KR100672612B1 - 카리오필렌 또는 이의 유도체를 함유한 뇌졸중 예방 및치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카리오필렌 또는 이의 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 카리오필렌 또는 이의 유도체와 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물과 건강기능식품은 뇌신경 세포의 손상에 대한 보호 효과를 발휘하여 뇌졸중을 예방 및 치료할 수 있다.

뇌졸중, 카리오필렌

Description

카리오필렌 또는 이의 유도체를 함유한 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물{Compositions for Prevention and Treatment of Stroke Comprising Caryophellene or Derivative Thereof}

도 1은 허혈성 뇌졸중에 대한 트랜스-카리오필렌의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 허혈성 뇌졸중에 대한 가시오가피 정유, 소나무 정류 및 트랜스-카이로피렌 각각의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 면역자극 및 포도당 결핍에 의한 신경 교세포 손상에 대한 카리오필렌의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 산소 및 포도당 결핍에 의한 대뇌신경세포 손상에 대한 카리오필렌의 보호 효과를 나타낸 그래프이다(OGD: 산소 및 포도당결핍).

도 5는 NMDA 유발 흥분성 신경독성에 의한 대뇌신경세포 손상에 대한 카리오필렌의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 뇌졸중 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 카리오필렌과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물 그리고 카리오필렌과 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 함유하는 건강기능식품에 관한 것이다.

뇌졸중은 크게 2가지로 분류되는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 또는 차단으로 뇌조직의 허혈 상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분되고 있다. 이 중 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80%를 차지하므로 특히 심각한 질환이라고 할 수 있다.

뇌졸중은 선진국의 고령층에서 주요 사망 원인이며, 이를 예방 및 치료하기 위하여 상당한 비용이 소요되고 있다(Davenport et al. Journal of Neurology, 2000, vol.68, p.277). 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포 손상의 원인으로는 과도한 흥분성 신경 전달 물질의 유리, 자유 라디칼의 생성, 단백질 합성의 저해, 유전자 발현 이상 및 면역반응의 활성화 등으로 설명되고 있으나, 뇌신경세포의 손상기전이 복잡하고 기존 약물의 독성 등으로 인하여 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 또한, 뇌허혈로 인한 신경계의 손상을 보호할 수 있는 물질의 개발은 작용 목표가 다양하여 어느 한 작용점에서 효과가 나타나더라도 최종적으로 신경계 손상에 대한 보호효과가 보이지 않은 경우가 많다. 또한, 효과를 평가하는 방법에서도 시험관에서는 효과가 있었으나 생체내 시험에서는 효과가 없는 것이 많아 뇌허혈과 같은 뇌손상 보호 작용을 가지는 물질의 개발은 다양한 작용 목표에 대한 검증을 거쳐야 할 뿐만 아니라 시험관내 및 생체내 시험이 동시에 진행되어야 할 것이다.

한편, 카리오필렌은 항미생물(세균, 곰팡이, 효모) (Sacchetti et al. J. Agric. Food Chem. 2004, vol.52, pp.3486-3491; Lourens et al. J. Ethnopharmacol. 2004, vol.95, pp.253-258; Alma et al. Biol. Pharm. Bull. 2003, vol.26, pp.1725-1729), 항산화 (Mimica-Dukic et al, J. Agric. Food Chem. 2004, vol.52, pp.2485-2489; Lourens et al. J. Ethnopharmacol. 2004, wol.95, pp.253-258; Jayaprakasha et al. J. Agric. Food Chem. 2003, vol.51, pp.4344-4348), 항염증(Martin et al. Planta. Med. 1993, vol.59, pp.533-536), 위세포 보호(Tambe et al, Plata Med. 1996, vol.62, pp.469-470), 암세포 사멸(Kubo et al. Planta Med. 1996, vol.62, pp.427-430), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 유도(Zheng et al. J. Nat. Prod. 1992, vol.55, pp.999-1003) 활성이 있는 것으로 알려져 있다.

구체적으로 마틴 등(Martin et al. Planta. Med. 1993, vol.59, pp.533-536)은 Wister rat에서 염증유발제인 카라기난과 프로스타글란딘 E₁을 주사하기 15분전에 150 또는 300mg/kg과 300 또는 600mg/kg의 카리오필렌을 경구 투여했을 때 카라기난과 프로스타글란딘 E₁에 의해 유발된 염증이 감소되었다고 보고하고 있다. 쿠보 등(Kubo et al. Planta Med. 1996, vol.62, pp.427-430)은 human epithelioid cervix carcinoma(HeLa)와 human breast carcinoma(BT-20)에 대한 카리오필렌의 세포독성을 살펴본 결과 IC₅₀이 각각 3.86 및 3.92㎍/㎖이었고 human melanoma skin cell(HTB-140)과 mouse melanoma cell(B-16)에서도 상당한 효과를 보였다고 했다. 아울러, 카리오필렌을 30㎎의 용량으로 A/J 암컷 마우스에게 투여할 경우 대조군에 비해 간의 GST 활성이 2.6배, 소장의 GST 활성이 3.0배 높았다(Zheng et al. J. Nat. Prod. 1992, vol.55, pp.999-1003). 그러나 상술한 카리오필렌의 항미생물, 항곤충 및 항산화 효과는 카리오필렌이 미량 포함되었거나 또는 주성분 중의 하나인 정유의 형태로서 활성을 나타낸 경우가 대부분이었기 때문에 카리오필렌의 작용 뿐만 아니라 다른 성분들과의 복합적인 작용에 의해 나타난 활성을 배제할 수 없다.

카리오필렌과 관련하여 대한민국특허공개 2005-0012803호에는 헥실알데히드, 카리오필렌 알코올, 신나믹알데히드, 디하이드로유게놀, 파르네솔, 디하이드로파르네솔, 히노키티올, 이소유게놀, γ-운데카락톤, d-리모넨, o-메톡시신나믹알데히드, β-피넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌, 오렌지 오일, 육두구유 및 그레이프프루트 오일과 같은 식품 방향 물질로부터 선택된 하나 이상의 물질을 함유하는 향료 및 방향 조성물 및 이를 함유하는 구강 케어 조성물이 개시되어 있다.

또한, 일본특허공개 JP62132822호는 간질환을 완화 및 치료하기 위하여 α-카리오필렌 , β-카리오필렌 또는 이들의 혼합물을 포함하는 간질환 치료제를 개시한 것으로서, 상기 카리오필렌은 시지기움 아로마티쿰(Syzygium aromaticum)을 메탄올 또는 n-헥산으로 추출하여 얻은 것으로, 특히 D-갈락토사민에 의해 유발된 간질환을 치료할 수 있다.

아울러, 일본특허공개 JP07215846호는 높은 항알레르기 작용을 보이고 우수 한 안전성을 보이는 항알레르기제를 제공하기 위하여 α-카리오필렌 또는 β-카리오필렌을 활성 성분으로서 포함하는 항알레르기제를 개시한 것으로서, 상기 카리오필렌은 유제니아 카리오필라타 텀브(Eugenia caryophyllata thumb)를 추출하고 이렇게 얻은 추출물을 증류함으로써 얻을 수 있으며, 특히 아토피 피부질환 치료하는데 탁월한 효과를 발휘한다.

그러나 상기 문헌들에는 카리오필렌 및 이의 유도체가 뇌허혈에 의한 뇌손상을 보호할 수 있다는 것에 대하여 언급 또는 시사된 바가 없다.

본 발명자들은 카리오필렌 또는 이의 유도체를 뇌세포가 손상되기 전 및 손상된 후에 처리한 결과 뇌세포 손상을 예방하고 치료함을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로서, 카리오필렌 또는 이의 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 뇌졸중 예방 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 다른 관점으로서, 카리오피렌 또는 이의 유도체와 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 함유하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 한 측면은 카리오필렌 또는 이의 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

"뇌졸중"은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 또는 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중으로 구분되는데, 본 발명에 따른 조성물의 활성성분인 카리오필렌 또는 이의 유도체는 특히 허혈성 뇌졸중에 의한 뇌신경세포 손상을 치료하는데 탁월한 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 이용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 뇌졸중을 예방 및 치료하는 활성 성분인 "카리오필렌(또는 트랜스-카리오필렌 또는 β-카리오필렌)"은 식물, 특히 허브와 약용 식물 등에서 추출된 정유(essential oil) 또는 과일의 방향성 화합물의 구성 성분이다. 자연계에서 카리오필렌은 이소카리오필렌 및/또는 α-카리오필렌과 혼합물로서 존재한다. 카리오필렌의 화학식은 [1R-(1R,4E,9S)]-4,11,11-트리메틸-8-메틸렌-비사이클로[7.2.0]운덱-4-엔이고, 구조적으로는 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoid)로 분류되며, 다음과 같은 구조식(1)을 갖고 있다.

.........(1)

카리오필렌의 쥐에서 급성 경구 반수치사량(LD₅₀)과 토끼에서 급성 피부 반수치사량은 5g/kg 이상이었으며(Opdyke, Food Cosmet Toxicol 1973, vol.11, pp.1059-1060) F344 쥐에게 카리오필렌을 12, 24, 48mg/kg의 용량으로 기관내(intratracheal) 투여했을 때 폐에 독성을 일으키지 않았다. 또한, 카리오필렌은 150,000mg/판의 농도까지 살모넬라 티피무리움 균주(Salmonella typhimurium strains) TA1535, TA1537, TA1538, TA98 및 TA100을 대상으로 한 변이원성 시험에서 음성을 보였으며, DNA 부정기 합성 시험(unscheduled DNA synthesis assay)에서 10,000㎎/㎖의 농도까지 변이원성을 나타내지 않았다(Heck et al, Toxicologist 1989, vol.9, p.257; Flavor and Extract Manufacturers Association, FEMA database 1997, p.12). 아울러, 카리오필렌은 1,000mM 농도까지 차이니즈 햄스터 난소세포주(Chinese hamster ovary K-1 cells)에서 자매염색체교환(sister chromatid exchanges, SCE) 빈도에 영향을 미치지 않았다(Sasaki et al. Mutat. Res. 1989, vol.226, pp.103-110). 현재 카리오필렌은 GRAS(Generally Recognized as Safe) 물질로 간주되고 있고 미국 FDA에 의해 식품 첨가물로 인정되었다. 이와 같은 안정성으로 인하여 카리오필렌은 본 발명에 따른 약제학적 조성물 뿐만 아니라 후술되는 건강기능식품에도 안정적으로 도입할 수 있다.

본 발명에 따른 활성 성분인 카리오필렌은 상업적 공급업자로부터 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 수득할 수 있다. 당업계에서 카리오필렌은 통상적으로 정향유(clove leaf oil, clove stem oil), 계피유(cinnamon leaf oil) 또는 파인유(pine oil)로부터 분리하여 제조하고 있다.

본 발명에서는 상기 카리오필렌과 유사한 정도로 뇌졸중 예방 및 치료 효과를 발휘할 수 있는 카리오필렌 유도체가 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 활성 성분으로서 도입될 수 있다. 본 발명에서 카리오필렌 유도체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 이소카리오필렌, α-카리오필렌(즉, 시스-카리오필렌), 카리오필렌 옥사이드, 카리오필렌 알코올, 카리오필렌일 아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 카리오필렌 또는 이의 유도체를 단독 또는 2종 이상을 조합하여 활성 성분으로서 포함하는데, 상기 카리오필렌 또는 이의 유도체는 약제학적 조성물 전체 중량당 0.5 내지 50 중량%로 포함되는 것이 적합하다. 카리오필렌 또는 이의 유도체가 0.5 중량%미만인 경우에는 목적한 예방 및 치료 효과를 달성하기 어렵고 50 중량% 초과인 경우에는 카리오필렌의 독성이 유발할 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있다면 어떠한 일 반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

한 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물을 경구용 고형제로 제형화하는 경우, 활성성분과 함께 희석제(예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예를 들면 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예를 들면 전분, 아라빅검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예를 들면 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예를 들면 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 유탁액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 등의 경구 투여용 액상 조성물로 제형화하는 경우, 통상적으로 사용되는 불활성 희석제(예를 들면 정제수, 에탄올)를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 액상 조성물은 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제 및 현탁제, 감미제, 향료 방향제 및 방부제를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로서 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드 를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예를 들면 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 사용할 수 있다.

앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다. 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.

일반적으로 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효 투여량은 1일당 체중 1kg 당 0.1㎍ 내지 약 500mg의 양을 1회 또는 수회로 나누어서 투여할 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 환자에게 투여될 약제학적 조성물의 특정량은 환자의 증상, 부작용의 심도 등 다수의 인자들에 따라 달라질 것이다.

본 발명은 다른 관점으로서 카리오피렌 또는 이의 유도체와 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 카리오필렌은 뇌세포 보호 또는 뇌졸중 예방을 목적으로 하는 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 카리오피렌 또는 이의 유도체의 양은 일반적으로 식품 조성물에는 전체 식품 중량당 0.1 내지 20중량%, 바람직하게는 1 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 음료 조성물에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품의 필수 성분인 카리오피렌 또는 이의 유도체는 전술된 약제학적 조성물에서와 같은 형태로 포함될 수 있다.

상기 건강 음료 조성물의 필수 성분으로서 카리오피렌 또는 이의 유도체 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 텍스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들면, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 10 내지 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

허혈성 뇌졸중에 대한 카리오필렌의 보호 효과

허혈성 뇌졸중에 대한 카리오필렌의 보호효과는 중뇌대동맥 폐색 모델을 이용하여 확인하였다. 즉, 래트(바이오제노믹스, 한국)의 내경동맥(internal carotid artery)으로 나일론 필라멘트(Ethicon, Johnson-Johnson, 벨기에)를 삽입하여 중뇌대동맥을 폐색시킨 다음 120분 후에 다시 필라멘트를 제거함으로써 재관류시켰다. 재관류를 시작하기 약 5 분전에 카리오필렌을 1, 3, 10, 50 mg/kg으로 투여하고 재관류시킨 다음 약 24시간 후에 동물을 치사시켜 뇌를 적출하고 뇌 매트릭스(brain matrix)를 이용하여 2 mm 두께로 뇌절편(brain slice)을 만든 다음 2, 3, 5-트리페닐테트라졸리눔 클로라이드(TTC) 염색법을 이용하여 염색하였다. 이때 세포손상이 일어나지 않은 부위만 TTC에 의해 붉게 염색되므로 염색이 되지 않은 뇌경색 부위를 컴퓨터화된 영상분석 시스템을 이용하여 산출하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 대조군(즉, 생리식염수 또는 5% 카르복시메틸셀룰로오스 투여군)에서 뇌경색 용적율이 약 23%인 것과 비교하여 카리오필렌 10 mg/kg 투여에 의한 뇌경색 용적율은 약 7%로서, 통계적으로 유의성 있게 감소하여 카리오필렌의 뇌세포 보호 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

허혈성 뇌졸중에 대한 카리오필렌과 소나무 정유에 의한 보호 효과

한편, 동일 뇌허혈 동물 모델에서 카리오필렌이 구성성분으로 약 4-10 중량% 함유되어 있는 소나무 정유(HP-90138, 한빛향료)와 가시오가피 정유(실험실에서 제조)를 300mg/kg의 용량으로 투여하고, 카리오필렌 단독을 10mg/kg의 용량으로 투여한 후 허혈성 뇌졸중 보호 효과를 살펴보았다.

도 2에 나타낸 바와 같이 300mg/kg 농도의 가시오가피 정유를 투여하였을 때에는 뇌허혈 손상을 감소시키지 못하였다. 그러나 소나무 정유를 300mg/kg의 용량으로 투여하였을 때에는 뇌허혈 손상 부위가 약 10%로 감소하였다(100mg/kg 투여 시에는 거의 효과 없음). 이 결과는 카리오필렌의 단독 투여가 카리오필렌을 구성성분으로 하는 정유를 투여할 때 보다 더 우수한 허혈성 뇌졸중 보호효과를 나타내어 준다는 것을 시사한다. 상기 결과는 카리오필렌은 다른 활성 성분들과 공존할 때 상기 활성 성분들로 인하여 고유의 뇌세포 보호 활성이 경감되기 때문에 단독으로 이용하는 것이 바람직하다는 것을 보여준다.

<실시예 3>

포도당 결핍에 의한 신경 교세포의 손상에 대한 보호 효과

태어난지 1-2일되는 흰쥐의 뇌로부터 신경 교세포(glia cell)를 분리하여 배양하였다. LPS (1㎍/㎖) 및 IFN-γ (100U/㎖)을 48시간 동안 처리하여 면역자극 후 포도당을 결핍시킴으로써 세포사를 유도한 모델 (Immunostimulation and glucose deprivation model)에서 카리오필렌(ICN Biomedicals, USA)의 신경 교세포 보호 효과를 관찰하였다.

이 때, 세포 사멸율은 죽은 세포로부터 배지로 유리된 LDH(lactate dehydrogenase) 활성을 측정하여 확인하였다. 즉, 상기 처리 조건에서 세포를 배양한 후 각 배양액을 20㎕씩 취해 1㎎/㎖의 NADH-피루베이트 용액 20㎕와 혼합하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 여기에 발색시약(2,4-디니트로페닐히드라진) 20㎕를 가한 후, 실온에서 20분간 더 반응시키고 0.4M의 NaOH 100㎕를 가해 반응을 정지한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 사멸율(%)은 총 LDH 활성에 대한 측정된 LDH 활성으로 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 면역자극 및 포도당 결핍으로 약 55%의 세포사를 보였으며, 카리오필렌을 1μM의 농도로 처리하였을 때에는 세포사가 약 30%로 감소되었고, 10μM의 농도로 처리하였을 때에는 세포사가 약 10%로 감소되었다. 이러한 카리오필렌에 의한 세포사 감소는 면역자극 및 포도당 결핍군과 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다.

<실시예 4>

산소 및 포도당의 결핍으로 인한 대뇌 신경세포의 손상에 대한 보호 효과

임신 17일의 SD 래트의 태아를 분리하여 뇌를 적출한 후 대뇌 신경세포를 분리하고 배양하였다. 산소와 포도당을 결핍시킴으로써 대뇌 신경세포의 손상을 유도하고 1시간, 3시간, 5시간이 경과한 후에 각각 세포 사멸율을 확인하였다. 세포 사멸율은 실시예 3에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 수행되었다.

도 4에 나타낸 바와 같이 산소와 포도당의 결핍으로 약 60%의 세포사가 나타났다. 카리오필렌을 1μM의 농도로 처리하였을 때 대뇌신경세포사가 약 30%로 감소하였으며, 10μM의 농도로 처리하였을 때 약 25%로 감소하여 대뇌신경세포의 손상을 억제함으로써 세포사를 억제하는데 통계적으로 유의한 효과가 있었다. 또한, 도 4에서 대조군이란 비히클만을 처리한 것이며, 트랜스-카리오필렌이란 대조군에 산소 및 포도당을 결핍시키지 않은 채 트랜스-카리오필렌만을 처리한 것으로서, 이는 트랜스-카리오필렌 단독 처리시 대뇌신경세포에 아무 독성을 유발하지 않는다는 것을 보여준다.

<실시예 5>

흥분성 신경독성에 의한 대뇌 신경세포의 손상에 대한 보호 효과

임신 17일의 SD 래트의 태아를 분리하여 뇌를 적출한 후 대뇌 신경세포를 분 리하고 배양하였다. NMDA(N-methyl-D-Aspartate)에 처리에 의해 대뇌 신경세포의 흥분성 신경독성을 유발하고 세포 사멸율을 확인하였다. 세포 사멸율은 실시예 3에 기재된 바와 동일한 절차에 따라 수행되었다.

도 5에 나타낸 바와 같이 NMDA 처리로 약 45%의 세포사가 관찰되었으며, 카리오필렌을 1μM 농도로 처리하였을 때에는 약 32%로, 10μM의 농도로 처리하였을 때에는 약 38%로 세포사가 감소하였으나 통계적으로 유의하지는 않아 흥분성 신경독성에 의한 대뇌 신경세포의 손상에 대한 보호 효과는 다른 효과에 비해 비교적 낮음을 시사한다.

<실시예 6>

카리오필렌의 반응성 산소종 및 질소종의 소거 효과

A. 하이드록시 라디칼 소거능 분석

펜톤 시스템(Fenton system, 아스코르브산/FeSO₄-EDTA/H₂O₂)에 의해 생성된 하이드록시 라디칼이 데옥시리보오스를 분해시키는 정도를 데옥시리보오스법을 이용하여 측정하였다(Halliwell, B. et al. Anal. Biochem. 1987, vol.26, pp.215-219). 구체적으로, 시험관에 1.5㎖의 3.74mM 데옥시리보오스, 100㎕의 다양한 농도의 카리오피렌(1-1,000μM), 100㎕의 28.4mM H₂O₂, 100㎕의 2mM EDTA, 100㎕의 2mM 아스코르브산 및 100㎕의 400μM FeSO₄를 순서대로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 직후 1㎖의 1% (w/v) 티오바비투르산(thiobarbituric acid)과 1㎖의 2.8% (w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하고 100℃에서 12분 동안 끓인 후 곧바로 얼음에 넣어 10분 동안 냉각시켰다. 분광 광도계를 이용하여 532nm에서 흡광도를 측정하였으며, 용매의 흡광도에 대한 시료 처리 후 흡광도의 차이를 소거능(%)으로 표현하였다.

B. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능 분석

페나진 메토술페이트(Phenazine methosulfate, PMS)/β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(β-nicotinamide adenine dinucleotide, NADH) 시스템에서 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼이 니트로블루 테트라졸리움 클로라이드(nitroblue tetrazolium chloride, NBT)를 환원시키는 정도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였다(Robak, J. et al. Biochem. Pharmacol. 1988, vol.37 pp.837-841). 구체적으로, 마이크로플레이트에 190㎕의 NADH/NBT (각각 103ＢμM, 50μM), 10㎕의 다양한 농도의 카리오피렌 (1-1,000μM) 및 50㎕의 50μM PMS를 순서대로 첨가하고, 실온에서 3분 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 용매의 흡광도에 대한 시료 처리 후 흡광도의 차이를 소거능(%)으로 표현하였다.

C. 과산화수소 소거능 분석

과산화수소가 구아야콜(guaiacol) 및 퍼옥시다제(peroxidase)와 반응하여 갈 색을 띠는 정도를 구아야콜 방법(Guaiacol method)을 이용하여 측정하였다(Tan, D. X. et al. Free Radic. Biol. Med. 2000, vol.29, pp.1177-1185). 구체적으로, 시험관에 880㎕의 150mM 인산완충용액(1mM EDTA 포함, pH 7.4), 10㎕의 다양한 농도의 카리오피렌(1-1,000 μM), 10㎕의 14.5 U 호스라디쉬 퍼옥시다제, 50㎕의 0.2% 구아야콜 용액 및 50㎕의 10mM H₂O₂를 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 분광 광도계를 이용하여 436nm에서 흡광도를 측정하였으며, 용매의 흡광도에 대한 시료 처리 후 흡광도의 차이를 소거능(%)으로 표현하였다.

D. 하이포염소산 소거능 분석

하이포염소산이 타우린과 반응하는 정도를 분광 광도계를 이용하여 측정하였다(Nㅸve, J. et al. Eur. J. Pharmacol. 2001, vol.417, pp.37-43). 구체적으로, 시험관에 960㎕의 PBS(pH 7.4), 10㎕의 150mM 타우린, 10㎕의 2M KI, 10㎕의 다양한 농도의 카리오피렌(1-1,000μM) 및 10㎕의 60mM 치아염소산 나트륨을 첨가한 후, 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 분광 광도계를 이용하여 350 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 용매의 흡광도에 대한 시료 처리 후 흡광도의 차이를 소거능(%)으로 표현하였다.

E. NO 소거능 분석

소듐 니트로푸르시드(Sodium nitroprusside)가 생성한 NO를 그리스(Griess) 반응을 이용하여 측정하였다(Marcocci, L. et al. Biochem. Biophy. Res. Commun., 1994, vol.201, pp.748-755). 즉, 마이크로플레이트에서 50㎕의 다양한 농도의 카리오피렌(1-1,000μM)과 50㎕의 10mM 소듐 니트로푸르시드를 혼합하고 실온에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 동량의 그리스 시약(1% 술파닐아미드/2.5% H₃PO₄ 및 0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드/2.5% H₃PO₄)을 혼합하고 10분 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매의 흡광도에 대한 시료 처리 후 흡광도의 차이를 소거능(%)으로 표현하였다.

F. 퍼옥시나이트레이트 소거능 분석

카리오필렌이 SIN-1(3-morpholinosydnonimine)에 의해 생성되는 퍼옥시나이트레이트를 어느 정도 소거할 수 있는지 확인하기 위하여 먼저 200μM의 SIN-1과 다양한 농도(1 내지 1,000㎍/㎖)의 카리오필렌을 DMSO에 녹이고 37℃에서 20분간 배양하였다. 배양이 끝난 후 퍼옥시나이트레이트에 의해 산화되어 형광을 발생하는 디히드로로다민(dihydrorhodamine)-123(DHR123), 100μM을 상기 배양액에 가한 후 30분간 37℃에서 다시 배양시켜 536 nm(emission), 500 nm(excitation)에서 형광을 측정하여 카리오필렌의 퍼옥시나이트레이트 소거 작용의 정도를 측정하였다(Szabo, C. et al. FEBS Lett. 1995, vol.372, pp.229-232).

카리오필렌의 반응성 산소종 및 질소종 소거 효과

농도	하이드록시기		슈퍼옥사이드		과산화수소		하이포염소산		산화질소		퍼옥시 나이트레이트
(μM)	t-Car2 )	만니톨3 )	t-Car	아스코르브산	t-Car	아스코르브산	t-Car	아스코르브산	t-Car	쿼세틴4 )	t-Car	아스코르브산
1	0	-	0	3.6 ± 0.6	0	0	1.7 ± 0.1	4.3 ± 0.5	0	12.2 ± 2.6	-	-
10	0	-	0	6.2 ± 3.5	0	6.3 ± 0.3	7.1 ± 0.3	30.7 ± 3.8	0	13.0 ± 1.7	-	-
100	0	-	0	19.2 ± 4.8	0	91.5 ± 0.9	54.4 ± 2.3	100	0	47.6 ± 2.1	12.6 ± 2.2	96.1 ± 0.3
1000	-	25.7 ± 0.4	0	0	0	97.3 ± 0.1	100	100	0	68.6 ± 1.3	64.1 ± 1.8	97.4 ± 0.1

이와 측정 방법을 이용하여 카리오필렌이 여러 반응성 산소종 및 질소종을 어느 정도 소거할 수 있는지 측정하여 그 결과를 상기 표 1에 나타내었다. 카리오필렌은 하이드록시 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼, 과산화수소, 산화질소와 같은 반응성 산소종 및 질소종을 소거하는 효과는 없었으며, 염산(IC₅₀: 88.8μM)과 SIN-1에 의해 생성되는 퍼옥시나이트레이트의 소거 활성이 비교적 우수한 것으로 확인되었다(IC₅₀ : 760μM).

<실시예 7>

활성화된 소교세포에서 카리오필렌에 의한 아질산염 및 TNF-α의 생성 억제

마우스 소교세포(microglial cell)계 BV2 세포(Weill Medical College of Cornell University, USA)를 24개의 구판에 구 당 10만개씩 분주하고 배지에서 하룻밤 배양한 후 100ng/㎖의 LPS(Lipopolysaccharide) 및 카리오필렌 (1-100μM)을 상기 배양액에 넣어주고 24시간 동안 추가로 배양한 후 그리스(Griess) 시약을 사용하여 배지로 유리되어 나온 아질산염의 양을 측정하였다. 또한, 동일한 처리 및 배양 조건에서 배지로 유리되어 나온 TNF-α를 ELISA 측정 키트(Biosource International, USA)를 이용하여 측정하였다. 이를 표 2에 나타내었다.

활성화된 소교세포에서 카리오필렌에 의한 아질산염 및 TNF-α의 생성 억제

카리오필렌(μM)	아질산염(nmoles)		TNF-α(pg/㎖)
	LPS 비첨가구	LPS 첨가구	LPS 비첨가구	LPS 첨가구
0	0.2	3.0	12	680
0.1	0.2	2.6	12	560
1	0.2	2.0	12	350
10	0.2	1.7	12	280
100	0.2	1.5	12	230

표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 카리오필렌은 0.1, 1, 10 및 100μM의 농도에서 LSP(100ng/㎖)에 의해 유리되는 아질산염의 양을 약 13, 33, 43 및 50%로 감소시켰으며, LSP(100ng/㎖)에 의해 유리되는 TNF-α를 약 18, 49, 59 및 66%로 감소시켰다.

<실시예 8>

건강음료의 제조

설탕 5 내지 10 중량%, 구연산 0.05 내지 0.3 중량, 카라멜 0.005 내지 0.02 중량%, 소르비탄 모노스테아레이트 0.1% 중량, 비타민 C 0.1 내지 1 중량%의 첨가물을 혼합하고 여기에 79 내지 94 중량%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 약 90℃에서 약 100초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82 중량%를 주입하였다. 그 후 카리오필렌 20g을 탄산가스와 혼합된 시럽과 혼합하여 탄산음료를 제조하였다.

본 발명에 따른 카리오필렌 또는 이의 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 및 건강기능식품을 이용하여 뇌졸중을 예방하고 치료할 수 있다.

Claims (7)

1. 카리오필렌 또는 이소카리오필렌, α-카리오필렌, 카리오필렌 옥사이드, 카리오필렌 알코올 및 카리오필렌일 아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 카리오필렌의 유도체와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 카리오필렌 또는 이의 유도체는 약제학적 조성물의 전체 중량당 0.5 내지 50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제

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