KR20060023885A

KR20060023885A - 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 함유하는조성물

Info

Publication number: KR20060023885A
Application number: KR1020040072799A
Authority: KR
Inventors: 백흠영; 김윤철; 강태현
Original assignee: 정우약품공업 주식회사
Priority date: 2004-09-11
Filing date: 2004-09-11
Publication date: 2006-03-15

Abstract

본 발명은 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 백작약 및 감초 추출물은 항산화활성을 가지고 있어서 뇌허혈에 의해 유도되는 신경세포 손상을 보호하는 효과가 있으므로, 이를 포함하는 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 즉, 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병 등의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

작약감초탕, 백작약, 감초, 항산화활성, 신경세포 보호, 뇌허혈, 퇴행성 뇌질환, 약학조성물, 건강기능식품.

Description

항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 함유하는 조성물{Composition comprising the extract of Paeoniae Radix and Glycyrrhizae Radix having anti-oxidative activity}

도 1a는 t-BHP(tert-Butyl hydroperoxide)투여시의 세포생존율을 보여주며, 도 1b, 도 1c와 도 1d는 쥐의 해마신경세포 HT22세포에 t-BHP투여하기전에 작약감초탕 추출물(도 1b), 백작약 추출물(도 1c), 감초 추출물(도 1d)을 투여한 경우의 세포생존율을 보여주며,

도 2는 작약감초탕 추출물, 백작약 추출물과 감초 추출물의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 제거활성을 보여주며,

도 3은 작약감초탕 추출물, 백작약 추출물과 감초 추출물의 슈퍼옥사이드(superoxide)의 제거활성을 나타낸 도이다.

본 발명은 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하 는 조성물에 관한 것이다.

통계청에서 2003년 10월 발표한 우리나라 노령 인구의 비율을 살펴보면, 우리나라는 지난 2000년 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 오는 2019년에는 이 비율이 14 %를 넘어 고령사회에 진입할 것으로 전망되고 있다. 이와 같이 최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 이러한 변화의 핵심은 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여년 간 사망의 주된 원인이 되었던 급성전염성질병보다는 만성퇴행성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두되고 있다는 점이다. 특히 만성퇴행성 질병 중에서 뇌혈관질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다.

뇌혈관질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소, 부종(edema)이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69, 1982).

지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J. Neurocytol., 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사, 2가지 기전에 있다(Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM. J. Biomed. Sci., 5 , pp401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz. 6, pp169-180, 1998).

이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서 직접적으로 신경세포 를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용 또는 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다.

또한 초기의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.

한편 국내의 경우, 다수의 천연물질이 뇌졸중 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.

따라서, 오랫동안 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급히 요구된다.

t-BHP(tert-Butyl hydroperoxide)는 지질 과산화의 유사물로서 포유동물의 세포에서 산화적인 스트레스를 유도하는 것으로 알려져있다(Gebhardt R., Antioxidative and protective properties of extracts form leaves of the artchoke(Cynara scolymus L.) against hyeroperoxide-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes. Tosicol. Appl.Phacmacol. 144, pp279-286, 1997; Hogberg et al., Further studies on lipid peroxide formation in isolated hepatocytes.Eur.J.Biochem. 59, pp449-455, 1975). t-BHP는 미립자의 시토크롬 P450 시스템에 의해 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 대사되어지고, 이들은 연쇄적으로 지질 과산화를 유도하고, 세포의 환원된 글루타치온(GSH)을 감소시켜 세포손상을 야기시킨다.(Davies, M.J., Detection of peroxyl and alkoxyl radicals produced by reaction of hydroperoxides with rat liver microsomal fractions. Biochem. J. 257: pp603-606, 1989; Thornalley, P., R.J. Trotta and A. Stern., Free radical involvement in the oxidative phenomena induced by tert-butyl hydroperoxide in erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 759: pp16-22, 1983.)

이 현상은 세포나 조직에서 일어나는 산화적 스트레스와 유사하다. 이 산화적 스트레스는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 또는 치매 등과 같은 퇴행성 뇌질환에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.(Behl, C., J.B. Davis, R. Lesley and D. Schubert., Hydrogen peroxide mediates amyloid b protein toxicity. Cell 77: pp817-827: 1994, Coly, J.T. and P. Puttfarcken., Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262: pp689-695: 1993, Makkesbery, W.R. Oxidative stress hypothesis in Alzhiemer's disease. Free Radical Bio. Med. 23: pp134-147:1997, .Simonian, N.A. and J.T. Coly., Oxidative stress in neurodegenerative diseases. Ann. Rev. Pharmacol., 36: pp83-106: 1996).

작약감초탕(Jakyak Gamcho Tang, Shaoyao Gancao Tang, JGT)은 전통적인 중국 의료 처방으로, 백작약(Paeoniae Radix, PR)과 감초(Glycyrrhizae Radix, GR)로 구성되어 있다.

작약감초탕의 구성성분의 하나인 백작약(Paeonia Radix)의 성분은 뿌리에는 패오니플로린(paeoniflorin)이 함유되어 있고 정유, 지방유, 수지, 탄닌(tannin), 당, 전분, 점액질, 단백질이 들어있고, 그 외에 안식향산이 0.92% 포함되어 있다. 백작약의 약리로는 복부경련을 진정시키는 진경작용,순환계에 대해서는 강압작용, 또한 진통, 진정, 항경련작용이 있으며, 항염, 항궤양 작용과 항균작용이 있는데, 이들은 백작약의 성분중에서 패오니플로린에 기인한 것이다(정 보섭 및 신 민교, 향약대사전, 영림사, pp534-525, 1998).

작약감초탕의 또 다른 구성요소인 감초(Glycyrrhizae Radix)의 성분으로는 감초의 뿌리와 근경에는 트리테르핀(triterpene)계 사포닌(saponin), 글리시리진(glycyrrhizin)이 함유되어 있다. 이것은 글리시레틴(glycyrrhetin) 산의 2-글루쿠론(glucuron) 산 배당체로 감초의 감미성분이다. 이 배당체에는 용혈작용은 없으나 글리시레틴산에는 있다. 감초근의 가수분해 중에는 우라렌(uralen)산이 추출되어 이것이 18α-글리시레틴(18α-glycyrrhetin)산이라는 것이 증명되었다. 또 감초에는 다종의 플라보노이드(flavonoid)가 함유되어 있다. 감초가 함유하고 있는 글리시리진은 약물중독, 식물중독, 체내대사물의 중독뿐만 아니라 세균독소, 즉 파상풍, 디프테리아독소 등에 대한 모든 해독작용을 가지며, 글리시리진과 글리시레틴산은 현저한 항이뇨작용을 가지고 글리시레틴산은 또 신상선피질호르몬양의 작용이 있다(정 보섭 및 신 민교, 향약대사전, 영림사, pp684-687, 1998).

상기와 같은 성분과 효능을 지닌 백작약 및 감초로 이루어진 작약감초탕은 중국,한국 또는 일본에서는 통각상실(analgesia), 항경련(anti-spasm)과 관련된 임 상적인 징후들이 나타나는 경우에 사용되어져 왔다.

그러나 백작약 및 감초 추출물이 항산화활성을 나타낸다는 것은 상기 문헌 어디에도 교시하거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자는 백작약 및 감초 추출물의 t-BHP에 의해 유발되는 산화적인 손상, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 슈퍼옥사이드(superoxide)에 대한 효과를 확인하여 상기 추출물이 뇌허혈성 신경세포 사멸에 대한 억제 활성 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다.

상기 백작약 및 감초 추출물은 백작약과 감초의 생약 건조 중량을 기준으로 1 내지 5 : 1의 비율, 바람직하게는 1 내지 2 : 1의 비율로서 혼합된 것을 제공한다.

상세하게는, 본 발명은 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성 분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 백작약 및 감초 추출물은, 백작약과 감초를 햇볕에 건조하고, 이 건조 중량을 기준으로 1내지 5 : 1, 바람직하게는 1 내지 2 : 1의 비율로 혼합한 다음, 이 혼합된 백작약과 감초의 건조 중량의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 50℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 5일, 바람직하게는 1일 내지 5일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 제조방법에 따라 얻어진 백작약 및 감초 추출물을 말한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환으로는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병이 포함될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼 슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 백작약 및 감초 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본원에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며 하기에 예시한다.

본 발명의 건강 기능 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사 카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

이 외 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물: 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그다지 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백작약 및 감초 추출물의 제조

1-1. 백작약 및 감초 추출물 제조

백작약(Paeoniae Radix)과 감초(Glycyrrhizae Radix)는 경동시장 약재상에서 구입하였다. 백작약과 감초 각각의 생약 건조 중량을 기준으로 1 내지 2 : 1의 비율로 하여 작약감초탕을 조제하였다. 이 작약감초탕 80g을 80℃ 물 1ℓ를 가하여 40분동안 3회에 걸쳐 열수추출법으로 추출한 후에 여과한 여액을 냉동건조하여 조추출물을 얻어 이를 -20℃에서 보관하였다. 작약감초탕은 16.5w/w%의 추출물을 얻었다.

1-2. 백작약과 감초의 추출물 제조

백작약 및 감초 추출물의 항산화활성을 실험하기 위하여, 이와 비교하기 위하여 작약감초탕의 성분인 백작약과 감초의 추출물을 제조하였다. 경동시장에서 구입한 백작약과 감초를 각각 40g을 상기 실시예 1-1의 과정과 동일한 과정을 거쳐 백작약과 감초 추출물을 추출하였다. 그 결과, 백작약은 11.9w/w% , 감초는 25w/w%의 추출물을 각각 수득하였다.

참고예 1. 시약 및 세포배양

1-1. 시약

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), NBT(2,2'-di-p-nitrophenyl-5,5'-diphenyl- 3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylene)-ditetrazolium chloride), NADPH(nicotinamide adenine phosphate), PMS(phenazine methosulfate) 그리고 에탄올은 시그마케미컬사(the Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

t-BHP는 알드리치(Aldrich)에서, 세포배양물질은 지브코 비알엘(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 또한 HT22 세포는 아주대학교 (묵인희 박사 연구실)에서 분양을 받아서 본 실험에 사용하였다.

1-2. 세포배양

HT22 세포는 HT4 해마세포라인(HT4 hippocampal cell line)의 서브클론으로쥐의 해마 HT22세포로서, 10% 열불활성되는 FBS, 페니실린 G(penicillin G, 100 IU/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin, 100 ㎍/㎖), L-글루타민(L-glutamine, 2mM)을 함유한 DMEM배지에서 1× 10⁶cells/㎖로, 5% CO₂와 95% 공기를 포함하는 습한 대기상태에서 37℃에서 배양하였다.

실험은 대조군, t-BHP 투여군, 시료전처리군의 세군으로 시행하였고, 대조군은 t-BHP와 시료 어느것도 투여하지 않은 군이고, t-BHP 투여군은 60μM의 농도로 24시간동안 처리한군이며, 시료전처리군은 t-BHP를 투여하기 전에 상기 실시예 1-1에서 수득한 백작약 및 감초 추출물과 실시예 1-2에서 수득한 백작약과 감초 추출물을 3시간동안 투여하였다. 이 추출물들은 초기에 스탁 솔루션(stock solution)으 로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 배지용액으로 희석하였다. DMSO는 각 실험군과 대조군에서 항상 0.1%를 유지하였으며 이 농도는 하기 실험에서 세포의 성장과 생존률에 어떠한 관련된 효과를 보여주지 않았다.

실험예 1. MTT 세포 독성 실험

MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 세포독성실험은 모스만 방법(Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65: pp55-63, 1983)에 따라 수행하였다. MTT 용액을 상기 참고예 1-2에서 수득한 대조군, t-BHP투여군, 시료전처리군에 50㎍/㎖의 농도로 첨가하여 37℃에서 4시간동안 배양한뒤, 이 배지는 제거하고 세포내에 형성되는 포마잔블루(formazan blue)를 50 ㎕ DMSO에 용해시켰다. 그 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 광학밀도를 측정하였다. 대조군에서 형성된 포마잔의 광학밀도는 100%의 활성을 보였다.

상기 실시예 1-1에서 수득한 백작약 및 감초 추출물과 실시예 1-2에서 수득한 백작약, 감초 추출물의 t-BHP에 의해 유도된 세포독성에 대한 보호효과를 알아보기 위하여, 쥐 해마 신경 세포 HT22세포에 20 내지 100μM의 농도로 24시간동안 t-BHP를 처리한 결과, 산화적 스트레스에 의해 유도된 세포 사멸은 도 1a에서 보는 바와 같이 t-BHP의 농도의존적임을 확인할 수 있었다.

t-BHP의 60μM를 투여한 경우에는, 대조군의 경우 32%의 세포생존률을 보였 으며, 실시예 1-1에서 수득한 작약감초탕 추출물(도 1b참조), 실시예 1-2에서 수득한 백작약 추출물(도 1c참조), 감초 추출물(도 1d 참조) 각각으로 3시간동안 전처리한 군에서는 t-BHP투여군과 비교해서 높은 세포생존률을 확인할 수 있었다.

각 추출물을 200㎍/㎖로 투여한 경우, 작약감초탕은 12.6%, 백작약은 52.97% 그리고 감초는 7.8%의 세포생존율을 보여 백작약의 t-BHP에 대한 세포보호효과가 월등히 우수하고, 또한 작약감초탕 역시 감초에 비하여 세포보호효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다. α-토코페롤을 양성 대조군으로 이용하였으며, 이는 IC₅₀138μM에서 농도의존적으로 세포생존률이 증가하였다.

실험예 2. DPPH 라디컬 실험

DPPH 라디컬 제거활성에 대한 실험은 블로이스(Blois, M.S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature 181: pp1199-1200, 1958.) 방법에 따라 수행하였다. 반응혼합용액은 0.1mM DPPH-에탄올 1㎖, 에탄올 1㎖, 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 0.95㎖ 와 시료 50㎕ 또는 탈이온화된 물로 이루어졌다. DPPH 자유 라디컬 반응은 시료첨가후 정확히 30초간 517nm에서의 흡수율을 측정하였다. 양성 대조군으로 L-아스코르브산을 이용하였다.

상기 실시예 1-1에서 수득한 백작약 및 감초 추출물, 실시예 1-2에서 수득한 백작약, 감초 추추물의 자유라디칼 제거활성을 확인하기 위하여, 각각의 추출물의 DPPH 제거활성을 측정하였으며, L-아스코르브산을 양성 대조군으로 사용하였다. 상 기 실험 수행의 결과, 도 2에서 나타난바와 같이 작약감초탕의 경우 IC₅₀ 이 112.2 ± 5.02㎍/㎖으로 백작약(IC₅₀ : 53.26 ± 3.09 ㎍/㎖)에 비해서는 DPPH 라디컬 제거활성이 저조하지만 감초(IC₅₀ : 466.2 ± 4.99㎍/㎖)에 비해서는 월등한 DPPH 라디컬 제거활성을 보임을 확인할 수 있었다. 양성 대조군인 L-아스코르빈산은 IC₅₀50.3μM의 제거활성을 나타났다.

실험예 3. 슈퍼옥사이드 실험

슈퍼옥사이드는 NBT(nitroblue tetrazolium) 환원법으로 실험수행하였다(Robak, J. and R.J. Gryglewski., Flavonoids are scavengers of superoxide scavengers and antioxidants. Biochem. Pharmacol. 37: pp837-841, 1988.). 반응용액 250㎕는 10mM PMS, 78 mM NADH, 25 mM NBT와 각 시료를 첨가한 0.1M 인산완충액(pH 7.4)에서 사용하였다. 실온에서 5분간 방치한 뒤, NBT환원의 비율을 실험용액과 완충액 대신 PMS로 대체된 무처리용액의 사이에서 560nm에서의 흡수율로 측정하였다. 트롤록스(Trolox; 알드리치사 제품)를 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 실험 수행의 결과 도 3에서 보는 바와 같이, 작약감초탕, 백작약 또는 감초 추출물은 슈퍼옥사이드의 생성을 저해함을 확인할 수 있었다. 이 중에서 작약감초탕은 IC₅₀ 이 55.1±1.36㎍/㎖으로서 백작약 (IC₅₀ : 45.9 ± 0.76㎍/㎖)에 미치지는 못하지만 감초(IC₅₀ : 87.7 ± 1.36㎍/㎖)에 비해서는 우수한 슈퍼옥사이드 생성 제거활 성을 확인할 수 있었다. 양성 대조군인 트롤록스는 IC₅₀ 52.3μM을 보였다.

실험예 4. 급성독성 실험

4-1. 경구투여

ICR계 마우스(몸무게 25　± 5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

4-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25± 5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 25, 50, 100 및 200㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

하기에 본 발명의 백작약 및 감초 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1-1의 추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1-1의 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1-1의 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1-1의 추출물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1-1의 추출물 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1-1의 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1-1의 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상술한 바와 같이, 항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으 로 함유하는 조성물은 뇌허혈시 발생되는 신경세포사를 저해하는 효과가 탁월하여 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품 또는 건강보조식품으로 사용될 수 있다.

Claims

항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 백작약과 감초의 생약 건조 중량을 기준으로 1 내지 2 : 1의 비율로 혼합됨을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매로 추출된 약학조성물.
제 3항에 있어서, 상기 추출물은 물로 추출된 약학조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사 유발에 기인한 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크 (Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병인 약학조성물.
항산화활성을 갖는 백작약 및 감초 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 건강음료인 건강기능식품.