KR20050096063A - 소르타제 효소에 대하여 강력한 저해활성을 갖는 아크릴유도체 화합물 및 이를 함유한 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 아크릴 유도체 화합물들은 소르타제 효소를 탁월하게 억제하므로 내성균주에 의한 각종 세균 감염증 질환의 치료 및 예방에 효과적이므로 기존 항균제에 내성을 갖는 세균감염증 치료에 효과적인 의약품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

소르타제 효소에 대하여 강력한 저해활성을 갖는 아크릴 유도체 화합물 및 이를 함유한 약학 조성물{Novel acryl derivative having strong inhibiting activity against sortase enzyme and the pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 소르타제 효소에 대하여 강력한 저해활성을 갖는 아크릴 유도체 및 이를 함유한 약학 조성물을 제공한다.

병원균의 항생제에 대한 내성 문제는 심각한 상황으로 병원에서 분리되는 임상 균주들은 대부분의 항생제에 대해 내성을 갖고 있어 이들에 의한 감염증을 치료하기가 매우 힘들며(Gold, S. H., N. Engl. J. Med., 335, pp14-45, 1996), 더욱이 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)와 메틸실린-내성 응고효소-음성 스타필로코커스(MRSE)로 대표되는 내성 균주들은 이제 이들의 감염증에 유일하게 사용되는 반코마이신에 대해서도 내성을 나타내고 있다(Sieradzki, K. et al., N. Engl. J. Med., 340, p517, 1999). 그러므로, 이들 내성 병원균의 약제 저항성을 극복할 새로운 개념의 치료제가 절실히 요구된다.

항생제 내성을 나타내는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등의 그램 양성균은 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라는 세포벽으로 둘러싸여 있는데, 이 세포벽에는 세포벽에 부착되어 표면으로 발현되는 여러 종류의 표면 단백질(surface protein)이 있는 것으로 알려져 있다. 이 단백질들은 이들 병원균이 인체에 감염될 때 필수적인 역할을 하는데, 인체 세포와의 접촉을 도와주며 면역계를 피할 수 있게 함으로써 감염이 쉽도록 하여 발명을 일으키게 한다고 한다(Navarre, W. W. and Schneewind, O., Microbial. Mol. Biol. Rev., 63, p174, 1999). 이들 표면 단백질은 N 말단의 시그널펩티드(signal peptide)와 C 말단의 소팅 시그널(sorting signal)로 구성된 상호 유사한 구조를 가지고 있는데, 특히 C 말단의 소팅 시그널은 LPXTG라는 공통 모티프(motif) 즉, 20여 개의 아미노산으로 이루어진 소수성 부분 및 양전하를 띠는 아미노산으로 이루어져 있다(Schneewind, O. Model, P.Fischetti, V. A. Sorting of protein A to the staphylococcal cell wall. Cell, 70, pp267-281, 1992; Schneewind, O. Mihaylova-Petkov, D.Model, P. Cell wall sorting signals in surface proteins of Gram-positive bacteria. EMBO J., 12, pp4803-4811, 1993; Navarre, W. W. Schneewind, O. Proteolytic cleavage and cell wall anchoring at the LPXTG motif of surface proteins in Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol., 14, 115121, 1994). 스타필로코커스 아우레우스에는 LPXTG 모티프를 가진 표면 단백질이 약 10가지 정도 있는 것으로 보고 되고 있으며, 예를 들면 단백질 A, 클럼핑 인자(clumping factor), 피브로넥틴-결합 단백질(fibronectin-binding protein) A와 B, 콜라겐-결합 단백질 A(Collagen-binding protein A) 등이 있고(Josefsson et al., Microbiology, 144, pp33-87, 1998), 그램 양성균은 전체적으로 약 60여 가지가 발견되었으며 그 수가 점차 증가하고 있는 것으로 보고 되고 있다. 표면 단백질이 세포 표면으로 이동되어 세포벽에 부착되는 메커니즘(sorting reaction mechanism)은 이미 알려져 있는데 소팅될 단백질이 세포막을 통과할 때 양전하를 띤 아미노산 부분이 정지 신호 역할을 하여 통과를 멈추게 하고 소수성 부분은 세포막에 고착되게 된다. 표면 단백질의 C 말단이 고정된 후 트랜스펩티데이션(transpeptidation) 반응이 일어나는데, 효소에 의해 LPXTG 모티프의 트레오닌(threonine)과 글리신(glycin) 사이의 아미드 결합이 끊어지고 이렇게 해서 생긴 트레오닌의 유리 카복실기와 세포벽 펩티도글리칸의 가교 역할을 하는 펜타글리신 등의 유리 아미노기가 결합을 하여 표면 단백질을 세포벽에 부착하게 된다(Schneewind, O., Science, 268, p103, 1995). 이 때 LPXTG 모티프의 트레오닌과 글리신 사이의 아미드 결합을 끊어주고 세포벽에 이어주는 역할을 하는 효소가 바로 소테이즈(Sortase)인데, 지금까지 알려진 소테이즈 종으로는 소르타제 A(Srt A; surface protein sorting A)와 소테이즈 B(Srt B)가 있으며 이들은 각각 특정 단백질의 소팅 시그널을 감지한다(Mazmanian, S. K. et al., An iron-regulated sortase anchors a class of surface protein during Staphylococcus aureus pathogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99 , pp2293-2298, 2002).

소르타제는 206개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 이미 그 기능과 속성은 쉬니빈트(Schneewind)의 여러 실험을 통해 밝혀지고 확인되었다(Schneewind, O., P. N. A. S., 96, p12424, 1999; Schneewind, O., J. B. C., 275, p9876, 2000). 소르타제는 데이터베이스 검색을 통해 스타필로코커스 외에 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus) 등 대부분의 그램 양성균에서 유사 시퀀스가 발견되었고 효소 활성에 매우 중요하다고 발혀진 184번 아미노산 위치의 시스테인기 또한 공통적으로 가지고 있는 것이 밝혀졌다(Cossart, P. and Jonquieres, R., P. N. A. S., 97, p5013, 2000).

최근의 생물학적 연구에서 Srt A 및 Srt B는 모두 감염과 그 지속성에 관여하는 결정적인 효소임이 밝혀졌다. 따라서 소르타제에 대한 선택적 저해는 그램 양성 병원균 자체를 없애기보다 이들의 병원성을 제거한다는 점에서 항생제 분야의 새로운 방법으로 주목받고 있다( Supuran, C. T., Scozzafava, A., Clare, B. W., Bacterial protease inhibitors. Med. Res. Rev., 22, p32937, 2002).

현재 소르타제 저해제에 대해 기술한 논문은 별로 알려진 바가 없는데 이는 부분적으로는 새로운 타겟으로서 소르타제가 지니는 중요성이 최근에 와서야 알려졌다는 데 그 이유가 있다. 초기에 쉬니빈트 연구팀은 메탄티오설포네이트(methanethiosulfonate)와 유기수은(organomercurial)이 소르테이즈의 활성 부분인 시스테인(cysteine) 내 티올(thiol)기와의 상호작용을 통해 소팅 반응에 대한 저해 효과를 가진다는 것을 밝혀냈다(Ton-That, H., Schneewind, O., Anchor structure of staphylococcal surface proteins. IV. Inhibitors of the cell wall sorting reaction. J. Biol. Chem., 247, pp24316-24320, 1999). 또한, 펩티도글리칸으로의 세포벽 중합반응을 저해하는 반코마이신(Vancomycin), 모에노마이신(Moenomycin)도 소팅 반응의 속도를 늦추어준다는 것을 밝혀냈다. 그러나 이러한 항생제들은 소팅 반응을 직접적으로 방해하기보다 펩티도글리칸 전구체의 생리적인 농도를 바꾸어줌으로서 소팅 반응을 저해한다.

최근에 두 연구팀이 독립적으로 Srt A의 비가역성 저해제를 만들었다. 워커(Walker) 연구팀은 LPXTG 모티프 내 트레오닌과 글리신사이의 약한 아미드 결합을 디아조케톤(diazoketone)이나 클로로메틸 케톤(chloromethyl ketone) 그룹으로 바꾸는 방법을 사용했고(Scott, C. J., Walker, B. et al., Irreversible inhibitionof the bacterial cysteine protease-transpeptidase sortase (SrtA) by substrate-derived affinity labels. Biochem. J., 366, p95395, 2002), 클러브(Clubb) 연구팀은 펩티딜-비닐 설폰(peptidyl-vinyl sulfone) 모방 기질을 합성했으며(Connolly, K. M., Clubb, R. T. et al., Sortase from Staphylococcus aureus Does Not Contain a Thiolate-Imidazolium Ion Pair in Its Active Site. J. Biol. Chem., 278, pp34061-34065, 2003), 본 발명자들은 재조합된 SrtA에 대해 저해 작용을 하는 약용식물 추출물에 대해 보고하면서 시험한 식물의 추출 부분 중 댕댕이덩굴(Coculus trilobus DC.)의 줄기로부터 나온 에틸아세테이트 추출물이 가장 큰 효과가 있음을 보고한 바 있다(Kim, S. W. et al., Inhibition of the bacterial surface protein anchoring transpeptidase sortase by medicinal plants. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, pp2751-2754, 2002). 그러나 천연물 저해제는 활성을 나타내는 추출 부분의 정제와 그 구조분석이 아직 해결해야 할 과제로 남아 있다. 그러므로 그램 양성균 감염의 치료 뿐 아니라 소르타제의 효소적 특징에 대한 구조 분석에 응용될 수 있는 약과 같은 소분자 소르타제 저해제 발견에 대한 필요성이 증대되고 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 정제되고 재조합된 Srt A를 이용하여 약 1,000여 가지 이상의 다양한 소분자 화합물들에 대해 무작위로 스크리닝을 수행한 결과, 수백 마이크로몰(Micromole)의 양으로 Srt A 저해 능력을 가지는 여러 화합물들을 감별함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 소르타제에 대하여 저해활성을 갖는 아크릴 유도체의 용도를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소르타제에 대하여 강력한 저해활성을 갖는 하기 일반식 (I)을 표기되는 아크릴 유도체 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그 이성체를 유효 활성 성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 소르타제 효소를 강력하게 저해시킴으로서 세균 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

(I)

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 o, m, p 위치에 하나 이상 치환가능한 O-R' 기 또는 N-R'기이고,

R₃ 는 수소, 시아노, 히드록시, O-R', 카르복실산, 및 R"로 치환된 에스테르기 또는 아미드기로부터 선택된 치환기이고,

R' 및 R"는 C1 내지 C3 탄소수를 갖는 저급알킬기이고, 상기한 점선(‥)은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.

상기 일반식 화합물 (1) 군중에서 바람직하기로는 R₁ 및 R₂는 p위치가 O-R' 기로 치환되고, R₃가 시아노 또는 R"로 치환된 에스테르기 또는 아미드기로부터 선택된 치환기이고, R' 및 R"는 메틸기 또는 에틸기인 화합물 군이며, 보다 바람직하기로는 R₁ 및 R₂는 p위치가 메톡시기로 치환되고, R₃가 시아노 또는 메틸에스테르기인 화합물 군이다.

본 발명의 일반식 (I) 화합물의 대표적인 화합물로는 예를 들어, (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(2), 메틸 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(1), (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴아미드(3), (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(4), (Z)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(5), (E)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(11), 메틸 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오네이트(6), 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오니트릴(7) 1,2-비스(4-메톡시페닐)에탄(8), (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(10), (Z)-3-(2-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14a), (Z)-3-(3-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14b) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 일반식 (I) 화합물은 시스(cis) 또는 트랜스(trans)형의 이중결합을 갖는 기하이성체, 부제탄소를 갖는 경우는 상기 부제탄소에 의한 각종, 입체이성체, 및 라세믹 혼합물을 포함한다.

이하 구체적으로 설명하면,

상기 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 화합물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 일반식 (Ⅰ) 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (Ⅰ)의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 상기의 일반식 (Ⅰ)의 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 일반식 (Ⅰ)의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기 일반식 (II)의 화합물을 하기 일반식 (III)의 알데히드체 화합물과 반응시킴을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.

본 발명의 화합물들은 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다. 하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 다른 화합물들은 당업자들에 의해 숙지된 시약 및 출발물질의 적당한 변화에 의해 제조될 수 있다.

일반식 (Ⅰ) 화합물을 제조하는 방법은 하기 반응식 1 내지 5에 기재된 바에 의해 설명되어진다.

예를 들어, 상기 일반식 (I) 화합물의 R₃ 치환기가 에스테르기 또는 카르복실산인 경우의 화합물은 하기와 같은 반응식 1에 기재된 반응을 통하여 수득될 수 있다.

출발물질로 알데히드체 및 벤조산 화합물을 무수아세트산 및 트리에킬아민과 염기성 용매 존재하에 100 내지 200℃, 바람직하게는 140℃ 내외의 반응온도하에서 반응시켜 R₃ 치환기가 카르복실산인 아크릴 카르복실산 화합물(2)을 얻고, 이 카르복실산을 알킬화반응시킴으로서 R₃ 치환기가 저급알킬에스테르체인 에스테르체(1)을 얻을 수 있고, 이 아크릴 카르복실산 화합물(2)에 암모니아 수용액상에서 SOCl₂와 같은 활성화제를 상온에서 반응시켜 아미드체(3)을 얻을 수 있으며, 이를 다시 피리딘 용매하에 SOCl₂와 같은 활성화제를 반응시켜 R₃ 치환기가 시안기인 화합물(4)을 연이어 제조할 수 있다.

상기 일반식 (I) 화합물의 R₃ 치환기가 수소기인 경우의 화합물은 하기와 같은 반응식 2에 기재된 반응을 통하여 수득될 수 있다.

출발물질로 알데히드체 및 포스포늄할라이드체 화합물을 n-부틸리튬과 같은 금속알킬 시약으로 반응시키는 위티그 반응(Wittig reaction)에 의하여 시스체-스틸벤 (5) 및 트랜스-스틸벤 (11) 화합물들을 제조할 수 있다.

상기 일반식 (I) 화합물의 중간연결쇄가 단일결합인 경우의 화합물은 하기와 같은 반응식 3에 기재된 반응을 통하여 수득될 수 있다.

출발물질로 이중결합의 중간사슬을 갖는 스틸벤 유도체 화합물(1,4, 5)을 팔라듐/활성탄 및 수소 가스하에 반응시키는 환원반응을 통하여 단일결합의 중간쇄를 갖는 화합물(6,7,8)들을 제조할 수 있다.

상기 일반식 (I) 화합물의 R₃ 치환기가 시안기인 화합물은 하기와 같은 반응식 4에 기재된 반응을 통하여 수득될 수 있다.

출발물질로 니트릴체 화합물(12) 및 알데히드체 화합물(13a-e)을 t-BUOK와 같은 금속알콕시드 시약으로 무수 반응시켜 R₃ 치환기가 시아노기인 니트릴체 화합물(14a-e)들을 제조할 수 있다.

상기 일반식 (I) 화합물의 R₃ 치환기가 에스테르인 화합물은 하기와 같은 반응식 5에 기재된 반응을 통하여 수득될 수 있다.

출발물질로 R₃ 치환기가 시아노기인 니트릴체 화합물(10)을 DIBAL-H와 같은 환원제와 반응시켜 알데히드체 화합물을 얻고 이를 다시 NaClO₂, NaH₂PO₄ ·2H₂O와 같은 산화제와 반응시킴으로서 R₃치환기가 카르복실산인 아크릴산 화합물을 얻고 연이어 염산, 메탄올과 같은 알킬화 반응을 통하여 R₃ 치환기가 에스테르인 화합물(9)을 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 활성성분으로써 소르타제 효소를 강력하게 저해시키는데 유효한 양의 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물과 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 함유하는 세균 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 활성성분으로써 유효 활성 성분으로 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석액을 함유하는 소르타제 저해활성을 통한 세균 감염증의 치료 또는 예방 효과를 갖는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세균 감염증의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물은 세균 감염증, 특히, 항생제 내성을 갖는 세균 감염증에 특히 치료 및 예방 효과가 탁월한데, 예를 들어, 메티실린에 내성을 갖는 스타필로코커스(Staphyllococus) 속의 그램 양성균(MRSA) 또는 메티실린 내성 응고효소-음성 스타필로코커스속의 그램양성균(MRSE)에 특히 강력한 억제활성을 나타내므로 상기 균주에 의한 감염증에 가장 탁월한 항균효과를 나타내므로 본 발명은 상기 균주 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물을 0.5 ~ 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 일반식 (Ⅰ) 화합물과 함께 사용할 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석액으로 예를 들면, 본 발명의 화합물은 주사 용액의 제조에 통상적으로 사용되는 오일, 프로필렌글리콜 또는 다른 용매에 용해시킬 수 있다. 적당한 담체로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일 및 이소프로필미리스테이트 등이 있다. 국소 적용을 위해서는 본 발명의 화합물을 연고나 크림으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 화합물을 활성성분으로 하는 약학 조성물은 스타필로코거스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아에( Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 표게스(Streptococcus pyogenes), 코르네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙코코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 엔테로코커스 파칼리스(Enterococcus facalis), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 등과 같은 세균 감염증의 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학조성물은 봉와직염, 장염, 위염, 치주염, 폐렴, 화농증, 탄저병, 파상풍, 항생제내성균증 등과 같은 세균성 감염 질환 의 치료 및 예방에 사용이 가능하다.

이하, 제형방법 및 부형제를 설명하지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 일반적인 식염수, 5% 텍스트로스와 같은 수용성 용매 또는 식물성 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 에스테르 또는 프로필렌글리콜과 같은 비수용성 용매에 화합물을 용해시키거나, 현탁시키거나 또는 유화시켜 주사제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 제형은 용해제, 등장화제(isotonic agents), 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001∼100 mg/체중kg으로, 바람직하게는 0.001~100 mg/체중kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량%, 바람직하게는 0.001~1중량%의 양으로 존재하여야 한다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. ( E )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(2) 합성

p-메톡시페닐 아세트산(6.02mM) 1.00g 및 p-아니스알데히드(6.08mM) 0.740㎖를 아세트산 무수물 2.0㎖에 용해시킨 다음, 트리에틸아민(7.17mM) 1.00㎖를 가하여 반응 혼합물을 140℃, 오일-욕조(oil-bath) 상에서 12시간 동안 교반한 후, 실온까지 냉각시킨 다음 1N 수산화나트륨 수용액으로 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물을 1N 염산 수용액으로 산성화시킨 다음, 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 20㎖씩 가하여 3회 추출하고 결합된 유기층을 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조시키고 농축하였다. 얻어진 잔사를 헥산/에틸아세테이트(5:1) 혼합 용액을 이용하여 재결정하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(화합물 2) 화합물 1.03g을 수득하였다(수득율 60%).

mp = 213-214℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.77(s, 3H), 3.85(s, 3H), 6.71(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.93(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.06(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.17(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.87(s, 1H)

MS (EI) m/z : 284 (M⁺)

실시예 2. 메틸 ( E )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(1) 합성

상기 실시예 1에서 얻은 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(화합물 2) 화합물(1.76mM) 500㎎을 메탄올 20㎖에 용해시킨 다음 진한 염산 80㎕를 가한 후, 반응 혼합물을 20시간 동안 환류시킨 다음 실온까지 냉각하였다. 반응 용매를 증발시킨 후 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=3:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 메틸 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(화합물 1) 화합물 326㎎을 수득하였다(수득율 62%).

mp = 95℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.76(s, 3H), 3.78(s, 3H), 3.85(s, 3H), 6.70(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.92(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.02(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.15(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.78(s, 1H)

MS (EI) m/z : 298 (M⁺)

실시예 3. ( E )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴아미드(3) 합성

상기 실시예 1에서 얻은 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(화합물 2) 화합물(0.528mM) 150㎎을 디클로로메탄 25㎖에 용해시킨 다음 DMF(디메틸포름아미드) 0.5㎖에 녹인 SOCl₂ 0.30㎖를 서서히 가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 진공농축하였다. 얻어진 잔사를 디클로로메탄 5㎖에 용해시킨 다음 28% 수산화암모늄 수용액 0.50㎖를 가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 증류수 10㎖로 희석하고 디클로로메탄 10㎖로 추출하였다. 이 과정을 2회 반복 수행하였으며, 결합된 유기층을 식염수로 세척하고 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조 및 농축한 후 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=3:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴아미드(화합물 3) 화합물 77㎎을 수득하였다(52%).

mp = 86-87℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ3.71(s, 3H), 3.83(s, 3H), 5.51(br s, 1H), 5.58 (br s, 1H), 6.65(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.95(m, 4H), 7.17(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.45(s, 1H)

MS (EI) m/z : 283 (M⁺)

실시예 4. ( E )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(4) 합성

상기 실시예 3에서 얻은 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴아미드(화합물 3) 화합물(0.191mM) 54㎎을 피리딘 2.0㎖에 녹인 다음, SOCl₂ 0.70㎖를 서서히 가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 진공 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=5:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 4) 화합물 32㎎을 수득하였다(수득율 63%).

mp = 86-87℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.78(s, 3H), 3.83(s, 3H), 6.74(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.88(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.14(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.20(s, 1H), 7.32(d, J = 9.0 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 265 (M⁺)

실시예 5. ( Z )-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(5) 및 ( E )-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(11) 합성

테트라하이드로퓨란(THF) 3㎖에 포스포늄 염(0.597mM) 250㎎을 현탁시킨 현탁액에 n-부틸리튬(n-BuLi, 0.661mM, 1.6M 헥산에 용해됨) 413㎕를 0℃에서 천천히 가한 후, 반응 혼합물을 실온이 될 때가지 방치한 다음 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 p-아니스알데히드(p-Anisaldehyde, 0.542mM) 660㎕을 가한 다음 실온에서 다시 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 포화된 염화암모늄(NH₄Cl)을 가하여 반응을 중지시킨 다음 에틸아세테이트 10㎖로 희석하고 식염수로 세척하였다. 결합된 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후 얻어진 잔사를 실리카겔(petroloum ether:에틸아세테이트=40:1~25:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 (Z)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(화합물 5) 화합물 47㎎ 및 (E)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(화합물 11) 화합물 36㎎을 수득하였다(각각 수득율 36% 및 27%).

( Z )-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(화합물 5)(시스-스틸벤 구조)

mp = 35℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.79(s, 6H), 6.45(s, 2H), 6.77(d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.20(d, J = 9.0 Hz, 4H)

MS (EI) m/z : 240 (M⁺)

( E )-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐(화합물 11)(트랜스-스틸벤 구조)

mp = 208-209℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.83(s, 6H), 6.89(d, J = 9.0 Hz, 4H), 6.93(s, 2H), 7.43(d, J = 9.0 Hz, 4H)

MS (EI) m/z : 240 (M⁺)

실시예 6. 메틸 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오네이트(6) 합성

출발물질로 상기 실시예 2의 메틸 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(화합물 1) 화합물(24㎎, 0.080mM) 현탁액 및 메탄올 3㎖에 녹인 10% Pd/C 5㎎을 수소기체 1기압 하에서 3시간 동안 교반한 다음, 현탁액을 셀라이트 패드(Celite pad)로 여과하여 수득된 여과액을 농축 및 건조시킨 후 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=6:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 메틸 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오네이트(화합물 6) 화합물 22㎎을 수득하였다(수득율 91%).

mp = 83℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 2.94(dd, J = 13.8, 6.9 Hz, 1H), 3.32(dd, J = 13.8, 8.7 Hz, 1H), 3.60(s, 3H), 3.76(m, 1H), 3.77(s, 3H), 3.79(s, 3H), 6.77(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.84(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.03(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.22(d, J = 8.7 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 300 (M⁺)

실시예 7. 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오니트릴(7) 합성

출발물질로 메틸 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴 (화합물3) 화합물(24㎎, 0.080mM)을 사용하는 것만 제외하고, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 2,3-비스(4-메톡시페닐)피로피오니트릴(화합물 7) 화합물 35㎎을 수득하였다(수득율 74%).

mp = 116-117℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.04(dd, J = 13.8, 6.9 Hz, 1H), 3.11(dd, J = 13.8, 8.1 Hz, 1H), 3.79(s, 3H), 3.81(s, 3H), 3.90(dd, J = 7.8, 6.9 Hz, 1H), 6.82(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.87(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.03(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.15(d, J = 8.7 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 267 (M⁺)

실시예 8. 1,2-비스(4-메톡시페닐)에탄(8) 합성

출발물질로 (Z)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐 (화합물 5) 화합물(24㎎, 0.080mM)을 사용하는 것만 제외하고, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 2,3-비스(4-메톡시페닐)에탄(화합물 8) 화합물 20㎎을 수득하였다(수득율 95%).

mp = 125-126℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 2.83(s, 4H), 3.79(s, 6H), 6.82(d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.09(d, J = 8.4 Hz, 4H)

MS (EI) m/z : 242 (M⁺)

실시예 9. ( Z )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(10) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴 (화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 p-아니스알데히드(2.01mM) 0.245㎖에 t-BuOK(4.02mM) 451㎎을 0℃에서 가한 다음, 반응 혼합물을 실온이 될 때까지 방치한 후 2시간 동안 교반하였다. 포화된 염화암모늄(NH₄Cl) 수용액을 가하여 반응을 중지시킨 다음 에틸아세테이트 50㎖를 가하여 희석한 후 식염수로 세척하였다. 결합된 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 농축한 후, 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=7:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 10) 화합물 341㎎을 수득하였다(수득율 65%).

mp = 107℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.85(s, 3H), 3.87(s, 3H), 6.95(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.97(d, J = 9.0 Hz, 2H) 7.36(s, 1H), 7.58(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.85(d, J = 9.0 Hz, 2H)

실시예 10. ( Z )-3-(2-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14a) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴(화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 o-아니스알데히드(2.01mM) 0.245㎖를 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 엷은 황색 고체상의 (Z)-3-(2-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14a) 화합물 1.20g을 수득하였다(수득율 63%).

mp = 96℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.86(s, 3H), 3.89(s, 3H), 6.93(m, 1H), 6.96(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.06(ddd, J = 7.8, 7.8, 0.6 Hz, 1H), 7.40(ddd, J = 7.8, 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.63(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.84(s, 1H), 8.11(dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H)

MS (EI) m/z : 265 (M⁺)

실시예 11. ( Z )-3-(3-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14b) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴 (화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 m-아니스알데히드(2.01mM) 0.245㎖를 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 엷은 황색 오일상의 (Z)-3-(3-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14b) 화합물 1.34g을 수득하였다(수득율 60%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.85(s, 3H), 3.87(s, 3H), 6.93-6.99 (m, 3H), 7.33-7.41(m, 3H), 7.48(m, 1H), 7.61(d, J = 9.0 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 265 (M⁺)

실시예 12. ( Z )-3-(2,5-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14c) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴 (화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 2,5-디메톡시벤즈알데히드(2.01mM) 0.245㎖를 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 엷은 녹색 고체상의 (Z)-3-(2,5-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14c) 화합물 1.39g을 수득하였다(수득율 62%).

mp = 84-85℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.84(s, 3H), 3.85(s, 3H), 3.86(s, 3H), 6.87(d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.94-6.98(m, 3H), 7.63(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.75(d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.83(s,1H)

MS (EI) m/z : 295 (M⁺)

실시예 13. ( Z )-3-(3,4-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14d) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴 (화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 3,4-디메톡시벤자알데히드(2.01mM) 0.245㎖를 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 엷은 황색 고체상의 (Z)-3-(3,4-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14d) 화합물 2.01g을 수득하였다(수득율 66%).

mp = 102-103℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.86(s, 3H), 3.94(s, 3H), 3.97(s, 3H), 6.92(d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.96(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.33(ddd, J = 8.7, 2.1, 0.6 Hz, 1H), 7.35(s, 1H), 7.59(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.68(d, J = 2.1 Hz, 1H)

MS (EI) m/z : 295 (M⁺)

실시예 14. ( Z )-3-(3,5-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14e) 합성

출발물질로 (4-메톡시-페닐)-아세토니트릴 (화합물 12) 화합물(1.99mM) 0.270㎖ 및 테트라히드로퓨란(THF) 20㎖에 용해시킨 3,5-디메톡시벤자알데히드(2.01mM) 0.245㎖를 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 엷은 황색 고체상의 (Z)-3-(3,5-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14e) 화합물 1.39g을 수득하였다(수득율 59%).

mp =78℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.84(s, 6H), 3.85(s, 3H), 6.52(t, J = 2.4 Hz, 1H), 6.95(d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.03(d, J = 2.1 Hz, 2H), 7.34(s, 1H), 7.60(d, J = 9.0 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 295 (M⁺)

실시예 15. 메틸 ( Z )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(9) 합성

15-1. 메틸 ( Z )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴알데히드 합성

톨루엔 10㎖에 녹인 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 10) 화합물(1.88mM) 500㎎ 용액에 DIBAL-H(2.25mM, 1.5M 톨루엔에 용해시킴) 1.5㎖를 -78℃에서 가한 다음, 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반한 후 0℃에서 5% 황산(H₂SO₄) 수용액을 가하여 반응을 중지시켰다. 수득된 반응 혼합물을 디에틸에테르(Et₂O) 30㎖ 및 식염수 20㎖를 이용하여 분획시킨 다음, 수용성 층을 디에틸에테르 20㎖로 추출한 후 결합된 유기층을 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조시키고 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔(헥산/에틸아세테이트=10:1)을 이용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 메틸 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴알데히드 화합물 296㎎을 수득하였다(수득율 59%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.79(s, 3H), 3.85(s, 3H), 6.76(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.96(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.14(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.21(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.29(s, 1H), 9.70(s, 1H)

15-2. 메틸 ( Z )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산 합성

상기 실시예 15-1에서 얻은 메틸 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴알데히드 화합물(0.276mM) 74㎎을 t-BuOH-H₂O(1:1) 6㎖에 녹인 후, 2-메틸-2부텐 2.0㎖(2.0M THF에 용해시킴), NaClO₂ 140㎎ 및 NaH₂PO₄·2H₂O 128㎎을 0℃에서 가한 다음 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 교반 후 반응 혼합물을 THF가 모두 제거될 때까지 농축한 다음 에틸아세테이트 25㎖를 가하여 추출하였다. 이 과정을 3회 반복하여 수행한 후 결합된 유기층을 식염수로 세척하고 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조시킨 다음 증발시켰다. 얻어진 잔사에 헥산/에틸아세테이트(5:1) 혼합용액 20㎖를 가하여 1시간 동안 교반시킨 다음 생성된 백색 고체를 여과한 후 헥산/에틸아세테이트(7:1) 혼합용액 10㎖로 세척하였다. 이 과정을 2회 반복 수행한 다음 진공건조시킨 후 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 메틸 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산 화합물 62㎎을 수득하였다(수득율 79%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.82(s, 3H), 3.84(s, 3H), 6.89(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.93(d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.96(s, 1H), 7.43(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.43(d, J = 8.7 Hz, 2H)

15-3. 메틸 ( Z )-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(9) 합성

상기 실시예 15-2에서 얻은 메틸 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산 화합물을 출발물질로 사용하는 것만 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여 하기 물성치를 갖는 백색 고체상의 메틸 (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트(화합물 9) 31㎎을 수득하였다(수득율 70%).

mp = 76℃

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.80(s, 3H), 3.83(s, 6H), 6.85-6.93 (m, 5H), 7.30(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.37(d, J = 8.7 Hz, 2H)

MS (EI) m/z : 289 (M⁺)

실험예 1. 생물학적 분석의 프로토콜

1-1. PCR 클로닝, 재조합형 소르타제의 발현 및 정제

N-터미널 세포막 고정 영역이 결핍된 소르타제 유전자 영역은 프라이머 orf6N-ds-B(5'-AAACCACATATCGATAATTATC-3') 및 orf6C-B(5'-TTATTTGACTTCTGTAGCTACAA-3')를 사용하여 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 유전자 DNA, ATCC 6538p로부터 PCR 증폭되었으며, 결과적으로 암플리콘(Amplicon)은 TA 클로닝 및 발현 벡터, pBAD/티오-TOPO(인비트로겐, 글로닌겐, 네델란드)로 클로닝되었다. 충분한 대장균(Escherichia coli, 탑10, 인비트로겐) 세포는 암피실린 50㎍/㎖를 포함하는 LB(Luria-Bertani) 아가 플레이트로부터 선택되고 변형되었다. 디데옥시뉴클레오티드 DNA 시퀸싱(Sequencing)에 의해 양성 클론의 확인 및 선택 후, 변형된 박테리아를 37℃, 암피실린 50㎍/㎖를 포함하는 LB 욕조에서 증식시켰으며, 발현은 0.002% 아라비노스(arabinose)로 유도하였다. 배양물은 37℃에서 6시간 동안 후-유도 배양 후에 수득되었으며, 재조합형 효소는 Ni-NTA 어피너티(affinity) 컬럼으로 정제하였다(Lee, K. Y., Shin, D. S., Yoon, J. M., Kang, H., Expression of sortase, a transpeptidase for cell wall sorting reaction from Staphylococcus aureus ATCC 6538p in Escherichia coli. J. Microbiol. Biotechnol., 12, pp530-533, 2002).

1-2. 소르타제 저해법

반응 용기에 300㎕의 반응 혼합물(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, 0.75㎍ 합성 펩타이드 기질, 댑실-QALPETGEE-에단스 및 55㎍ 재조합형 소르타제)을 가한 다음, 시료(최종 0.5% MeOH)를 포함하는 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰을 가하였다. 시료 용액을 포함하는 것만 제외하고 상기와 동일한 조건을 블랭크(blanks)로 하였다. 반응 용액을 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 형광 강도의 증가를 여기 파장 350nm 및 발광 파장 495nm에서 형광분광광도계(SpectralMAX Gemini XS, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다. 소르타제 저해제로 알려진 p-히드록시머큐리벤젠산(p-Hydroxymecuribenzoic acid; pHMB)을 양성 대조군으로 하였으며, 각 시료 화합물은 메탄올에 용해시킨 다음 1%보다 낮은 농도에서 효소 활성에 대한 효과를 가지지 않는 안정화된 증류수로 희석하여 사용하였다. 실험은 시료 각 농도에서 독립적으로 5회 반복하여 수행하였다(표 1 참조).

	화합물명	IC50(μM)b
1	1	231.086 ± 6.530
2	2	>1000
3	3	476.034 ± 11.083
4	4	187.403 ± 3.958
5	5	>1000
6	6	>1000
7	7	>1000
8	8	>1000
9	9	908.928 ± 26.682
10	10	27.892 ± 0.490
11	11	>1000
12	14a	36.222 ± 0.942
13	14b	17.376 ± 0.490
14	14c	9.244 ± 0.474
15	14d	22.957 ± 0.643
16	14e	25.463 ± 0.948

그 결과, 합성된 화합물 14a 내지 14e 모두에서 40 μM 이하의 IC₅₀ 수치를 지닌 소르타제 저해활성을 나타내었다. 특히, 화합물 14c가 9.2 μM의 IC₅₀ 수치를 나타내는 바, 소르타제 효소에 대하여 가장 강력한 저해활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

1-3. 효소 동역학(Enzyme kinetics)

모든 소르타제(SrtA) 저해법은 상기 실험예 1-2와 동일하게 150mM NaCl 및 5mM CaCl₂(SrtA 완충액)을 포함하는 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 용액, 37℃에서 수행하였다. 댑실-QALPETGEE-에단스(Dabcyl-QALPETGEE-Edans)는 pH 7.5의 완충액 Km의 상, 하의 다양한 농도에서 기질로서 사용되었으며, 상기 실시예 12에서 얻은 저해제 (Z)-3-(2,5-디메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(화합물 14c) 화합물을 메탄올에 용해시킨 다음 즉시 상기의 SrtA 완충액으로 적당한 농도가 되도록 희석하였다. 저해제에 의한 효소 저해 정도의 측정은 주어진 농도의 저해제의 유, 무에 따라 다른 기질 농도에서 수행하였으며, 그들의 동역학은 리네위버(Lineweaver) 및 버크(Burk)의 방법(Lineweaver, H. Burk, D., The determination of enzyme dissociation constants., J. Am. Chem. Soc., 56, 658-666, 1934)으로 측정하였다(도 1). 효소 동역학 측정을 위한 투석을 위하여 효소 용액(15.3μM) 0.96㎖ 및 고정된 저해제 농도 0.04㎖를 준비한 다음 재생된 셀룰로오스 투석 세포막 SPECTRAPOR을 이용하여 2시간 동안 37℃에서 완충액 100㎖에 대하여 투석하였다. 효소 저해제 혼합액 0.03㎖의 반응액(Aliquots)을 0, 30, 60, 90, 120분의 시간 구간별로 조사(take in)한 다음 기질(0.17μM) 0.020㎖를 가한 후 1시간 동안 배양하고 효소 활성을 측정하였다. 대조 용액 및 완충액(SrtA 완충액, 1㎖; SrtA, 15.3μM)에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 수행하여 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 화합물 14c는 경쟁적 억제자(Ki = 6.81 ± 0.41 μM)로서 작용함을 확인하였다. 게다가, 화합물 14c의 효소와의 결합은 효소활성이 2시간 내의 투석에 의해 즉시 회복되기 때문에 가역적이었으며, 억제자와 효소 사이의 공유결합의 가능한 존재를 배제할 수 있었다.

실험예 2. 분자 모델링 방법

시빌 6.90 버전(Sybyl 6.90 version)(Tripos Associates)의 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 표준 결합 길이 및 각을 적용하여 리눅스 7.3하에 작동시켜 계량적인 계산(computational calculations)을 수행하였다. 저해제의 구조는 시빌 팩키지를 이용하여 규명하였으며, 트리포스 장력(tripos force field)에서 기울기가 0.001㎉/mol이 될 때가지 결합 기울기법(conjugate gradient method)을 이용하여 저해제의 구조를 최소화하였다. 또한, 거리-의존적 유전체 함수를 가지는 가스테이저-휙켈 전하(Gasteiger-Huckel charge)를 최소화 과정에 적용하였다. 이형태체(conformer)는 트리포스 장력에서 각 화합물 당 20 사이클씩 1000fs 동안 700K로 가열하고 1000fs 동안 200K까지 냉각시키는 모의 가열냉각법(simulated annealing method)을 수행하였다. 선택된 에너지 최소화 이형태체를 모팍 팩키지(MOPAC package)의 반-경험적(semi-empirical) PM3 방법을 사용하여 다시 최소화한 다음 얻어진 이형태체(-10.7611㎉)를 플렉시덕 연구(Flexidock study)의 리간드로 이용하였으며, 소르타제의 구조는 단백질 데이터 은행(ⅡJA)으로부터 얻었다. 시빌 팩키지의 일부분인 플렉시덕을 위한 멀티 채널 지표법(Multi Channel Surfaces method)을 수행하여 얻어진 바인딩 포켓(binding pocket)은 4Å 리간드 내에서 모든 잔기를 선택함에 의해 한정하였다. 리간드는 시스 184(Cys 184)에 가깝게 활성 위치(active site)로 추정되는 곳을 수동적으로 지정해 주었으며, 화합물 14c의 5개의 회전 결합 및 수소 결합 인자들을 가지고 플렉시덕을 수행하였다. 마지막 덕킹 모델(docking model)은 -220.56㎉의 에너지를 가지며 도 2에 나타낸 바와 같이 소르타제의 활성 위치에서 화합물 14c의 결합 형태를 보였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 아크릴 유도체 화합물들은 소르타제 효소를 탁월하게 억제하므로 내성균주에 의한 각종 세균 감염증 질환의 치료 및 예방에 효과적이므로 종래 항균제에 내성을 갖는 세균감염증 치료에 효과적인 의약품으로 유용하게 사용이 가능하다.

도 1은 화합물 14c에 의한 소르타제 저해활성의 리네위버-버크(Lineweaver-Burk) 플롯을 나타낸 도이고,

도 2a 및 2b는 소르타제 내에서 화합물 14c의 덕킹 모델(docking model)을 나타낸 사진으로서, 도 2a는 화합물 14c의 CN과 Arg 197 골격의 NH 수소사이의 수소결합을 점선으로 나타낸 사진이고, 도 2b는 화합물 14c가 소르타제의 대표적인 결합부위를 MOLCAD 표면으로 나타낸 사진이다.

Claims (7)

1. 하기 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이성질체를 유효 활성 성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 소르타제 효소를 강력하게 저해시킴으로서 세균 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물:

   (I)

   상기 식에서,

   R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 o, m, p 위치에 하나 이상 치환가능한 O-R' 기 또는 N-R'기이고,

   R₃ 는 수소, 시아노, 히드록시, O-R', 카르복실산, 및 R"로 치환된 에스테르기 또는 아미드기로부터 선택된 치환기이고,

   R' 및 R"는 C1 내지 C3 탄소수를 갖는 저급알킬기이고, 상기한 점선(‥)은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.
2. 제 1항에 있어서, R₁ 및 R₂는 p위치가 O-R' 기로 치환되고, R₃가 시아노 또는 R"로 치환된 에스테르기 또는 아미드기로부터 선택된 치환기이고, R' 및 R"는 메틸기 또는 에틸기인 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이성질체인 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, R₁ 및 R₂는 p위치가 메톡시기로 치환되고, R₃가 시아노 또는 메틸에스테르기인 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이성질체인 약학 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 일반식 (I) 화합물이 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴산(2), 메틸 (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴레이트, (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴아미드, (E)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴, (Z)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐, (E)-1,2-비스(4-메톡시페닐)에텐, 메틸 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오네이트, 2,3-비스(4-메톡시페닐)프로피오니트릴, 1,2-비스(4-메톡시페닐)에탄, (Z)-2,3-비스(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴, (Z)-3-(2-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴, (Z)-3-(3-메톡시페닐)-2-(4-메톡시페닐)아크릴로니트릴(14b) 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 이성질체인 약학 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 세균감염은 항생제 내성을 갖는 세균에 의한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 세균은 메티실린에 내성을 갖는 스타필로코커스(Staphyllococus) 속의 그램 양성균(MRSA) 또는 메티실린 내성 응고효소-음성 스타필로코커스속의 그램양성균(MRSE)인 약학 조성물.
7. 제 4항에 있어서, 세균 감염성 질환은 봉와직염, 장염, 위염, 치주염, 폐렴, 화농증, 탄저병, 파상풍인 약학조성물.