KR20060028977A

KR20060028977A - 해양균류 아스퍼질러스속에서 분리한 라디칼 소거작용과자외선-ａ (ｕｖ-ａ) 차단작용이 있는 신규 화합물

Info

Publication number: KR20060028977A
Application number: KR1020040077918A
Authority: KR
Inventors: 손병화
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2006-04-04
Also published as: KR100578004B1

Abstract

본 발명은 해양균류 아스퍼질러스 속에서 분리한 라디칼 소거작용과 자외선-A (UV-A) 차단작용이 있는 신규 화합물에 관한 것으로, 해양 홍조류인 마디잘록이 (Lomentaria catenata)에서 분리한 해양균류 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주로부터 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용이 있는 신규 화합물 골매논과 디하이드록시이소에치눌린 A를 개발하였다. 또한, 본 발명 신규 화합물 골매논과 디하이드록시이소에치눌린 A는 현재 일반적으로 자외선 차단제로 사용되고 있는 옥시벤존 보다 강한 UV-A 차단활성을 보였다.

골매논, 디하이드록시이소에치눌린 A, 아스퍼질러스속, 자외선-A 차단, 라디칼 소거능

Description

해양균류 아스퍼질러스속에서 분리한 라디칼 소거작용과 자외선-Ａ (ＵＶ-Ａ) 차단작용이 있는 신규 화합물{Novel compounds having radical scavenging and Ultraviolet-A protecting activity from the marine-derived fungus Aspergillus sp.}

도 1은 본 발명 해양균류 아스퍼질러스 속에서 분리한 디케토피페라진 알칼로이드 류, 디하이드록시이소에치눌린 A(1), 골매논(2), 동종의 네오에치눌린(3), L-알라닐-L-트립토판 안하이드라이드(4) 및 에치눌린(5)의 분자 구조를 도시한 것이다.

본 발명은 해양균류 아스퍼질러스 속에서 분리한 라디칼 소거작용과 자외선-A (UV-A) 차단작용이 있는 신규 화합물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)의 체표에서 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주를 분리하여 배양하고 상기 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물을 분리정제하여 얻은 라디칼 소거작용과 자외선 A 차단작용이 뛰어난 신규 화합물의 개발에 관한 것이다.

자외선은 가시광선의 단파장보다 바깥쪽에 나타나는 눈에 보이지 않는 빛으로 인체에 있어서 피부암, 홍반, 그리고 눈의 손상을 발생시킬 수 있다. 동식물과 해양 생물에 이러한 질병과 다른 악영향의 발생은 태양광 중 자외선의 증가 정도에 따라 증가될 것으로 예상된다. 장기간에 걸쳐 반복하여 조사되는 태양 자외선, 특히 UV-B에 대한 노출은 민감한 백인에 있어서 비흑색종 피부암(non-melanoma skin cancers; NMSC)의 위험과 관련이 있는 반면에, 강하고 단속적인 UV-B에 대한 노출은 악성 흑색종(malignant melanoma; MM)의 상당히 위험한 인자가 될 수 있다. 몇몇 나라에서 최근 수년 동안 피부암 발병이 늘고 있다고 보고되고 있다. 이러한 경향은 일차적으로 개인적 노출의 증가로 인한 것으로 생각할 수 있다.

한편, 수산기 라디칼을 비롯하여 자유 라디칼과 활성 산소종 또는 활성 질소종 및 페록시나이트라이트는 매우 다양한 인간 질병들의 원인으로 중요하게 작용 하는 것으로 잘 알려져 있다. 특히, 초과산화물(superoxide)과 산화질소(nitric oxide)의 반응 결과로 생성된 페록시나이트라이트(ONOO^-)는 단백질과 지질 그리고 DNA 같은 몇몇 세포 성분들을 산화시켜서 세포를 파괴시키는 종이다. 이것은 알츠하이머 병, 류마티스성 관절염, 암 및 죽상 동맥 경화증과 같은 질병들과 연관이 있음이 알려져 있다. 또한, 활성산소종(ROS)은 노화와 관련된 다양한 퇴행성 장애와 밀접한 연관이 있다. 과산화수소, 초과산화 음이온(superoxid anion), 수산기 라디칼(hydroxyl radical) 그리고 산화질소(nitric oxide)와 같은 활성 산소종(ROS)은 호기성 대사와 핵산, 단백질 및 지질 같은 세포내 모든 성분이 손상되는 결과로서 체내에서 생성된다. 상기의 여러가지 라디칼에 의한 산화적 손상을 예방하기 위해 다양한 노력들이 진행되어 왔으며, 특히 항산화 활성을 가진 천연화합물들에 대한 관심이 고조되고 있는 실정이다.

본 발명자는 해양생물유래의 생물활성화합물의 화학적 연구의 일환으로서, 해양숙주 재료에서 분리된 해양균류의 생물활성 2차대사성분을 연구하고 있으며, 이중 해조류 착생 균류인 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)의 조추출물이 적절한 UV-A 차단 활성을 가짐을 발견하고 이를 특허출원한 바 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 해양 서식지에서 분리된 균류에서 분리한 자외선 A 차단작용과 라디칼 소거작용을 동시에 가지고 있는 신규 화합물과 대사물질을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)의 체표에서 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주를 분리하여 배양하고 상기 균주 배양액을 에틸아세테이트로 HPLC를 통해 정제하여 자외선 A 차단활성과 라디칼 소거능이 있는 골매논과 프레닐치환기를 가진 디하이드록시이소에치눌린 A를 얻고 그것의 구조와 입체화학적 특징을 규명함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명은 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)의 체표에서 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주를 분리 배양하는 단계; 균주 배양액의 에틸아 세테이트 추출물의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 디케토피페라진 분획 획득 및 상기 분획의 HPLC를 통한 골매논 획득 단계; 이들의 화학구조, 입체화학적 특징 규명단계; 상기 디케토피페라진 분획의 ODS 컬럼 크로마토그래피와 HPLC를 통한 디하이드록시이소에치눌린 A 획득 단계 및 이의 구조, 입체화학적 특징 규명 단계; 상기 신규 화합물의 자외선 A 차단활성과 라디칼 소거능 측정단계로 구성된다.

본 발명은 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 분리한 아스퍼질러스 에스피(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물에서 얻었으며, 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용을 가짐을 특징으로 하는 하기 구조식 (1)로 표시되는 디하이드록시이소에치눌린 A를 제공한다:

...(1)

본 발명은 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 분리한 아스퍼질러스 에스피(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물에서 얻으며, 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용을 가짐을 특징으로 하는 하기 구조식 (2)로 표시되는 골매논을 제공한다:

...(2)

본 발명은 일렉트로써말 모델 IA 9100 마이크로 녹는점측정 기기(Electrothermal model IA 9100 micro-melting point apparatus) 상에서 녹는점을 측정하고 이를 별도로 보정하지는 않는다. 퍼킨 엘머 모델 341 편광계(Perkin Elmer model 341 polarimeter)에서 선광도를 측정하였다. IR 스펙트럼은 브루커 FT-IR 모델 IFS-88 분광광도계(Bruker FT-IR model IFS-88 spectrophotometer) 로 측정한다. ¹H(400 MHz)과 ¹³C NMR(400 MHz) 스펙트럼은 JEOL JNM-ECP 400 NMR 분광계에서 표준물질로써 TMS 또는 용매의 피크를 이용하여 얻는다. MS 스펙트럼은 JEOL JMS-700 분광계에서 얻는다. UV/가시광선 스펙트럼은 Hitachi U-2001 UV/가시광선 분광계에서 얻는다. CD 스펙트럼은 JASCO J-715 분광편광계에서 얻는다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명을 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 본 발명 해양 홍조류인 마디잘록이( Lomentaria catenata )에서 아 스퍼질러스속 균주의 분리·동정

해양생물로부터 자외선 A 차단작용과 라디칼 소거능이 있는 신규 화합물을 개발하기 위해 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 상기 화합물을 생산하는 균주를 분리 동정하였다.

해양 균주는 대한민국 울산시 골매마을에서 수집한 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)의 체표에서 분리하였으며, 한국미생물보존센타에서 실시한 지방산 메틸 에스테르 분석(fatty acid methyl ester analysis, FAME)을 통해 유사성지수(similarity index)가 0.62로써 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)으로 동정하였다. 따라서, 상기 균주를 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) MFA 212로 명명하고, 2004년 7월 19일자로 농용미생물센터에 기탁번호 KACC 93012로 기탁되었다.

실시예 2: 본 발명 아스퍼질러스속 균주에서 자외선 A 차단작용과 라디칼 소거능이 있는 신규 화합물의 분리 및 그것의 구조, 입체화학적 특징 규명

실시예 1에서 분리한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주를 29℃에서 30일 동안 SWS 배지(soytone 0.1%, 수용성 전분 1.0%, 해수 100%, 20L)에서 배양하였다. 상기 배양액과 균사체를 분리하고, 배양액은 에틸아세테이트로 추출하여 조추출물(1.5g)을 얻은 다음, 실리카겔(용매: n-헥산/에틸아세테이트)과 옥타데실 실리카겔(octadesyl silica, ODS, 용매: 물/메탄올)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여, 디케토피페라진 2(20 mg), 3(120 mg), 4(35 mg)을 포함 한 3개의 분획을 얻었다. HPLC(YMC ODS-A, 메탄올)를 통해 각 분획을 다시 정제하여 신규한 골매논[Golmaenone]( 2 , 12 mg), 네오에치눌린 A[Neoechinulin A]( 3 , 95 mg) 및 L-알라닐-L-트립토판 안하이드라이드[L-alanyl-L-tryptophan anhydride]( 4 , 7 mg)을 얻었다. 도 1에 3개의 화합물의 분자 구조를 나타내었다.

신규한 화합물인 골매논은 노란색을 띠는 고체로, (HR)-FAB-MS 및 ¹³C-NMR 데이터로부터 분자 조성은 C₁₉H₂₁N₃O₄로 판명되었다. HR-FAB-MS에 따르면, 골매논은 11개의 불포화기를 포함하고 있는데 즉, 4개의 카보닐기, 5개의 이중결합, 2개의 고리가 있다. IR 스펙트럼에서, 자유 아미노기(3433, 1697cm^-1)와 수소결합을 하고 있는 아미드(3242, 1629cm^-1)유래의 흡수 시그날이 관찰되었다. 그리고, UV 스펙트럼에서, 컨쥬게이티드 아미드 발색단(222 mm(logε1.8), 327(1.9), 368(1.7))이 관찰되었다. ¹H-NMR 스펙트럼에서, 3개의 프로톤(proton)이 D₂O에 의해 치환되어, 골매논이 3개의 아미드 프로톤[δ6.61 (1H, s, H-11), 11.57 (1H, s, H-14), 11.44 (1H, s, H-15)]을 가지고 있음을 유추할 수 있다.

골매논의 NMR 스펙트럼 결과^a,b)

C#	δ_H(mult.,J)	δ_C(mult.)	HMBC(H to C)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20/21 22	7.96(dd, 8.0, 1.5) 7.14(ddd, 8.2, 8.0, 1.0) 7.57(ddd, 8.6, 8.2, 1.5) 8.74(dd, 8.6, 1.0) 7.22(s) 6.61(br s) 4.40(qd, 7.0, 1.8) 11.57(s) 11.44(s) 6.12(dd, 17.5, 10.5) 5.37(d, 17.5) 5.31(d, 10.5) 1.43(s) 1.66(d, 7.0)	141.4 123.6 130.5 122.6 135.4 121.3 195.1 102.3 140.0 157.3 51.8 166.4 175.9 46.8 142.4 114.9 24.8 21.1	1,4,5,7 2,3,5,6 1,3,4 1,2,4 7,10 9,13 10,13,22 10,12 2,6,16 16,17,20/21 17,18 16,17,18 12,13

a: CDCl₃에서 400 MHz(¹H) 및 100 MHz(¹³C)에서 측정됨.

b: DEPT, HM QC 및 HMBC에 의해 귀속.

표 1에 나타난 바와 같이, 구체적으로, ¹H- 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석, DEPT(distortionless enhancement by polarization transfer), HMQC(1H-detected heteronuclear multiplequantum coherence) 및 HMBC(heteronuclear multplebond correlation) 실험에 따르면, 메틸기가 치환된 디케토피페라진[δ6.61 (1H, br s, H-11), 4.40 (1H, qd, J=7.0, 1.8 Hz, H-12), 11.57 (1H, s, H-14), 1.66 (3H, d, J=7.0 Hz, H₃-22), 140.0 (C-9), 157.3 (C-10), 51.8 (C-12), 166.4 (C-13), 21.1 (C-22)], 1,2-치환 벤젠(1,2-disubstituted benzene)[δ7.96 (1H, dd, J58.0, 1.5 Hz, H-3), 7.14 (1H, ddd, J=8.2, 8.0, 1.0 Hz, H-4), 7.57 (1H, ddd, J=8.6, 8.2, 1.5 Hz, H-5), 8.74 (1H, dd, J=8.6, 1.0 Hz, H-6), 141.4 (C-1), 123.6 (C-2), 130.5 (C-3), 122.6 (C-4), 135.4 (C-5), 121.3 (C-6)], 2,2-디메틸-3-부텐아미드(2,2-dimethyl-3-butenamide)[δ11.44 (1H, s, H-15), 6.12 (1H, dd, J=17.5, 10.5 Hz, H-18), 5.31, 5.37 (각각 1H, d, J=10.5, 17.5 Hz, H₂-19), 1.43 (6H, s, CH₃-20/21), 175.9 (C-16), 46.8 (C-17), 142.4 (C-18), 114.9 (C-19), 24.8 (C-20/21)] 및 1,3,3-치환 프로페논(1,3,3-trisubstitited propenone)[δ7.22 (1H, s, H-8), 195.1 (C-7), 102.3 (C-8), 140.0 (C-9)] 유래의 시그널이 관찰되었다.

HMQC 와 HMBC의 결과에 따라 골매논의 작용기 간의 연결을 통해 평면구조를 결정하였다. 즉, H-15와 C-2, C-6와 C-16; H-3과 C-7; H-8과 C-7, C-10; H₃-20/21과 C-16, C-18; H-14와 C-8, C-10과 C-12 간의 HMBC 상관관계가 관찰되었다.

골매논의 C-8/C-9의 이중결합의 기하학적 구조는 H-8[δ7.22(1H,s)] 과 H-14[δ11.57(1H,s)]의 케미칼 쉬프트(chemical shift)가 각각 9-카르보닐기에 의한 디쉴딩(deshielding) 효과와 7-카르보닐기와의 수소결합에 의한 디쉴딩 효과에 의해 저자장(low field)로 이동되어, Z-입체배치가 결정되었다.

알라닌 잔기의 입체화학은 변형된 Marfey's 방법의 변법으로 결정하였다. 즉, 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alaninamide(L-FDAA)를 2개의 거울상의 알라닌 이성질체와 반응시켜 얻은 각각의 유도체를 역상 HPLC를 통해 이를 분석하였다. 해당 이성질체(2S, 2R)의 체류시간(retention times)은 각각 9.6분과 10.6분으로 관 찰되었다. 같은 방법으로, 골매논의 산 가수분해산물(acid hydrolysate)로부터 유도한 유도체와 표준 유도체를 HPLC로 비교함으로써 12S의 배열을 결정하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 화합물 3과 4는 보다 극성을 띠는 분획에서 분리되었으며, 이미 아스퍼질러스 속의 균주에서 항산화물질로 분리된 바 있는 네오에치눌린 A과 L-알라닐-L-트립토판 안하이드라이드로 동정하였다.

실험예 1: 자외선 A 차단능 조사

본 발명 신규 화합물 골매논과 종래의 자외선차단제인 옥시벤존의 자외선 A 차단능을 비교 실험하였다.

이를 위해, 골매논과 네오에치눌린 A(1 mg)를 각각 칭량하여 MeOH (1 mL)에 용해시킨 용액(1 mg/mL)을 단계별로 희석하여 1000 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL 농도의 시료를 조제하였다. 옥시벤존을 MeOH에 용해시킨 용액 (0.1 mg/mL)을 단계별로 10배씩 희석하여 내부표준물질로서 사용하였다. 위에서 조제한 각 시료 및 표준물질 (200 ㎕)을 96-웰 마이크로타이터 트레이(microtiter tray)에 취한 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ED₅₀을 계산하였다.

화합물 2와 3은 ED₅₀이 각각 90, 170 μM으로 UV-A 차단능을 나타내었는데, 이는 현재 자외선 차단제로 사용되고 있는 옥시벤존(ED₅₀=350 μM)보다 강한 자외선 A 차단능이 관찰되었다.

실험예 2: 라디칼 소거능 조사

본 발명 신규 화합물 골매논과 네오에치눌린 A의 라디칼 소거능은 통상의 방법에 따라 DPPH에 대한 라디칼 소거능을 조사하였다. 상기 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (DPPH)은 자유 라디칼 화합물이며, 다양한 화합물질의 자유 라디칼 소거 능력을 실험하는 데 주로 사용된다.

그 결과, 화합물 2(골매논)와 3(네오에치눌린 A)은 IC₅₀이 각각 20, 24 μM으로 DPPH에 대해 유의한 라디칼 소거능을 나타내었으며, 이 수치는 대조군인 아스코르브산과 유사하였다(IC₅₀=20 μM).

실시예 3: 본 발명 아스퍼질러스속 균주에서 자외선 A 차단작용과 라디칼 소거능이 있는 프레닐 치환 디옥소피페라진 알칼로이드의 분리 및 그것의 구조, 입체화학적 특징 규명

실시예 1에서 분리한 아스퍼질러스속 균주에서 디케토피페라진 분획을 분리하였으며, 이 분획 보다 극성이 큰 분획으로부터 이소에치눌린 타입의 신규 대사물질을 분리할 수 있었다.

디하이드로트립토판을 기본구조로서 가지고 있으면서 인돌 핵의 2번과 5번 위치에 이소프렌과 리버스-이소프렌 체인이 결합되어 있는 많은 종류의 이소에치눌린 타입의 대사물질들이 아스퍼질러스속의 균류에서 분리되었으며, 이들은 다 같이 사이클로-L-알라닐-L-트립토파닐(cyclo-L-alanyl-L-tryptophanyl)을 전구체로하여 생합성되었다.

상기 이소에치눌린 타입의 대사물질을 분리하기 위해, 실시예 1에서 분리한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주를 29℃에서 30일 동안 SWS 배지(soytone 0.1%, 수용성 전분 1.0%, 해수 100%, 20L)에서 배양하였다. 상기 균주배양액과 균사체를 분리하고 상기 배양액은 에틸 아세테이트로 추출하여 조추출물(1.5g)을 얻었으며, 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(용매: n-헥산/에틸 아세테이트)를 실시하여 디케토피페라진 알칼로이드 2(20 mg), 3(120 mg), 4(35 mg), 1(15 mg), 5(10 mg)의 5개의 분획을 얻었다. ODS 컬럼 크로마토그래피(물/메탄올), HPLC(YMC ODS-A, 메탄올)을 연속적으로 실시하여 1과 5를 포함하는 분획을 최종적으로 정제하여 신규한 화합물인 디하이드록시이소에치눌린 A[dihydroxyisoechinulin A]( 1 , 10 mg) 뿐만 아니라 이미 알려져 있는 에치눌린( 5 , 6 mg)을 얻었다.

디하이드록시이소에치눌린 A(1)의 물리화학적 특징

형태	무색의 오일
[α]D(c0.4, CHCl₃)	-47℃
분자식	C₂₄H₃₁N₃O₄
LREI-MS(m/z)	425[M]⁺(72), 407[M-H₂O]⁺(1), 382[M-H₂O-C₃H₇]⁺(1), 367[M-C₃H₆O]⁺(13), 356[M-C₅H₉]⁺(42), 336[M-C₄H₉O₂]⁺(47), 298[356-C₃H₆O]⁺(100), 268[336-C₅H₈]⁺(81), 194(41), 69[C₅H₉]⁺(17), 59[C₃H₇O]⁺(51)
HREI-MS(m/z) Found	425.2320[M]⁺
C₂₄H₃₁N₃O₄	425.2315
IR ν_max(neat)cm^-1	3358, 3262, 3085, 1673, 1629, 1425, 1381, 1323, 1242, 1160, 1024, 1000, 902, 756
UV λmax(MeOH)nm(logε)	209(3.9), 226(3.9), 289(3.4), 340(3.5)
CD(MeOH)nm(Δε)	212(-6.6), 239(+3.2), 266(+1.7), 284(+1.6), 341(-1.1)

디하이드록시이소에치눌린 A(1)의¹H(δ, mult,J) 및¹³C(δ, mult) NMR 스펙트럼 결과^a,

위치	δ_H	δ_C	HMBC(H to C)
1 2 3 3a 4 5 6 7 7a 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 19-OH 20-OH	10.91(s) 7.02(br. s) 6.98(dd, 8.2, 1.3) 7.29(d, 8.2) 6.87(s) 8.36(d, 1.9) 4.10(qd, 6.5, 1.9) 8.51(s) 6.06(dd, 17.0, 10.5) 5.01(d, 17.0) 5.03(d, 10.5) 2.36(dd, 13.5, 10.0) 2.93(d, 13.5) 3.27(m) 1.09(s)^b 1.06(s)^b 1.46(s)^c 1.45(s)^c 1.39(d, 6.5) 4.11(s)d 4.16(s)d	144.0(s) 103.1(s) 126.2(s) 119.2(d) 132.3(s) 123.0(d) 111.1(d) 133.9(s) 110.8(d) 124.8(s) 160.0(s) 51.0(d) 166.6(s) 39.2(s) 145.4(d) 111.6(t) 38.0(t) 80.0(d) 72.0(s) 26.5(q)^e 24.7(q)^e 27.6(q)^e 27.7(q)^e 20.3(q)	2,3,3a,7a 3,6,7a,18 4,7a,18 3a,5 2,3a,10 9,13 10,13,25 10,12,13 2,15,23,24 15,16 4,5,6,19 5,20,21,22 19,20,22 19,20,21 2,15,16,24 2,15,16,23 12,13 18,19,20 20,21,22

a: CDCl₃에서 400 MHz(¹H) 및 100 MHz(¹³C)에서 측정됨.

b-e: 치환성.

화합물 1의 물리화학적 특징과 NMR 자료는 표 2와 3에 나타내었다. 화합물 5는 무색의 고체로 분리되었으며, 스펙트럼 데이터는 문헌상에 보고된 것과 동일하였다.

화합물 1과 5의 알라닌 잔기의 입체화학을 결정하기 위해, 실시예 1에서와 같이, 산 가수분해와 Marfey 분석을 실시하였다. 화합물 1과 5의 시료(0.5 mg)를 5N HCl(1 mL)로 110℃에서 12시간 동안 산 가수분해를 실시하였다. 가수분해산물을 건조시키고, 물(100 ㎕)로 재현탁하고, 1-플루오로2,4-딘트로페닐-5-L-알라니나마이드(1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alaninamide)로 유도하였다. 상기로부터 얻은 유도체는 0.1%(v/v) 수용성 TFA(30~70% MeCN, 50분 이상)의 MeCN의 선 구배(linear gradient)를 이용한 HPLC[HiQ sil C18W(4.6×250 mm), 5㎛, 유량(flow rate)은 1 mL/min, 340 nM에서 UV ditection]에 따라 유사하게 유도된 L- 및 D-알라닌 유도체와 비교하였다. L- 및 D-알라닌 유도체의 체류시간은 각각 14.4와 17.1 분이었으며, 두 가수분해 산물의 유도체의 체류시간은 14.4분이었다.

화합물 1의 C-19에서 입체화학적 특징을 규명하기 위해, (±)-α-페닐뷰트릭 안하이드라이드(15 mg)를 화합물 1(3.5 mg)과 디메틸아미노피리딘(1.0 mg)을 피리딘(0.5 mL)에 녹인 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서, N₂대기에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합액을 에틸아세테이트로 포화된 수용성 NaHCO₃혼합액으로 분배시켰다. 유기층은 진공건조시키고, 잔류물은 실리카겔 크로마토그래피(용매: 에틸아세테이트)와 HPLC(Applo-C18, 메탄올:물=5:1)를 실시하여 에스테르 생성물(1.0 mg)을 얻었다. 수용성 NaHCO₃층은 2N HCl로 산성화시키고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 일반적인 방법에 따라 에틸아세테이트 추출물은 HPLC(ODS-A, 메탄올:물=10:1)로 정제하여 [α]_D+4.9°(c0.6, 벤젠)의 α-페닐뷰티르산(α-phenylbutric acid)(5 mg)을 얻었다. 상기 에스테르에 대한 NMR 데이터는 다음과 같다: 1H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ8.14(1H, br.s, H-1), 7.00 (1H, br.s, H-4), 6.82 (1H, dd, J=8.3, 1.5 Hz, H-6), 7.03 (1H, d, J=8.3 Hz, H-7), 7.21 (1H, s, H-8), 5.88(1H, br.s, H-11), 4.32 (1H, q, J=7.0 Hz, H-12), 7.37 (1H,br.s, H-14), 6.08 (1H, dd, J=17.5, 10.5 Hz, H-16), 5.21,5.25 (each 1H, d, J=17.5, 10.5 Hz, H₂-17),2.78 (1H, dd, J=14.5, 9.0 Hz, H_a-18), 3.06 (1H, dd,J=14.5, 4.5 Hz, Hb-18), 5.09 (1H, dd, J=9.0, 4.5 Hz, H-19), 1.19 (3H, s, H₃-21), 1.17 (3H, s, H₃-22), 1.54 (6H, s,H₃-23/24), 1.60 (3H, d, J=7.0 Hz, H₃-25), 7.09 (2H, m, ph-α),7.15 (3H, m, ph-α), 3.39 (1H, t, J=7.6 Hz, H- a), 1.69(2H, m, H₂-β), 0.78 (3H, t, J=7.5 Hz, H₃-γ); HREI-MS m/z 571.3092 [M]⁺(calcd for C₃₄H₄₁N₃O₅, 571.3046); LREIMS m/z 571 [M]⁺(rel. int. 24), 407 [M-(2-phenylbutyric acid)] ⁺ (22), 338 (19), 336 (18), 320 (8), 194 (12), 164 [2-phenylbutyric acid]⁺ (22), 119 (35), 91 (100).

상기 결과에 따르면, 19, 20-디하이드록시에치눌린 A (1)는 무색의 오일로 HREI-MS 및 ¹³C NMR 데이터의 검토에 의해 분자 조성은 C₂₄H₃₁N₃O₄로 결정되었다. HREI-MS에서, 11개의 불포화도가 계산되어, 이는 화합물 1이 2개의 카르보닐기, 6개의 이중결합과 3개의 고리를 가지고 있는 것으로 추측할 수 있다. IR 스펙트럼에 서, 화합물 1은 복합 하이드록실기 및 아민 (3358, 3262 cm^-1), 및 아미드(1673, 1629 cm1) 작용기 유래의 흡수 시그널이 관찰되었다. UV 스펙트럼에서, 아미드[209 nm (logε3.9), 226 (3.9)] 와 컨쥬게이티드 인돌[289 nm (3.4), 340 (3.5)] 발색단의 존재가 추정되었다. ¹H NMR 스펙트럼에서는, 5개의 프로톤이 D₂O에 의해 치환되어, 이는 화합물 1이 한 개의 방향족 아민 프로톤[δ10.91 (H-1)], 2개의 아미드 프로톤[δ8.36 (H-11), 8.51 (H-14)] 및 2개의 하이드록실 프로톤[δ4.11 (19-OH), 4.16 (20-OH)]를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 표 3에 나타난 바와 같이, ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼에서는 메틸기가 치환된 디케토피페라진[δ8.36(H-11), 4.10 (H-12), 8.51 (H-14), 1.39 (H₃-25), 124.8 (C-9), 160.0 (C-10), 51.0 (C-12), 166.6 (C-13), 20.3 (C-25)], 3치환 인돌(trisubstituted indole)[δ10.91 (H-1), 7.02 (H-4), 6.98 (H-6),7.29 (H-7), 144.0 (C-2), 103.1 (C-3), 126.2 (C-3a), 119.2(C-4), 132.3 (C-5), 123.0 (C-6), 111.1 (C-7), 133.9 (C-7a)], 이소펜테닐(isopentenyl, [δ6.06 (H-16), 5.01, 5.03 (H₂-17), 1.45,1.46 (CH₃-23/24), 39.2 (C-15), 145.4 (C-16), 111.6 (C-17),27.6 (C-23), 27.7 (C-24)]), 디하이드록시이소펜타닐(dihydroxyisopentanyl)[δ2.36(Ha-18), 2.93 (Hb-18), 3.27 (H-19), 1.09, 1.06 (H₃-21/22),4.11 (19-OH), 4.16 (20-OH), 38.0 (C-18), 80.0 (C-19), 72.0(C-20), 26.5 (C-21), 24.7 (C-22)], 및 3치환 이중결합(trisubstitited double bond)[δ6.87 (H-8), 110.8 (C-8), 124.8 (C-9)]의 시그널이 관찰되었다.

화합물 1에서 각 작용기 간의 연결은 COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY 의 실험결과로 가능하였다. 즉, H-4과 C-18; H-6과 C-18; H-8과 C-2, C-3a, 및 C-10; H-16 과 C-2; H-18 과 C-4, C-6 및 C-19; H-19 과 C-5의 HMBC 교차시그널에 의해 화합물 1의 평면구조가 결정되었다.

그리고, H-11의 결합상수(1.9 Hz)로부터 H-12는 유사수평방향의 배향 (pseudoequatorial orientation)을 취하고 있는 것으로 추정되었다.

실시예 1에서와 같이, C-12에서의 절대배치는, Marfey법에 의해 12S로 결정하였으며, C-8/C-9 이중결합의 기하학적 구조는 9-카르보닐기에 의한 H-8의 디쉴딩 효과와 H-8 및 H₃-23 및 H₃-24 간의 NOE 결과에 의해 Z-입체배치로 결정되었다.

화합물 1에서 C-19의 절대배치는 HOREAU 법에따라 반응을 행한 후 회수된 α-phenylbutyric acid의 비선광도가 [α]_D+ 4.9^o로 관찰되어 19R로 판명되었다.

또한, 화합물 1의 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용은 실시예 2의 실험예 1과 2에 따라 실시하였다. 그 결과, 화합물 1은 DPPH 라디칼을 유의성 있게 소거하였으며 (IC₅₀, 20 μM), 이는 양성 대조군으로 사용된 아스코르빈산과 같은 소거능을 보였다. 또한, 화합물 1의 자외선 A 차단 능(ED₅₀=130 μM)은 현재 자외선 차단제로 사용되는 옥시벤존 (ED₅₀=350 μM)보다 2.7배 더 강한 활성을 보였다.

상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 해양균류 아스퍼질러스속에서 분리한 라디칼 소거작용과 자외선-A (UV-A) 차단작용이 있는 신규 화합물에 관한 것으로, 해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 분리한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균주는 얻은 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용이 있는 신규 화합물 골매논과 대사물질인 디하이드록시이소에치눌린 A를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명 신규 화합물인 골매논과 대사물질인 디하이드록시이소에치눌린 A는 현재 일반적으로 자외선 차단제로 사용되고 있는 옥시벤존보다도 월등히 뛰어난 UV-A 차단활성을 가지는 효과가 있으므로 화장품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 분리한 아스퍼질러스 에스피(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물에서 분리된, 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용이 있음을 특징으로 하는 하기 구조식 (1)로 표시되는 디하이드록시이소에치눌린 A (dihydroxyisoechinulin A):

...(1)
해양 홍조류인 마디잘록이(Lomentaria catenata)에서 분리한 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) MFA 212 KACC 93012 균주 배양액의 에틸아세테이트 추출물에서 분리된, 라디칼 소거능과 자외선 A 차단작용이 있음을 특징으로 하는 하기 구조 식 (2)로 표시되는 골매논(Golmaenone):

...(2)
제1항 또는 제2항 기재의 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 자외선 A 차단제용 조성물.
제1항 또는 제2항 기재의 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 라디칼 소거제용 조성물.