KR20050088916A

KR20050088916A - 생리활성 펩티드

Info

Publication number: KR20050088916A
Application number: KR1020040106319A
Authority: KR
Inventors: 나카모리시게루; 다카기히로시; 다카하시마사카즈; 츠지모토가즈히사; 야마다히데유키
Original assignee: 세이렌가부시끼가이샤
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2005-09-07
Also published as: EP1571156B1; US7329726B2; US20050196861A1; KR101152871B1; EP1571156A1; JP4476645B2; JP2005247718A

Abstract

본 발명에 따른 펩티드는 하기의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다: (a) 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드; (b) 상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 혹은 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사(細胞死) 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드; 및 (c) 상기 (a)의 아미노산 서열의 펩티드와 적어도 80%의 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드. 본 발명에 따른 펩티드는, 세포사 억제활성 및 세포증식 촉진활성을 가지고, 안전성이 높으면서 제조가 용이하다. 본 발명에 따른 펩티드는, 배지첨가제로서 또는 세포배양용 배지의 유효성분으로서 유용하다.

Description

생리활성 펩티드{PHYSIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES}

본 발명은 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 생리활성 펩티드, 및 이것을 포함하여 이루어지는 세포배양용 배지첨가제에 관한 것이다.

동물 세포는 배양환경의 변화에 따라, 그 증식이 현저히 저하하거나 사멸이 일어나는 것으로 알려져 있다. 그 때문에, 통상은 동물세포 배양용 배지에, 소의 태아혈청이나 소의 혈청 알부민 등, 포유동물 유래성분을 첨가하여, 세포증식의 효율을 높이는 방법이 사용되고 있다.

하지만, 상기 포유동물 유래성분에는, 바이러스나 병원인자 등이 혼입할 위험성이 지적되고 있어, 안정성에 커다란 문제가 있다. 그 때문에, 포유동물 유래성분을 포함하지 않는 배지가 지금까지도 제안되고 있다. 그런데, 이 배지들을 사용하면, 세포증식이 현저하게 저하하거나 세포의 사멸을 초래하는 경우가 있어, 세포배양이 어려워지는 경우가 있었다.

그래서, 포유동물 유래성분 대신에, 밀 유래 펩티드 등과 같은 식물유래 성분으로서 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드를, 세포의 증식촉진을 목적으로 하여 동물세포 배양용 배지에 첨가하는 방법이 제안되고 있다. 하지만, 이와 같은 식물 유래 성분을 사용한 경우라도, 세포의 종류나 배양 조건에 따라서는, 충분한 효과를 항상 얻을 수는 없었다.

그래서, 본 발명자들은 이전에, 천연의 누에고치 등으로부터 채취할 수 있는 단백질 세리신(sericin)이, 동물세포증식 촉진활성을 가지는 것을 알아내고, 세리신을 배지에 첨가할 것을 제안하였다(국제공개 WO 02/086133호 공보). 세리신은 38개의 아미노산으로 이루어지는 본질적 영역과, 그 이외의 비본질적 영역으로 이루어지는 것이었다. 또한, 상기 본질적 영역을 적어도 포함하여 이루어지는 세리신 유도체도 동물세포증식 촉진활성을 나타낼 수 있는 것이었다. 이와 같은 동물세포증식 촉진활성은, 세리신 또는 세리신 유도체가 화학적 또는 유전자 공학적 방법에 의해 인공적으로 합성된 것인 경우에도, 마찬가지로 나타났다.

하지만, 천연의 누에고치 등에 포함되는 세리신 성분은, 분자량이 서로 다른 타입만으로도 여러 종류가 존재한다. 또한, 세리신의 추출 과정에서는 가수분해가 실시되기 때문에, 추출하여 얻은 세리신 성분 중에는, 다양한 분자종이 포함되게 된다. 이와 같은 다양한 분자종의 혼합물 중에서, 특정 구조를 가지는 단일 성분만을 정제하기 위해서는, 일반적으로 번잡한 조작이 필요하며, 매우 많은 비용이 요구된다. 또한, 이와 같은 혼합물은 생체로의 안정성이나 물질의 안정성 등을 충분히 확보하기 어려운 경우가 많아, 이 때문에 의약품이나 재생 의료 등의 분야에서 사용할 수 없는 경우도 있다.

일반적으로, 펩티드는 그 분자량이 커질수록 구조가 복잡해져, 화학합성이나 정제가 기술적으로 어려워지는 것으로 알려져 있다. 높은 정제도를 가진 펩티드를 필요한 양 얻는다는 관점에서는, 원하는 활성을 유지하면서 분자량이 가능한 작은 펩티드가 바람직하다.

한편, 유전자 공학적 방법에 의해 펩티드를 제조하는 경우에는, 목적으로 하는 펩티드를 코드하는 유전자를 조제하고, 숙주 세포에 도입하는 번잡한 조작이 필요하게 된다. 또한, 세포 안이나 배양상청 중에서 목적물을 얻기 위해서는, 많은 정제공정이 필요하게 되어, 제조 비용도 증대된다.

세포배양에 의한 유용물질 생산이나 재생의료 등의 분야에서는, 안전성이 높으면서, 세포배양 효율을 높일 수 있는 배양배지 성분으로서, 비교적 저가의 화합합성에 의해 얻을 수 있는 성분이 여전히 요구되고 있다.

본 발명자들은 이번에, 천연유래의 세리신의 본질적 영역에 상당하는 38개의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 중, 그 부분 구조인 특정 10개의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가, 그것만으로 뛰어난 세포사 억제활성 및 세포증식 촉진활성을 나타내는 것을 발견하였다. 그리고, 이 특정 아미노산 서열은, 세포증식의 효율을 높일 수 있다고 이미 알려져 있는 상술한 표유동물유래 혈청성분이나 식물유래 펩티드의 아미노산 서열과도 다른 것이었다. 이 때문에, 본 발명에 따른 펩티드가 뛰어난 세포사 억제활성 및 세포증식 촉진활성을 나타낼 수 있다는 것은, 예기할 수 없는 놀라운 것이었다. 본 발명은 이러한 발견에 근거한 것이다.

따라서, 본 발명은 세포사 억제활성 및 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드로서, 안정성이 높으면서 제조가 쉬운 펩티드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명에 따른 펩티드는 하기의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다:

(a) 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드;

(b) 상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 혹은 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드; 및

(c) 상기 (a)의 아미노산 서열의 펩티드와 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드.

본 발명에 따른 세포배양용 배지첨가제 조성물은, 본 발명에 따른 펩티드를 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 세포배양용 배지는, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량과, 배지기초 성분을 적어도 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 세포의 배양방법은, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량을 첨가하여 이루어지는, 세포배양용 배지를 사용하여, 목적으로 하는 세포를 유지 또는 증식시키는 것을 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 펩티드 및 그것을 포함하여 이루어지는 세포배양용 배지첨가제 조성물에 따르면, 목적으로 하는 세포의 사멸을 억제할 수 있으며, 배양시의 세포의 생존율을 유지 또는 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드 및 그것을 포함하여 이루어지는 세포배양용 배지첨가제 조성물에 따르면, 목적으로 하는 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 약 10개의 아미노산만으로 이루어지기 때문에, 높은 정밀도의 단일 펩티드로서 용이하면서 저가로 취득할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드에 따르면, 세포의 배양에 있어서, 소의 태아혈정 또는 소의 혈청알부민과 같은 혈청 성분의 사용량을 줄이거나, 또는 그 사용을 회피할 수 있기 때문에, 배양생성물의 안전성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는, 화학적으로 용이하게 합성할 수 있기 때문에, 천연물을 추출하는 경우에서와 같이 불순물이 혼입할 가능성을 낮출 수 있어, 충분한 안전성을 확보할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 따른 펩티드는, 배지첨가제로서 또는 세포배양용 배지의 유효성분으로서 매우 유용하다.

펩티드

본 발명에 따른 펩티드의 하나의 태양은, 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것이다. 이 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열은 본 발명자들에 의한 국제공개 WO 02/086133호 공보에 개시된 38개의 아미노산(서열번호 2)으로 이루어지는 펩티드의 일부, 구체적으로는 그 21~30번 아미노산 서열에 상당한다. 이 특정 10개의 아미노산으로 이루어지는 프래그먼트(fragment)가, 이 짧은 플래그먼트만으로 뛰어난 세포사 억제활성 및 세포증식 촉진활성을 나타낼 수 있다는 것은, 본 발명자들이 알고 있는 한, 지금까지 전혀 알려지지 않았었다.

본 발명에 따른 펩티드는, 상술한 바와 같이 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열과 동일한 것과 함께, 그것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것도 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드는 상술한 바와 같이 하기 (a)의 펩티드와 함께, 하기 (b) 및 (c)의 펩티드도 포함된다:

(b) 상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 혹은 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드;

상기 펩티드는 모두 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 것이다.

본 명세서에서 펩티드라고 할 때는, 펩티드의 유도체도 포함하는 의미로 사용된다. 여기서 펩티드의 유도체란, 상술한 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 것으로서, 상기 펩티드의 아미노 말단(N 말단)의 아미노기 또는 각 아미노산 측쇄의 아미노기의 일부 혹은 전부, 및/또는 펩티드의 카르복실 말단(C 말단)의 카르복실기 또는 각종 아미노산 측쇄의 카르복실기의 일부 혹은 전부, 및/또는 펩티드의 각 아미노산 측쇄의 아미노기 및 카르복실기 이외의 관능기(예를 들어, 수소기, 티올기, 아미드기 등)의 일부 또는 전부가, 적당한 다른 치환기(예를 들어, 인산기)에 의해 수식을 받은 것을 말한다. 이와 같은 적당한 다른 치환기에 의한 수식은 예를 들어, 펩티드 중에 존재하는 관능기의 보호, 안전성 및 조직 이행성의 향상, 또는 활성의 증강 등을 목적으로 하여 이루어지는 것이다.

또는 상기 펩티드의 유도체에는, 본 발명에 따른 펩티드의 약학상 허용될 수 있는 염도 포함된다. 이와 같은 염의 바람직한 예로서는, 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리토류 금속염, 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화 수소산염과 같은 할로겐화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염, 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알킬술폰산염, 캄파술폰산, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 푸마르산(fumaric acid), 호박산(succinic acid)염, 구연산(citric acid)염, 주석산(tartaric acid)염, 수산(oxalic acid)염, 말레산(maleic acid)염, 아세트산염, 사과산(malic acid)염, 유산염, 아스코르브산(ascorbic acid)염과 같은 유기산염, 및 글리신염, 페닐알라닌염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드는 용매화물로서도 좋다. 이와 같은 용매화물로서는 수화물, 알코올화물(예를 들어, 메탄올화물, 에탄올화물), 및 에테르화물(예를 들어, 디에틸에테르화물)을 들 수 있다.

본 명세서에서 아미노산이란, 광학이성체, 즉 D체 및 L체 모두를 포함한다. 또한, 여기서 말하는 아미노산은, 천연의 단백질을 구성하는 20종의 α-아미노산뿐만 아니라, 그 이외의 α-아미노산, 및 β-, γ-, δ-아미노산 및 비천연의 아미노산 등을 포함하여도 좋다.

여기서, '세포사 억제활성'이란, 목적으로 하는 세포의 사멸 또는 쇠약을 억제할 수 있는 성질의 것을 말하며, 이 '세포사 억제활성'을 가짐으로써, 배양시의 세포의 생존율을 유지 또는 향상시킬 수 있다. '세포사 억제활성'을 가지는 것은, 예를 들어, 후술하는 실시예의 평가시험 1과 마찬가지의 조건에서 측정한 경우에, 세포사 억제활성이 인정되었다고 평가되는 경우를 의미한다.

또한, '세포증식 촉진활성'이란, 목적으로 하는 세포의 증식을 촉진 또는 유지할 수 있는 성질의 것을 말하며, 이 '세포증식 촉진활성'을 가짐으로써, 배양시의 세포의 세포수 또는 세포밀도를 증가 또는 유지할 수 있다. '세포증식 촉진활성'을 가지는 것은, 예를 들어, 후술하는 실시예의 평가시험 2와 마찬가지의 조건에서 측정한 경우에, 세포증식 촉진활성이 인정되었다고 평가되는 경우를 의미한다.

상기 (b) 에서 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열에 대하여, 결실, 치환, 삽입 또는 부가되어도 좋은 아미노산 잔기의 수는 바람직하게는 1~5개, 보다 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 1~2개, 특히 바람직하게는 1개이다.

본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 상기 (b)의 펩티드는 상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 것이다.

여기서, '보존적 치환'이란, 상기 펩티드의 활성이 실질적으로 변하지 않도록, 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기를 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 바꿔놓는 것을 의미한다. 예를 들어, 어느 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 치환하는 경우, 어느 극성 잔기를 동일한 전하를 가지는 다른 극성 잔기로 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이와 같은 보존적 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은, 아미노산마다 당해 기술분야에서 공지된 것이다. 구체적인 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로서 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트리프토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 가지는(염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌, 히스티딘, 리신(lysine) 등을 들 수 있다. 또한, 음전하를 가지는(산성) 아미노산으로서는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 펩티드는 통상, 극성(중성) 아미노산으로 구성되어 있다.

상기 (c)의 펩티드는 서열번호 1로 나타내어지는 상기 (a)의 아미노산 서열의 펩티드와, 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 바람직하게는 상기 상동성은 90% 이상이다.

한편, 본 명세서에서 나타낸 상동성의 수치는 모두, 당업자에게 공지되어 있는 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이면 좋고, 예를 들어, FASTA, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 등에서 디폴트(초기설정)의 파라메터를 사용함으로써, 쉽게 산출할 수 있다.

펩티드의 제조

본 발명에 따른 펩티드는, 공지의 모든 방법을 적용하여 제조하여도 좋다. 여기서, 본 발명에 따른 펩티드는, 기본적으로 10개의 아미노산으로 이루어지는 저분자량 펩티드(이론 분자량 965)이기 때문에, 펩티드 합성에 통상 사용되는 당업자에게 이미 알려진 방법에 따라 쉽게 제조할 수 있다.

이와 같은 합성방법으로서는 예를 들어, 아미노산의 α-아미노기를 t-부톡시카르보닐(Boc)기로, 측쇄관능기를 벤질알코올계 보호기로 보호하는 것에 의한 t-Boc법이나, α-아미노기를 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기로, 측쇄관능기를 t-부틸알코올계 보호기로 보호하는 것에 의한 Fmoc법 등에 따른, 액상법, 고상법(固相法), 및 고상법과 액상법을 조합한 방법 등을 들 수 있다. 이 방법들의 실시에 있어서는, 예를 들어, 이즈미 노부오 등이 저술한 '펩티드 합성' 1984년, 마루젠 가부시키가이샤 발행; 일본화학회편 '생화학실험강좌(Ι)/단백질의 화학' 제 4권, 208~495페이지, 1977년, 동경화학동인 발행; 일본화학회편 '신 생화학 실험강좌(Ι)/단백질' 제 4권(합성 및 발현), 3~74페이지, 1992년, 동경화학동인 발행; 속 의약품의 발행 14 '펩티드 합성', 히로가와서점 발행 등의 문헌을 적절히 참조할 수 있다.

상기와 같이 하여 합성된 펩티드는, 통상의 방법에 따라 정제하여, 목적으로 하는 본 발명에 따른 펩티드를 회수할 수 있다. 이와 같은 정제방법으로서는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이 방법들은 단독으로 또는 조합하여 실시하여도 좋다. 합성된 펩티드를 이와 같이 하여 정제함으로써, 높은 정제도의 단일 펩티드로서 본 발명에 따른 펩티드를 취득할 수 있다. 얻어진 펩티드는, 필요에 따라 더욱 동결건조 등의 수단에 의해 건조하여도 좋다.

취득한 펩티드의 아미노산 서열은, 에드먼 분해법(Edman Degradation)에 의해 N-말단으로부터 아미노산 서열을 일어내는 프로테인 시퀀서(Protein sequencer), FAB-MS, TOF-MS 등에 의해 분석하고, 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 태양에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드는 화학적으로 합성하여 얻어지는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 펩티드는 예를 들어, 유전자 공학적 방법에 의해 제조된 것이어도 좋다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드는 그것을 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 입수, 혹은 제조할 수 있는 경우에는, 그 DNA에 의해 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 세포에 있어서 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드는 그것을 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편을, 숙주세포 안에서 복제 가능하며, 동일 유전자가 발현가능한 상태로 함유하는 DNA, 특히 재조합 벡터의 형태로 하여, 그것을 사용하여 숙주세포의 형질전환을 행하고, 얻어진 형질전환체를 배양함으로써 제조할 수 있다. 이 때, 상기 펩티드의 제조에 있어서, 소위 숙주-백터계를 사용하여도 좋다. 한편, 이와 같은 숙주-벡터계를 적용하는데 있어서는, 이 기술분야에 있어서 관용되고 있는 각종 발현 벡터(재조합 벡터) 작성법 및 형질전환법을 사용할 수 있다.

배지첨가제 조성물

본 발명에 따른 세포배양용 배지첨가제 조성물은, 본 발명에 따른 펩티드를 포함하여 이루어지는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물은, 본 발명에 따른 펩티드를 포함하여 이루어지며, 상기 펩티드가 가지는 활성을 저해하는 것이 아닌 한, 임의의 성분을 더욱 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 임의의 성분으로서는 예를 들어, 관용의 배지성분의 일부(예를 들어, 비타민류, 호르몬류 등)나, 제제분야에서 공지된 성분 등을 들 수 있다. 여기서, 제제분야에서 공지된 성분으로서는 예를 들어, 통상 사용되고 있는 부형제, 증량제, 붕괴제, 결합제, 활택제, 착색제, 희석제, 습윤화제, 계면활성제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해보조제, 방부제, 교미교취제(矯味矯臭劑), 무통화제, 안정화제 등을 들 수 있다. 또한, 완충제, pH 조정제, 등장화제(等張化劑) 등도 상기 성분으로서 사용할 수 있다. 이 성분들은, 약학상 허용될 수 있는 담체로서 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 제형은 특히 한정되지 않지만, 전형적인 제형으로서는 예를 들어 캡슐, 분말, 과립, 고형, 액체, 겔, 시트 등을 들 수 있다. 이것들은 상술한 임의의 성분을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 사용량은, 첨가하는 배지 안에서 본 발명에 따른 펩티드가 원하는 농도가 되도록 적절히 변경할 수 있다.

세포배양용 배지

본 발명에 따른 세포배양용 배지는, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량과, 배지 기초성분을 적어도 포함하여 이루어지는 것이다.

여기서, 배지 기초성분이란, 통상 동물세포가 동화(同化)할 수 있는 탄소원, 소화할 수 있는 질소원 및 무기염으로 이루어지는 것이며, 예를 들어 과당, 아미노산, 무기염류, 및 비타민류를 들 수 있다. 또한, 배지기초 성분에는 필요에 따라 미량의 영양 촉진물질, 전구물질 등의 미량의 유효물질을 더욱 배합하여도 좋다.

이와 같은 배지기초 성분으로서는 당업자에게 공지된 배지성분을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 예를 들어, MEM 배지(H.Eagle, Science, 130, pp432(1959)), DMEM 배지(R.Dulbecco, Virology, 8, pp396(1959)), RPMI 1640 배지(G.E.Moore, J.A.M.A., 199, pp519(1967)), Ham's F12 배지(R.G.Ham, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A., 53, pp288(1965)), MCDB104 배지(W.L.Mckeehan, In Vitro, 13, pp399(1977)), MCDB 153 배지(D.M.Peehe, In Vitro, 16, pp526(1980)), 및 Sf900IISFM 배지(인비트로겐사 제품 등)를 예로 들 수 있다.

또한, 예를 들어 무혈청배지 ASF104(아지노모토 가부시키가이샤 제품), 무혈청배지 SF-O2(산코쥰야쿠 가부시키가이샤 제품), 무혈청배지 Hybridoma-SFM(라이프텍오리엔탈 가부시키가이샤 제품), 무혈청배지 BIO-MPM-1(바이올로지컬 인더스트리사 제품), 무혈청배지 EX-CELL^TM302-HDP(제이알에이치 바이오사이언스사 제품), 무혈청배지 Cosmedium001(코스모 바이오 가부시키가이샤 제품) 및 무혈청배지 SFM-101(닛스이세이야쿠 가부시키가이샤 제품)과 같은 배지도, 본 발명에서 적절히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 세포배양용 배지는 상술한 각 성분을 포함하여 이루어지는 한, 예를 들어, 알부민이나 트랜스페린(transferrin) 등의 결합 단백, 인슐린, 상피증식인자(EGF), 섬유아세포 증식인자나 각종 스테로이드 호르몬 등의 호르몬류, 피브로넥틴(Fibronectin) 등의 세포접착 인자 등의 각종 세포증식 인자나, 또한 혈청을 필요에 따라 포함하고 있어도 좋다.

본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 세포배양용 배지는 사용되는 혈청의 양이 관용된 배지인 경우에 비하여 저감되어 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 무혈청배지 즉, 혈청유래 성분을 실질적으로 포함하지 않는 것이다. 한편, 여기서 무혈청배지란, 혈청을 실질적으로 함유하지 않는 것을 말하며, 혈청 이외의 세포증식 인자나 호르몬은 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 하나의 태양에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지 첨가제 조성물을, 배지기초 성분에 첨가하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포배양용 배지의 제조방법이 제공된다.

세포배양용 배지에 대한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 첨가량은, 배양하는 세포의 종류나 배양조건에 따라 적절히 변경가능하다. 본 발명에 따른 펩티드의 첨가량으로 환산하면, 배지 안에서의 상기 펩티드의 함유량은 배지 전체량에 대하여 10~3000mg/L의 농도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50~2000mg/L이고, 더욱 바람직하게는 100~1000mg/L 이다.

본 발명에 따른 배지 안에서의 본 발명의 펩티드 함유량이 소량이어도 본 발명은 충분한 효과를 나타낼 수 있는데, 본 발명의 펩티드는 독성이 없고, 수용성에도 뛰어나기 때문에, 다량으로 첨가하더라도 커다란 문제는 발생하지 않는다.

본 발명에 따른 세포배양용 배지는 바람직하게는 동물세포의 배양에 사용된다. 여기서 말하는 동물에는, 포유류, 어류, 조류, 곤충류 등이 포함된다.

본 발명에 따른 배지에 의해 배양가능한 동물세포에는 특별한 제한은 없으며, 배양세포로서 주화(株化)된 것이더라도, 생물조직으로부터 얻어지는 주화되지 않은 정상 세포이어도 좋다. 따라서, 본 발명에서 동물세포는 예를 들어, 그 세포 자체가 단백질을 생산할 수 있는 세포이어도, 유전자 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 이종 단백을 발현하게 된 세포이어도 좋으며, 또한, 각종 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포이어도 좋다.

세포자체가 단백질을 생산하는 세포로는 예를 들어, 모노클로날(monoclonal) 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma), 인터페론(IFN)-α를 생산하는 백혈구, IFN-β를 생산하는 선유아세포, IFN-γ를 생산하는 임파구, 프로우키나아제(프로UK) 혹은 UK를 생산하는 사람의 신장세포, 조직 플라스미노겐 액티벡터(plasminogen activator)(tPA)를 생산하는 멜라노마(melanoma) 세포, 인슐린을 생산하는 In-111 세포, 글루카곤을 생산하는 HIT 세포, 에리트로포에틴(erythropoietin)을 생산하는 HepG2 세포 및 인터류킨(interleukin)-5를 생산하는 B151K12 세포 등을 들 수 있다.

또한, 유전자 공학적 방법에 의해 형질전환된 주화된 세포로는 Vero 세포, HeLa 세포, CHO(chinese hamster ovary)세포, HKG세포, NIH3T3세포, BHK세포, COS-1세포, COS-7세포 및 골수종(myeloma) 세포 등을 들 수 있다.

바이러스벡터에 의해 감염된 세포로는 예를 들어, 레트로 바이러스벡터, 렌티 바이러스벡터, 아데노 바이러스벡터, 아데노수반 바이러스벡터, 및 헤르페스 바이러스벡터 등과 같은 바이러스벡터에 감염된 세포를 들 수 있다. 이 경우, 바이러스벡터는 관용의 유전자 공학적 방법에 의해 유전자 재조합된 것일 수 있다. 또한, 이와 같은 바이러스벡터를 감염시켜, 본 발명에 의한 배지에 의해 배양되는 동물세포로서는 예를 들어, HEK(Human Embryonic kidney) 293 세포, A549 세포, 및 PER.C6 세포 등을 들 수 있다.

배양방법 및 기타

본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량을 첨가하여 이루어지는 세포배양용 배지를 사용하여, 목적으로 하는 세포를 유지 또는 증식시키는 것을 포함하여 이루어지는 세포의 배양방법을 제공할 수 있다.

이 경우의 배양조건은 예를 들어, 배지 안의 산소농도, 침투압, pH, 배지온도 등은, 배양하는 세포의 종류, 배양목적, 배양하는 양, 기초배지 성분의 종류 등에 따라 적절히 변경할 수 있다. 또한, 배양하는 형식은 배치(batch)식 배양, 연속식 배양이나 관류(灌流)배양 등 어떤 형식이어도 좋고, 고밀도 배양을 행하여도 좋다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량을 세포배양용 배지에 첨가하고, 얻어진 배지를 사용하여 단백질을 생산할 수 있는 동물세포를 배양하여 상기 동물세포를 증식시키고, 이어서 상기 배지 및/또는 상기 동물세포로부터 생산된 단백질을 채취하는 것을 포함하여 이루어지는 단백질의 제조방법이 제공된다. 이 단백질의 제조방법에 있어서, 바람직하게 제조할 수 있는 단백질로서는 예를 들어, 모노클로날(monoclonal) 항체, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 프로UK 혹은 UK, tPA, 인슐린, 글루카곤, 에리트로포에틴 및 인터류킨-5 등을 들 수 있다.

본 발명의 더욱 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 배지첨가제 조성물의 유효량을 세포배양용 배지에 첨가하고, 얻어진 배지를 사용하여 바이러스벡터를 감염시킨 동물세포를 배양하여 증식시켜, 상기 배지 및/또는 상기 동물세포로부터 바이러스벡터를 채취하는 것을 포함하여 이루어지는 바이러스벡터의 복제방법이 제공된다. 이 방법에 의해, 복제가능한 바이러스벡터로서는 상기 예로 든 각종 바이러스벡터를 들 수 있으며, 이것들은 필요에 따라 유전자 재조합된 것일 수 있다. 목적으로 하는 바이러스벡터를 적절히 선택한 동물세포에 감염시키는데 있어서는, 관용의 방법을 적용함으로써 행할 수 있다. 또한, 증식시킨 세포로부터의 바이러스벡터의 채취는, 한외(限外) 여과 및 원심분리 등과 같은 관용의 각종 분리조작을 적용함으로써 분리정제하여 행할 수 있다. 이 때, 바이러스 벡터의 채취방법은, 바이러스 벡터의 종류에 따라 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

일반적으로 유전자 치료에는 생체외(ex vivo) 유전자 치료법 또는 생체내(in vivo) 유전자 치료법의 2가지 방법이 있다. 전자는 환자 유래의 세포를 일단 체외에서 배양, 유전자 도입처리한 후에 환자에게 투여하는 치료법이고, 후자는 유전자 도입 벡터를 직접 환자체내로 투입하는 치료법이다. 본 발명에 따르면, 이와 같은 유전자 치료법에 사용되는 유전자 도입 바이러스벡터를, 종래에 비하여 보다 효율적으로 복제할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 배지는, 이러한 복제방법에 사용되는 동물세포, 예를 들어, 293 세포에 대하여, 뛰어난 증식 촉진 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 세포배양에 있어서, 목적으로 하는 세포의 세포사를 억제하거나, 세포증식을 촉진하기 위한, 본 발명에 따른 펩티드의 사용이 제공된다.

본 발명의 더욱 다른 태양에 따르면, 세포배양 배지를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 펩티드의 사용이 제공된다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하는데, 본 발명의 이것에 한정되는 것은 아니다.

제조예

펩티드 A(본 발명):

서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를, 펩티드 신시사이저 모델 432A(Synergy(상표))(어플라이드 바이오시스템사 제품)를 사용하여, Fmoc법에 따라 합성하였다.

즉, p-히드록시메틸-페녹시-메틸(p-hydroxymethyl-phenoxy-methyl)(HMP)을 기재로 하는 25μmol의 Fmoc-L-Serine(tBu) HMP 수지 및 각 75μmol을 넣은 Fmoc 아미노산 카트리지를 필수잔기분 펩티드신시사이저에 세트하여 합성하고, 펩티드를 결합시킨 수지를 얻었다. 이 수지를 원심 튜브로 옮기고, 티오아니솔(thioanisole) 및 에탄디올의 존재하에서, 트리플루오로 아세트산으로 처리하여, 수지에 결합되어 있는 펩티드를 잘라냈다. 이어서, 메틸-t-부틸에테르(MTBE)를 여기에 더하고, 수지로부터 빼낸 펩티드를 침전시켰다. 이것을 MTBE로 세정하면서 필터 여과하고, 보호기 등의 염류를 제거하여, 펩티드 함유물을 얻었다. 이어서, 2M 아세트산을 사용하여 이 펩티드 함유물을 용해시켜 추출하고, 거친 펩티드를 얻었다. 거친 펩티드는 COSMOSIL 5C₁₈-AR-II 칼럼(나카라이테스크사 제품)을 사용한 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 이 때, 용매로서는 0.1% 트리플루오로 아세트산/물과, 0.1% 트리플루오로 아세트산/아세토니트릴을 사용하였다. 아세토니트릴에 의해 칼럼으로부터 용출한 펩티드를 동결건조하여, 정제 펩티드 분말(펩티드 A) 약 5mg를 얻었다.

얻어진 펩티드를 단백질 서열 Procise NT(어플라이드 바이오시스템사 제품) 및 MALDI-TOF-MS Voyager(상표)(어플라이드 바이오시스템사 제품)를 사용하여 분석함으로써, 이 펩티드가 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 가지는 것을 확인하였다.

펩티드 B(비교예):

국제공개 WO 02/086133호 공보의 제조예 2의 기재에 따라, 천연의 세리신에 포함되는 38 아미노산으로 이루어지는 서열(서열번호 2)을 2회 반복하여 이루어지는, 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드(펩티드 B)를 얻었다.

평가시험

평가시험 1: 세포사 억제활성

본 발명에 따른 펩티드의 세포사 억제활성을, 곤충세포 Sf9(인비트로겐사 제품)를 사용하여 평가하였다.

Sf9 세포는 통상 10% FCS(소의 태아혈청)(시그마사 제품)를 포함하는 Sf900IISFM 배지(인비트로겐사 제품)를 사용하여 27.5℃ 온도 조건하에서 계대배양(Subcultury)된다. 이와 같이 배양된 Sf9 세포가 FCS를 포함하지 않는 배지에 급히 옮겨지면, 급격한 혈청 기아 조건에 노출됨으로써, 현저한 세포사를 일으킨다고 알려져 있다. 본 시험에서는 이와 같은 급격한 혈청 기아 조건하에 피실험세포를 두고, 그 생존율을 측정함으로써, 본 발명에 따른 펩티드의 세포사 억제활성을 평가하였다.

먼저, 10% FCS 첨가배지를 사용하여 계대배양한 Sf9 세포를, 4℃ 조건하, 1000rpm으로 5분간 원심 침전시켰다. 이어서 그 상청을 버리고, 침전된 세포를 FCS를 포함하지 않는 Sf900IISFM 배지에 현탁시켰다. 이것을 다시 4℃ 조건하, 1000rpm으로 5분간 원심 침전시키고, 이에 의해 세포를 세정하였다.

이어서, 세포를 급격한 혈청 기아 조건으로 하기 위하여, 세정 후의 세포를 다시 FCS를 포함하지 않는 Sf900IISFM 배지에 현탁시켜, 세포 밀도 5×10⁵cells/ml의 세포 현탁액을 조제하였다.

한편, 펩티드 A(본 발명)를 펩티드 농도가 각각 0.2mg/ml, 0.6mg/ml, 2.0mg/ml가 되도록, FCS를 포함하지 않는 Sf900IISFM 배지에 용해하여, 펩티드 용액을 조제하였다. 조제한 펩티드 용액은 필터 여과에 의해 멸균하였다.

계속하여, 상기 세포 현탁액 50㎕와, 상기 펩티드 용액 50㎕를 96웰의 세포배양 플레이트에 파종하여, 최종 세포 밀도가 2.5×10⁵cells/ml이고, 최종 펩티드 농도가 각각 0.1mg/ml, 0.3mg/ml, 1.0mg/ml가 되도록 조제하였다. 이 배양 플레이트를 27.5℃에서 5일간 배양하였다.

배양 5일 후에, 세포를 트리판 블루(trypan blue) 염색하여, 죽은 세포와 살아있는 세포의 수를 세어 생존율을 구하였다. 한편, 생존율이란, 세포수를 셀 때 전체 세포수에 대하여 살아있는 세포수의 비율을 의미한다.

비교예로서 펩티드 A(본 발명) 대신에 펩티드 B를 사용한 것 이외에는, 상기 펩티드 A의 경우와 마찬가지로 하여 실험하여, 생존율을 구하였다.

또한, 다른 비교예로서, 상기 펩티드 용액 대신에 소의 혈청 알부민(시그마사 제품) 용액을 사용한 것 이외에는, 상기 펩티드 A의 경우와 마찬가지로 하여 실험하여, 생존율을 구하였다.

결과는 표 1에 나타내는 바와 같았다.

펩티드를 첨가하지 않은 경우(무첨가의 경우)에는, SF9 세포의 생존율은 약 20% 였다. 한편, 펩티드 A(본 발명)를 첨가한 경우의 생존율은, 현저하게 향상되었고, 펩티드 농도가 1.0mg/ml일 때의 세포의 생존율은 약 60%였다. 또한, 펩티드 A(본 발명)의 경우의 생존율은 펩티드 B(비교예)의 경우의 생존율에 비하여 동등 이상의 값이었다.

(표 1)

샘 플	샘플 농도(mg/ml)	생존율(%)평균±표준편차(n=4)
무첨가	0	20.1±2.8
펩티드 A(본발명)	0.1	28.5±3.4
	0.3	47.3±2.9
	1.0	58.0±3.2
펩티드 B	0.3	46.1±2.2
소의 혈청 알부민	0.3	62.5±3.0

평가시험 2: 세포증식 촉진활성

본 발명에 따른 펩티드의 세포증식 촉진활성을, 곤충세포 Sf9(인비트로겐사 제품)를 사용하여 평가하였다.

Sf9 세포는 급격한 혈청 기아 조건에 놓이면, 평가시험 1과 같은 현저한 세포사를 일으키는 동시에, 그 후 세포증식도 저하하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 급격한 혈청 기아 조건하에 피실험세포를 둔 후, 피실험세포의 세포 증식능력을 측정함으로써, 본 발명에 따른 펩티드의 세포증식 촉진활성을 평가하였다.

시험평가 1과 마찬가지로 하여 세포현탁액을 조제하고, 또한 평가시험 1과 마찬가지로 하여 펩티드 A(본 발명)를 사용하여 펩티드 용액을 조제하였다. 이 세포현탁액 50㎕와, 펩티드 용액 50㎕를 96웰의 세포배양 플레이트에 평가시험 1의 경우와 마찬가지로 하여 파종하여, 이것을 27.5℃에서 9일간 배양하였다.

배양 9일후에, MTT 분석(MTT Assay)에 의해 세포증식 촉진효과를 평가하였다.

구체적으로는 9일간 배양한 96웰의 플레이트의 각 웰에, 인산완충 생리식염수로 5mg/ml에 녹인 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT)를 5㎕ 씩 첨가하여, 이것을 27.5℃에서 다시 5시간 배양하였다. MTT는 이 배양 과정에서, 살아있는 세포안에서 불용성 포마즌(formazan)으로 변환된다. 5시간 배양 후, 세포배양 상청을 모두 제거하고, 이어서 10% SDS, 10mM NH₄Cl 용액을, 각 웰에 200㎕ 씩 더하여, 세포 및 세포안의 포마즌을 완전히 용해시켰다. 이어서, 각 웰의 595nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트리터에 의해 측정하였다.

비교예로서 펩티드 A(본 발명) 대신에 펩티드 B를 사용한 것 이외에는, 상기 펩티드 A의 경우와 마찬가지로 하여 실험하여, 각 웰의 595nm에서의 흡광도를 측정하였다.

또한, 다른 비교예로서, 상기 펩티드 용액 대신에 소의 혈청 알부민(시그마사 제품) 용액을 사용한 것 이외에는, 상기 펩티드 A의 경우와 마찬가지로 하여 실험하여, 각 웰의 595nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과는 표 2에 나타내는 바와 같았다. 또한, 살아있는 세포밀도의 증가와 함께, MTT 분석의 흡광도 값이 높아졌다.

펩티드를 첨가하지 않은 경우(무첨가의 경우)에는, MTT 분석의 흡광도 값(OD595nm)은 약 0.3이었다. 한편, 펩티드 A(본 발명)를 첨가한 경우에는, MTT 분석의 흡광도 값이 현저히 향상하고, 펩티드 농도가 1.0mg/ml일 때 약 0.9였다. 또한, 펩티드 A(본 발명)의 경우의 세포증식 촉진활성은 펩티드 B(비교예)의 경유의 세포증식 촉진활성에 비하여 동등 이상의 성능을 나타내었다.

(표 2)

샘 플	샘플 농도(mg/ml)	OD 595nm평균±표준편차(n=4)
무첨가	0	0.30±0.02
펩티드 A(본발명)	0.1	0.48±0.01
	0.3	0.80±0.02
	1.0	0.92±0.02
펩티드 B	0.3	0.72±0.03
소의 혈청 알부민	0.3	0.90±0.03

본 발명에 따른 펩티드 또는 배지첨가제 조성물에 따르면, 배지에 첨가하는 것만으로, 세포의 증식을 촉진시킬 수 있기 때문에, 재생의료를 목적으로 한 동물세포의 제조 및 세포배양에 의한 유용물질을 생산할 때, 그 제조비용을 줄일 수 있다.

<110> SEIREN Co., Ltd <120> a peptide having phsiological activity <130> 150751USEPKRsq <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from sericin <400> 2 Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Asn Ser Asn Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Arg Asp Gly Ser Val 35 <210> 3 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide derived from sericin <400> 3 Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Asn Ser Asn Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Arg Asp Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp 35 40 45 Ser Asn Ser Asn Ser Ala Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr 50 55 60 Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Asp Gly Ser Val 65 70 75

Claims

하기의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드:

(a) 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드;

(b) 상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 혹은 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드; 및

(c) 상기 (a)의 아미노산 서열의 펩티드와 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드.
제 1 항에 있어서,

세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 것인 펩티드.
제 1 항에 있어서,

상기 (a)의 아미노산 서열에서 한개 혹은 복수개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환되어 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지며, 세포사 억제활성 및/또는 세포증식 촉진활성을 가지는 펩티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

화학적으로 합성하여 얻어진 것인 펩티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

펩티드의 약학상 허용될 수 있는 염인 펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하여 이루어지는, 세포배양용 배지첨가제 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 제 6 항에 기재된 배지첨가제 조성물의 유효량과, 배지기초 성분을 적어도 포함하여 이루어지는 세포배양용 배지.
제 7 항에 있어서,

동물세포의 배양에 사용되는 것으로서, 혈청유래 성분을 실질적으로 포함하지 않는 것인 세포배양용 배지.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 제 6 항에 기재된 배지첨가제 조성물의 유효량을 첨가하여 이루어지는, 세포배양용 배지를 사용하여, 목적으로 하는 세포를 유지 또는 증식시키는 것을 포함하여 이루어지는 세포의 배양방법.
제 9 항에 있어서,

배양하는 세포가 동물세포로서, 세포배양용 배지가 혈청유래 성분을 실질적으로 포함하지 않는 것인 세포의 배양방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 제 6 항에 기재된 배지첨가제 조성물을, 배지기초 성분에 첨가하는 것을 포함하여 이루어지는 세포배양용 배지의 제조방법.
세포배양에 있어서, 목적으로 하는 세포의 세포사를 억제하거나 또는 세포 증식을 촉진하기 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 사용.
세포배양용 배지를 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 사용.
제 13 항에 있어서,

배양하는 세포가 동물세포로서, 세포배양용 배지가 혈청유래 성분을 실질적으로 포함하지 않는 것인 펩티드의 사용.