KR20050095285A - 세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 디엔에이칩 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 DNA 칩에 대한 것이다.
본 발명의 세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 DNA 칩은, 대뇌피질세포에서 영양분 고갈(serum deprivation)에 의해 유도된 세포사멸 관련 유전자인 HDAC2, ULK2, GTFII(General transcription factor II), Magonashi homolog의 4 가지 유전자의 cDNA와 기존의 알려진 세포사멸 관련 특정 유전자 364 개의 cDNA와, 컨트롤로 사용되는 베타 튜블린 2(Tubulin, beta 2), 베타 튜블린 5(Tubulin, beta 5), 베타 글루코루니다아제(Beta glucuronidase ; GUSB), 베타 2 마이크로글로불린 (Beta-2-microglobulin) 유전자로 구성된다.
본 발명에 의해, 질병과 밀접한 현상인 세포사멸의 정도를 판별할 수 있는 세포사멸 관련 cDNA 칩과 새로이 밝혀낸 세포사멸 관련 특정 유전자의 발현정도를 평가하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 DNA칩에 대한 것이다.
세포사멸(apoptosis)은 세포 예정사로서 세포가 어떠한 자극이나 신호에 의해서 스스로 죽는 것을 의미한다.
세포사멸 관련 유전자는 세포사멸을 유도하였을 때 세포사멸 기전에 관련하여 여러 가지 반응을 나타내는 유전자 성향을 나타내는 말이다. 즉 염색체 응축, DNA 단편화 등과 같은 세포사멸의 형태학적인 변화를 나타낸다.
이러한 형태학적인 변화는 세포사멸의 후기에 일어나는 변화이며, 이러한 변화를 일으키는 것은 세포사멸 초기 유전자들의 발현 양상의 변화에 의해 나타난다. 이때 세포사멸을 유도 후, 아무런 변화가 일어나지 않는 유전자의 경우에는 “하우스 키핑 유전자(house keeping gene)”라 한다.
세포사멸은 발달이나 퇴행성 뇌질환과 같은 질병의 가장 중요한 요소이며 (Birigitte Pettmannand Christopher E. Henderson. 1998, Junying Yuan and Brunce A. Yankner. 2000), 항암제와 같은 질병 치료제의 효과를 판단할 수 있는 중요한 지표가 되는 현상이다.
세포사멸 여러 가지 유전자 예를 들면 Bcl-2 family, caspase family 등의 유전자가 관여한다고 알려져 있다.
세포사멸 신호에 의해 유전자 발현에 변화가 생기게 되면, 세포사멸 관련 유전자는 분자적 기전을 거쳐 염색체 응축, DNA 분절화 등 형태학적 변화를 일으켜 세포사멸에 이르게 한다(Scott H. Kaufmann and Michael O. Hengartner. 2001).
여러 유전자가 조화롭게 작용하여 이루어지는 세포사멸의 분자적 기전을 살펴보면, 두 가지 기전으로 나눠볼 수 있다.
우선, 첫 번째 기전은 마이토콘드리아(mitochondria)가 관계된 기전이다.
세포사멸 신호에 의해 마이토콘드리아에서 사이토크롬 씨(Cytochrome C)가 방출되면 세포질에 존재하는 caspase 9과 함께 아폽토좀(apoptosome)을 형성한다. 이렇게 형성된 아폽토좀(apoptosome)은 아래 기전의 존재하는 caspase 3를 활성화 시켜 세포사멸의 형태학적 변화를 일으키게 된다.
또 다른 대표적인 기전은 세포 사멸관련 수용체관련 기전이다.
이 사멸 수용체의 종류는 TNFR1, Fas (CD95), DR3/WSL, and TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)/Apo-2L receptors 가 있으며, 이러한 수용체에 리간드가 와서 붙으면, 차례로 capase와 같은 사멸 관련 유전자들이 활성화 되어 세포사멸을 일으키게 된다. 이외에도 Smac/DIABLO, AIF 등이 알려져 있다(Susin, S.A et al. 1999).
세포사멸의 형태학적 변화가 일어나기 전 세포사멸을 예측하기 위하여 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상을 측정하는데, 이를 조사하기 위해서 DNA 칩, DD-PCR(differnetial display, PCR), SAGE(Serial analysis gene expression) 및 EST (Ezpressed seqeunce taq)등의 방법이 있다.
이중에서 DNA 칩은 개개의 유전자 대신 수천 또는 수 만개의 유전자 조합의 발현 양상을 동시에 관측할 수 있도록 해주는 장점 때문에 분자생물학의 기초 연구뿐만 아니라 질병 진단, 신약개발 등 다양한 응용 분야에 적용될 수 있다.
따라서, DNA 칩 상에서 mRNA 수준을 측정하는 것은 특정 자극에 의한 여러 유전자의 반응을 알아낼 수 있는 방법이다.
그러나, 종래에는 세포사멸의 가능성을 예측하고, 세포사멸 정도를 비교분석하는데 어려움이 있었다.
본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여, 세포사멸의 정도를 판별할 수 있는 세포사멸 관련 cDNA 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 새로이 밝혀낸 세포사멸 관련 특정 유전자의 발현정도 평가방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 DNA칩에 대한 것이다.
보다 상세히 설명하면, 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상을 분석함으로써, 다양한 질병, 특히 항암제의 치료효과를 분석하는데 유용한 방법 및 이를 위한 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명의 세포사멸에 대한 유전자 발현양상 측정용 DNA 칩은, 대뇌피질세포에서 영양분 고갈(serum deprivation)에 의해 유도된 세포사멸에 의한 유전자 발현 양상을 비교 분석하여 밝혀낸 세포사멸 관련 유전자인 HDAC2, ULK2, GTFII(General transcription factor II), Magonashi homolog의 4 가지 유전자의 cDNA와, 표 2에 나타낸 기존의 알려진 세포사멸 관련 특정 유전자 364 개의 cDNA, 컨트롤로 사용되는 베타 튜블린 2(Tubulin, beta 2), 베타 튜블린 5(Tubulin, beta 5), 베타 글루코루니다아제(Beta glucuronidase ; GUSB), 베타 2 마이크로글로불린(Beta-2-microglobulin) 유전자로 구성된다.
또한, 본 발명의 세포사멸 정도에 관한 반응 평가방법은, 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 추출한 RNA를 역전사시켜 DNA를 생성하며, 생성된 DNA를 서열번호 1 및 서열번호 2의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 3 및 서열번호 4의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 5 및 서열번호 6의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 7 및 서열번호 8의 DNA 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여, 세포사멸 유전자를 증폭시키고, 증폭된 세포사멸 유전자의 발현양상을 분석하는 것으로 구성된다.
세포사멸은 정상적인 신체에서 발달 과정이나 인체의 항상성 유지에서 일어나는 현상이다. 하지만 이러한 세포사멸 과정이 잘 조절이 못될 경우 기형이나 질병을 일으킬 수 있다.
인류의 커다란 숙제인 암의 경우 세포주기가 조절이 되지 않아 세포사멸이 일어나지 않아 계속 세포가 증식하여 종양을 형성하게 되는데, 이때 이용하는 치료제의 상당수가 세포사멸을 유발하게 된다.
세포사멸에 관한 유전자 발현을 확인하고자 하는 방법은 대표적인 유전공학 방법으로 서던 블롯, 노던블롯, S1 nuclease protection, DD-PCR (differential display), cDNA library screeing, SAGE(serial analysis of gene expression)등이 있다.
그러나, 이러한 방법을 이용한 결과는 활용하기 불편하고, 많은 유전자의 발현 변화를 보기에 적당하지 못한 단점이 있다. 이와 같은 문제점을 극복하기 위해 개발된 방법 중의 하나로서 정확하고 빠르게 유전자의 발현을 분석할 수 있는 DNA 칩을 이용한 유전자 검색방법이 사용된다.
DNA 칩은 엄청나게 많은 종류의 각기 다른 유전자의 cDNA를 고밀도로 슬라이드나 나일론 멤브레인에 붙여 놓은 것을 말한다. DNA 칩은 동시에 최소한 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점이 있다.
또한 노던 블럿의 경우 많은 양의 RNA를 필요로 하는데 DNA 칩의 경우 최소한 5㎍에서 최대한 100㎍의 RNA를 이용하여 수많은 유전자의 발현 정도를 검색할 수 있는 장점이 있다.
DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA(complementary DNA) 칩과 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide) 칩으로 분류된다. cDNA 칩에는 최소한 500bp이상의 유전자(full-length open reading frame 또는 EST)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25 개의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 붙여져 있다.
또한 DNA 칩은 제작 기술에 따라 4 가지로 나눌 수 있는데, cDNA chip과 올리고뉴클레오타이드 칩을 제작하는데 활용되는 방법인 솔리드핀(solid pin)과 스필트핀(spilt pin)을 이용한 핀 어레이(pin microarray) 방식, 잉크젯 원리를 이용한 잉크젯 방식, 그리고 주로 올리고뉴클레오타이드 칩을 제작하는데 활용되는 포토리소그래피에 의한 직접합성 방법과 전기를 활용한 전기적 어레이(electronic array) 방법이 있다.
현재 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)로부터 얻는 염기서열 정보는 빠르게 증가하고 있으며, 이 정보는 생물 의학적 실험(Biomedical expreiment)으로부터 재확인될 수 있다.
그러므로, 유전자 발현 양상을 상기의 DNA 칩 기술로 분석하여 전체적인 세포적 반응(cellular event)을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에서는 배양한 대뇌피질세포에 세포사멸을 유도한 후 유전자의 발현 양상을 2,300 개의 알고 있는 유전자 cDNA 칩을 이용하여 선별하는 방법을 이용하였다.
본 발명에서 사용된 cDNA 칩에 집적된 유전자는 2,300 여개의 알려진 유전자 (Known gene)를 PCR로 증폭하여 제작하였다.
cDNA 칩과 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포의 RNA로부터 역전사된 DNA와 혼성화 결과는 도 1에 나타내었다.
DNA 칩의 혼성화 결과를 분석하기 위해 사용한 형광물질은 Cy3-dUTP Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia. U.K)를 사용할 수 있다. 이는 임의로 색깔차이로 인해 유전자 발현의 강도를 비교하기 위해서 표지하는 물질이다.
따라서, 유전자 발현 정도를 스캔할 때 Cy3는 532nm 파장에서 녹색을 띠게 되고, Cy5는 635nm에서 빨간색을 띠게 된다.
DNA 칩의 혼성화한 결과는 일반적으로 표준화를 거쳐 산점도(scatter plot)으로 나타내게 된다. 본 연구에서는 β-actin, GAPDH 유전자를 기준(standard)으로 하여“1”로 보고, 각 스팟의 시그날을 각 슬라이드의 스팟 시그날의 평균값으로 나눠서 표준화하였다. 산점도 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
그 결과, cDNA 칩의 2,300 개 유전자 중에서 69 개 유전자가 세포사멸에 의해 상향 조절(up-regulation)되었고, 21 개의 유전자가 하향조절(down-regulation)되었다. 또한 변화가 없는 유전자(house keeping gene)을 포함하는 2,220 개의 유전자는 세포사멸과 관련이 없는 것으로 나타났다.
상기결과는 적어도 80/2,300 개의 유전자가 대조군에 비하여 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 유의적으로 변화함을 보여준다. 이는 cDNA 칩을 이용하여 세포사멸의 가능성을 예측해 볼 수 있음을 보여준다.
특히, 대부분의 항암치료제가 세포사멸을 유발하기 때문에 본 발명에서 확인된 유전자 세트(set)는 여러 형태의 항암제의 효과를 파악할 수 있는데 이용될 수 있다.
또한, 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 확인된 80 개의 유전자의 발현양상이 항암제 치료를 받는 환자의 반응 및 퇴행성 질병의 진행정도를 판단할 수 있는 가치있는 정보를 제공할 것이며, 특히 HDAC2를 포함하는 4 가지 유전자는 세포사멸을 판단하는 중요한 바이오마커(biomarker)가 될 수 있다.
본 발명에서는 세포사멸이 유도된 세포에서 아직 형태학적 변화가 일어나기 전 수득한 유전자 중 ULK2, HDAC2, GTFⅡ(General transcription factor II), Magonashi homolog의 4 종류의 세포사멸 관련 유전자의 바이오마커(biomarker)로서의 가능성을 확인하기 위하여 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 추출한 RNA를 이용하여 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)을 수행하였다.
총 RNA 추출방법은 구아니딘을 사용하는 방법, 트리졸(Trizol) 시약을 사용하는 방법, 상업적으로 판매하는 RNA 추출 키트를 사용하는 방법 등이 있으나. 본 연구에서는 트리졸(Trizol)시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다.
역전사연쇄중합반응(RT-PCR)이란 본 연구 분야에서 잘 알려진 방법으로서 oligo dT12-18 프라이머를 사용하여 RNA중에서 메신저 RNA만을 선별적으로 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이다.
실험과정은 (1) 역전사효소(reverse trasncriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정; (2) cDNA를 이용하여 특정 부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어진다.
따라서, 세포사멸 관련 유전자를 생성하기 위해서 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포로부터 추출한 RNA를 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 생성하고 여기에 세포사멸 관련 유전자를 증폭하기 위한 특이적인 DNA 서열 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시킴으로써 세포사멸 관련 유전자를 수득할 수 있었다.
아래 표 1에 세포사멸에 특이적으로 변화하는 4 종류의 세포사멸 관련 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 나타내었다.
<표 1> 세포사멸 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍
유전자 | 염 기 서 열 | 서열번호 |
HDAC 2 | 5'-AAG GAG GTC GTA GGA ATG TTG CTG-3' | 1 |
5'-ATC CCA GAA TCG TCT CAC TTT TCG-3' | 2 | |
ULK2 | 5'-ACA GAC ACC TTA CGC CAT CTG A-3' | 3 |
5'-CTC AGC TTC CCA GAC TTG ACC T-3' | 4 | |
GTFⅡ | 5'-CGA CCT CTT CAG TCG GAA GTT T-3' | 5 |
5'-TTC TTG TAT CAC AGG GCC TTC A-3' | 6 | |
Mago nashi homolog, proliferation -association | 5'-TAA ATT GCG ATA CGC CAA CAA C-3' | 7 |
5'-GGA TCC TTG GAC TGG TTG ACA T-3' | 8 |
상기 표 1의 프라이머 쌍을 이용하여 수득한 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상은 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이 세포사멸 유전자들이 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 발현이 증가하는 양상을 보였다.
아가로스 겔에서 발현이 확인된 세포사멸 관련 유전자는 ULK2(Mus musculus, Unc-51 like kinase 2), HDAC2(Mus musculus, histone deacetylase 2), GTFII(Mus musculus, General transcription factor II), Magonashi homolog(Mus musculus) 이다.
이것은 유도된 전사수준(transcript level)이 뚜렷한 범위(range)의 값을 가질 때 이들 세포사멸 관련 유전자 mRNA가 바이오마커(biomarker)로서 사용될 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명은 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포로부터 수득한 유전자의 발현 양상을 분석하여 세포사멸에 관한 반응을 판단하기 위해 세포사멸 관련 유전자 cDNA가 기판에 집적된 칩을 제공한다.
본 발명에서는 세포사멸 관련 cDNA 칩을 제작하기 위하여 상기 cDNA 칩 결과로부터 유도되는 세포사멸 관련 주요 마커유전자 및 기존의 참고문헌들을 분석하여 찾아낸 세포사멸 관련 유전자들을 토대로 다음의 표 2과 같은 유전자 리스트를 만들었다.
<표 2> 세포사멸 관련 cDNA 칩 유전자 목록
DNA 칩을 제작하는 방법은 위에서 제시한 4가지 방법을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 핀 마이크로어레이법을 사용한다.
DNA칩 제작 방법은 일반적으로 다음과 같다.
세포사멸 관련 유전자들을 한꺼번에 증폭할 수 있는 보편적인 프라이머를 이용하여 동시에 세포사멸 관련 여러 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한다.
PCR을 한 후 증폭 성공 여부는 아가로스 겔에서 검사하고, 증폭된 유전자들은 정제과정을 거쳐 농축된다. 이렇게 증폭, 농축된 유전자들은 핀 마이크로어레이어 기계를 이용하여 슬라이드글라스에 집적한다.
이때 사용되는 슬라이드는 폴리-L-라이신, 슈퍼-아민(super-amine) 혹은 알데하이드(Aldehyde)가 코팅되어있는 실리레이트 DNA를 고정시켜주는 알데하이드 코팅된 슬라이드를 활용하였다.
집적이 끝난 마이크로어레이(microarray)는 공유결합을 원활히 하기 위해 일주일간 상온에서 말린 후, 슬라이드 표면에 남아있는 알데하이드를 비활성화 시키기 위하여 소듐보르하이드레이트(sodium borohydrate)와 함께 반응시킨다.
본 발명에서 사용된 DNA 칩은 cDNA(complementary DNA)를 탐침으로 사용하였는데 특히 세포사멸 관련 바이오마커 유전자를 포함하는 것이 특징이다.
또한, 세포사멸 관련 유전자 cDNA 칩을 제작하기 위하여 367 개의 유전자와 컨트롤로 이용될 베타 튜블린 2 (Tubulin, beta 2), 베타 튜블린 5 (Tubulin, beta 5), 베타 글루코루니다아제 (Beta glucuronidase ; GUSB), 베타 2 마이크로글로불린(Beta-2-microglobulin)유전자 각각 17 개, 18 개씩 모두 400 개의 유전자를 두번 반복하여 칩에 집적하였다.
세포사멸 관련 마이크로어레이(micorarray)의 설계는 도 4와 같이 하였다.
본 발명에서 사용된 DNA 칩은 한 칩 위에 세포사멸 관련 유전자가 2 번 반복되어 있으므로 반복실험의 효과를 가지고 있다.
한편, 세포사멸이 유도된 대뇌피질 세포에서 추출한 RNA를 역전사시켜 DNA를 생성하며, 생성된 DNA를 (a) 서열목록 1 및 2의 DNA 단편 ; (b) 서열목록 3 및 4의 DNA 단편; (c) 서열목록 5 및 6의 DNA 단편; (d) 서열목록 7 및 8의 DNA 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍으로 세포사멸 유전자를 증폭시켜 염기서열을 만들고, 이 염기서열을 이용하여 세포사멸 유전자의 발현양상을 분석하여 세포사멸 정도에 관한 반응을 평가한다.
상기와 같은 방법으로 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상을 분석함으로써, 다양한 질병, 특히 항암제의 치료효과를 분석하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 대뇌피질 세포의 배양 및 영양분 고갈에 의한 세포사멸 유도
임신한지 14일째 되는 웅성 생쥐 (ICR mice)로부터 생쥐태아를 꺼낸 후 생쥐태아의 대뇌피질세포를 분리해 냈다.
분리해낸 대뇌피질 세포는 2 mM 글루타민(glutamine)과 20 mM의 글루코즈 (glucose)가 들어있는 MEM배지에 10% 우태혈청(fetal bovine serum)과 5% 말혈청(horse serum)이 첨가된 배지에 잘 풀어준 후 폴리-D-라이신 (Sigma, Amherst, NY)과 라미닌(lamine, Sigma, Anherst, NY)가 코팅되어 있는 세포배양 용기에서 6일간 배양하였다.
배양을 시작한지 2 일에서 3 일째 되는 날 신경교세포(gila cell)을 제거하기 위하여 50 ㎛ 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)를 첨가하였다.
영양분 고갈에 의한 세포사멸 유도는 대뇌피질세포를 배양한 지 6일째 되는 날 실시하였다.
현미경으로 세포의 상태를 확인한 후 세포사멸을 유도하기 위한 실험군과 세포사멸을 유도하지 않은 대조군 모두 글루코즈(glucose)와 소듐바이카보네이트 (sodium bicarbonate)가 첨가되어 있는 MEM으로 3회 세척하였다.
세포사멸을 유도하지 않은 대조군은 2 mM 글루타민과 20 mM의 글루코즈가 들어있는 MEM배지에 5% 말혈청(horse serum)이 첨가된 배지에 실험군과 마찬가지로 글루타메트레스(Oxidative stress)나 라디칼(radical)에 의한 세포사멸을 막기 위하여 100 ㎛ 트롤락스(trolox)와 20 mM의 글루코즈(glucose)가 첨가한 후 8 시간 동안 배양하였다.
세포사멸을 유도하기 위한 실험군에는 글루타메이트 독성에 의한 세포괴사를 방지하기 위해 NMDA 수용체 길항제인 1 ㎛ MK-801과 산화적인 스트레스(Oxidative stress)나 라디칼(radical)에 의한 세포사멸을 막기 위하여 100 ㎛ 트롤락스 (trolox)와 20 mM의 글루코즈(glucose)가 첨가된 혈청 고갈 MEM 배지에서 8 시간동안 배양하여 세포사멸을 유도하였다.
<실시예 2> 세포사멸이 유도된 대뇌 피질 세포로부터 총 RNA의 추출
실시예 1에서 제조한 대뇌피질 세포로부터 총 RNA를 추출하였다.
실시예 1의 대뇌피질 세포로부터 트리졸(Trizol, Gibbco-BRL, Grand Island, NY, U.S.A.) 방법을 사용하여 총 RNA를 분리하였다.
이때 사용한 모든 용액은 0.1 % 디에틸피로카보네이트 처리수(diethyl pryrocarbonate-treaed water, DEPC-dH2O)로 RNA 분해효소 활성(RNase activity)을 저해하기 위해 처리하였다.
상기 실시예 1에서 배양된 대뇌피질세포들을 PBS로 완전하게 세척한 다음 1㎖의 트리졸/1×106cells 시약을 첨가하여 파이펫팅하여 세포를 분쇄하였다.
상온에서 5분간 방치한 후, 상층액에 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고 15 초 동안 세게 흔들어 섞어주고, 상온에서 15 분간 방치한다. 그리고 혼합물을 4 ℃에서 13,000 rpm으로 15 분간 원심분리하였다.
새 튜브에 상층액만 따라서 500 ㎕의 아이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여, 세게 흔들어서 섞어준 후 상온에서 1 분간 방치하였다.
혼합액은 4 ℃에서 13,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 총 RNA를 획득하였다.
RNA 펠렛은 DEPC-dH2O 처리된 1 ㎖의 75 % 에탄올로 씻어준 다음 건조시키고, DEPC-dH2O로 재균질화 시킨 뒤 -70 ℃에서 보관하였다.
RNA 농도는 동일한 조건하에서 260 nm(RNA; 1 OD 260=40 ㎍ of RNA/㎖)와 280 nm의 흡광도를 측정하였다.
1% MOPS 포름알데하이드-아가로스 겔에 1 ㎕를 러닝(running)하여, 총 RNA를 추출하였다.
<실시예 3> 세포사멸이 유도된 대뇌 피질 세포의 총 RNA를 이용한 DNA 단편의 제조
실시예 2에서 분리한 세포사멸을 유도한 대조군과 세포사멸을 유도하지 않은 실험군의 총 RNA를 이용하여 형광물질이 표지된 cDNA를 제조하였다.
총 RNA 100 ㎍에 2 ㎍의 올리고 dT12-18을 넣고, 70 ℃에서 10 분간 RNA를 변성시킨 다음, 바로 얼음에 방치하였다.
세포사멸을 유도한 대조군과 세포사멸을 유도하지 않은 실험군의 100 ㎍ RNA의 각각 튜브에 10 ㎛ dNTP, 100 ㎛ DTT, 50 ㎛ Cy3-dUTP(세포사멸이 유도되지 않은 컨트롤 RNA Amersham Pharmacia, U.K.)과 Cy5-dUTP(세포사멸이 유도된 RNA, Amersham Pharmacia, U.K.), 200U 역전사 효소(Reverse transcriptase, 4U/㎕, Gibbco-BRL, Grand Island, N.Y. U.S.A.)을 넣고 총 부피를 30 ㎕가 되도록 하였다.
이때, 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포의 RNA는 Cy5-dUTP로 표지하고, 세포사멸이 유도되지 않은 대뇌피질세포의 RNA는 Cy3-dUTP로 표지하였다.
각각의 튜브를 42 ℃에서 2 시간 배양한 다음 각 형광물질로 표지된 뉴클레오타이드를 잘 혼합하고, 1.5N 수산화나트륨을 첨가하고 65 ℃에서 10 분간 배양시켰다.
여기에 혼합액의 중화를 위해 1M Tris-HCl과 1N 염산을 첨가한 후 마이크로콘 30 (Milipore, U.S.A.)에 넣어서 13,000 rpm에서 4 분간 원심분리하였다.
원심분리 후 Cy3, Cy5 표지 용액이 각각 30 ㎕씩 남게 농축시킨 다음, 컬럼을 뒤집어 5,000 rpm에서 2 분간 원심 분리하여 새로운 튜브에 농축액을 회수히여 DNA 단편을 제조하였다.
<실시예 4> 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포의 총 RNA로부터 제조한 DNA 단편 및 cDNA 칩과의 혼성화(hybridization)
실시예 3에서 대뇌피질세포의 총 RNA를 역전사하여 제조한 cDNA와 2,300개의 공지된 유전자 cDNA 칩과 혼성화 반응을 실시하였다.
실시예 3에서 제조한 각각의 cDNA를 잘 혼합하고, Mouse Cot1 DNA 10㎍, 효모 tRNA 4㎍, 폴리dA 4㎍을 첨가한 후, 99 ℃에서 5 분간 끓였다.
여기에 혼성화 용액(Hybridization solution, Genotech, U.K.) 8㎕를 넣고, 잘 혼합하였다.
혼성화 챔버 (Hybridization chamber)에 스팟이 찍힌 부분을 표시한 글라스를 깔고 그 위에 상기 cDNA 칩을 올려놓았다.
cDNA 혼합 용액을 cDNA 칩 글라스 위에 버블이 생기지 않게 잘 떨어뜨린 다음 22×22㎜ 커버 글라스로 덮었다.
글라스 양측 면에 습기를 주기 위하여 5×SSC와 0.1% 혼합용액을 떨어뜨린 다음, 55 ℃에서 16 시간 동안 혼성화시켰다.
혼성화가 종료되면 슬라이드를 상온에서 0.1% SDS를 포함하는 1×SSC 용액으로 10분간 세척하고, 0.1% SDS를 포함하는 55 ℃ 0.1×SSC 용액에서 10 분간 세척한 다음, 마지막으로 SDS를 제거하기 위하여 0.1×SSC 용액에서 10 분간 세척한 후 500 rpm, 25 ℃, 1 분 30 초간 원심분리한 다음 레이저 공초점 현미경 (Laser confocal microscope) (GenePix 5000, U.S.A.)이 있는 엑손 스케너(Exon scanner)로 스캔(scan)하였다.
상기의 실험을 4 회 반복실험을 하여 그 cDNA 칩의 형광 발광 프로파일을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 세포사멸과의 관련성에 따라 발현된 유전자가 녹색과 빨간색으로 나타났다.
<실험예 1> cDNA 칩 데이터의 산점도 분석을 통한 유전자 발현 양상 조사
실시예 40에서 혼성화 시킨 네개의 cDNA 칩의 형광 발광 프로파일을 나타낸 이미지 파일을 준비하여, 새포사멸이 유도된 유전자의 발현 양상을 형광물질의 발광정도를 측정하여 비교하였다.
2 개의 형광물질의 발광(Fluorescence) 이미지(Cy3 및 Cy5)를 532 nm, 635 nm 파장으로 스캔하였고, 각각 백그라운드(background)가 올라가지 않고 시그날이 초대로 취해질 수 있는 레이저 강도(laser intensity)와 PMT 감도를 설정하였다.
세포사멸에 대하여 변화가 거의 없는 유전자 수준을 정상범위로 설정하여 정상범위이상이면 세포사멸 관련 유전자로 분류하였다.
즉 β-actin, GAPDH 유전자를 기준으로 하여 "1"로 보고 그것과 비교하여 비율(ratio)값이 2배 이상이면 상향 조절(up-regulate)되는 유전자(세포사멸 관련 유전자)로 보고, 비율(ratio) 값이 0.5 배 이하이면 하향 조절(down-regulate)되는 유전자로 보았다.
각 cDNA 칩의 산점도(scatter plot)를 이용하여 유전자 발현 양상을 분석하기 위하여 Imagene 5.0(Biodiscovery)를 사용하여 분석을 수행하였다.
상기 cDNA 칩의 혼성화 결과를 유전자 발현 양상에 따라 나타낸 산점도 (scatter plot)를 도 2에 나타냈다.
각 스팟의 시그날을 각 슬라이드의 스팟 시그날의 평균값으로 나눠서 표준화하였다.
cDNA 칩의 2,300 개의 유전자 중에서 69 개의 유전자가 세포사멸과 관련되어 상향 조절된 유전자로 나타났으며, 21개의 유전자가 하향 조절되는 유전자로 나타났다.
그리고, 2,300 여개의 유전자 중에서 2,200 개 유전자는 세포사멸과 관련이 없는 것으로 나타났다.
<실험예 2> 역전사연쇄중합반응(RT-PCR)을 통한 세포사멸이 유도된 대뇌피질세포에서 수득한 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상 분석실험
상기 실시예 2에서 대뇌피질 세포로부터 추출한 RNA를 역전사하여 세포사멸 관련 유전자를 동정하였다.
RNA 5 ㎍을 DEPC-처리수에 녹인 후, 1 ㎕의 oligo(dT)12-18와 10mM의 dNTP 1 ㎕을 넣고, 70 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 곧바로 얼음에서 냉각시켰다.
상기 시료에 5×첫번째 가닥 완충용액(frist strand buffer) 4 ㎕, 100 mM DTT 2 ㎕, RNase OUT(Invitrogen, U.S.A) 40 Unit을 넣고, 42 ℃에서 50 분간 반응시킨 다음, 65 ℃에서 10 분간 배양하여 잔류단백질을 불활성화 시켰다.
이렇게 만들어진 cDNA는 10×완충용액 5 ㎕, 10 mM dNTP 5 ㎕, ULK2(Mus musculus, Unc-51 like kinase 2), HDAC2(Mus musculus, histone deacetylase 2), GTFII(Mus musculus, General transcription factor II), Magonashi homolog()의 4종류의 세포사멸 관련 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머쌍(50pmole) 각각 1 ㎕, cDNA 1 ㎕, Taq polymerase(Bioneer, Korea, 5U/㎕) 0.5㎕ 및 나머지는 증류수로 50 ㎕가 되도록 첨가한 후, 94 ℃에서 5분간 반응시킨 후, 94 ℃에서 1 분간, 56 ℃에서 1분간, 72 ℃에서 1 분간 과정을 30 주기로 수행하였다.
72 ℃에서 10 분간 신장시킨 다음 1% 아가로오스 겔에서 확인하였다.
이때, β-actin은 마커로 하여 세포사멸관련 유전자의 발현을 비교하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3a는 컨트롤로 쓰인 베타엑틴, 도 3b는 Suppressor of Ty 4 homolog (S. cerevisiae)의 발현 양상, 도 3c는 GTFII-1(General transcription factor II-1)의 발현 양상, 도 3d는 Mago-nashi homolog, proliferation-associated (Drosophila)의 발현 양상, 도 3e는 UNC-51-like kinase (ULK) 2의 발현 양상, 도 3f는 Histone deacetylase 2의 발현 양상을 나타낸 결과이다.
그 결과로서 세포사멸 관련 유전자들이 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포에서 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이것은 유도된 전사수준(transcript level)이 뚜렷한 범위(range)의 값을 가질 때 이들 세포사멸관련 유전자 mRNA가 바이오마커(Biomarker)로서 각각의 환자에서 이용될 수 있음을 의미한다.
<실험예 3> 세포사멸 관련 바이오마커 유전자중 하나인 ULK2와 세포사멸과의 연관성 확인실험
4종류의 세포사멸 관련 바이오마커(biomarker) 유전자 중 하나인 ULK2와 세포사멸과의 관련성을 확인하기 위하여 두 가지 연구 방법을 통하여 분석하였다.
우선 뇌로부터 유래된 세포주를 활용하여 다음과 같은 방법으로 세포주에 ULK2의 유전자를 과발현시켰다.
ULK2 유전자를 과발현 시키기 위해 ULK2 전장 유전자는 FLAG-tagging vector (Sigma, Amherst, NY)에 Not I과 Sal I, 두 제한 효소를 이용하여 클로닝하였다.
상기 세포주를 DMEM 배지에 20 % 우태혈청(Fetal bovine serum)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicilin-streptomycine)을 첨가하여 5 % CO2 37 ℃ 배양기에서 배양하였다.
세포배양 용기에 90 %정도 가득 차있는 세포주에 혈청이 없는 DMEM 배지를 넣어주고, 여기에 리포펙타민(Lipofectamine ; Invitrogen)과 ULK2-FLAG DNA를 잘 섞은 용액을 첨가하여 주고, 4 ~ 6 기단 동안 5 % CO2 37 ℃ 배양기에서 배양한 후 DMEM 배지에 20 % 우태혈청(Fetal bovine serum)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신 (penicilin-streptomycine)을 첨가한 배지에서 35 시간에서 72 시간까지 배양하여 ULK2를 과발현시켰다.
이렇게 ULK2를 과발현시킨 세포주는 두 가지 분석방법(MTT 분석법과 지노믹 (Genomic) DNA 단편화 분석)을 통하여 세포사멸과의 연관성을 분석하였다.
MTT 분석법은 35 시간 동안 ULK2 유전자를 과발현시킨 세포주를 PBS 용액으로 세척한 후 MTT 시약(Sigma)이 첨가된 배지를 넣고 4 시간 동안 배양한 후, 배지를 모두 석션(sunction)해서 버리고, 결정을 DMSO와 소렌슨 버퍼에 녹였다.
DMSO와 소렌슨 버퍼에 녹은 결정 용액은 ELISA 기계를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정한 흡광도는 도표로 그려 도 5 a에 나타내었다.
지노믹(Genomic) DNA 단편화 분석은 세포사멸의 지표인 DNA 단편화를 조사하는 실험으로, ULK2유전자를 과발현 시킨 세포주에서 지노믹(Genomic) DNA를 추출하여 2 % 아가로스겔을 이용하여 단편화 정도를 측정한 실험이다.
ULK2에 의한 DNA 단편화 정도는 도 5b에 나타내었다.
본 발명에 의해 세포사멸의 정도를 판별할 수 있는 세포사멸 관련 cDNA 칩이 제공된다.
또한, 새로이 밝혀낸 세포사멸 관련 특정 유전자의 발현정도를 평가하는 방법이 제공된다.
도 1은 cDNA 칩과 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포의 RNA로부터 역전사된 DNA와 혼성화 결과.
a : 첫번째 실험에서 얻은 혼성화 결과
b : 두번째 실험에서 얻은 혼성화 결과
c : 세번째 실험에서 얻은 혼성화 결과
도 2는 혼성화된 cDNA 칩의 유전자 발현 양상을 분석한 산점도 분석 결과.
a : 도 1a 에서 얻은 산점도 분석결과
b : 도 1b 에서 얻은 산점도 분석결과
c : 도 1c 에서 얻은 산점도 분석결과
d : cDNA 칩과 세포사멸을 유도한 대뇌피질세포의 RNA로부터 역전사된 DNA와 혼성화 실험 중 네번째 실험에서 얻은 산점도 분석결과
도 3은 세포사멸 관련 유전자의 발현 양상.
a: 컨트롤로 쓰인 베타엑틴
b: Suppressor of Ty 4 homolog (S. cerevisiae)의 발현 양상
c: GTFII-1(General transcription factor II-1)의 발현 양상
d: Mago-nashi homolog, proliferation-associated(Drosophila)의 발현 양상
e: ULK2(UNC-51-like kinase 2) 의 발현 양상
f: HDAC2(Histone deacetylase 2)의 발현 양상
도 4는 본 발명의 세포사멸 관련 특이 유전자 칩의 제작을 위한 설계도.
도 5는 본 발명의 세포사멸의 마커 유전자인 UNC-51-like kinase 2(ULK2) 를 과발현 시킨 세포주의 세포사멸 정도.
a는 UNC-51-like kinase 2(ULK2) 를 과발현 시킨 세포주의 생존률을 조사하기 위한 흡광도 측정결과.
b는 UNC-51-like kinase 2(ULK2) 2를 과발현 시킨 세포주에서 세포사멸의 정도를 판단하기 위한 지노믹 DNA 단편화 정도.
<110> PARK, Jong-Hun
<120> DNA CHIP FOR GENE EXPRESSON MONITORING ABOUT APOPTOSIS
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acttacctgc ttgaatactt gaataaacca ttcaccggtt ttaatccttt tacttcaaaa 4380
cttacacata ctgacctact ctctgatagc tgcacagaaa ctctttggcg ccacacttgc 4440
tttagtgtgc tgattaaagt taacagagaa aacatggttt tcatttactt ggtgaacaaa 4500
gtaatgtaat ttttacatta tttatctgta tgaaattcca gcagttaatt tgaacgttta 4560
tgtataggat gtttgtatcc ttaggtcttt actacagtgt ttctacccct catttgtaac 4620
tgcattatct tcaaaatagg taaaacccac taagtcattg tggaatagcc ttttttaaat 4680
tgcttataca aatgtatatt aaggttaaat aaaactgaca gtgtttttag gttatagttg 4740
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catcaatatt ctttgccctg ctccaggatt caaaactctt gtaagctgtc atgcaggctc 4860
ctacagacaa gactatatcc ctccttatat tagtggtaaa atgccttctg taatttttac 4920
actaaattct ttcatgttct cccaattacc ccgtttatct cagttgattt tccaagtaac 4980
tagatgtagt tggcctcctc ttctaccact ttttaaaaat ataatatgaa caagcttgga 5040
gagggtaagg ttggtgtgaa gacaggaagt aggcaagtgt tgaaactgca ctggactctc 5100
aagctcttct tgtatgacaa aggtcttgta ggtggtgtgt ataaagcagt gatgtctcag 5160
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ctagttgttt aaagaaaagt ttgccttgat tatagcaata ataaataaat gcttt 5275
<210> 11
<211> 4091
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
tgggagagca gaaaaaaggg ggcaccggcg gcccccccgc ttccctgcac gcgcttgccg 60
accctccccg gctgctcttc gggaatcatg gcccaagtag cgatgtctgc cttgcctgcc 120
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ccgccgcccg tcccggagcc cgccaacgct ggcaagcgca aagtgaggga gttcaacttt 1080
gagaaatgga acgcacgcat cactgaccta cggaaacaag ttgaagagtt gttcgaaaga 1140
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gtgattaaga aacatgagct tctgaactca acacgagaag atttacagct tgataaacca 1380
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taccaaaaat ttgaggccca tcccaatgat ctctatgtgg aaggacttcc agaaaacatt 1560
cctttccgaa gcccctcgtg gtatggaatc ccaagactgg aaaaaatcat ccaagtgggc 1620
aatcgaatta aatttgttac caagagacca gagctgctca ctcacagcac aactgaagtg 1680
actcagccac ggacaaacac accagtcaaa gaagattgga atgtcagaat caccaagctc 1740
cgaaagcaag tggaagagat ctttaatttg aagtttgctc aggctctggg cctcacagag 1800
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cagctggttg atcagaacga gtctgaaggc cctgtgatac aagaatcagc cgaggcaagc 2940
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ataaatgcga taaaaaaaaa aaa 623
Claims (3)
- DNA 칩에 있어서,대뇌피질세포에서 영양분 고갈(serum deprivation)에 의해 유도된 세포사멸 관련 유전자인 서열번호 9인 HDAC2, 서열번호 10인 ULK2, 서열번호 11인 GTFII, 서열번호 12인 Magonashi homolog의 4 가지 유전자의 cDNA와 표 2에 나타낸 세포사멸 관련 특정 유전자 364 개의 cDNA와, 컨트롤로 사용되는 베타 튜블린 2(Tubulin, beta 2), 베타 튜블린 5(Tubulin, beta 5), 베타 글루코로니다아제(Beta glucuronidase ; GUSB), 베타 2 마이크로글로불린(Beta-2-microglobulin) 유전자로 구성된,세포사멸 관련 유전자 발현양상 측정용 DNA칩.
- 세포사멸 유전자의 발현정도를 평가하는 방법에 있어서,세포사멸이 유도된 대뇌피질세포로부터 RNA를 추출하고, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 생성하고, 여기에 세포사멸 관련 유전자를 증폭하기 위한 특정 DNA 서열 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켜 얻은 염기서열을 이용하여, 세포사멸 관련 유전자의 발현양상을 분석하는 것으로 이루어진,세포사멸 유전자의 발현정도 평가방법.
- 제2항에 있어서,세포사멸 관련 유전자를 증폭하기 위한 특정 DNA 서열 프라이머는, 서열목록에 나타낸 서열번호 1 및 서열번호 2의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 3 및 서열번호 4의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 5 및 서열번호 6의 DNA 단편으로 이루어진 그룹, 서열번호 7 및 서열번호 8의 DNA 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켜, 세포사멸 관련 유전자의 발현양상을 분석하는 것으로 이루어진,세포사멸 유전자의 발현정도 평가방법.
Priority Applications (1)
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KR (1) | KR100632325B1 (ko) |
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- 2004-03-26 KR KR1020040020581A patent/KR100632325B1/ko not_active IP Right Cessation
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