KR20050105122A

KR20050105122A - 솔잎 추출물을 함유하는 뇌세포 보호 또는 뇌졸중 치료를위한 건강 보조식품

Info

Publication number: KR20050105122A
Application number: KR1020050092814A
Authority: KR
Inventors: 전향숙; 김원기; 김현정; 최은혜; 장남수
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2005-10-04
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2005-11-03

Abstract

본 발명은 솔잎 추출물을 함유하는 뇌세포 보호 또는 뇌졸중 치료를 위한 건강보조식품에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 다양한 뇌신경계의 손상으로 인한 뇌졸중과 같은 뇌손상이 유발된 신경세포를 보호하는 효과가 있다.

Description

솔잎 추출물을 함유하는 뇌세포 보호 또는 뇌졸중 치료를 위한 건강 보조식품{Health assistance food for nerve cell protection or treatment of stroke containing pine needle extract}

본 발명은 솔잎 추출물을 함유하는 뇌세포 보호 또는 뇌졸중 치료를 위한 건강보조식품에 관한 것이다.

뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하므로 허혈성 뇌졸중이 심각한 질환이라고 할 수 있다. 최근 신경계는 비면역성 기관(immune privileged organ)이라는 기존의 학설과는 달리 다발성 경화증(multiple sclerosis), 외상, 알쯔하이머 질환(Alzheimer's disease), 뇌허혈(cerebral ischemia) 및 각종 뇌손상 등의 신경 질환시에 중추신경계 내에서도 염증반응이 나타나며 이는 신경퇴행을 야기하는 주요 원인 중의 하나임이 보고되고 있다.

뇌졸중은 선진국의 고령화 층에서 사망의 주요원인이며, 건강 관리 비용에 있어서 큰 비중을 차지하고 있다(Davenport et al. Journal of Neurology, 2000, Vol. 68, p277.). 이러한 뇌졸중을 유발시키는 가장 일반적인 원인인 뇌 허혈증은 뇌손상 및 영구적인 신경학상 장애의 원인이다. 또한, 실험적 모델 등을 이용하여 뇌졸중으로 유도되는 신경 손상의 생물학적 메카니즘을 보다 자세하게 이해하기 위한 연구가 다양하게 진행되고 있으나, 뇌졸중으로 인한 여러 형태의 손상으로부터 신경세포를 보호하려는 향상된 치료방법을 개발하여 임상적으로 적용하기는 아직 어려운 실정이다(Endres et al. Molecular and Cellular Biology of Neuroprotection in the CNS., 2002, Vol. 513, p455.).

한편, 한국 및 중국 등의 동양권 국가에서는 뇌졸중 증상을 완화시키기 위해 약초를 이용한 다양한 치료방법을 사용하여 왔으며, 우리나라에서는 많은 의학적 식물 추출물을 치료제로 이용하여 뇌혈관 질환 등에 사용하여 왔다. 또한, 여러 가지 식품에 함유되어 있는 성분들이 허혈성 뇌손상에 대해 잠재적인 보호 효과가 있음이 알려져 있는데, 구체적으로는 포도주 성분인 레스베라트롤(resveratrol)(Virgili et al. Neuroscience Letters, 2000, Vol. 281, p123.), 숙성마늘에서 추출한 타이오알릴(thioallyl) 화합물(Numagami et al. Neurochemistry International, 1996, Vol. 29, p135.), 녹차 성분인 (-)-에피갈로카테친(epigallocatechin)(Lee et al. Neuroscience Letters, 2000. Vol. 287, p191.) 및 정향나무 성분인 유지놀(eugenol)(Wie et al. Neuroscience Letters, 1997, Vol. 225, p93.) 등이 허혈성 뇌손상에 대한 효과적인 신경세포 보호제로 잘 알려져 있다. 따라서, 매년 뇌 허혈증을 겪는 대부분의 사람들에 있어서, 재발되는 허혈성 발작 또는 뇌졸중의 위험요소를 감소시키는 보다 효과적인 방법은 식이요법 또는 신경세포보호작용을 나타내는 식품에 함유된 성분을 통해 가능할 것이다.

상기 제시된 뇌질환 치료효과와 관련하여, 식물 추출물 중 솔잎 추출물은 종래의 민간요법으로 중풍, 고혈압, 비만증, 빈혈, 요통 및 이질 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 종래의 특허문헌들에서는 솔잎 추출물의 발모, 항균 및 세정효과 등이 주로 기재되어 있다.

구체적으로, 미국특허 제6,329,000호에서는 솔잎 추출물을 이용하여 고혈압, 당뇨병, 관상동맥질환, 협심증, 부정맥, 심근염, 고지혈증, 고혈액점도, 고혈액응집, 뇌경색, 동맥경화증 및 노인성치매 등을 치료할 수 있다고 기재되어 있으나, 이는 주로 솔잎 추출물이 혈액의 흐름을 원활하게 해주며, 혈관에 존재하는 지방수치를 감소시킨다는 결과 등을 제시할 뿐, 뇌졸중을 유도한 동물모델이나 세포를 이용하여 뇌졸중 치료효과를 입증한 실험은 기재되어 있지 않다.

즉, 뇌졸중 치료에 있어서 활성물질이 세포수준에서는 효과적일 수 있으나, 생체 내(in vivo)의 경우 특히, 뇌 신경세포 활성이나 보호 효과를 나타내기 위해서도 혈액-뇌-장벽(Blood Brain Barrier)을 통과하여 뇌세포까지 이동해야 하므로 생체 내 실험은 필수적이다.

이에, 본 발명자들은 뇌졸중 예방 또는 치료제 개발을 위하여 여러 가지 식물 원료로부터 식물 추출물을 수득한 후, 이를 유사 허혈 모델 및 뇌허혈 동물모델(국소 허혈 모델 및 전뇌 허혈 모델)에 처리하여 뇌졸중 예방 및 치료효과를 조사한 결과, 솔잎 추출물이 가장 뛰어난 효능을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 활성성분으로서 솔잎 추출물 및/또는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조제를 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료에 효과적인 건강 보조식품을 제공하고자 한다.

첫 번째 관점으로서, 본 발명은 활성성분으로서 솔잎 추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

활성성분으로서 솔잎 추출물을 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강 보조 식품에 관한 것으로,

상기 솔잎 추출물의 성분이 5 내지 15중량%의 보닐 아세테이트(bornyl acetate), 1 내지 10중량%의 카리오필렌(caryophyllene), 1 내지 10중량%의 트렌스-버베놀(trans-Vervenol), 1 내지 10중량%의 보르네올(borneol), 1 내지 10중량%의 델타-카딘(δ-cadinene), 1 내지 10중량%의 p-키맨-8-올(p-Cymene-8-ol), 5 내지 15중량%의 카리오필렌 산화물(caryophyllene oxide), 1 내지 10중량%의 메틸 유지놀(Methyl Eugenol), 5 내지 15중량%의 스파투레놀(Spathulenol), 1 내지 10중량%의 5-m메톡시-2,8,8-트리메틸-디피란-4-원(5-mMethoxy-2,8,8-trimethyl-dipyran-4-one), 5 내지 15중량%의 툰버골(thunbergol) 등으로 이루어진 것을 특징으로 하는 뇌졸증 예방 및 치료용 건강 보조식품을 제공한다.

상기 솔잎추출물은 보닐 아세테이트, 카리오필렌 산화물, 스파투레놀, 5-m메톡시-2,8,8-트리메틸-디피란-4-원 및 툰버골 성분이 다량으로 포함되어 있는 것이 바람직하다.

상기 솔잎 추출물은 일반적으로 식품 조성물에는 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 음료 조성물에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명에 따른 건강보조식품에는 상기 솔잎 추출물에 식품학적으로 허용되는 식품보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물에 사용되는 식품보조제는 식품 분야에서 통상적으로 사용하는 향미제 또는 천연 탄수화물 등이 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

또한 추가적으로, 상기 솔잎 추출물은 1 내지 10중량%의 알파-파이넨(α-pinene) 및 1 내지 10중량%의 베타-파이넨(β-pinene)이 함유될 수 있다.

상기 솔잎 추출물을 제조하기 위한 소나무 종류로는 이에 한정되지 않으나 Pinus densiflora , Pinus thunbergii , Pinus pumila , Pinus rigida , Pinus banksiana, Pinus bungeana , Pinus palustris , Pinus koraiensis , Pinus sylvestris 또는 pinus strobus 등을 사용할 수 있으며, 일부 전나무 종류로서 Abies alba 또는 Abies picea 등도 사용할 수 있다.

또한, 상기 솔잎 추출물 대신에 소나무의 잎, 열매, 꽃, 껍질 등을 사용한 소나무 추출물이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 솔잎을 사용할 수 있다.

한편, 솔잎 추출물을 수득하는 공정으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 시료인 솔잎 부피의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 5 내지 10배의 물, 저급 알콜 또는 이들의 약 1 : 0.1 내지 1 : 10, 바람직하게는 1 : 1 내지 1 : 3의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 2일, 바람직하게는 약 2시간 내지 1일 정도에서 증류, 초음파 추출, 환류 추출 등의 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 상기와 같은 용매를 이용하지 않고 압착 고난도 방법으로 초임계 추출로도 본 발명의 솔잎 추출물을 수득할 수 있다.

상기 추출공정으로부터 수득된 솔잎 추출물을 함유하는 본 발명의 건강식품보조제는 뇌졸중을 예방 또는 치료에 유용하며, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중을 치료를 보조할 수 있다.

한 양태로서, 상기 건강 보조식품 조성물의 필수 성분으로서 본 발명의 솔잎 추출물 이외에 첨가되는 액체성분으로는 이에 한정되지는 않으나 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들면, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

다른 양태로서. 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 약 10 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 용어 "허혈성 뇌졸중"이란 뇌조직에 혈액을 공급하는 혈관이 막히거나 터져서 뇌조직에 혈액순환이 차단된 상태를 의미한다.

본 발명에 따른 솔잎 추출물이 뇌졸중을 예방 또는 치료하는데 효과적이라는 것을 증명하는 방법으로는 유사 허혈 모델(Simulated in vitro ischemia model)조건을 조성하여 이에 상기 솔잎 추출물을 처리하여 신경세포 보호활성을 측정하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "유사 허혈 모델"이란 뇌조직이 혈액순환에 의해 지속적인 산소공급이 필요하다는 점과 혈액중의 포도당을 흡수하여 산화시켜 얻은 에너지를 뇌조직이 이용한다는 점을 이용한 것으로 산소 및 포도당의 결핍(hypoxia 및 hypoglycemia) 상태로 허혈조건을 조성한 후, 이를 다시 회복시킨 조건(reperfusion)을 결합시킨 신경 세포주를 의미한다. 따라서 본 발명에서는 허혈상태의 신경세포에 본 발명의 솔잎 추출물을 처리하였을 때 신경세포 보호활성이 나타난다는 것을 증명할 수 있다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 솔잎 추출물이 뇌졸중을 예방 또는 치료하는데 효과적이라는 것을 증명하는 바람직한 방법으로는 뇌허혈 동물모델 (국소허혈 모델 및 전뇌허혈 모델)에 상기 솔잎 추출물을 투여하여 그 효과를 입증할 수 있다.

본 발명의 용어 "뇌허혈 동물모델"이란 실험용 동물을 이용하여 뇌로 혈액을 공급하는 혈관을 차단하여 허혈조건을 조성한 동물을 의미한다. 이러한 뇌허혈 동물모델은 사람의 뇌혈관 질환과 병리학적, 생리학적인 측면에서 유사하다. 특히, 뇌에는 혈액-뇌-장벽(Blood Brain Barrier)이 존재하므로 이를 통과하여 신경세포를 보호한다는 효과를 증명할 수 있는 모델로서 상기 뇌허혈 동물모델이 가장 적합할 것이다. 따라서 본 발명에서는 뇌허혈 동물모델에 본 발명의 솔잎 추출물을 투여하였을 때 신경세포의 손상방지 및 보호활성을 나타낸다는 것을 증명할 수 있다(실시예 4 및 5 참조).

본 발명의 솔잎 추출물을 함유하는 뇌졸중 예방 또는 치료 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질 (예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질 (예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명의 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 비내, 정맥내, 복강 내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

한 양태로서, 본 발명의 조성물을 경구용 고형제로 제형화하는 경우, 활성성분과 함께 희석제 (예를 들면, 락토즈, 덱스트로, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제 (예를 들면, 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제 (예를 들면, 전분, 아라빅검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제 (예를 들면, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제 (예를 들면, 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명의 조성물은 용액, 유탁액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 등의 경구 투여용 액상 조성물로 제형화하는 경우, 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예, 정제수, 에탄올)를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 액상 조성물은 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제 및 현탁제, 감미제, 향료 방향제 및 방부제를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 조성물은 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 (예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액 (예, 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일 (예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해, 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다. 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.

본 발명의 조성물과 관련하여 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 적용되는 뇌졸중에 대해 예방 또는 치료효과를 나타내는 활성성분의 양을 의미한다. 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로 주사제의 경우 1 내지 500㎎, 바람직하게는 50 내지 300㎎을 1일 1 내지 수회로 나누어 투여하고, 경구 투여제의 경우 일반적으로 1 내지 2,000㎎ 바람직하게는 100 내지 1,000㎎을 1일 1 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

<실시예>

실시예 1

솔잎 추출물의 제조

분쇄된 건조 솔잎 50g 및 상기 솔잎량의 10배 정도의 증류수를 플라스크에 넣고 80℃에서 3시간동안 환류 가열하여 솔잎 추출액을 수득하였다. 상기 추출액을 여과한 후, 동결건조기(일산, 대한민국)에서 동결건조하여 -70℃로 보관하였다. 이때 추출물의 수득율은 19.2%였다. 상기 솔잎 추출물은 소량의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하고 PBS(phosphate buffer saline)로 희석하여 시료로 사용하였다.

실시예 2

솔잎 추출물을 처리한 유사 허혈 모델에서의 신경세포 보호활성 측정

사람 뇌 신경모세포종 세포주(human neuroblastoma cell line)인 SK-N-SH(ATCC 번호: HTB-11)를 2×10⁵의 농도로 24-웰 플레이트에 접종시킨 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 RPMI 1640 배지(Invitrogen Co., U.S.A.)에서 5일동안 배양하였다. 상기 배양된 세포주에 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물 0.1, 1, 5, 10 및 50㎍/㎖을 처리하여 실험군으로 사용하였고, 솔잎 추출물 대신 PBS를 동량 투여하여 대조군으로 사용하였다. 상기 실험군 및 대조군은 48시간 동안 배양하였다.

유사 허혈조건을 조성하기 위해 솔잎 추출물을 처리한 상기 세포주의 배지를 포도당을 제거한 RPMI 1640 배지로 교환한 후, 이를 N₂ : CO₂ : H₂ = 90 : 5 : 5로 유지시킨 무산소 챔버(Coy Laboratory Products Inc., U.S.A.)에 넣어 6시간 동안 배양하였다 (산소 및 포도당 결핍상태). 그 후 상기 세포주의 배지에 포도당 5.5mM를 첨가하고 챔버 내로 산소가 통과되도록 24시간 방치하여 정상적인 조건을 유지시켰다 (재관류(reperfusion) 상태). 이러한 유사 허혈 모델로부터 MTT 검정을 통한 세포 생존율을 측정하였다.

허혈 조건에서의 솔잎 추출물의 신경세포의 보호 활성은 대조군의 세포 생존율에 대한 솔잎 추출물을 처리한 세포주의 세포 생존율을 백분율(%)로 하여 유의도 수준을 평가하여 나타내었으며, 신경세포의 보호 활성을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 실험은 3회 반복하여 실시하였다.

유사 허혈 모델에서의 세포 생존율

조건	솔잎 추출물 처리량(㎍/㎖)	신경세포의 보호활성(%)
대조군	-	100.4±4.0^a
실험군	0.1	98±5.1
	1	104±2.1
	5	115±4.2^*
	10	121.5±4.9^*
	50	126.1±12.0^*

^a평균값 ± 표준편차

*p<0.01

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 유사 허혈 모델을 이용하여 신경세포 보호활성을 측정한 결과, 솔잎 추출물 처리량이 증가할수록 신경세포 보호활성이 높게 나타났다. 특히, 솔잎 추출물 처리량을 5㎍/㎖ 이상으로 유사 허혈상태의 세포주에 처리하였을 경우, 유의적으로 신경세포의 보호 효과를 나타내었다.

즉, 상기 결과로부터 본 발명자들은 솔잎 추출물이 허혈상태의 신경세포를 보호하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3

솔잎 추출물을 처리한 전뇌허혈 동물모델에서의 신경세포 손상 관찰

몽골리안 게르빌루스(Mongolian gerbils, 자성, 60 내지 70g)를 24시간 절식시킨 후, 질소 : 산소의 비율이 7 : 3으로 혼합된 가스 및 2.5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취시켰다. 마취 상태에서 경부를 절개하고 양쪽 온목동맥(carotid artery)을 5분 동안 결찰하여 허혈상태를 유발하여 이를 실험군으로 사용하였다. 이 때 체온은 워밍 패드(warming pad)를 사용하여 37±0.5℃가 유지되도록 하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물은 상기 허혈상태 유발 전 30분, 재관류 한 후 30분 및 재관류 한 후 2시간이 경과하였을 때 각각 500㎎/㎏을 경구 투여하였다. 대조군으로는 생리식염수를 경구 또는 복강 내로 투여하였다. 한편, 비교 실험을 위하여 외과적 수술을 가한 후, 온목동맥 결찰을 수행하지 않고 다시 봉합한 몽골리안 게르빌루스를 정상군으로 사용하였다.

상기 정상군, 대조군 및 실험군에 허혈상태 후 7일이 경과한 뒤에 클로랄 하이드레이트 400㎎/㎏를 각각 복강 내 투여하여 전신마취시켰다. 그 후 상기 실험동물들의 흉곽을 절개하여 심장의 좌심실을 통해 캐눌라(canula)를 오름대동맥(ascending aorta)에 삽입한 다음, 우심방을 통하여 방혈시킴과 동시에 주입기를 이용하여 생리식염수로 분당 10㎖의 속도로 관류 세척하였다. 그 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 전신을 관류 고정한 후 골절절단기를 이용하여 머리뼈를 절개하여 뇌를 적출하였다. 상기 고정된 뇌조직을 통상적인 조직처리 과정을 거쳐서 파라핀 포매를 한 다음 박절기를 이용하여 5㎛ 두께의 파라핀 연속절편을 수행하였다. 상기 연속절편의 파리핀을 크실렌(xylene)으로 제거하고 에탄올을 처리하여 신경세포의 분포 및 변성 여부를 확인하기 위하여 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하였다.

염색된 신경세포가 존재하는 부위는 해마(hippocampus)의 CA1이고 이를 이미지 분석기(Olympus, BX51, Japan)로 관찰하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 또한 이미지 분석기(Olympus BX51, Japan)로 ㎟당 살아있는 세포의 수를 각각 계산하여 비교함으로써 신경세포 손상정도를 측정하였다. 이를 하기 표 2에 나타내었다.

전뇌허혈 동물모델에서의 신경세포 손상정도 측정

처리조건	솔잎 추출물 투여량 (㎎/㎏)	투여경로	살아있는신경세포의수(수/㎟)
정상군	-	-	241±10.4^b
대조군	-	경구 또는 복강 내	27.7±4.0
실험군	500	경구	57.7±7.1^*

^b평균값± 표준편차

^*p<0.01

도 1에 나타낸 바와 같이, 뇌의 해마 CA1 부위의 신경세포 손상을 관찰한 결과, 정상군의 신경세포는 조밀하게 배열되어 있는 반면(A 및 D), 대조군의 신경세포는 손상되어 정상군에 비해 약 25% 만이 살아있는 신경세포였다(B 및 E). 반면, 솔잎 추출액을 처리한 실험군의 신경세포는 정상군과 비교하여 볼 때 약 60% 이상의 살아있는 신경세포가 존재함을 알 수 있었다(C 및 F).

또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 정상군, 대조군 및 실험군의 살아있는 신경세포의 수를 측정한 결과, 대조군의 살아있는 신경세포의 수보다 솔잎 추출물을 처리한 실험군의 살아있는 신경세포의 수가 높았으며 유의적으로 신경세포 보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4

솔잎 추출물을 처리한 국소허혈 동물세포에서의 경색용적 측정 및 관찰

스프라크 도리(Sprague-Dawley, 자성, 250 내지 300g) 레트(rat)를 24시간 절식시킨 후, 질소 : 산소의 비율이 7 : 3으로 혼합된 가스 및 2.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 마취 상태에서 경부를 절개하여 양쪽 온목동맥과 바깥목동맥을 결찰하고, 속목동맥의 분지점으로부터 17㎜의 프로브를 삽입하여 중간대뇌동맥의 바닥부위를 2시간 동안 폐쇄한 후 허혈상태를 유발하여 이를 실험군으로 사용하였다. 이 때 체온은 워밍 패드를 사용하여 37±0.5℃가 유지되도록 하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물을 상기 허혈상태 유발 전 30분, 재관류 한 후 30분 및 재관류 한 후 2시간이 경과하였을 때 100㎎/㎏ 및 300㎎/㎏을 복강 내로 투여하였다. 대조군으로는 생리식염수를 복강 내로 투여하였다.

상기 대조군 및 실험군의 일시적인 뇌허혈에 의해 유발되는 뇌조직 손상을 관찰하기 위해 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색을 수행하였다. 즉, 대조군 및 실험군의 뇌를 적출하여 뇌기질(brian matrix)을 2㎜ 두께로 절편한 후, 2% TTC 용액으로 37℃에서 60분간 반응시켜 염색하였다. 염색된 뇌 절편을 10% 중성 완충포르말린(neutral buffered formalin) 용액에 고정시킨 후 경색용적(infarct volume)을 이미지 처리 소프트웨어 패키지(image processing software package, Optimas 6.5, Olympus, Japan)를 사용하여 관찰 및 측정하였다. 이를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 실험군의 경색용적을 관찰한 결과, 대조군의 뇌기질에서는 경색부위인 흰색부위가 관찰되었다. 그러나 솔잎 추출물 300㎎/㎏을 처리한 실험군의 뇌기질에서는 경색부위를 관찰할 수 없었다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 실험군의 경색부위를 비교한 결과, 대조군의 경색용적은 23%이지만, 솔잎 추출물 100㎎/㎏ 및 300㎎/㎏을 각각 처리한 실험군에서는 경색용적이 10% 이하이며, 유의적으로 뇌의 경색용적을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 실시예 3 및 4의 결과에 있어서, 솔잎 추출물이 국소허혈 및 전뇌허혈 동물모델에서 신경세포를 보호하는 활성이 있다는 것은 생체 내에 솔잎 추출물을 투여하였을 때 뇌-혈관-장벽을 통과하여 뇌세포에 직접 작용함으로써 신경세포 보호 효과를 나타낸다는 것을 확인한 것이다.

실시예 5

솔잎 추출물의 퍼옥시니트라이트 ( peroxynitrite ) 소거효과

본 발명의 솔잎 추출물이 SIN-1(3-morpholinosydnonimine) 및 SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)에 의해 생성되는 퍼옥시니트라이트를 소거할 수 있는지를 측정하여 솔잎 추출물의 작용기전을 확인하고자 하였다.

먼저 200μM의 SIN-1 및 SNAP와 다양한 농도(1 내지 50㎍/㎖)의 상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물을 디메틸설폭사이드에 녹이고 37℃에서 20분간 배양하였다. 배양이 끝난 후 퍼옥시니트라이트에 의해 산화되어 형광을 발생하는 디히드로로다민(dihydrorhodamine)-123(DHR-123) 100μM을 상기 배양액에 가한 후 30분간 37℃에서 다시 배양시켜 536㎚(emission), 500㎚(excitation)에서 형광을 측정하여 솔잎 추출물의 퍼옥시니트라이트의 소거 작용의 정도를 측정하여 그 결과를 표 3 에 나타내었다.

솔잎 추출물의 퍼옥시니트라이트 소거작용

농도(㎍/㎖)	DHR-123의 산화율(%)
농도(㎍/㎖)	SIN-1	SNAP
0	100	100
1	93	93
5	73	95
10	60	89
20	53	83
40	39	57
50	33	29

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 솔잎 추출물은 SIN-1 및 SNAP에 의해 생성되는 퍼옥시니트라이트의 소거 활성이 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 6

활성화된 소교세포에서 솔잎 추출물에 의한 아질산염의 생성 억제

마우스 소교세포(microglial cell)계 BV2 세포(Weill Medical College of Cornell University, U.S.A.)를 24개의 웰 플레이트에 웰 당 10만개씩 분주하고 배지에서 하룻밤 배양한 후 100ng/ml의 LPS(Lipopolysaccharide) 및 상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물(1 내지 50μg/㎖)을 배양액에 넣어주고 24시간 동안 추가로 배양한 후, 그리스(Griess) 시약을 사용하여 배지로 유리되어 나온 아질산염의 양을 측정하였다. 이를 표 4에 나타내었다.

추출물 농도(μg/㎖)	아질산염(nmoles)
추출물 농도(μg/㎖)	LPS 비첨가구	LPS 첨가구
0	0.2	1.9
1	0.2	1.8
5	0.2	1.6
10	0.2	1.5
20	0.2	1.1
40	0.2	0.6
50	0.2	0.5

표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 솔잎 추출물은 20μg/㎖의 농도에서 LSP(100ng/㎖)에 의해 유리되는 아질산염의 양을 약 40%로 감소시켰으며, 40μg/㎖의 농도에서는 약 68%로 감소시켰다.

실시예 7

마우스를 이용한 솔잎 추출물의 급성독성시험

마우스를 사용하여 상기 실시예 1에서 제조한 솔잎 추출물의 급성독성시험을 실시하였다. 급성독성시험 결과, 솔잎 추출물을 투여 가능 용량인 500 mg/kg으로 마우스에 경구 투여하였을 때 사망예를 전혀 관찰할 수 없었으며, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없었다. 따라서 솔잎 추출물은 안전한 약물임을 알 수 있었다.

실시예 8

건강음료의 제조

설탕 5 내지 10중량%, 구연산 0.05 내지 0.3중량%, 카라멜 0.005 내지 0.02중량%, 비타민 C 0.1 내지 1중량%의 첨가물을 혼합하고 여기에 79 내지 94중량%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 약 90℃에서 약 100초간 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82중량%를 주입하였다. 그 후 솔잎 추출물 20g을 탄산가스가 혼합된 시럽과 혼합하여 탄산음료를 제조하였다.

실시예 9

주사제의 제조

솔잎 추출물 30중량%

pH 조절제 pH 7 조성량

주사용 멸균 증류수 100% 조성량

적절한 용기에 상기 기재된 함량의 솔잎 추출물, pH 조절제 및 멸균수 100% 조성량을 배합한 다음 이를 바이알(1000㎎)에 충진하여 주사제를 제조하였다.

실시예 10

정제의 제조

솔잎 추출물 30중량%

락토즈 20중량%

마그네슘 스테아레이트 5중량%

나트륨 전분 글리콜레이트 10중량%

멸균수 100% 조성량

적절한 용기에 상기 기재된 함량의 솔잎 추출물, 락토즈, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 멸균수 100% 조성량을 혼합한 다음 이를 30 내지 60℃로 유지하면서 1시간 동안 교반하고 실온으로 냉각시킨 후 통상적인 정제의 제조 방법에 따라 타정하여 조성물 350㎎을 함유하는 정제를 제조하였다.

본 발명에 따른 솔잎 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 뇌신경세포의 손상으로 인한 허혈성 뇌졸중에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내므로 뇌손상을 예방 또는 치료하는 뇌보호 조성물로서 유용될 수 있다.

도 1은 전뇌허혈 동물모델에서의 해마 CA1 부위의 신경세포 손상을 관찰한 사진이다(A, D : 정상군; B, E : 대조군, C, F : 실험군)

도 2는 국소허혈 동물모델 뇌기질에서의 경색용적을 관찰한 사진이다.

도 3은 국소허혈 동물모델 뇌기질에서의 경색용적을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

Claims

솔잎 추출물을 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품에 있어서,

상기 솔잎 추출물의 성분이 5 내지 15중량%의 보닐 아세테이트(bornyl acetate), 1 내지 10중량%의 카리오필렌(caryophyllene), 1 내지 10중량%의 트렌스-버베놀(trans-Vervenol), 1 내지 10중량%의 보르네올(borneol), 1 내지 10중량%의 델타-카딘(δ-cadinene), 1 내지 10중량%의 p-키맨-8-올(p-Cymene-8-ol), 5 내지 15중량%의 카리오필렌 산화물(caryophyllene oxide), 1 내지 10중량%의 메틸 유지놀(Methyl Eugenol), 5 내지 15중량%의 스파투레놀(Spathulenol), 1 내지 10중량%의 5-m메톡시-2,8,8-트리메틸-디피란-4-원(5-mMethoxy-2,8,8-trimethyl-dipyran-4-one) 및 5 내지 15중량%의 툰버골(thunbergol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸증 예방 및 치료용 건강보조식품.
제1항에 있어서,

상기 솔잎 추출물이 1 내지 10중량%의 알파-파이넨(α-pinene) 및 1 내지 10중량%의 베타-파이넨(β-pinene) 성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품.
제1항에 있어서,

상기 솔잎 추출물이 건강 식품 조성물의 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품.
제1항에 있어서,

상기 건강보조식품이 음료 조성물인 경우에는 상기 솔잎 추출물이 음료 조성물 100㎖를 기준으로 1 내지 30g으로 포함되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품.
제 1항에 있어서,

상기 건강 보조식품이 상기 솔잎 추출물 이외에 천연 전체 조성물 100ml 당 1 내지 20g의 천연 탄수화물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 건강보조식품.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 뇌졸중이 허혈성 뇌졸중임을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 건강보조식품.