 세포는 결합 분석에도 사용될 수 있다. 본원에 기재한 바와 같이, 적당한 기능적 효과는 어느 것이나 측정할 수 있다. 예를 들면, 세포막 전위의 변화, 세포내 이온 수준의 변화, 및 리간드 결합 모두 세포 기반 시스템을 사용하여 잠재적 조절제를 동정하는 적당한 분석법이다. 그러한 세포 기반 분석법에 적당한 세포에는 일차 세포, 예를 들면 ENaC 단백질을 발현하는 미각 상피 세포, 및 ENaC를 발현하는 HEK293T 세포와 같은 배양된 세포주 모두가 포함된다. 또다른 바람직한 발현 시스템은 양서류 난모세포를 포함한다. 언급한 바와 같이, 이들 분석법에서는 바람직하게는 먼저 ENaC 발현 세포주, 예를 들면 양서류 난모세포 또는 HEK293과 공지된 ENaC 억제제, 예를 들면 아밀로라이드 또는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체를, 상기 세포주와 하나 이상의 추정 ENaC 조절제를 접촉시키기 전제, ENaC 기능을 부분적으로 억제하는 농도로 접촉시킨다. ENaC 단백질은 천연 발생 또는 재조합의 것일 수 있다. 또한, 상기 기술한 바와 같이, ENaC 단백질의 조각 또는 이온 채널 활성을 갖는 키메라가 세포 기반 분석법에 사용될 수 있다.
또다른 구현예에서는, 세포 ENaC 폴리펩타이드 수준이 단백질 또는 mRNA 수준을 측정함으로써 결정된다. ENaC 단백질 또는 ENaC 이온 채널 활성화에 관련된 단백질의 수준은 웨스턴 블로팅, ELISA 등과 같은 면역분석법을 사용하여, ENaC 폴리펩타이드 또는 그의 조각에 선택적으로 결합하는 항체로써 측정한다. mRNA의 측정을 위해서는, 예를 들면 PCR, LCR을 사용하는 증폭, 또는 교잡반응 분석법, 예를 들면 노던 (Northern) 교잡반응, RN에이즈 보호, 도트 블로팅이 바람직하다. 단백질 또는 mRNA의 수준은 본원에 기술한 바와 같이, 직접 또는 간접적으로 표지된 검출 작용제, 예를 들면 형광 또는 방사능 표지된 핵산, 방사능 또는 효소 표지된 항체 등을 사용하여 검출한다.
대안적으로는, ENaC 발현은 보고 유전자 (reporter gene) 시스템을 사용하여 측정할 수 있다. 그러한 시스템은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈, 초파리 루시퍼레이즈, 박테리아 루시퍼레이즈, β-갈락토시데이즈 및 알칼리성 포스파테이즈와 같은 보고 유전자에 사용가능하게 연결된 ENaC 단백질 프로모터를 사용하여 고안할 수 있다. 또한, 상기 관심대상인 단백질은 적색 또는 녹색 형광 단백질과 같은 제 2 보고자로의 부착을 통해 간접적인 보고자로서 사용할 수도 있다 (예를 들면, Mistill & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997) 참조). 상기 보고자 구조물은 통상 세포 내로 트랜스펙션된다. 잠재적 조절제로써 처리, 및 바람직하게는 그전의 공지된 ENaC 억제제, 예를 들면 페나밀로써 처리한 후에, 보고 유전자 전사, 번역 또는 활성의 양을 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 측정한다.
또다른 구현예에서는, 신호 전달에 관련된 기능적 효과를 측정할 수 있다. 활성화되거나 억제된 ENaC는 목표 효소, 제 2 메신저, 채널 및 기타 이펙터 (effector) 단백질의 특성을 변화시킬 것이다. ENaC 활성에 대한 분석법은, 예를 들면 세포막 탈분극 (depolarization) 또는 나트륨 유입을 관찰함으로써, 채널 활성을 보고하는 이온 또는 전압 민감성 색소가 부하된 세포를 포함한다. 그러한 보고자의 활성을 결정하는 분석법은 또한 공지된 ENaC의 안타고니스트, 예컨대 아밀로라이드 또는 페나밀을 시험 화합물의 활성을 평가하는 대조군으로서 사용할 수 있다. 조절성 화합물 (예를 들면, 아고니스트, 안타고니스트)을 동정하기 위한 분석법에서는, 세포질 내 이온 수준 또는 세포막 전위의 변화를, 각각 이온 민감성 또는 세포막 전위 형광 지시자 (indicator)를 사용하여 관찰한다. 사용할 수 있는 이온-민감성 지시자 및 전압 프로브 중에는 분자 프로브 2002 카탈로그: (www.probes.com)에 개시된 것들 및 아래에 개시된 특정 화합물이 있다.
바람직한 분석 시스템은 ENaC cRNA가 주입된 개구리 난모세포를 사용할 것이고, 상기 난모세포는 시험 화합물과 접촉한 뒤 이전극 전압고정 전기생리학적 기록 기법에 의해 분석된다 (Stuhmer, Meth . Enzymol. 207:319-339 (1992); Wagner 등, Cellular Physiology and Biochemistry (10:1-12 (2000) 참조).
전기생리학적 분석법
언급한 바와 같이, ENaC를 조절, 즉 증강, 억제 또는 차단하는 화합물의 동정을 위한 바람직한 분석법은, 하나 이상의 추정 ENaC 조절제 (증강인자 또는 억제제)와 접촉된. 인간 ENaC 서브유닛을 발현하는 세포 내 전류 변화를 관찰하는 전기생리학적 분석법으로 이루어진다. 이러한 분석법은 기능성 ENaC를 발현하는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 상기 세포가 난모세포, 바람직하게는 개구리 난모세포, 포유류 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포, 또는 기능성 ENaC 이온 채널을 발현하는 데 적당한 다른 발현 시스템으로 이루어질 것이다. 바람직하게는, 상기 발현 시스템은 활발하고 신속한 인간 ENaC 나트륨 채널 발현을 나타낼 것이고, 바람직하게는 내재 이온 채널을 전혀 발현하지 않거나 매우 적은 양으로 발현하여 ENaC 나트륨 채널 기능을 특이적으로 조절하는 화합물의 동정을 용이하게 할 것이다. 이에 따라, 원치않는 배경 반응이 최소화되거나 제거된다. 또한, 난모세포와 같은 활발한 세포가 바람직한데, 이는 본 발명에 따른 분석법에서 상기 세포를 재사용할 수 있게 하기 때문이다. 난모세포는 이전에 ENaC를 포함한 기타 기능성 이온 채널을 신속하고 활발히 발현하는 것으로 보고되었다 (Pascal, CRC Crit . Rev. Biotech. 22(4):317-87 (1987); Wagner 등, Cell Physiol. Biochem . 10:1-12 (2000); Canessa 등, Nature 367:463-467 (1994)).
특별히 바람직한 전기생리학적 분석법은 이전극 전압고정 기법에 의해 개구리 난모세포에서 ENaC 나트륨 채널 기능을 측정하는 중간처리량 분석법이다. 상기 활발하고 신속한 발현 시스템은 약 18 내지 24 시간 만에 난모세포 세포막에서 약 1백만 개의 ENaC 채널의 발현을 제공한다. 더욱이, 난모세포는 비교적 크기 때문에 (직경 1 mm, 대부분의 포유류 세포에 비해 비교적 크다), 취급하고 작업하기가 쉽다.
이러한 장점을 기초로, 다중의 반복적인 전기생리학적 기록을 수득하는 데 단일 난모세포를 사용할 수 있다. 또한, 난모세포는 통상 내재 채널은 몇 개밖에 발현하지 않으며, 발현은 일부 다른 발현 시스템, 예를 들면 HEK293T 세포에서 나타나는 배경에 비해 높은 배경의 원인이 되는 수준에 미달한다. 따라서 난모세포는 ENaC 나트륨 채널 기능에 대한 목표 화합물의 효과를 반복적으로 직접 측정할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 바람직한 이전극 전압고정 분석법 (하기 실시예 4에서 상세히 예시됨)에서는 ENaC α, β 및 γ 인간 ENaC cRNA (또는 δ, β 및 γ)로 미세주입된 개구리 난모세포가 유리 섬광계수용 바이알에 옮겨지고 ENaC 단백질 발현을 촉진시키는 적절한 조건 하에 인큐베이션된다.
통상 cRNA 미세주입 후 약 24 시간 내인 ENaC 나트륨 이온 채널 발현이 수득된 후, 적절한 이전극 전압 측정 장치, 예를 들면 OpusXpress 6000A 병렬 난모세포 전압고정 시스템 (Axon Instruments)를 사용하는 이전극 전압고정 기법에 따라 ENaC 기능을 측정한다. 상기 이전극 전압고정 기법은 ENaC 나트륨 이온 채널을 통해 난모세포막 전체를 가로질러 흐르는 거시적 전류를 측정한다. 난모세포는 전압-감지 전극 및 전류 감지 전극으로써 천공되고; 전압, 혹은 난모세포막을 가로지르는 전위차는 전압-감지 전극을 사용하여 특정치로 고정되고, 상기 전압을 유지하는 데 필요한 전류, 혹은 난모세포막을 가로지르는 이온 흐름은 전류-감지 전극을 사용하여 측정한다. OpusXpress 시스템은 반자동화되고 8 개의 난모세포로부터 동시에 전기생리학적 기록을 가능하게 하는 워크스테이션을 포함하는 시판되는 이전극 전압 측정 장치의 한 예이다. 상기 시스템은 또한 자동화된 난모세포 찌르기 및 96공 화합물 플레이트로 화합물을 전달하는 컴퓨터-제어된 유체 취급기에 의한 목표 화합물의 전달을 제공한다. 상기 시스템은 주당 약 60 개의 화합물의 평가를 가능하게 하므로, 중간- 또는 적당처리량 시스템으로서 가장 잘 나타낼 수 있다. 물론, 상기한 바와 같이, 다른 전압 측정 장치를 첨가함으로써 더 많은 화합물을 스크리닝할 수 있다.
상기 분석 시스템에서는, ENaC 증강인자는 난모세포막 내 ENaC 채널을 통과하는 전류를 증가시킬 것이다. 이 값은 하기 (실시예 4)에 제공된 표준 식에 의해 산출된다. 그러한 분석법은 또한 적절한 음성 대조 (negative controls), 예를 들면 ENaC 채널을 통한 나트륨 수송을 차단하는 공지된 ENaC 억제제인 아밀로라이드를 포함할 수도 있다. 따라서 상기 화합물은 난모세포가 기능성 ENaC를 발현한다는 것을 확인하기 위한 내부 대조로서 기능하며, 또한 아밀로라이드 억제를 나타내는 난모세포에서는, 아밀로라이드 화합물이 적용된 후 추정 ENaC 증강인자의 스크리닝을 가능하게 하기도 한다 (목표 화합물이 ENaC 증강인자인 경우, 난모세포막 내 ENaC 채널을 통과하는 전류를 증가시킬 것이다).
바람직하게는, 각각의 증강인자에 대해 % 증강 계수 (% enhancement factor)가 산출된다. 예를 들면 100% 증강인자는 기본 대조 값 (화합물 없음)에 비해 ENaC 활성을 100% 증가시킨다.
음성 대조는 또한 바람직하게는, ENaC cRNA가 주입되지 않은 난모세포는 동일한 효과를 나타내지 않는다는 것을 확인하도록 수행된다.
하기 실시예 4에 보다 상세히 거론된 바와 같이, 보다 복잡한 분석법이 최대 % 증강치를 나타내는 화합물에 대해 또한 바람직하게 수행되며, 예를 들면 전류/전압 (I/V) 곡선, 아밀로라이드 경쟁 실험 및 상기 화합물이 반-최대 활성을 나타내는 농도 (EC50 값)을 구하는 투여량-반응 곡선이 있다. 이러한 실험을 화합물의 효과가 ENaC에 특이적이라는 것을 추가로 확인시킬 것이다.
이러한 분석법은 식품, 음료, 의약품 등을 위한 첨가제로서, 이들에 수반된 짠맛을 조절하기 위해 사용될 수 있는 ENaC 조절제, 바람직하게는 ENaC 증강인자의 동정을 제공할 것이다. 바람직하게는, ENaC 증강인자는 20% 이상의 증강계수, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 100% 이상의 증강계수를 나타낼 것이다. 이러한 난모세포 기반 분석법을 비롯하여 이에 수반된 고유 장점에 대해서는 본 출원의 실시예 4에서 보다 상세히 거론될 것이다.
동물 모델
hENaC를 발현하는 동물 모델은 또한 짠맛의 조절제를 스크리닝하는 데 사용된다. 유사하게, 예를 들면 절절한 유전자 목표 벡터와의 동종 재조합, 또는 유전자 과잉발현의 결과로서, 유전자 녹아웃 (knockout) 기술을 포함한 유전자 도입 (transgenic) 동물 기술은 ENaC 단백질의 발현의 부재 또는 증가를 초래할 것이다. 동일한 기술은 또한 녹아웃 세포를 만드는 데 적용될 수 있다. 원하는 경우, ENaC 단백질의 조직-특이적 발현 또는 녹아웃이 필요할 수도 있다. 그러한 방법에 의해 생성된 유전자 도입 동물은 짠맛 자극에 대한 반응의 동물 모델로서 사용된다.
녹아웃 세포 및 유전자 도입 마우스는 동종 재종합을 통한, 마우스 게놈 내 내재 ENaC 유전자 부위로의 마커 유전자 또는 기타 이종 유전자의 삽입에 의해 만들어질 수 있다. 상기와 같은 마우스는 또한 ENaC 유전자의 돌연변이 버전으로 치환하거나, 내재 유전자를 돌연변이 시킴으로써 만들어질 수도 있다.
DNA 구조물은 배아 줄기 세포의 핵 내로 도입된다. 새로 엔지니어링된 유전적 손상을 함유하는 세포가 숙주 마우스 배아 내로 주입되고, 상기 배아는 암컷 수용체 내로 재이식된다. 이들 배아 중 일부는 돌연변이 세포주로부터 부분적으로 유래한 배세포를 갖는 키메라적 마우스로 발전한다. 따라서 키메라적 마우스를 번식시킴으로써, 도입된 유전적 손상을 함유하는 새로운 마우스 세포주를 수득할 수 있다 (예를 들면, Capecchi 등, Science 244:1288 (1989) 참조). 키메라를 목표로 하는 마우스는 Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 및 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson 편저, IRL Press, Washington, D.C., (1987)에 따라 유래될 수 있다.
B. 조절제
ENaC 단백질의 조절제로서 시험하는 화합물은 임의의 유기 소분자, 또는 생물학적 개체, 예컨대 단백질, 예를 들면 항체 또는 펩타이드, 당, 핵산, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임, 또는 지질일 수 있다. 대안적으로는, 조절제는 ENaC 단백질의 유전적으로 변형된 버전일 수 있다. 통상, 시험 화합물은 유기 소분자, 펩타이드, 지질, 및 지질 유사체이다. 바람직하게는 시험 화합물은 인간 소비에 안전하다.
본질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 분석법에서 잠재적 조절제 또는 리간드로서 사용될 수 있으나, 종종 수성 또는 유기 (특히 DMSO계) 용액에 용해될 수 있는 화합물이 사용된다. 상기 분석법은 분석 단계를 자동화하고 임의의 편리한 공급원으로부터 화합물을 분석에 제공하며, 분석을 통상 병렬적으로 수행함으로써 (예를 들면, 로봇을 사용하는 분석법의 미세적정 (microtiter) 플레이트 상에서 미세적정 방식으로), 대형 화학적 라이브러리를 스크리닝하도록 고안된다. ChemDiv (San Diego, CA), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica-Analytika (Buchs Switzerland) 등을 포함한 화학적 화합물의 공급자가 많다는 점에 주목해야 할 것이다.
바람직한 구현예에서는, 중간처리량 또는 고처리량 스크리닝 방법에 상당한 수의 잠재적 ENaC 조절제 (잠재적 활성화제 또는 억제제 화합물)를 함유하는 유기 소분자 또는 펩타이드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 상기와 같은 "화학적 라이브러리"는 이어서 본원에 기술한 바와 같이, 하나 이상의 분석법으로 스크리닝하여, 원하는 특징적 활성을 나타내는 라이브러리 구성원 (특정 화학종 또는 하위부류)를 동정한다. 이와 같이 동정된 화합물은 통상적인 "리드 (lead) 화합물"로 작용할 수 있거나, 화합물 자신이 잠재적 또는 실제 생성물로서 사용될 수도 있다. 언급한 바와 같이, 바람직한 난모세포 이전극 전압고정 시스템 (단일 장치)는 주당 약 60 개의 화합물을 시험할 수 있게 한다.
조합화학적 라이브러리 (combinatorial chemical library)는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해, 시약과 같은 화학적 "빌딩 블록 (building block)"을 다수 조합함으로써 생성된 다양한 화학적 화합물의 수집물이다. 예를 들면, 폴리펩타이드 라이브러리와 같은 선형 조합화학적 라이브러리는 주어진 화합물 길이 (즉, 폴리펩타이드 화합물에선 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 화학적 빌딩 블록 (아미노산)의 셋트를 조합함으로써 형성된다. 수백만 가지의 화학적 화합물이 이러한 화학적 빌딩 블록의 조합적 혼합을 통해 합성될 수 있다.
조합화학적 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 공지되어 있다. 이와 같은 조합화학적 라이브러리는 펩타이드 라이브러리 (예를 들면, 미국특허 제 5,010,175 호, Furka, Int . J. Pept . Prot . Res. 37:487-493 (1991) 및 Houghton 등, Nature 354:84-88 (1991) 참조)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 화학적 다양성의 라이브러리를 생성하기 위한 기타 화학 또한 사용될 수 있다. 그러한 화학에는 펩토이드 (예를 들면, PCT 공보 제 WO 91/19735 호), 코딩된 펩타이드 (예를 들면, PCT 공보 제 WO 93/20242 호), 랜덤 바이오-올리고머 (예를 들면, PCT 공보 제 WO 92/00091 호), 벤조디아제핀 (예를 들면, 미국특허 제 5,288,514 호), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩타이드와 같은 다이버소머 (diversomer) (Hobbs 등, Proc . Nat. Acad . Sci . USA 90:6909-6913 (1993)), 비닐위치 폴리펩타이드 (Hagihara 등, J. Amer . Chem . Soc. 114:6568 (1992)), 글루코스 골격을 갖는 비펩타이드성 펩타이드 유사체 (Hirschmann 등, J. Amer . Chem . Soc . 114:9217-9218 (1992)), 소화합물 라이브러리의 유사 유기 합성 (Chen 등, J. Amer . Chem . Soc . 116:2661 (1994)), 올리고카바메이트 (Cho 등, Science 261:1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (Campbell 등, J. Org . Chem . 59:658 (1994)), 핵산 라이브러리 (Ausubel, Berger 및 Sambrook, 모두 상동, 참조), 펩타이드 핵산 라이브러리 (예를 들면, 미국특허 제 5,539,083 호), 항체 라이브러리 (예를 들면, Vaughn 등, Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) 및 PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리 (예를 들면, Liang 등, Science, 274:1520-1522 (1996) 및 미국특허 제 5,593,853 호 참조), 유기 소분자 라이브러리 (예를 들면, 벤조디아제핀, Baum C&EN, 1월 18일, 33 면 (1993); 이소프레노이드, 미국특허 제 5,569,588 호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국특허 제 5,549,974 호; 피롤리딘, 미국특허 제 5,525,735 호 및 5,519,134 호; 모르폴리노 화합물 미국특허 제 5,506,337 호; 벤조디아제핀 제 5,288,514 호 등 참조)가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 시판된다 (예를 들면, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA 참조). 또한, 수많은 조합 라이브러리 자체도 시판된다 (예를 들면, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, RU, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 등 참조).
개시된 분석법을 사용하여 동정된 ENaC 조절 화합물을 함유하는 식품 및 음료 조성물
개시된 분석법, 예를 들면 실시예에 기술된 전기생리학적 (이전극 전압고정 기법) 분석법 및 형광발광 세포 기반 분석법을 사용하여 동정된 화합물은 섭취가능한 조성물, 즉 식품 및 음료를 비롯하여 경구투여되는 의약품의 성분 또는 향미제로서 잠재적으로 유용하다. 짠맛 지각을 조절하거나 증강시키는 화합물은 식품 또는 음료의 향미제로서 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 바람직한 용도로는, 상기 조절제가 감소된 수준의 나트륨과 함께 식품 또는 음료에 혼입되며, 수득된 제품의 짠맛은 고나트륨 제품의 맛과 유사할 것이다. 그러한 식품 및 음료의 예로는 무엇보다도 프렛℃, 감자칩, 크래커와 같은 스낵 식품, 수프, 딥소스, 청량음료, 포장 육류제품이 포함된다.
대안적으로는, 짠맛 지각을 차단하거나 억제하는 화합물은 자연적으로 고농도의 염분을 함유하는 식품에서, 짠맛을 차단하거나 위장하기 위한 성분 또는 향미제로서 사용될 수 있다.
그러한 화합물(들)의 양은 짠맛 지각을 원하는 정도로 제공할 양이 될 것이다. 물론, 그러한 용도에 사용되는 화합물은 인간 소비에 안전하고 인간의 미각 시험에서 허용가능해야 할 것이다.
페나밀 또는 대등물을 사용하는 바람직한 분석법 구현예
위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구현예들 중 하나는, 기능성 ENaC를 발현하는 시험 세포를 막전위 색소의 존재 하에 하나 이상의 추정 조절제 화합물과 접촉시키고, 바람직하게는 그전에 상기 시험 세포를 ENaC 기능을 조절 (억제)하는 것으로 알려진 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 페나밀과 같은 아밀로라이드 유도체와 접촉시키고, 상기 시험 세포에 의해 발현된 ENaC의 활성을 관찰하여 ENaC 조절 정도를 결정하는 것을 포함한다. 언급한 바와 같이, 시험 화합물 전에 ENaC 억제제를 첨가하는 것은 분석 결과를 개선한다. 이러한 억제제, 예를 들면 페나밀은 적어도 부분적으로 ENaC 기능을 억제하는 농도로 사용된다. 상기 방법은, 추정 조절제 화합물을 짠맛 지각에 대한 생체내 효과에 대해 평가하는 것 (예를 들면, 짠맛 지각에 대한 생체내 효과를 결정하기 위해 시식 실험을 수행함)을 추가 포함한다. 예를 들면, ENaC 서브유닛을 코딩하는 cDNA는 인간 신장세포 cDNA, 인간 폐세포 cDNA 또는 인간 미각세포 cDNA로부터 클론된다. 상기 언급된 바와 같이, 자연적 ENaC는 세 개의 서브유닛 (알파 또는 델타, 베타 및 감마)으로 이루어진 다량체 단백질이다. ENaC는 구성적으로 활성인 Na+ 선택적 양이온 채널로서 기능하며, 미뢰 및 기타 조직에서 발견되며, 짠맛의 생리학적 지각의 기초를 이루는 인간 염분 수용체의 후보이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서는, 상기와 같은 방법이 멀티-웰 플레이트 및 형광 강도 플레이트 판독기 (예를 들면, Aurora Biosciences VIPR 기기 또는 Molecular Device의 FLIPR 기기)를 사용하여 고처리량 분석법 형식으로 수행된다. 시험 세포는 접종되고, 색소부하되고, 경우에 따라 바람직하게는 먼저 시험 세포를 공지된 ENaC 억제제와 ENaC 기능이 적어도 부분적으로라도, 바람직하게는 가역적으로 억제되는 농도로 접촉시키고, 그 후 상기 시험 세포를 하나 이상의 시험 화합물과 접촉시키고, 동일한 멀티-웰 플레이트에서 형광 강도를 관찰한다. 이와 같은 분석 형식은 ENaC 기능의 활성 또는 억제를 모두 신뢰성있게 검출할 수 있어서, 채널 활성을 증강시키거나 차단할 수 있는 화합물에 대한 활발한 스크리닝을 제공한다. 상기한 분석법은 ENaC 증강인자를 동정하도록 최적화되었다. 따라서 본원에 기재된 분석법은 상기 언급한 것들과 같은 기존의 분석법에 비해, 인간 ENaC가 활용되고, 포유류 세포가 사용되며, 분석이 표준 멀티-웰 (96, 384 또는 1536공) 플레이트에서 고처리량 방식으로 수행될 수 있다는 점에서 유리하다 (그러나, 상기 거론한 바와 같이, 포유류 세포는 몇몇 단점적인 특성을 갖는데, 예를 들면 내재 이온 채널을 원치않는 배경 수준을 초래하는 수준으로 발현할 수 있다).
본 발명의 이러한 바람직한 구현예에서는, 적어도 ENaC의 알파 (또는 델타) 서브유닛을 기능적으로 발현하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포가 제조될 것이다. 바람직한 구현예에서는, hENaC의 세 서브유닛 모두 (α 또는 δ, β 및 γ)가 일시적으로 또는 안정적으로 발현된다. 사용되는 ENaC 서브유닛(들)은 천연 발생 형태, SNP 함유 변형체, 교대접합된 형태, 조합된 형태 또는 당업계에 공지된 임의의 기능성 변형체일 수 있다 (예를 들면, 접수번호 P37088, P51168, P51170, 및 P51172 참조). 바람직하게는, ENaC는 서열번호 1, 2, 3의 핵산 서열에 의해 코딩되는 인간 알파, 베타 및 감마 ENaC 서브유닛, 또는 서열번호 2, 3 및 7에 의해 코딩되는 인간 베타, 감마 및 델타 ENaC 서브유닛으로 이루어질 것이다. 포유류 세포는 당업계에 공지된 임의의 유형, 예컨대 COS, CHO, BHK, MDCK, HEK293 또는 HEK293T (대형 T-세포 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 HEK293T이다. 상기 세포는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대 Ca2 + 포스페이트 또는 지질계 시스템 (그러나 여기에 국한되지 않는다), 또는 전에 언급된 방법을 사용하여 트랜스펙션될 수 있다.
이들 트랜스펙션된 세포는 이어서 바람직하게는 멀티-웰 배양 플레이트에 접종된다. 이어서 약 70% 이상의 융합, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상의 융합에 도달하기에 충분한 시간 동안, 또는 화합물 첨가로 인한 가능한 유체 교란을 견디기에 충분하도록 조밀한 세포층을 형성하기에 충분한 시간 동안 기능적 발현을 진행시킨다. 일반적으로, 24 시간 이상의 인큐베이션 시간으로 충분할 것이나 더 길수도 있다. 상기 세포를 이어서 세정하여 증식 배지를 제거하고, 접종된 세포의 원형질막을 사이에 두고 색소가 평형을 이루기에 충분한 시간 동안 막전위 색소와 함께 인큐베이션 시킨다. 당업자는 색소 부하 조건이 세포 유형, 색소 유형, 인큐베이션 파라미터 등과 같은 요소에 의존적이다. 한 구현예에서는, 약 2 μM 내지 약 5 μM의 최종 농도로 사용될 수 있다. 또한, 최적의 색소 부하 시간은 대부분의 세포에 대해 37℃에서 약 30 내지 약 60 분의 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 막전위 색소는 Molecular Devices (cat# R8034)에서 입수한 것이다. 다른 구현예에서는, 적절한 색소는 예를 들면 DiBAC, DiSBAC (Molecular Devices) 및 Di-4-ANEPPS (Biotium)와 같은 단일파장계 색소, 또는 DiSBAC2, DiSBAC3 및 CC-2-DMPE (Aurora Biosciences)와 같은 이중파장 FRET계 색소가 포함된다 [화학물질명 - Di-4-ANEPPS (피리디늄, 4-(2-(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필))-, 히드록사이드, 내부염), DiSBAC4(2) (비스-(1,2-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), DiSBAC4(3) (비스-(1,3-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), CC-2-DMPE (Pacific Blue™ 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세롤-3-포스포에타놀아민, 트리에틸암모늄 염) 및 SBFI-AM (1,3-벤젠디카르복실산, 4,4'-[1,4,10-트리옥사-7,13-디아자시클로펜타데칸-7,13-디일비스(5-메톡시-6,12-벤조푸란디일)] 비스-, 테트라키스[(아세틸옥시)메틸]에스테르].
한 구현예에서는, 색소 부하된 세포는 바람직하게는 공지된 ENaC 억제제, 예를 들면 페나밀과 접촉되고, 이어서 시험 화합물 (또는 대조)과 접촉되고, 세포 배양은 VIPR 또는 FLIPR
Figure 112006001007985-PCT00001
와 같은 표준 형광 분석 장비를 사용하여 관찰된다. NaCl 또는 ENaC에 약리학적으로 작용하는 기타 시험 화합물의 첨가는 막전위의 변화를 유발하고, 이는 이어서 표준 형광 강도 플레이트 판독기 (예를 들면, FLIPR) 또는 전압 강도 플레이트 판독기 (예를 들면, VIPR)에서 휴면 형광발광의 변화로서 검출된다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 형광발광을 통해 시험 세포에서의 ENaC의 활성을 관찰함으로써 짠맛 조절 화합물을 동정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 형광발광의 감소는 미각 (짠맛) 차단제를 지시할 수 있는 반면, 형광발광의 증가는 미각 (짠맛) 증강인자를 지시할 수 있다.
본 발명을 개괄적으로 기술하였으나, 본 발명은 하기의 실시예를 참고로 하면 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 개시된 예시적 구현예는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변화가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
도 1 은 hENaC의 기능적 발현으로 인한 나트륨 의존성 아밀로라이드 민감성 형광발광의 변화를 도시한다. 인간 신장 ENaC의 α, β 및 γ 서브유닛 플라스미드를, 1:1:1 비율을 변화시키면서 HEK293T 세포에 트랜스펙션시키면, 모의 트랜스펙션된 (mock transfected) 세포에 비해 Na+ 의존성 아밀로라이드 민감성 전압 변화 가 나타난다. A, B, C 및 D는 각각 111:1 정량의 α, β 및 γ 플라스미드로써 4.4.1. 및 0.25의 절대 수준으로 트랜스펙션되었다. E 및 F는 Beta-gal 및 pUC로써 모의 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 효율은 대략 40%였고, 세포 밀도는 대략 70%였다. 모든 선은 A (n=4), B, C, D, E (n=12) 및 F (n=8)를 갖는 단일 플레이트에서 비롯된 것이다.
도 2 는 hENaC α, β 및 γ를 발현하는 HEK293T 세포의 NaCl 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 3 은 50 mM NaCl로 처리된 hENaC α, β 및 γ를 발현하는 HEK293T 세포의 아밀로라이드 투여량-반응 관계를 도시한다.
도 4 는 ENaC를 발현하는 HEK293T 세포의 NaCl 투여량-반응 관계를 전압 영상화 플레이트 판독기 (voltage imaging plate reader; VIPR)를 사용하여 도시한다. HEK293T 세포를 ENaC 서브유닛 발현 플라스미드 (ENaC) 또는 캐리어 플라스미드 (모의 (Mock))로써 트랜스펙션시켰다. 24 시간 후, 세포에 막전위 색소를 부하시켰고, Na+ 자극에 대한 반응인 세포 형광발광의 변화를 VIPRII (Aurora Biosciences)로써 관찰하였다. ENaC를 발현하는 세포만이 Na+ 농도 증가에 대해 반응하여 변화를 나타내었다.
도 5 또한 인간 ENaC를 발현하는 HEK293T 세포의 NaCl 투여량-반응 관계를 도시한다. HEK293T 세포를 ENaC 서브유닛 발현 플라스미드 (ENaC)로써 트랜스펙션시켰다. 24 시간 후, 세포에 막전위 색소를 부하시켰고, Na+ 자극에 대한 반응인 세포 형광발광의 변화를 VIPRII (Aurora Biosciences)로써 관찰하였다. ENaC 안타고니스트인 페나밀은 형광발광에서의 Na+-유발된 변화를 억제하였다. 반대로, ENaC 증강인자인 화합물 "X"는 형광발광에서의 Na+-유발된 변화를 증가시켰고, 이 효과는 페나밀에 의해 억제되었다.
도 6 은 ENaC 활성에 대한 페나밀의 농도 증가의 효과를 나타낸다. 청색 선: 페나밀에 의한 ENaC 활성의 억제. 적색 선: ENaC 증강인자인 화합물 478354 100 μM의 존재 하에서의 페나밀에 의한 ENaC 활성 억제. 흑색 상자는 페나밀의 부재 하에서의 화합물 478354의 효과를 나타내는 데이터를 포함한다. 황색 상자는 증가하는 농도의 페나밀의 존재에 의해 증강된 478354 효과를 나타내는 데이터를 포함한다.
도 7A. 페나밀의 부재 하에서의 Z'의 분포. "Z'"는 1 - ((3×ENaC의 표준 편차는 화합물 478354의 존재 하에서의 ENaC 반응의 3×표준 편차에 반응한다)/(478354의 존재 하에서의 평균 ENaC 활성 - 평균 ENaC 활성))으로 정의된다. 대부분의 Z' 값은 0 미만이며, 이는 고급 대조군에서 사용되는 경우 479354가 의미있는 분석창 (assay window)을 제공하지 못함으로 의미한다.
도 7B. 0.5 μM 페나밀의 존재 하에서의 Z'의 분포. Z1 은 1 - ((3×ENaC 반응의 표준 편차 + 3×478354의 존재 하에서의 ENaC 반응의 표준 편차)/(478354의 존재 하에서의 평균 ENaC 활성 - 평균 ENaC 활성))으로 정의된다. 대부분의 Z1 값은 > 0 및 ≤ 1 이며, 이는 고급 대조군으로서, 478354가 페나밀의 존재 하에 의미 있는 분석창을 제공할 수 있음을 의미한다.
도 8 은 ENaC 활성을 증가시키는 화합물에 대한, 인간 ENaC cRNA가 주입된 난모세포 스크리닝의 일례를 도시한다. 각각의 선별된 화합물에 대해, % 증강 계수를 산출한다. 상기 값은 화합물로 인한 전류 변화의 크기 나누기 아밀로라이드로 인한 전류 변화의 크기 곱하기 -100% 와 같다. 본 예에서는 두 개의 화합물이, 가능한 최대 8 개 중 7 개의, OpusXpress 시스템에서 -60 mV로 전압고정된 난모세포에서 차례로 선별된다. 모든 7 개의 난모세포가 ENaC를 발현하며, 이는 측정된 난모세포 전류에 대한 아밀로라이드의 억제 효과에 의해 증명된다.
도 9 는 인간 ENaC cRNA가 주입된 난모세포 각각에 대해 % 증강 계수가 어떻게 산출되는지를 보여주는 일례를 도시한다. % 증강 계수가 각각의 화합물에 대해 구해지고, 선별되고, 평균 내어지고, 표준 편차가 구해진다. 이 경우, 화합물 1 및 화합물 2는 도 8에서 2 내지 8로 번호 매겨진 세포에서 선별된 화합물과 일치한다.
도 10 은 인간 hENaC cRNA가 주입되지 않은 난모세포를 선별하는 일례이다. 화합물들은 난모세포 세포막에서 내재적으로 발현되는 이온 채널의 활성에 대한 효과가 없으며, 이는 화합물 활성이 ENaC-의존성이고 ENaC 채널을 통해 흐르는 거시적 나트륨 전류의 증가에 기인함을 도시한다. 또한 상기 도면은 아밀로라이드가 ENaC 나트륨 채널 발현의 부재로 인해 주입되지 않은 난모세포에 대해서는 효과가 없음을 나타낸다.
도 11 은 화합물의 존재 또는 부재 하에서의 인간 ENaC cRNA가 주입된 난모 세포 또는 주입되지 않은 난모세포에서의 I/V 곡선의 일례를 도시한다. 주입된 난자에서는 화합물이 I/V 곡선의 기울기를 증가시키는 반면, 주입되지 않은 난모세포에서는 화합물이 I/V 곡선의 기울기에 대해 효과가 없다 (즉 화합물의 존재 및 부재 하에서의 곡선이 동일하다).
도 12 는 아밀로라이드 경합 실험의 일례를 도시한다. 인간 ENaC cRNA가 주입된 난모세포에서는 아밀로라이드 및 화합물을 함께 가해도 ENaC 채널을 통해 흐르는 나트륨 전류를 증강시키지 않는다. 이는 화합물이 ENaC 채널에 직접 작용함을 나타내며; ENaC 채널이 아밀로라이드에 의해 닫힌 경우, 화합물은 ENaC 기능을 증강시키지 못한다.
도 13 은 인간 ENaC cRNA가 주입된 난모세포에서의 2 종의 화합물에 대한 투여량-반응 곡선의 일례를 도시한다. 화합물 A는 화합물 B에 비해 효력이 덜한데, 이는 더 큰 EC50 (화합물 B의 0.47 μM에 비해 화합물 A는 5.4 μM) 및 오른쪽으로 치우친 투여량-반응 곡선에 의해 증명된다.
도 14 는 이전극 전압고정 (two-electrode voltage clamp; TEVC) 기법을 사용하는, 난모세포 발현 시스템에서의 인간 ENaC 활성에 대한 화합물의 효과를 검사하기 위해 사용된 실험 세트를 도식적으로 나타낸다.
실시예 1
인간 미각 세포에서 발현되는 인간 ENaC의 알파, 베타 및 감마 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열을 RT-PCR에 의해 인간 신장 세포로부터 클론하였다.
인간 상피 나트륨 채널 서브유닛 DNA 서열 ( ENaC )을 클론하는 방법
α, β 및 γ ENaC에 대한 인간 ENaC cDNA를 각각 PCR에 의해 하기 프라이머 짝을 사용하여 인간 신장 cDNA (Origene Technologies Inc.)로부터 증폭시켰다: 5'CGC GGA TCC GCC CAT ACC AGG TCT CAT G 3' 및 5' CCG GAA TTC CTG CAC ATC CTT CAA TCT TGC 3'; 5' CGC GGA TCC AGC AGG TGC CAC TAT GCA C 3' 및 CCG CTC GAG GTC TTG GCT GCT CAG TGA G 3'; 5' CGC GGA TCC CCT CAA AGT CCC ATC CTC G 3' 및 5' CCG GAA TTC GAC TAG ATC TGT CTT CTC AAC 3'. 프라이머는 내재 번역 개시 시그널을 유지하기 위해 5' 및 3'-미번역 구역 서열에 대해 상보적이도록 디자인하였고, 기능성 발현 실험을 위해 포유류 발현 벡터 pcDNA3 (Invitrogen) 내로, 증폭된 ENaC cDNA를 클론하는 데 사용된 말단 제한 엔도누클리에이즈 부위를 도입하였다. 클론된 ENaC cDNA를 시퀀싱하고 공개 DNA 데이터뱅크의 ENaC 서열과 비교하였다. 각각의 클론된 서브유닛은 상이한 데이터뱅크 대립유전자에 존재하는 다형체 (polymorphism)의 복합물이다; 즉, 클론된 서브유닛과 데이터뱅크 대립유전자의 짝을 이룬 비교에 의해 동정된 각각의 클론된 서브유닛의 모든 다형체는 다른 데이터뱅크 대립유전자에서도 발견할 수 있었다. 또한, 클론된 ENaC 서브유닛에서의 다형체는 독립적인 PCR 실험에서 증폭된 클론된 cDNA의 시퀀싱에 의해 확인되었다.
클론된 서열 알파, 베타 및 감마 hENaC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 함유되며, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 4, 5 및 6에 함유된다. 이들 DNA 서열은 각각 발현벡터 pcDNA3에 삽입하여, 인간 ENaC 서브유닛 폴리펩타이드를 발현하는 알파, 베타 및 감마 서브유닛 플 라스미드를 제조하였다. 또한, 인간 아밀로라이드 민감성 나트륨 채널 델타 서브유닛 (ΔNaCh)에 대한 핵산 서열은 서열번호 7에 함유되며, 이는 ENaC 알파 서브유닛에 대등하게 기능한다. 델타 서브유닛에 대한 아미노산 서열은 서열번호 8에 함유된다. HEK293T 세포를 중량비 1:1:1의 인간 ENaC를 발현하는 α, β 및 γ 서브유닛 플라스미드로써, Ca2 + 포스페이트를 통해 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 이러한 트랜스펙션은 모의-트랜스펙션된 세포에 비해 Na+ 의존적 아밀로라이드 민감성 형광 변화를 초래하였다. 도 1을 참조하면, 샘플 A, B, C 및 D를 1:1:1 비율의 α, β 및 γ 서브유닛 플라스미드로써, 각각 4, 4, 1 및 0.25 마이크로그램의 절대 수준으로 트랜스펙션시켰다. 샘플 E 및 F는 Beta-gal 및 pUC DNA로써 모의 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 효율은 대략 40%였고, 세포 밀도는 대략 70%였다. 세포는 FLIPR I (Molecular Devices) 장비를 사용하여 막전위 형광 색소를 사용하여 분석하였다. 모든 나타내어진 선은 A (n=4), B, C, D, E (n=12) 및 F (n=8)를 갖는 단일 플레이트로부터 나온 것이다.
도 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 휴지전위 (resting potential)의 나트륨-의존적 아밀로라이드-민감성 변화 (hENaC 반응)는 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포에 그다지 영향을 미치지 않았다. 또한, 그러한 휴지전위 변화는 hENaC의 알파 서브유닛만으로 트랜스펙션된 세포 (데이터 나타나지 않음)에 비해 hENaC의 세 서브유닛 모두로 트랜스펙션된 세포에서 현저히 증강되었다. 더욱이, NaCl의 막전위 변화를 유도하는 능력, 및 아밀로라이드의 hENaC 채널 활성을 차단하는 효과는, 저 처리량 전기생리학적 기록을 사용하는 문헌에 보고된 것과 유사한 투여량-반응 관계를 따른다.
실시예 2
각각 서열번호 1, 2 및 3인 인간 ENaC의 알파, 베타 및 감마 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열을 각각 발현 벡터 pcDNA3로 클론하여, 인간 ENaC 서브유닛 폴리펩타이드를 발현하는 알파, 베타 및 감마 서브유닛 플라스미드를 제조하였다. HEK293T 세포를 1:1:1 중량비의 인간 ENaC 발현 α, β 및 γ 서브유닛 플라스미드 (2 μg의 각 서브유닛/2천만 개의 세포)로써 리포펙션 (lipofection)을 통해 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 384공 플레이트에서 평판배양 시키고, 전압-민감성 형광 색소를 사용하여 VIPRII 장비 (Aurora Biosciences)로 분석하였다. ENaC를 발현하는 세포는 모의 트랜스펙션된 세포에 비해 Na+-의존적 형광발광 변화를 나타내었다 (도 1). 도 2 에서는, Na+-의존적 형광발광 변화가 공지된 ENaC 안타고니스트인 페나밀에 의해 완전히 폐지된다. 반대로, 또다른 화합물은 Na+-의존적 형광발광 변화를 증가시키는 것으로 발견되었으나, 이 효과는 페나밀에 의해 무효화된다. 이 화합물은 본 ENaC 기능에 대한 분석법에서 페나밀에 반하도록 작용하므로, ENaC 증강인자인 것으로 여겨진다.
실시예 2를 위한 방법 및 물질:
1. 모든 사용된 물질은 하기에 "물질 부문"에서 확인된다.
2. HEK293T 세포는 80% 융합에 이르도록 증식시키고, 배양 접시로부터 효소 용액 (트립신/EDTA)으로써 37℃에서 3 분간 분리시켰다. 분리된 세포는 벤치톱 유세포분석기 (bench top flow cytometer) (Guava; Guava Technologies)를 사용하여 밀도 및 생존능력에 대해 분석하였다. 생존능력이 85% 미만인 세포는 실험에서 폐기하였다.
[본원의 절차는 384공 플레이트를 10회 스크리닝 (200,000,000 개의 세포)하는 것과 대등한 정도의 HEK293T 세포의 트랜스펙션을 위한 조건이다. 이러한 조건은, 예를 들면 다양한 크기의 멀티-웰 플레이트 등을 사용함으로써 세포 융합도 (confluency)를 증가 또는 감소시킴으로써 변경될 수 있다.]
3. 분리된 세포를 세정하고 약 1,000,000 세포/ml 의 밀도로 배지 (완전) 중에 회수한다. 인간 ENaC 서브유닛을 코딩하는 포유류 발현 플라스미드 DNA를 동등한 비율 (10 μg의 α; 10 μg의 β 및 10 μg의 γ/20,000,000 개의 세포)로 에펜도르프 튜브 내에서 혼합한다. 이어서 170 μg의 캐리어 플라스미드 DNA (pUC-18)를 상기 DNA 혼합물 (총 200 μg의 DNA/200,000,000 개의 세포에 대해)에 첨가한다. 557 μl의 트랜스펙션 시약 TransIT (Panvera Corporation)을 혈청과 항생제를 제거한 배지 20 ml에 첨가한다. 이어서 DNA 용액을 TransIT 용액에 첨가하고, DNA-지질 용액을 실온에서 인큐베이션한다. 60 분 후, 상기 DNA-지질 복합체를 세포 용액으로 옮기고, 부피를 완전 세포 배지로써 320 ml가 되도록 조정하여, 최종 밀도가 635,000 개의 생존가능한 세포/ml가 되게 한다 (앞서 거론하였듯이, 알파 서브유닛 DNA는 델타 서브유닛 DNA와 상호교환될 수 있으며 베타, 감마 및 델타 ENaC 서브유닛으로 이루어진 기능성 ENaC를 발현하는 재조합 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다).
4. 블랙 384공 폴리-D-라이신 투명 바닥 스크리닝 플레이트 (Becton Dickinson)를 40 μl/웰의 Matrigel 용액 (20 μg/ml; Collaborative Biomedical Products)으로써, 실온에서 1 시간 동안 코팅한다. 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 세포 평판배양 시까지 실온에서 보관한다.
5. 세포/DNA 용액을 Multidrop으로써 384공 플레이트에, 50,000 세포/웰 (80 μl/웰)의 밀도로 평판배양한다.
6. 평판배양 후 27 시간 후, 세포를 세정하고, 막전위 민감성 색소 (CC2-DMPE 및 DiSBAC2(3))로 하기한 바와 같이 부하시킨다.
7. 세포를 200 μM의 화합물 ([2×])로 자극하고, 전압 강도 플레이트 판독기 (VIPRII; Aurora Biosciences Corporation)를 사용하여 온라인으로 판독한다. 분석에서 화합물을 다른 농도로 사용할 수도 있다. 완충제 제조 및 플레이트 배열은 VIPR에서 하기한다. 분석은 "실온"에서, 통상적으로 약 22℃에서 수행하나, 화합물의 첨가 전에 세포 및 시약을 예열하거나 냉각시켜서 다른 온도에서 수행할 수도 있다.
물질
1. 150 ㎠ 플라스크 (Becton Dickinson 0.2 ㎛ 환기되는 Blueplug 밀봉캡) 상에서 증식하는 HEK293T 세포 (37℃, 6% CO2)
2. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (cat#11965-092 Gibco BRL) (4℃에서 보관)
3. HEPES 첨가 DMEM (DMEMH) (cat#12430-054, Gibco BRL) (4℃에서 보관)
4. 소태아 혈청 (FBS) (cat#10082-147, Gibco BRL) (-20℃에서 보관)
5. 트립신 EDTA (1×) (cat#25200-072 Gibco-BRL) (-20℃에서 보관)
6. TransIT-293 (cat#MIR2705, Panvera) (4℃에서 보관)
7. α, β 및 γ ENaC DNA 제제 (각각 1 μg/μl) (4℃에서 보관)
8. pUC18 캐리어 DNA (1 μg/μl) (4℃에서 보관)
9. Matrigel (cat#40230, Collaborative Biomedical Products)
2. 세포 부하
HBSS - Hank 완충식염수
DiSBAC2(3) 100% DMSO 중 5 mM 2.5 μM
ESS-CY4 또는 VABSC-1 dH2O 중 200 mM 350 μM
VIPR NMDG 완충제 - 하기 "VIPR 플레이트 배열" 부분의 제형 참조
맞출 부피
성분 10 ml 50 ml 100 ml 200
CC2-DMPE (℃) 20 100 200 400
플루로닉 (℃) 20 100 200 400
HBSS (℃) 10 50 100 200
DiSBAC2(3) (℃) 5 25 50 100
ESS (℃) 17.5 87.5 175 350
VIPR NMDG 완충제 (ml) 10 50 100 200
CC2-DMPE 부하 완충제의 제조
1. 동일한 부피의 CC2-DMPE 저장용액 및 플루로닉 F127을 혼합한다.
2. CC2-DMPE/플루로닉 혼합물을 HBSS에 볼텍스 (vortex) 교반과 함께 첨가한다.
CC2-DMPE로 세포 부하
1. CO2 인큐베이터로부터 세포를 꺼낸다.
2. 밀도/웰에 변화가 있는지 살핀다.
3. HBSS로 EMBLA를 프라이밍한다.
4. 세포를 HBSS 3×80 μl 로 세정하여 잔류 증식 배지 및 혈청을 제거한다.
5. 40 μl의 10 μM CC2-DMPE 부하 완충제를 각 웰에 첨가한다.
6. 밀도/웰에 변화가 있는지 살핀다.
7. 암실 내 실온에서 30 분간 인큐베이션한다.
DiSBAC2(3) 부하 완충제의 제조
(CC2 인큐베이션 중에 수행할 수 있다)
1. DiSBAC2(3) 및 ESS-CY4 또는 VABSC-1, 및 두 배 부피의 DiSBAC2(3)의 플루로닉 F127을 혼합한다.
2. 상기 혼합물을 VIPR NMDG 완충제에 첨가하고 볼텍스 교반한다.
DiSBAC2(3) 부하 완충제로 세포 부하
1. NMDG 완충제로 EMBLA를 프라이밍한다.
2. CC2-DMPE-부하된 세포를 VIPR NMDG 완충제를 세정용 완충제로 사용하여 세정한다, 3×80 μl/웰
3. 40 μl의 2.5 μM DiSBAC2(3), 350 μM ESS-CY4 또는 VABSC-1 부하 완충제를 각 웰에 첨가한다.
4. 밀도/웰에 변화가 있는지 살핀다.
5. VIPR II에서 실험하기 전 암실 내 실온에서 20 분간 인큐베이션한다.
VIPR 플레이트 배열
Figure 112006001007985-PCT00002
실시예 3
ENaC 억제제 ( 페나밀 )을 사용하는 개선된 ENaC 분석법
세 개의 상이한 ENaC 서브유닛을 발현하는 인간 배아 신장 (HEK)293 세포에서 ENaC 기능의 조절을 관찰한다. HEK293 세포를 지질계 시스템을 사용하여 ENaC 서브유닛 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 HEK293 세포를 384공 스크리닝 플레이트로 접종하고, ENaC의 기능적 발현을 총 24 시간 동안 진행시킨다. 이어서 세포를 특정 색소 (예컨대 DisBac2(3) 및 CC2-DMPE, Panvera)로 표지하여, 막전위의 미세한 변화를 검출할 수 있게 한다. ENaC 기능의 조절 시 색소 형광발광 특성의 변화를 전압-고정-플레이트-판독기 (VIPR, Panvera)를 사용하여 관찰한다. 상기 기술을 사용하여, 공지된 ENaC 억제제 페나밀 (도 6, 청색 선)의 증가하는 농도로써 ENaC 기능 (Na+-유도된, 막전위 색소 형광발광의 변화)의 억제를 검출할 수 있다. 반면 ENaC 증강인자 (ID # 478354)는 ENaC 활성을 대략 18%만큼 증가시킨다 (도 6, 흑색 직사각형 내 적색 및 청색 데이터 포인트 간의 차이). 주목할 것은, 화합물 478354의 효과가 페나밀의 농도 증가 (도 6, 황색 직사각형 내 적색 및 청색 데이터 포인트 간의 차이)에 의해 크게 개선된다는 것이다. 이러한 조건 하에서, 478354는 0.2 내지 0.5 μM의 페나밀의 존재 하에서 ENaC 활성을 50 내지 60%만큼이나 증가시킨다. 0.5 μM의 페나밀의 부재 및 존재 하에서 각각 241 회 및 835 회 이상의 독립적인 실험을 수행하였다 (도 7A 및 도 7B). 이 실험 중, Z' 인자를 사용하여 분석창 (assay window)에 대한 478354의 효과를 구하였다. Z'는 고급 및 저급 대조군의 분리를 이들의 변이량 (variance)에 대해 정량화함으로써 시그널 창의 양을 결정하는 데 사용되는 통계학적 파라미터이다. A Z' ℃ 0 및 ℃ 1 은, 스크리닝 중에 시험한 화학을 비교할 수 있는 의미있는 시그널 창을 나타낸다. 페나밀의 부재 하에서, 478354 고급 대조 표준에 의해 결정된 시그널 창은 90% 초과의 실험에서 실패하였다 (도 2A). 그러나, 페나밀의 존재 하에서, 478354는 85%의 실험에서 시그널 창을 현저히 증가시켰고, 대부분의 Z'는 0.26을 중심으로 존재하였다 (도 2B).
이러한 결과는, 하나 이상의 잠재적 ENaC 조절제, 예를 들면 ENaC 증강인자로써 스크리닝하기 전의 페나밀과 같은 ENaC 억제제의 사용은 시그널 강도를 증강시켜서, 처리량 세포 기반 분석법에서 ENaC 활성을 증강시키는 분자를 동정할 확률을 현저히 개선시킴을 나타낸다.
실시예 4
기능성 인간 ENaC 를 발현하는 양서류 난모세포를 사용하는 ENaC 조절제 동정을 위한 전기생리학적 분석법
난모세포 발현 시스템은 ENaC 채널을 통한 나트륨 수송에 대한 화합물의 효과를 검사하는 데 유용하게 하는 고유한 장점 (발현 수준, 확실한, 낮은 내재 이온 채널 발현 등)이 있다. 이들 화합물은 염분 맛 지각을 증강시키는 후보물질이다. 난모세포 발현 시스템은 앞서 기능성 연구에서 ENaC를 포함한 이온 채널의 신속하 고 확실한 발현을 위해 사용되어 왔다 (Dascal, CRC Crit . Rev. Biochem . (1987) 22(4):317-387; Wagner 등, Cellular Physiology and Biochemistry (2000) 10:1-12; Canessa 등, Nature (1994) 367:463-467). 따라서 상기 시스템을 하기한 방법 및 물질을 사용하는 이전극 전압고정 분석법에서 사용하도록 선택하였다.
난모세포 발현 시스템은 하기 단계 및 방법론으로 이루어지며, 전체적으로는 ENaC 증강인자의 선별; 개구리 외과처치 및 난모세포 단리, cRNA 제조, 난모세포 미세주입, 및 이전극 전압고정 생리학적 기록을 사용한 난모세포에서의 ENaC 전류 측정을 포함한다. 하기 참고문헌은 개구리 외과처치 및 난모세포 단리에 대한 일반적 절차를 기술한다 (Marcus-Sekura 등, Methods in Enzymology (1987) 152:284-288; Goldin, Methods in Enzymology (1992) 207:266-279), cRNA 제조 (Swanson 등, Methods in Enzymology (1992) 207:310-319; Goldin 등, Methods in Enzymology (1992) 207:279-297), 난모세포 미세주입 (Matten 등, Methods in Enzymology (1995) 254:458-466; Hitchcock 등, Methods in Enzymology (1987) 152:276-284), 및 이전극 전압고정 전기생리학적 기록 (Stuhmer, Methods in Enzymology (1992) 207:319-339; Wanger 등, Cellular Physiology and Biochemistry (2000) 10:1-12). 이들 방법론은 각각 ENaC 증강인자의 선별에 관계된 것이며 하기에 더욱 상세히 기술한다.
개구리 외과처치 및 난모세포 단리
길이가 9 cm 이상인 암컷 제노푸스 라에비스 남아프리카산 발톱개구리를 NASCO (Fort Atkinson, WI)로부터 입수한다. 개구리를 증류수 중의 0.15% MS-222 (트리케인 또는 에틸-3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트; Sigma)로 마취시키고 얼음 위에 놓는다. 멸균 수술기구를 사용하여, 복부에 외표피층 및 내복강층 모두에 걸쳐 1 내지 2 cm로 순차적으로 절개한다. 절제한 난소구 (1000 내지 2000 개의 난모세포를 함유)를 OR-2 무칼슘 배지 (82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, NaOH 함유 5 mM HEPES pH 7.5)에 놓고, 실온에서 진탕 플랫폼 (rockign platform) 상에서 사용 직전에 제조한 2 mg/ml 콜라게네이즈 타입 IA (Sigma)로써 45 분간, 이어서 1 mg/ml 콜라게네이즈 타입 IA로써 15 분간 순차적으로 소화시킨다. 효소적 소화 후, 이 시점에는 대부분의 난모세포가 난소구로부터 배출되고, 난모세포를 콜라게네이즈 없이 OR-2로 헹구고, 2.5 mM 나트륨 파이루베이트가 보충된 Barth 식염수 (88 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.82 mM MgSO4, 0.33 mM Ca (NO3)2, 0.41 mM CaCl2, 2.4 mM NaHCO3, 및 5 mM HEPES pH 7.5; Specialty Media)를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다. 멜라닌 안료 과립을 함유하는 난자의 어두운 면 (dark side)에 해당하는, 뚜렷한 동물극 (animal pole), 및 난황 단백질을 함유하는 난자의 밝은 면 (light side)에 해당하는 식물극 (vegetal pole)을 함유하는 성숙단계 V 또는 VI의 난모세포 (약 1 mm 직경)를 미세주입을 위해 선택한다. C6 바늘을 사용하여 3-0 블랙 브레이드 (black braid) 봉합 (Harvard Apparatus)으로 개구리를 봉합하고, 2 내지 3 개월의 회복기 후에 난모세포 단리를 위해 재사용한다.
cRNA 제조
mMESSAGE mMACHINE키트를 사용하여 제조자의 지침 (Ambion)에 따라, 본 출원인의 이전 특허 (PCT WO 02/087306 A2)에 기술한 α, β 및 γ 인간 ENaC DNA 플라스미드로부터 T7 RNA 폴리머레이즈를 사용하여 ENaC cRNA를 생성시켜, α 및 γ ENaC에 대해서는 Eco RI로써 선형화되고 β ENaC에 대해서는 Xho로써 선형화된 DNA로부터 시험관내에서 cRNA를 전사한다. 전장 (full-length), 비분해 cRNA가 생성됨을 확실히 하기 위해, cRNA 품질을 변성 아가로스 젤 전기영동, 및 260 및 280 nm에서의 분광광도적 흡광도 판독에 의해 검사한다.
미세주입
미세주입 바늘을 보로실리케이트 유리 모세관 (World Precision Instruments Inc.)을 사용하여 모델 P-97 Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 (puller) (Sutter Instrument Co.) 상에서 뽑고, 미네랄 오일 (Sigma)로 역충전 (back-filled)한 후, Micro4 미세주사 펌프 제어기 (World Precision Instruments)와 함께 Nanoliter 2000 분주기를 사용하여 ENaC cRNA로써 전면-충전 (front-filled)한다. 난모세포는 동물극에다 각각 1 내지 3 ng의 α, β 및 γ 인간 ENaC cRNA를 함유하는 10 내지 15 nl로써 미세주입한다. 미세주입 후, 2.5 mM의 나트륨 파이루베이트가 보충된 Barth 용액을 함유하는 유리 섬광계수용 바이알로 난모세포를 옮기고 18 내지 19℃에서 정상적인 대기압 조건 하에서 밤새 인큐베이션 한다. 이 시간 동안 난모세포는 주입된 ENaC cRNA를 단백질로 번역한다.
이전극 전압고정 전기생리학적 기록을 사용하는 난모세포에서의 ENaC 전류 측정
미세주입 이후 24 시간 후, 이전극 전압고정 기법을 OpusXpress 6000A 병렬 난모세포 전압고정 시스템 (Axon Instruments) 상에서 난모세포에서의 ENaC 기능을 측정한다. 이전극 전압고정 기법은 ENaC와 같은 단백질 채널을 통해 전체 난모세포막을 가로질러 흐르는 거시적 전류를 측정하는 전기생리학적 방법이다 (Stuhmer, Methods in Enzymology (1992) 207:319-339). 난모세포를 전압-감지 전극 및 전류-감지 전극으로 찌르고; 전압, 또는 난모세포 막에 걸친 전위차를, 전압-감지 전극을 사용하여 특정 값으로 고정하고, 상기 전압을 유지하기 위해 필요한 전류, 또는 난모세포를 가로지르는 이온 흐름은 전류-감지 전극을 사용하여 측정한다. Opus Xpress 시스템은 8 개의 난모세포로부터 동시에 기록할 수 있는 반자동화된 이전극 전압고정 워크스테이션이다. 난모세포 찌르기는 자동화되어 있으며, 화합물 전달은 96공 화합물 플레이트로부터 컴퓨터-제어된 유체 취급기에 의해 수행된다. 상기 중간처리량 시스템은 검사할 수 있는 화합물의 개수를, 통상적인 단일 난모세포 전압고정 시스템을 사용하여 이루는 주당 약 1 개의 화합물로부터, OpusXpress 시스템을 사용하여 주당 약 60 개의 화합물로 현저히 증가시킨다.
난모세포를 OpusXpress 시스템에 놓고 ND-96 용액 (96 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 및 NaOH 함유 5 mM HEPES pH 7.5) 중에 담근다. 난모세포 를 전압-감지 및 전류-감지 전극으로 찌르고, 보로실리케이트 유리 모세관 (World Precision Instruments Inc.)을 사용하여 모델 P-97 Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 (Sutter Instrument Co.) 상에서 뽑고, 염화은 와이어를 함유하는 3M KCl로 역충전한다. 전극은 전압-감지 전극이 2 내지 10 Mohm의 저항을 나타내고, 전류-감지 전극이 0.5 내지 2 Mohm의 저항을 나타낸다. 찌르기 후, 난모세포를 -60 mV로 전압고정하고, 실험 기록을 개시한다. 데이터는 50 Hz에서 수득하고, 4-극 Bessel 필터를 사용하여 5 Hz에서 저역통과 필터링 (low-pass filter)한다.
본 발명에 따른 난모세포 분석법에서 ENaC 증강을 위한 화합물을 선별하는 데 사용되는 바람직한 절차는 하기와 같다 (도 8). 먼저, 아밀로라이드를 가한다 (1 μM; Sigma). 아밀로라이드는 ENaC 채널을 통한 나트륨 수송을 차단하는 억제제이며, 난모세포가 기능성 ENaC 단백질을 발현한다는 것을 확인하기 위한 내부 대조로 사용된다 (Canessa 등, Nature (1994) 367:463-467). 두 번째로, 아밀로라이드 처리 후에 난모세포막을 가로질러 흐르는 전류의 감소에 의해 증명되는 아밀로라이드 억제를 나타내는 난모세포에 화합물을 가한다 (농도는 약 0.1 μM 내지 약 100 μM). 상기 화합물이 ENaC 증강인자로서 기능하면, 난모세포 막 내 ENaC 채널을 통해 흐르는 전류가 증가한다. ENaC 기능에 대한 화합물의 효과를 정량화하기 위해, 하기 식을 사용한다: [(A-Ao)/(B-Bo)]×-100 (식 중, A는 화합물 처리 후의 전류이고, Ao는 화합물 처리 전의 전류이고, B는 아밀로라이드 처리 후의 전류이고, Bo는 아밀로라이드 처리 전의 전류이다) (도 8). 이 값은 본 분석법에서 화합물의 활성을 평가하는 데 사용되는 % 증강 계수 (enhancement factor)이다. 예를 들면, % 증강 계수가 100%와 같으면, 상기 화합물은 기본 대조 값 (화합물의 부재 하)에 비해 ENaC 활성을 100% 증가시킨다. % 증강 계수는 OpusXpress 시스템에서 난모세포 각각에 대해 별도로 산출한 후, 평균 및 표준 편차를 각 화합물에 대해 구한다 (도 9).
ENaC 발현 난모세포 내 화합물로써 관찰되는 효과가 ENaC 채널을 통해 흐르는 전류로 인한 것이고 난모세포 막에서 내재적으로 발현되는 채널을 통해 흐르는 전류로 인한 것이 아님을 입증하기 위해, ENaC cRNA가 주입되지 않은 난모세포로 음성 대조 실험을 수행한다 (Dascal, CRC Crit . Rev. Biochem. (1987) 22(4):317-387). ENaC를 특이적으로 증강시키는 화합물은 주입되지 않은 난모세포에서는 전류에 영향을 미치지 않아야 하며 % 증강 계수가 0을 나타내어야 한다 (도 10).
큰 % 증강계수를 나타내고 ENaC cRNA가 주입되지 않은 난모세포에 대해 영향을 미치지 않는 화합물에 대해 보다 복잡한 분석법을 수행한다. 상기 분석법은 전류/전압 (I/V) 곡선, 아밀로라이드 경쟁 실험 및 투여량-반응 곡선을 포함한다. I/V 곡선에 대해서는, 상기와 같이 ENaC 발현을 확인하기 위해 아밀로라이드의 존재 및 부재 하에서, 또한 화합물의 증강 정도를 확인하기 위해 화합물의 존재 및 부재 하에서, -100 mV부터 +60 mV까지 전압 단계를 20 mV씩 증가시키면서 전류를 측정한다 (도 11). 모든 비-ENaC 전류 (아밀로라이드에 의해 차단되지 않는 전류로 정의됨)는 차감하고, I/V 곡선을 플롯한다. 상기 I/V 곡선의 기울기는 관심 화합물에 의한 전류 증강 정도를 나타낸다. 강한 증강인자는 큰 양수 기울기를 갖는 I/V 곡선을 나타낸다. 또한, I/V 곡선의 x-절편은 이전극 전압고정 실험에서 어떤 유형의 이온이 수송되는가를 나타낸다. 나트륨 이온 수송에서는, x-절편이 난모세포 내 나트륨 부하 정도에 따라 10 내지 40 mV 범위에 속한다. ENaC cRNA가 주입되지 않은 난모세포에서는, 화합물의 존재 하에서 수행된 I/V 곡선은 동일하고 화합물의 부재 하에서 수행된 I/V 곡선과 일치해야 한다 (도 11).
화합물 효과가 ENaC에 의존적이라는 것을 입증하기 위해 아밀로라이드 경쟁 실험을 수행하는 것이 바람직하다 (도 12). 먼저, 아밀로라이드를 상기와 같이 가하여 난모세포 내 ENaC 발현을 입증한다. 이어서, 화합물을 가하여 % 증강 계수를 구한다. 최종적으로 아밀로라이드 및 화합물을 함께 가한다. 증강인자가 ENaC 채널에 직접 작용하려면, 아밀로라이드와 화합물을 함께 가하는 것은 아밀로라이드 표현형을 나타내어야 하는데, 이는 전류가 억제되고 증강되지 않음을 의미한다. 이 분석법은 ENaC 채널이 닫힌 경우 아밀로라이드에 의해 화합물이 증강 효과를 갖지 못함을 나타낸다; 따라서 상기 화합물은 ENaC 채널 기능을 직접 조절하는 것일 수밖에 없다.
상기 화합물이 반-최대 (half-maximal) 활성 (EC50)을 나타내는 농도를 구하기 위해 투여량-반응 곡선을 수행한다 (도 13). EC50가 낮을수록, 화합물은 ENaC 증강인자로서 보다 활성적이다. 투여량-반응 곡선은 낮은 투여량 (약 1 nM)부터 시작하여 높은 투여량 (약 1 mM)으로 진행되도록 증강인자의 농도를 순차적으로 증가하며 가함으로써 수행한다. % 증강 계수를 상기한 바와 같이 산출하고, 로그 스케일 상에서 화합물 농도의 함수로서 플롯하여 상기 화합물의 EC50 값을 구한다.
-60 mV의 고정 전위에서의 스크리닝, I/V 곡선, 아밀로라이드 경쟁 시험, 투 여량-반응 곡선 및 주입되지 않은 난모세포의 시험을 포함하는, ENaC 기능에 대한 화합물의 효과를 검사하기 위해 수행되는 실험 절차를 도식적으로 나타내는 흐름차트를 도 14에 도시한다.
결과 분석
본 출원인의 이전 특허출원 (PCT WO 02/087306 A2)에서는, 전압-민감성 형광 프로브가 부하된 ENaC-트랜스펙션된 세포 내 막전압을 분석함으로써 ENaC 활성을 간접적으로 측정한, HEK293T 인간 배아 신장 세포에서의 고처리량 포유류 세포 기반 분석법을 활용하였다. 상기 접근법은 고처리량의 것이고 ENaC를 조절하는 일부 화합물을 동정하기는 했지만, 불행히도 특이적이지 못했고, 약 90%의 동정된 화합물이 ENaC 기능을 직접적으로 조절하지 않았고, 대신 HEK293T 세포에 내적으로 발현되는 다른 이온 채널의 활성을 마찬가지로 조절하였다. 그러한 고처리량 분석법의 효율은, 페나밀 및 상기한 바와 같은 유사한 ENaC 억제제를 사용함으로써 본원에서 개선된다. 또한, 본 출원은 이전극 전압고정 기법을 사용하여 난모세포 내 ENaC 나트륨 채널 기능을 측정하는 보다 직접적 (특이적)이나 보다 낮은 처리량의 분석 방법론을 제공한다. 이 시스템은 이온 채널의 신속하고 활발한 발현을 허용한다 (약 1백만 개의 ENaC 채널이 단지 약 18 내지 24 시간 이내에 난모세포 막 내에서 발현될 수 있다). 상기 난모세포 발현 시스템의 다른 장점으로는: 난모세포가 크고 (직경 약 1 mm) 활발하여 취급과 작업이 용이하고; 동일하거나 상이한 관심 화합물에 대해 동일한 난모세포로부터 다중의 반복되는 기록을 수득할 수 있고; 난모세포가 몇 개 안 되는 내재 채널을, 외재적으로 발현된 이온 채널에 근거한 전류에 비해 높은 배경 전류를 유발하기에 충분한 수준으로 발현하고; 난모세포가 이온 채널 기능의 직접적인 측정을 가능하게 한다는 점이다. 따라서 전압-민감성 프로브를 사용하는, HEK293T 세포에서 ENaC 기능을 간접적으로 측정하는 분석법에 반해, 상기 난모세포 발현 시스템은 배경이 거의 없이 ENaC 나트륨 채널 전류를 직접 측정할 수 있게 한다.
[서열목록]
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Figure 112006001007985-PCT00008
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본 발명을 실시예 및 바람직한 구현예로써 설명하였으나, 본원에서 사용된 용어들은 설명하기 위한 것이지 한정하려는 용어가 아님을 이해해야 한다. 첨부된 청구범위의 범위 내에서, 보다 넓은 측면에서의 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 변화시키는 것이 가능하다. 본 발명은 본원에 특정 수단, 물질 및 구현예를 들어 설명하였지만, 본 발명이 개시된 특정사항으로 한정되는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 모든 대등한 구조물, 수단 및 용도로 확장된다.
SEQUENCE LISTING <110> SENOMYX, INC. <120> IMPROVED ELECTROPHYSIOLOGICAL ASSAYS USING OOCYTES THAT EXPRESS HUMAN ENaC AND THE USE OF PHENAMIL TO IMPROVE THE EFFECT OF ENaC ENHANCERS IN ASSAYS USING MEMBRANE POTENTIAL REPORTING DYES <130> 54315PCT <140> PCT/US04/021853 <141> 2004-07-09 <150> 60/485,745 <151> 2003-07-10 <150> 60/287,413 <151> 2001-05-01 <150> 10/133,573 <151> 2002-04-29 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 2010 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagggga acaagctgga ggagcaggac tctagccctc cacagtccac tccagggctc 60 atgaagggga acaagcgtga ggagcagggg ctgggccccg aacctgcggc gccccagcag 120 cccacggcgg aggaggaggc cctgatcgag ttccaccgct cctaccgaga gctcttcgag 180 ttcttctgca acaacaccac catccacggc gccatccgcc tggtgtgctc ccagcacaac 240 cgcatgaaga cggccttctg ggcagtgctg tggctctgca cctttggcat gatgtactgg 300 caattcggcc tgcttttcgg agagtacttc agctaccccg tcagcctcaa catcaacctc 360 aactcggaca agctcgtctt ccccgcagtg accatctgca ccctcaatcc ctacaggtac 420 ccggaaatta aagaggagct ggaggagctg 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1500 ttggccaaac tcttgatatt ctacaaagac ctgaaccaga gatccatcat ggagagccca 1560 gccaacagta ttgagatgct tctgtccaac ttcggtggcc agctgggcct gtggatgagc 1620 tgctctgttg tctgcgtcat cgagatcatc gaggtcttct tcattgactt cttctctatc 1680 attgcccgcc gccagtggca gaaagccaag gagtggtggg cctggaaaca ggctccccca 1740 tgtccagaag ctccccgtag cccacagggc caggacaatc cagccctgga tatagacgat 1800 gacctaccca ctttcaactc tgctttgcac ctgcctccag ccctaggaac ccaagtgccc 1860 ggcacaccgc cccccaaata caataccttg cgcttggaga gggccttttc caaccagctc 1920 acagataccc agatgctaga tgagctctga 1950 <210> 4 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Gly Asn Lys Leu Glu Glu Gln Asp Ser Ser Pro Pro Gln Ser 1 5 10 15 Thr Pro Gly Leu Met Lys Gly Asn Lys Arg Glu Glu Gln Gly Leu Gly 20 25 30 Pro Glu Pro Ala Ala Pro Gln Gln Pro Thr Ala Glu Glu Glu Ala Leu 35 40 45 Ile Glu Phe His Arg Ser Tyr Arg Glu Leu Phe Glu Phe Phe Cys Asn 50 55 60 Asn Thr Thr Ile His Gly Ala Ile Arg Leu Val Cys Ser Gln His Asn 65 70 75 80 Arg Met Lys Thr Ala Phe Trp Ala Val 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ccacttcgtc 780 ctctcctgca gttacgatgg cctggactgc caggcccgac agttccggac cttccaccac 840 cccacctacg gcagctgcta cacggtcgat ggcgtctgga cagctcagcg ccccggcatc 900 acccacggag tcggcctggt cctcagggtt gagcagcagc ctcacctccc tctgctgtcc 960 acgctggccg gcatcagggt catggttcac ggccgtaacc acacgccctt cctggggcac 1020 cacagcttca gcgtccggcc agggacggag gccaccatca gcatccgaga ggacgaggtg 1080 caccggctcg ggagccccta cggccactgc accgccggcg gggaaggcgt ggaggtggag 1140 ctgctacaca acacctccta caccaggcag gcctgcctgg tgtcctgctt ccagcagctg 1200 atggtggaga cctgctcctg tggctactac ctccaccctc tgccggcggg ggctgagtac 1260 tgcagctctg cccggcaccc tgcctgggga cactgcttct accgcctcta ccaggacctg 1320 gagacccacc ggctcccctg tacctcccgc tgccccaggc cctgcaggga gtctgcattc 1380 aagctctcca ctgggacctc caggtggcct tccgccaagt cagctggatg gactctggcc 1440 acgctaggtg aacaggggct gccgcatcag agccacagac agaggagcag cctggccaaa 1500 atcaacatcg tctaccagga gctcaactac cgctcagtgg aggaggcgcc cgtgtactcg 1560 gtgccgcagc tgctctccgc catgggcagc ctctacagcc tgtggtttgg ggcctccgtc 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335 Phe Leu Gly His His Ser Phe Ser Val Arg Pro Gly Thr Glu Ala Thr 340 345 350 Ile Ser Ile Arg Glu Asp Glu Val His Arg Leu Gly Ser Pro Tyr Gly 355 360 365 His Cys Thr Ala Gly Gly Glu Gly Val Glu Val Glu Leu Leu His Asn 370 375 380 Thr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Cys Leu Val Ser Cys Phe Gln Gln Leu 385 390 395 400 Met Val Glu Thr Cys Ser Cys Gly Tyr Tyr Leu His Pro Leu Pro Ala 405 410 415 Gly Ala Glu Tyr Cys Ser Ser Ala Arg His Pro Ala Trp Gly His Cys 420 425 430 Phe Tyr Arg Leu Tyr Gln Asp Leu Glu Thr His Arg Leu Pro Cys Thr 435 440 445 Ser Arg Cys Pro Arg Pro Cys Arg Glu Ser Ala Phe Lys Leu Ser Thr 450 455 460 Gly Thr Ser Arg Trp Pro Ser Ala Lys Ser Ala Gly Trp Thr Leu Ala 465 470 475 480 Thr Leu Gly Glu Gln Gly Leu Pro His Gln Ser His Arg Gln Arg Ser 485 490 495 Ser Leu Ala Lys Ile Asn Ile Val Tyr Gln Glu Leu Asn Tyr Arg Ser 500 505 510 Val Glu Glu Ala Pro Val Tyr Ser Val Pro Gln Leu Leu Ser Ala Met 515 520 525 Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Trp Phe Gly Ala Ser Val Leu Ser Leu Leu 530 535 540 Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Asp Ala Ser Ala Leu Thr Leu Val Leu 545 550 555 560 Gly Gly Arg Arg Leu Arg Arg Ala Trp Phe Ser Trp Pro Arg Ala Ser 565 570 575 Pro Ala Ser Gly Ala Ser Ser Ile Lys Pro Glu Ala Ser Gln Met Pro 580 585 590 Pro Pro Ala Gly Gly Thr Ser Asp Asp Pro Glu Pro Ser Gly Pro His 595 600 605 Leu Pro Arg Val Met Leu Pro Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Ala Glu 610 615 620 Glu Ser Trp Ala Gly Pro Gln Pro Leu Glu Thr Leu Asp Thr 625 630 635 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 cgcggatccg cccataccag gtctcatg 28 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 ccggaattcc tgcacatcct tcaatcttgc 30 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 cgcggatcca gcaggtgcca ctatgcac 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ccgctcgagg tcttggctgc tcagtgag 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 cgcggatccc ctcaaagtcc catcctcg 28 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 ccggaattcg actagatctg tcttctcaac 30

Claims (110)

  1. 하기 단계를 포함하는, 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 추정 조절제의 프로파일링 및 스크리닝을 위한 포유류 세포 기반 고처리량 분석법:
    알파, 베타 및 감마 서브유닛 또는 델타, 베타 및 감마 서브유닛, 또는 이들 세 서브유닛의 각각의 변형체, 조각 또는 기능적 대등물을 발현하고, 막전위 형광 색소 또는 나트륨 형광 색소가 부하된 시험 세포를, 적어도 부분적으로 ENaC 기능을 억제하는 조건 하에서 하나 이상의 공지된 ENaC 억제제와 접촉시키고, 그 후 상기 시험 세포를 나트륨 또는 리튬의 존재 하에서 하나 이상의 추정 조절제 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    추정 조절제/ENaC 상호작용의 존재 하에서 상기 시험 세포의 형광발광의 음이온-매개된 변화를, 상기 조절제의 부재 하에서의 변화와 비교하여 ENaC 조절 정도를 결정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 공지된 ENaC 억제제가 아밀로라이드 유도체인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀, 벤자밀, 에틸이소프로필아밀로라이드; 21,41-디메틸벤자밀 (DMB), 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀 (CBDMB); 31,41-디클로로벤자밀; 5-(N-메틸-N-과니디노카보닐)메틸아밀로라이드, 5-(N,N-헥사 메틸렌)아밀로라이드; 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA); 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀; 21,41-디메틸-21,31-벤자밀 21,31-벤조벤자밀; 및 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 음이온이 나트륨인 분석방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 음이온이 리튬인 분석방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 시험 세포가 MDCK, HEK293, HEK293T, BHK, COS, NIH3T3, Swiss3T3 및 CHO 로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 세포가 HEK293 세포인 분석방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 HEK293 세포가 HEK293T 세포인 분석방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 형광발광의 검출가능한 변화에 근거하여, 화합물이 특히 미각을 조절하는 화합물로 동정하기 위해 사용되는 것인 분석방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 미각이 짠맛인 분석방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 시험 세포가 멀티-웰 시험 플레이트의 웰 상에 접종되는 것인 분석방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 시험 세포가, 추정 조절제를 상기 멀티-웰 시험 플레이트의 웰에 첨가함으로써, 상기 추정 조절제와 접촉하는 것인 분석방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 시험 세포가 검출할 형광발광의 변화를 가능하게 하는 막전위 색소로써 부하되는 것인 분석방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 시험 세포가 각각의 알파, 베타 및 감마 ENaC 서브유닛을 발현하는 것인 분석방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 서브유닛이 각각 서열번호 1, 2 및 3, 또는 그의 조각, 또는 상기 서열과 교잡반응하고 기능성 hENaC 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 것인 분석방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 서브유닛이 서열번호 1, 2 및 3에 의해 코딩되는 것 인 분석방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 시험 세포가 hENaC 베타, 감마 및 델타 서브유닛 또는 그의 조각 또는 변형체를 발현하는 것인 분석방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 베타, 감마 및 델타 서브유닛이 각각 서열번호 2, 3 및 7에 의해 코딩되는 것인 분석방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 ENaC 서브유닛이 모두 인간 신장 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC 서브유닛을 포함하는 것인 분석방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 ENaC 서브유닛이 인간 폐 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC 서브유닛을 포함하는 것인 분석방법.
  22. 제 1 항에 있어서, ENaC가 인간 미뢰 세포 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC DNA 서열에 의해 코딩되는 인간 ENaC인 분석방법.
  23. 제 1 항에 있어서, ENaC가 알파 (또는 델타), 베타 및 감마 서브유닛으로 이루어지고, 천연 발생 인간 ENaC, 교대접합된 (alternatively spliced) 인간 ENaC, 그의 기능성 변형체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석 법.
  24. 제 1 항에 있어서, 형광 플레이트 판독기가 형광발광 변화를 관찰하는 데 사용되는 분석법.
  25. 제 1 항에 있어서, 전압 영상화 플레이트 판독기가 형광발광 변화를 관찰하는 데 사용되는 분석법.
  26. 제 1 항에 있어서, 막전위 색소가 Molecular Devices 막전위 키트 (cat#R8034), Di-4-ANEPPS (피리디늄, 4-(2-(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필))-, 히드록사이드, 내부염), DiSBAC4(2) (비스-(1,2-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), DiSBAC4(3) (비스-(1,3-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), CC-2-DMPE (Pacific Blue™ 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세롤-3-포스포에타놀아민, 트리에틸암모늄 염) 및 SBFI-AM (1,3-벤젠디카르복실산, 4,4'-[1,4,10-트리옥사-7,13-디아자시클로펜타데칸-7,13-디일비스(5-메톡시-6,12-벤조푸란디일)]비스-, 테트라키스[(아세틸옥시)메틸]에스테르; (분자 프로브)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 상피 나트륨 채널 (ENaC)의 활성을 관찰하는 방법:
    알파 (또는 델타), 베타 및 감마 ENaC 서브유닛, 그의 접합 변형체, 조각 및 서브유닛 조합으로 이루어진 기능성 ENaC로 트랜스펙션된 시험 세포를 제공하는 단계;
    상기 시험 세포를 멀티-웰 플레이트의 웰에 접종하고, 약 70% 이상의 융합 (confluence)에 이르기에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계;
    상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 접종된 시험 세포에 막전위 색소를 색소-부하하는 단계;
    상기 색소-부하된 숙주 세포를 하나 이상의 공지 ENaC 억제제와, 적어도 부분적으로라도 ENaC 기능을 억제하는 농도로 접촉시키는 단계;
    상기 멀티-웰 플레이트의 웰 내에서 상기 색소-부하된 시험 세포를 하나 이상의 추정 조절제 화합물 및 나트륨과 추가 접촉시키는 단계; 및
    형광 플레이트 판독기 또는 전압 강도 플레이트 판독기를 사용하여, 조절제/ENaC 상호작용으로 인한 막전위 색소의 형광발광의 변화를 관찰하는 단계.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 시험 세포가 HEK293 세포인 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 시험 세포가 HEK293T 세포인 방법.
  30. 제 27 항에 있어서, 상기 알파, 베타 및 감마 서브유닛이 각각 서열번호 1, 2 및 3에 의해 코딩되는 것인 방법.
  31. 제 27 항에 있어서, 상기 공지된 ENaC 억제제가 아밀로라이드 유도체인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀, 벤자밀, 에틸이소프로필아밀로라이드; 21,41-디메틸벤자밀 (DMB), 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀 (CBDMB); 31,41-디클로로벤자밀; 5-(N-메틸-N-과니디노카보닐)메틸아밀로라이드, 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드; 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA); 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀; 21,41-디메틸-21,31-벤자밀 21,31-벤조벤자밀; 및 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀인 방법.
  34. 제 27 항에 있어서, 상기 델타, 베타 및 감마 서브유닛이 각각 서열번호 7, 2 및 3에 의해 코딩되는 것인 방법.
  35. 제 31 항에 있어서, 시험 세포가 HEK293인 방법.
  36. 제 27 항에 있어서, 시험 세포가, 상기 시험 세포가 접종된 멀티-웰 플레이 트의 웰에 막전위 색소를 첨가하고, 시험 세포의 막을 통해 색소의 평형이 이루어지기에 충분한 시간 동안 인큐베이션 함으로써 색소-부하되는 것인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 막전위 색소가 멀티-웰 플레이트의 웰에 최종 농도 약 2 μM 내지 약 5 μM의 농도로 첨가되는 것인 방법.
  38. 제 27 항에 있어서, 막전위 색소가 Molecular Devices 막전위 키트 (cat#R8034), Di-4-ANEPPS (피리디늄, 4-(2-(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필))-, 히드록사이드, 내부염), DiSBAC4(2) (비스-(1,2-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), DiSBAC4(3) (비스-(1,3-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), CC-2-DMPE (Pacific Blue™ 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세롤-3-포스포에타놀아민, 트리에틸암모늄 염) 및 SBFI-AM (1,3-벤젠디카르복실산, 4,4'-[1,4,10-트리옥사-7,13-디아자시클로펜타데칸-7,13-디일비스(5-메톡시-6,12-벤조푸란디일)]비스-, 테트라키스[(아세틸옥시)메틸]에스테르; (분자 프로브)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  39. 제 27 항에 있어서, ENaC가 인간 신장 cDNA로부터 클론된 ENaC 서브유닛 DNA에 의해 코딩되는 인간 ENaC인 방법.
  40. 제 27 항에 있어서, ENaC가 인간 폐 cDNA로부터 클론된 ENaC 서브유닛 DNA에 의해 코딩된 인간 ENaC인 방법.
  41. 제 27 항에 있어서, ENaC가 인간 미각 세포 cDNA로부터 클론된 ENaC 서브유닛 DNA에 의해 코딩된 인간 ENaC인 방법.
  42. 제 27 항에 있어서, ENaC가 천연 발생 인간 ENaC 서브유닛, 교대접합된 인간 ENaC 서브유닛, 그의 기능성 변형체, 및 세포가 알파, 베타 및 감마 서브유닛을 발현하는 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제 27 항에 있어서, ENaC가 천연 발생 인간 ENaC의 알파 (또는 델타), 베타 및 감마 서브유닛, 또는 그의 교대접합된 버전 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  44. 제 27 항에 있어서, 시험 세포가 MDCK, HEK293, HEK293T, COS, BHK, NIH3T3, Swiss3T3 및 CHO 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  45. 제 27 항에 있어서, 시험 세포가 80%의 융합에 도달하도록 증식되는 방법.
  46. 하기 단계를 포함하는, 짠맛 조절 화합물의 동정 방법:
    기능성 인간 ENaC; 그의 접합 변형체, 키메라 또는 조각으로 트랜스펙션되거 나 형질변환된 시험 세포를 제공하는 단계;
    상기 시험 세포를 멀티-웰 플레이트의 웰에 접종하고, 약 70% 이상의 융합에 도달하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션 하는 단계;
    멀티-웰 플레이트의 웰에서 상기 접종된 시험 세포를 막전위 색소로 색소-부하하는 단계;
    상기 시험 세포를 하나 이상의 공지된 ENaC 억제제 화합물과, ENaC 기능이 적어도 부분적으로라도 억제되는 농도로 접촉시키는 단계;
    멀티-웰 플레이트의 웰에서 상기 색소-부하된 세포를 하나 이상의 추정 조절성 화합물 및 나트륨과 추가 접촉시키는 단계;
    형광 플레이트 판독기 또는 전압 강도 플레이트 판독기를 사용하여 조절제/ENaC 상호작용으로 인한 막전위 색소의 형광발광의 변화를 관찰하는 단계; 및
    관찰된 형광발광의 변화를 근거로, 하나 이상의 추정 조절제를 짠맛 조절 화합물로 동정하는 단계.
  47. 제 46 항에 있어서, 공지된 ENaC 억제제가 아밀로라이드 유도체인 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀, 벤자밀, 에틸이소프로필아밀로라이드; 21,41-디메틸벤자밀 (DMB), 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀 (CBDMB); 31,41-디클로로벤자밀; 5-(N-메틸-N-과니디노카보닐)메틸아밀로라이드, 5-(N,N-헥사 메틸렌)아밀로라이드; 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA); 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀; 21,41-디메틸-21,31-벤자밀 21,31-벤조벤자밀; 및 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀인 방법.
  50. 제 46 항에 있어서, 짠맛 지각에 대한 효과에 대해 동정된 ENaC 조절성 화합물을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제 46 항에 있어서, 상기 시험 세포가 MDCK, HEK293, HEK2933T, COS, HBK, NIH3T3, Swiss3T3 및 CHO로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 시험 세포가 HEK293 세포인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 시험 세포가 HEK2933T 세포인 방법.
  54. 제 46 항에 있어서, 세포가 HEK293 세포인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 HEK293 세포가 HEK293T 세포인 방법.
  56. 제 46 항에 있어서, 상기 방법이 형광발광의 검출가능한 변화에 근거하여, 화합물을 특히 미각을 조절하는 것으로 동정하는 데 사용되는 것인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 미각이 짠맛인 방법.
  58. 제 46 항에 있어서, 상기 시험 세포가 멀티-웰 시험 플레이트의 웰 상에 접종되고, 약 80%의 융합에 이르도록 증식되는 것인 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 시험 세포가, 상기 멀티-웰 시험 플레이트의 웰에 추정 조절제를 첨가함으로써, 상기 추정 조절제와 접촉되는 것인 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 시험 세포가 검출할 형광발광의 변화를 가능하게 하는 막전위 색소로 부하되는 것인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 시험 세포가 각각의 알파, 베타 및 감마 ENaC 서브유닛을 발현하는 것인 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 서브유닛이 각각 서열번호 1, 2 및 3, 또는 그의 조각, 또는 상기 서열에 교잡반응하고 기능성 hENaC 서브유닛을 코딩하는 DNA 서열 에 의해 코딩되는 것인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 서브유닛이 서열번호 1, 2 및 3에 의해 코딩되는 것인 방법.
  64. 제 46 항에 있어서, 상기 시험 세포가 hENaC 베타, 감마 및 델타 서브유닛 또는 그의 조각 또는 변형체를 발현하는 것인 방법.
  65. 제 18 항에 있어서, 상기 베타, 감마 및 델타 서브유닛이 각각 서열번호 2, 3 및 7에 의해 코딩되는 것인 방법.
  66. 제 46 항에 있어서, 상기 ENaC 서브유닛이 모두 인간 신장 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC 서브유닛을 포함하는 것인 분석법.
  67. 제 46 항에 있어서, 상기 ENaC 서브유닛이 모두 인간 폐 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC 서브유닛을 포함하는 것인 분석법.
  68. 제 46 항에 있어서, 상기 ENaC 서브유닛이 모두 인간 미각 세포 cDNA로부터 클론된 인간 ENaC 서브유닛을 포함하는 것인 분석법.
  69. 제 46 항에 있어서, ENaC가 알파 (또는 델타), 베타 및 감마 서브유닛으로 이루어지고, 천연 발생 인간 ENaC, 교대접합된 인간 ENaC, 그의 기능성 변형체, 또는 이들의 서브유닛 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석법.
  70. 제 46 항에 있어서, 형광 플레이트 판독기가 형광발광의 변화를 관찰하는 데 사용되는 것인 분석법.
  71. 제 46 항에 있어서, 전압 영상화 플레이트 판독기를 사용하여 형광발광의 변화를 관찰하는 것인 분석법.
  72. 제 46 항에 있어서, 막전위 색소가 Molecular Devices 막전위 키트 (cat#R8034), Di-4-ANEPPS (피리디늄, 4-(2-(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필))-, 히드록사이드, 내부염), DiSBAC4(2) (비스-(1,2-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), DiSBAC4(3) (비스-(1,3-디바르비투르산)-트리메틴 옥사놀), CC-2-DMPE (Pacific Blue™ 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세롤-3-포스포에타놀아민, 트리에틸암모늄 염) 및 SBFI-AM (1,3-벤젠디카르복실산, 4,4'-[1,4,10-트리옥사-7,13-디아자시클로펜타데칸-7,13-디일비스(5-메톡시-6,12-벤조푸란디일)]비스-, 테트라키스[(아세틸옥시)메틸]에스테르; (분자 프로브)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 분석법.
  73. 하기 단계를 포함하는, hENaC를 조절하는 화합물을 동정하는 방법:
    (i) 기능성 ENaC를 발현하는 재조합 포유류 세포를, ENaC 기능을 억제하는 것으로 알려진 화합물과 접촉시키고, 상기 세포를 상피 나트륨 채널을 조절하는 것으로 추정되는 후보 화합물과 추가 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 후보 화합물이 상기 hENaC를 조절하거나 거기에 결합하고/하거나, 상기 hENaC의 활성에 영향을 미치는지에 대해 결정하는 단계.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 MDCK, BHK, HEK293, HEK293T, COS, NIH3T3, Swiss3T3 및 CHO로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 HEK293 세포인 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 세포가 알파 (또는 델타), 베타 및 감마 ENaC 서브유닛을 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 것인 방법.
  77. 제 73 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 멀티-웰 시험 플레이트 장치 내에 포함되는 것인 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 막전위 색소로 부하되고, 추정 ENaC 조절제 및 나트륨과 접촉되고, 전압 강도 플레이트 판독기 또는 형광 플레이트 판 독기를 사용하여 형광발광의 변화가 관찰되는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 약 80% 융합에 이르도록 증식되는 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 막전위 색소가 CC2-DMPVE 또는 DiSBAC2(3) 및 ESS-CY4인 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 색소가 부하 완충제에 포함되는 것인 방법.
  82. 제 81 항에 있어서, 세포가 색소로 부하된 후, 세포 밀도의 변화가 평가되는 방법.
  83. 제 80 항에 있어서, 공지된 ENaC 억제제가 아밀로라이드 유도체인 방법.
  84. 제 83 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀, 벤자밀, 에틸이소프로필아밀로라이드; 21,41-디메틸벤자밀 (DMB), 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀 (CBDMB); 31,41-디클로로벤자밀; 5-(N-메틸-N-과니디노카보닐)메틸아밀로라이드, 5-(N,N-헥사메틸렌)아밀로라이드; 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA); 5-(N-4-클로 로벤질)-21,41-디메틸벤자밀; 21,41-디메틸-21,31-벤자밀 21,31-벤조벤자밀; 및 5-(N-4-클로로벤질)-21,41-디메틸벤자밀로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 화합물이 페나밀인 방법.
  86. 서열번호 1, 2 및 3에 함유된 핵산 서열 또는 엄격한 교잡반응 조건 하에서 상기 서열에 교잡반응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 α, β 및 γ 서브유닛을 포함하거나, 서열번호 7, 2 및 3에 함유된 핵산 서열에 의해 코딩되는 α, β 및 γ 서브유닛을 포함하는 기능성 인간 ENaC 나트륨 채널을 발현하는 난모세포.
  87. 제 1 항에 있어서, 포유류, 양서류, 조류 또는 파충류 난모세포인 난모세포.
  88. 제 1 항에 있어서, 개구리 난모세포인 난모세포.
  89. 제 88 항에 있어서, 서열번호 1, 2 및 3에 함유된 핵산 서열을 발현하는 난모세포.
  90. 제 88 항에 있어서, 서열번호 7, 2 및 3에 함유된 핵산 서열을 발현하는 난모세포.
  91. 기능성 인간 ENaC 나트륨 채널을 발현하는 난모세포와 추정 인간 ENaC 조절성 화합물을 활용하고, 상기 화합물의 ENaC 채널을 통한 나트륨 수송에 대한 효과를 분석하고, 상기 화합물의 나트륨 수송에 대한 증강 또는 억제 효과에 근거하여 상기 화합물이 ENaC 조절제인가를 확인하는, 인간 ENaC의 조절제를 동정하는 방법.
  92. 제 91 항에 있어서, 전기생리학적 분석법인 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 상기 분석법이 이전극 전압고정 기법인 방법.
  94. 제 91 항에 있어서, 난모세포가 포유류, 양서류, 조류 또는 파충류 난모세포인 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, 난모세포가 양서류 난모세포인 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 난모세포가 개구리 난모세포인 방법.
  97. 제 96 항에 있어서, 분석법이 전기생리학적 분석법인 방법.
  98. 제 97 항에 있어서, 상기 분석법이 이전극 전압고정 기법인 방법.
  99. 제 98 항에 있어서, 인간 ENaC 증강인자를 동정하는 데 사용되는 것인 방법.
  100. 제 98 항에 있어서, 인간 ENaC 억제제를 동정하는 데 사용되는 것인 방법.
  101. 제 96 항에 있어서, 상기 개구리 난모세포가 서열번호 1, 2 및 3 또는 서열번호 7, 2 및 3에 함유된 핵산 서열을 발현하는 것인 방법.
  102. 제 97 항에 있어서, 상기 난모세포가 추정 인간 ENaC 증강인자와 접촉되기 전에 인간 ENaC의 억제제와 접촉되는 방법.
  103. 제 102 항에 있어서, 상기 공지된 억제제가 아밀로라이드 또는 페나밀인 방법.
  104. 제 99 항에 있어서, 상기 추정 인간 ENaC 증강인자의 인간 ENaC를 특이적으로 증강시키는 능력이 전류/전압 (I/V) 곡선 분석법, 아밀로라이드 경쟁 분석법, 및 투여량-반응 분석법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 추가적 분석법으로 평가되는 것인 방법.
  105. 제 99 항에 있어서, 인간 ENaC cRNA가 미세주입되지 않은 난모세포를 사용하 는 음성 대조군을 추가 포함하는 방법.
  106. 제 103 항에 있어서, 추정 인간 ENaC 증강인자 및 아밀로라이드가 인간 ENaC 발현 개구리 난모세포에 함께 가해지는 방법.
  107. 제 99 항에 있어서, 상기 추정 조절제가 약 1 nM 내지 약 1 mM 범위의 농도로 가해지는 방법.
  108. 제 99 항에 있어서, 상기 인간 ENaC 증강인자가 20% 이상의 증강 계수를 나타내는 방법.
  109. 제 108 항에 있어서, 상기 인간 ENaC 증강인자가 50% 이상의 증강 계수를 나타내는 방법.
  110. 제 108 항에 있어서, 상기 인간 ENaC 증강인자가 100% 이상의 증강 계수를 나타내는 방법.
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