KR20050087824A - ｓｓＤＮＡ를 이용한 ＨＳＶ-관련 병리상태의 치료 - Google Patents

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Abstract

세포에서 단일-가닥 cDNA (ssDNA)의 생체내 생산에 의해 HSV-감염 세포의 하나 이상의 표적 서열(들)의 발현을 변하게 하는 발현 벡터를 포함하며 환부에 국소 도포하기 위해 적절한 전달 부형제에 현탁된 HSV-관련 병리상태의 치료용 조성물이 제공된다. 발현 벡터는 관심 서열, 역 탠덤 반복구조, 역 탠덤 반복구조의 3'에 있는 프라이머 결합 부위 및 역전사효소/RNAse H 코딩 유전자를 포함하는 카세트를 포함하고, HSV 복제 또는 표적 세포내로의 융합을 억제하기 위해 감염된 세포내로 형질감염된다. 생성된 ssDNA는 표적 서열에 결합하여 핵산의 듀플렉스 또는 트리플렉스 결합을 이용한 유전자 활성화 또는 불활성화, 위치-지정 돌연변이유발법, 특정 세포 단백질에의 결합에 의한 세포 기능의 중단, 또는 RNA 스플라이싱 기능의 방해 등을 위해 표적 서열의 발현을 변하게 한다.

Description

ｓｓＤＮＡ를 이용한 ＨＳＶ-관련 병리상태의 치료{TREATMENT OF HSV-RELATED PATHOLOGIES USING ssDNA}
본 발명은 HSV 복제와 관련된 유전자의 발현을 변화시키기 위해 생체내에서 ssDNA를 생산하는 조성물을 사용하는, HSV-관련 병리상태의 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 환부에 대한 국소적 도포로 숙주 면역계에 대한 HSV의 자기-보호 및 복제와 관련된 유전자 또는 유전자들의 기능을 변화시키기 위한 ssDNA의 생체내 생산에 필요한 정보를 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
단순 허피스 바이러스 타입 I 및 II(HSV-I 및 HSV-II)는 구인두 감염, 피부 감염, 안구 감염 및 중추 신경계 질환, 예를 들어 수막염 및 뇌염을 비롯한 여러 가지의 임상적으로 중요한 병리상태에 대한 병인학적 원인이다(예를 들어, 미국 특허 제5,795,721호 참조). 실질적으로 모든 인간 집단에서 HSV 혈청검사 양성 개체가 발견된다. 집단의 60% 초과는 HSV-I에 대해 혈청검사 양성이고, 집단의 16% 초과는 HSV-II에 대해 혈청검사 양성인 것으로 추산된다.
원발성 HSV는 흔히 무증상이다. 무증상이든 아니든, HSV 감염은 항상 신경 세포의 잠복성 바이러스 감염을 야기한다. 잠복성 감염, 및 그로 인한 지속적이면서 빈번한 발병에 대해서는 유효한 치료법이 알려지지 않았다. 잠복성 감염으로 인한 결과는 무증상부터 활동형 질병의 반복적이고(이거나) 중증인 에피소드에 이르기까지의 범위에 미친다.
본 발명의 다양한 태양들은 도면에서 예시되는데, 도 1은 본 발명의 교시에 따른 숙주 세포 내에서의 ssDNA 생산의 개략도이다.
도 2는 도 1에 예시된 방법으로 형성된 스템-루프 중간체의 개략도이다.
도 3A 및 3B는 본 발명의 교시에 따라 제작된 일 태양의 발현 벡터를 포함하는, pssXE 플라스미드의 2가지 태양에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 본 발명의 교시에 따라 제작된 제2 태양의 발현 벡터를 포함하는, pssXV 플라스미드의 2가지 태양에 대한 개략도를 나타낸다.
도 5 및 6은 pssXE(59) 플라스미드로 형질감염된 아프리카 그린 몽키(Vero) 세포에서 HSV1 바이러스 감염의 감소를 보여주는 막대 그래프(도 5), 및 대조군인 pssXE(59)S 플라스미드로 형질감염된 세포에서는 어떠한 현저한 감염의 감소도 없음을 보여주는 막대 그래프이다(도 6).
도 7 및 8은 pssXE(59) 플라스미드로 형질감염된 아프리카 그린 몽키(Vero) 세포에서 HSV2 바이러스 감염의 감소를 보여주는 막대 그래프(도 7), 및 대조군인 pssXE(59)S 플라스미드로 형질감염된 세포에서는 어떠한 현저한 감염의 감소도 없음을 보여주는 막대 그래프이다(도 8).
본 발명의 이러한 기술에서, 발현 벡터는 HSV-감염된 세포에서 실질적으로 임의의 미리 정의된 또는 소정의 뉴클레오티드 염기 조성의 단일가닥 디옥시리보핵산(ssDNA) 올리고뉴클레오티드(ODNs)로서, 플랭킹 뉴클레오티드 서열을 갖거나 갖지 않고, 표적 서열에 실질적으로 상동적이거나 상보적이어서 표적 서열에 결합하여 그 서열의 발현을 변화시키고(시키거나) 그 서열의 생성물을 불활성화 또는 파괴하는 올리고뉴클레오티드를 세포내에서 생체내적으로 생산하는데 사용하기 위한 것으로 기술된다. 발현 벡터는 크림, 로션, 연고, 스프레이 또는 겔 중에서 국소 도포로 환부의 감염된 세포에 전달된다.
하나의 태양에서, 본 발명의 발현 벡터는 ssDNA 분자를 바람직하게는, 대부분의 인접 벡터 서열 없이 HSV-감염된 세포 내에서 생산하도록 설계된다. 벡터는 감염된 세포 내에서 ssDNA를 생산하기 위한 모든 필요한 효소적 기능 및 신호전달 지시를 포함한다. 도 1(본 명세서에 발현 벡터로서 기술된 pssXE 또는 pssXV 플라스미드와 같은 플라스미드의, 본 발명의 교시에 따른 사용을 예시)에 나타낸 바와 같이, 벡터가 전달된 감염된 세포는 진핵 프로모터에 의해 하나 이상 RNA 전사체(들)을 생산하고, 이는 HSV의 복제 또는 융합에 관련된 하나 이상 유전자(들)의 기능을 변화시키기 위한 소정의 단일가닥 DNA 서열(들)을 합성하는 주형으로 사용된다.
생체내에서 생산되는 ssDNA는 억제성 핵산 또는 흥분성 핵산으로 기능하는 ODN을 비롯한 임의의 ODN일 수 있다. 억제성 핵산은 감염된 세포에서 상보적 핵산 서열(들)에 특이적으로 결합하는, mRNA 주형으로부터 합성된 ssDNA이거나 또는 mRNA 주형 자체일 수 있다. 적절한 표적 핵산 서열(들)에 결합함으로써, RNA--RNA, DNA--DNA 또는 RNA--DNA의 듀플렉스 또는 트리플렉스가 형성된다. 더욱 통상적으로, 이들 핵산 서열은 유전자의 센스 또는 코딩 가닥에 일반적으로 상보적이기 때문에 "안티센스" 서열로 명명되지만, "센스" 서열도 치료 목적으로 세포에서 사용된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "억제성 핵산"이란 용어는 "센스" 및 "안티센스" 핵산을 둘다 포함하지만, 이하에서 개시한 바와 같이 센스 및(또는) 안티센스 핵산으로 제한되는 것은 아니다.
표적 서열에 결합함으로써("표적 서열"이란 용어는, 이러한 표적 서열이 숙주 세포에서 내인하고(하거나) 바이러스의 게놈의 일부인 서열인지에 상관없이, 표적 서열 자체 뿐만 아니라 그러한 표적 서열의 전사 및 번역 생성물도 지칭하고자 한다), 억제성 핵산은 바이러스 복제에 관련된 유전자의 기능을 변화시킨다. 이러한 변형(일반적으로 억제 효과)는, 예를 들어 DNA 전사의 차단, mRNA로의 가공 또는 그에의 폴리(A) 부가, DNA 복제, 전사, 또는 세포의 억제 메카니즘 촉진(예를 들어, RNA 분해 촉진)으로부터 기인한다. 따라서, 억제성 핵산 방법은 HSV-감염 세포에서 유전자 발현을 변화시키기 위해, 몇가지 상이한 방식으로 기능하는 다수의 상이한 접근법을 포함한다. 이들이 다수의 방식으로 유전자의 기능을 변화시키기 때문에, 본원에서는 광범위하게 표적 서열에의 결합 또는 다르게는 이와의 상호작용으로 언급한다. 여러 가지 유형의 억제성 핵산 기술이 헬렌(Helene, C.) 및 토울름(J. Toulme)의 문헌[Biochim. Biophys. Acta., 1049, 99-125, 1990]에 기재되어 있으며(이하에서, "헬렌 및 토울름"으로 지칭됨), 이는 그 전체가 이러한 구체적 참조로 본원에 인용된다.
본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터에 대해 추가로 초점을 맞추면, 상기 벡터는,
(A) RNA 의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소) 유전자, 및
(B) (1) 역 탠덤 반복구조(IR), (2) (a) 역반복구조 사이(IR), (b) IR의 3' 또는 (c) IR 사이 및 IR의 3' 둘다에 위치하는 하나 이상의 관심 서열들(SOI), 및 (3) 도 2에 도시된 바와 같이 IR의 3'에 위치하는 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위(PBS)를 포함하는 카세트
를 포함하는, HSV 증식 또는 융합에 관련된 하나 이상의 표적 서열(들)의 발현을 변화시키기 위해 시험관내 또는 생체내에서 ssDNA를 생산하기 위해 세포에 전달하기에 적합한 유전 요소들의 세트를 포함한다.
필요하지 않음에도 불구하고, 상기 발현 벡터는 또한 바람직하게는 생체내에서 이러한 성분들의 전사를 위한 기능들 및 신호전달 지시들, 및 역전사효소(RT) 유전자의 번역을 위한 기능들 및 신호전달 지시들을 포함한다. 본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터에 임의로 포함되는 추가 요소들은 일반적으로 RT 유전자에 결합되어 있는 하나 이상의 RNase 유전자, 제한 엔도뉴클레아제(RE) 유전자(하기 목적을 위해), 진핵 세포에서의 발현을 위해 관심 서열에 의해 생산된 mRNA가 폴리(A) 테일을 포함하도록 하는 하류 폴리아데닐화 신호 서열(도 1 참조), 및 선형화된 ssDNA가 적절한 2차 구조로 폴딩될 때 효소 활성을 갖는 DNA 서열중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명이 이로써 제한되는 것은 아니지만, 발현 벡터의 한 태양에서는, 관심 서열이 역반복구조(IR)사이에 또는 IR의 3' 측면 과 PBS 사이에 위치하는지에 상관없이, 관심 서열내에 DNA 효소 서열이 위치한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물의 제1 태양에서, 발현 벡터는 카세트의 상기 3가지 요소들, 즉 역전사효소(RT)에 일치하는 프라이머 결합 서열(PBS), 관심 서열(SOI) 및 역반복구조(IR)를 포함하는, pssXE(세포 배양 시험용) 및 pssXV(인간을 비롯한 동물에서 사용하기 위함)로 지정된 플라스미드를 포함한다. 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, SOI는 역 탠덤 반복구조 사이 또는 PBS의 5' 위치(mRNA 전사체와 관련하여) 또는 양 위치에 존재하며, 이때 PBS는 mRNA 전사체의 3' 가장 바깥쪽 측면에 존재한다. 달리 말하면, SOI는 (1) IR 사이, (2) IR과 PBS 사이, 및(또는) (3) IR 사이 및 IR과 PBS 사이 둘다에 위치한다. PBS, SOI 및 IR은 도 3에 도시된 E 플라스미드에서 RT 다기능단백질의 비번역되는 3' 부분에 존재한다. 플라스미드의 RT-RNase H 성분이 적절한 프로모터(본원에 기재된 태양들에서는 CMV 프로모터가 사용된다)의 제어하에 전사되는 경우, 생성된 mRNA 전사체는 RT-RNase H 다기능단백질의 코딩 영역을 함유하며, 정지 신호에서의 번역 종료시 추가의 mRNA 전사체는 (이러한 번역된 단백질의 3'에서) 이들 3가지 요소들과 함께 RT-RNase H 성분으로부터 손상되지 않은채 남아있는 폴리아데닐화 신호를 위한 추가의 3' 하류 신호전달 사건을 함유한다.
본 발명의 발현 벡터의 한 태양을 포함하는 도 3 및 4에 도시된 pssXE 및 pssXV 플라스미드들은 SOI의 서브클로닝을 촉진시키는 복수 서브클로닝 부위를 포함한다. 당해 분야에 알려져 있는 바와 같이, 다수(통상 4 내지 10개)의 제한 효소 인지 서열을 함유하는 복수 서브클로닝 부위(MCS)는 상이한 DNA 서열들을 삽입하는데 있어서 더욱 가변적인 벡터를 만들기 위해 고안된다. 그러나, 당업계에 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 벡터를 절단하지 않는 제한 효소만을 선택할 수 있다. 많은 제한 효소들이 공지되어 있지만, pssXE, pssXV 또는 본 발명의 교시내용에 따라 제작된 임의의 다른 플라스미드에서 사용하기 위해 선택될 수 있는 제한 효소들의 목록은 다음과 같다: AfIII, AscI, BsiWI, BsmBI, BspMI, BsrGI, BsBI, ClaI, E1047III, HpaI, NarI, PFlMI, PshAI, SfiI, SgfI, SrfI, Sse8387I, SwaI, XcmI, 및 pssXE 및 pssXV 플라스미드들에 포함시키기 위해 선택되었던 EcoRI, PacI, PstI, 및 SacII 부위들. 본 개시내용의 이점을 누릴 당업계에 숙련된 자라면, 이들 특정 클로닝 부위들이 본원에 기재된 특정계에 대해 선택된 것이며, 기타 클로닝 부위들도 상기 동일한 목적을 위해 동일하게 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에서 SOI, IR 및 PBS를 포함하는 카세트로 지칭되는 핵산 서열은 바람직하게는 유전 요소의 상류에 위치하는, 적절한 넓은 스펙트럼의 또는 조직-특이적인 프로모터/인핸서, 예를 들어 CMV 프로모터, 또는 프로모터/인핸서의 조합에 의해 조절된다. 프로모터/인핸서는 항상적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 이하에서 상세히 개시한 바와 같이, 본 개시내용의 이점을 누릴 당업계에 숙련된 자라면, 다수의 기타 진핵 프로모터들이 SV-40, RSV(세포 유형에 비특이적임) 또는 조직-특이적 신경교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)을 비롯한 SOI의 발현을 조절하기 위해 유리하게 이용될 수 있음을 인식할 것이다.
cDNA 합성을 위해 프라이밍이 개시되는 프라이머 결합 부위(PBS)는 3' IR 및 폴리아데닐화 신호 사이에 위치한다. PBS는 진핵 표적 세포내에 내재하는 전달 RNA(tRNA)에 상보적인 서열이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 하나의 RT인 마우스 말로니(Maloney) 역전사효소(MoMULV RT)의 경우, PBS는 프롤린 tRNA를 이용한다. 인간 면역결핍 바이러스로부터 유래한 RT 유전자를 포함하는 본원에 기재된 발현 벡터에서 사용되는 PBS는 HIV의 핵산 서열로부터 취해졌다. 리(Y. Li) 등의 문헌[J. Virology, 66, 6587-6600, 1992]. 그러나, 본 개시내용의 이점을 누릴 당업계에 숙련된 자라면, 특정 RT에 일치하는 임의의 PBS가 이러한 목적으로 사용됨을 인식할 것이다. PBS는 표적 세포의 내인성 프라이머 tRNA에 의해서만 인식된다. 각각의 tRNA는 아미노산을 코딩하는 mRNA 전사체상의 고유 서열(즉, 코돈)을 인식할 수 있으며, 특정 아미노산에 공유결합할 수 있다(즉, tRNA는 특정 아미노산에 결합할 때 "하전"된다). 그러나, mRNA 전사체의 PBS에 결합하고 아미노산에 공유결합하지 않는(즉, "하전되지 않은") 경우, 프라이머 tRNA는 RT에 의해 ssDNA 합성을 개시하는데 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터내로 혼입된 각각의 PBS는 프라이머 tRNA에 의해 인식되는 고유 서열을 함유하여야 하며, 프라이머 tRNA는 사용된 특정 RT에 의해 인식되는 프라이머 tRNA이어야 한다.
다른 레트로바이러스 RT/RNase H 유전자들도 본 발명에 유리하게 사용될 수 있으며, RT/RNase H 유전자는 인간 세포에서의 발현을 위한 CMV 또는 RSV 프로모터와 같은 적절한 상류 진핵 프로모터/인핸서에 의해 조절되는 RT/RNase H 유전자인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제/RT 유전자는 레트로바이러스, B형 간염 균주, C형 간염 균주, 박테리아성 레트론(retron) 요소, 및 다양한 효모 및 박테리아 종으로부터 단리된 레트론으로부터 유래한 것을 포함한다. 자연계에서 발견되는 바와 같이, 이들 RNA-의존성 DNA 폴리머라제는 일반적으로 동일한 코딩 전사체내에서 연관된 RNase H 성분 효소를 갖는다. 그러나, 본 발명은 특정 RT에 대해 천연 RNase H 유전자를 요구하지 않는다. 달리 말하면, 당업계에 숙련된 자라면 본 개시내용으로부터 RT 및 RNase H 유전자의 다양한 조합이 본 발명에서 사용하기 위해 함께 스플라이스되어 상기 기능을 수행할 수 있으며, 상기 의도된 방식으로 기능할 이들 2가지 효소 시스템의 변형 및(또는) 하이브리드 버전(hybride version)들이 당업계에 숙련된 자에게 이용가능하고(하거나) 공지되어 있음을 인식할 것이다. 당업계에 숙련된 자라면 또한 표적 세포가 자체적으로 충분한 내인성 RNase H를 가져 이러한 기능을 수행할 수 있음도 인식할 것이다. 유사하게, 당업계에 숙련된 자라면 표적 세포가 자체적으로, 예를 들어 이전의 레트로바이러스 감염으로부터 충분한 내인성 RT 활성 형태를 가져 상기 기능을 수행할 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 본 개시내용의 이점을 누릴 당업계에 숙련된 자라면 본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터로서 바이러스 벡터를 사용함으로써 플라스미드 발현 벡터계에서 사용하기에 적합하지 않을 다수의 바이러스 RT 유전자를 사용할 수 있게 함을 인식할 것이다.
RT/RNase H 유전자는 또한 바람직하게는 RT/RNase H 유전자로부터 생산된 mRNA가 mRNA 안정성을 위해 3' 폴리(A) 테일을 포함하도록 하류 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 당업계에 숙련된 자에게 알려져 있는 바와 같이, 복수 폴리(A) 테일을 이용할 수 있으며, 발현되는 진핵 유전자를 생산하기 위해 통상 사용된다.
당업계에 숙련된 자라면 또한 다수의 조직-특이적 또는 넓은 스펙트럼의 프로모터/인핸서들 또는 상기 개시된 것 이외의 프로모터/인핸서들의 조합들이 또한 RT/RNase H 유전자, RE 유전자(사용하는 경우) 및 관심 서열을 조절하기 위해 유리하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명을 예시하기 위해 모든 이용가능한 프로모터/인핸서들의 목록이 필요하지는 않지만, 전술한 바와 같이, 프로모터/인핸서들은 항상적이거나 유도성일 수 있으며, 본원에 개시된 CMV 또는 RSV(세포 유형에 비특이적임) 또는 GFAP(조직 특이적임) 프로모터/인핸서들, 및 기타 많은 바이러스 또는 포유류의 프로모터들을 포함할 수 있다. 본 발명의 카세트에서 사용하기에 적합한 대표적인 프로모터/인핸서들은 HSVtk(맥나이트(S. L. McKnight) 등의 문헌[Science, 217, 316, 1982]), 인간 β-글로불린 프로모터(브레쓰나흐(R. Breathnach) 등의 문헌[Ann. Rev. of Biochem., 50, 349, 1981]), β-액틴(가와모토(T. Kawamoto) 등의 문헌[Mol. Cell Biol., 8, 267, 1988]), 래트 성장 호르몬(라센(P. R. Larsen) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 8283, 1986]), MMTV(후앙(A. L. Huang) 등의 문헌[Cell, 27, 245, 1981]), 아데노바이러스 5 E2(임페리얼(M. J. Imperiale) 등의 문헌[Mol. Cell. Biol., 4, 875, 1984]), SV40(엔젤(P. Angel) 등의 문헌[Cell, 49, 729, 1987]), α-2-매크로글로불린(쿤즈(D. Kunz) 등의 문헌[Nucl. Acids Res., 17, 1121, 1989]), MHC 클라스 I 유전자 H-2kb(블래나(M. A. Blanar) 등의 문헌[EMBO J., 8, 1139, 1989]), 및 갑상선 자극 호르몬(채터지(V. K. Chatterjee) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 9114, 1989])을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 카세트에서 사용하기에 적합할 수 있는 기타 프로모터들의 목록은 하기를 포함한다:
1. SV40 초기 프로모터;
2. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터;
3. 연장 인자-1a(EF-1a) 프로모터;
4. 티록신-결합 글로불린(TBG) 프로모터;
5. 다중약제 내성 유전자(mdr1) 프로모터, 약제 및 열 유도성
6. 열 쇼크 단백질(HSP) 프로모터;
7. Tet-반응성(TRE) 프로모터, 약제 유도성;
8. HSV(티민 키나제) TK 프로모터, 열 유도성;
9. Gal4-Elb 프로모터, 약제 유도성;
10. 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터; 및
11. 텔로머라제 역전사효소(TERT) 프로모터, 종양-특이적.
당업계에 숙련된 자라면 상기 목록의 프로모터들이 모두를 포괄하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 발현 벡터에 사용될 때 유리하게 기능할 기타 프로모터들이 존재함을 인식할 것이다.
세포에서 생산되는 RT는 SOI를 포함하는 카세트를 주형으로 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성한다. RT의 RNase H 활성은 RNA/cDNA 하이브리드의 mRNA 주형 성분을 분해하여 생체내에서 ssDNA를 생산한다.
RE를 코딩하는 유전자(사용되는 경우, 본 발명의 필수 요소가 아니다)는 RE를 코딩하는 임의의 몇몇 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 전술된 것들과 같은 하나 이상의 항상적 또는 유도성의 넓은 스펙트럼 및(또는) 조직-특이적 프로모터/인핸서들에 의해 제어되는 것들일 수 있다. 시험되어 온 2개의 RE는 MboII 및 FokI이지만, 본 개시내용의 이점을 누릴 당업계에 숙련된 자라면 임의의 RE(유형 I, II, IIS 또는 III) 부위가 IR에 포함될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 효소들은 하기 스템-루프 중간체의 스템을 "자르거나" 절단하여 SOI를 단일-가닥 DNA로 선형화한다. RE 유전자의 발현은 플라스미드 pssXA에서 제한 엔도뉴클레아제 유전자로부터 상류에 위치한 적절한 항상적 또는 유도성 프로모터/인핸서, 예를 들어 인간 세포에서의 발현을 위한 CMV 또는 RSV 프로모터에 의해 조절될 수 있다. RE 유전자는 또한 바람직하게는 RE 유전자로부터 유래한 mRNA 전사체가 3' 폴리(A) 테일을 가지도록 하류 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
상기 카세트는 또한 역 탠덤 반복구조(IR)를 포함한다. mRNA-cDNA 헤테로듀플렉스로부터 mRNA를 RNase H에 의해 절단하고 ssDNA를 방출한 후에, IR은 ssDNA가 스스로 폴딩되어 스템-루프 구조의 스템을 형성하도록 유도하며, 이때 스템 구조는 미국 특허 제6,054,299호에 기재되고 도 2에 도시된 바와 같은 방식으로 이중-가닥의 역평행 DNA로 구성된다. 생산되는 ssDNA는 스템 양편의 코딩된 5' 및 3' 영역(IR로 구성됨) 및 SOI를 함유하는 루프로 전사된다. 그다음 스템은 스템내로 고안된 절단 부위를 인식하는 다수의 RE 효소들중 임의의 효소에 의해 절단되거나 쪼개져(다시 말하면, RE 유전자가 본 발명의 벡터계에 포함되지 않음에도 불구하고 엔도뉴클레아제 인식 부위가 상기 스템내에 고안될 수 있음을 주지한다) ssDNA 루프를 방출한다(도 1 참조). RE는 단지 표적 기질로서 이중-가닥 DNA만을 인식하기 때문에 어떠한 외견상의 듀플렉스 DNA도 형성하지 않는 ssDNA의 루프 부분은 RE 활성에서 면제된다.
전술한 바와 같이, 당업계에 숙련된 자라면, PBS와 IR 사이에 위치하는 SOI로부터 ssDNA를 생산하고 IR에 의해 형성된 스템에서 종결되는 카세트를 전사하는 것이 바람직한 경우, 스템-루프 중간체의 스템을 형성하는 IR에 RE 부위(들)이 고안될 필요가 없음을 인식할 것이다. 또다른 선택사항은 선택된 세포 단백질들을 경쟁적으로 선별제거해내는 작용을 하는, 진핵, 원핵 또는 바이러스 단백질의 DNA 결합 부위들을 함유하도록 IR를 고안하는 것이다. 제한 부위들 또는 기타 서열 특이적 요소들의 조합은 선형의 또는 정확하게 절단된 스템-루프 중간체 형태의 ssDNA가 생산되도록 선택된 IR의 염기쌍 조성에 따라 IR에 포함될 수 있다. 천연 역 반복구조는 적합하게 정렬된 제한 부위들을 가지지 않을 것이므로, IR에서 합성 제작된 서열 특이적 요소들을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물의 발현 벡터를 포함하는 카세트는 또한 촉매 활성을 갖는 DNA 서열을 포함할 수도 있다. 카세트에 소위 "DNA 효소"가 포함되므로(그리고, 본원에 기재된 태양에서, DNA 효소는 관심 서열내에 위치한다), 본 발명은 관심 서열이 안티센스 서열, 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 또는 DNA 효소 서열인 억제성 핵산의 합성을 위한 주형으로 기능하는 경우 특히 유리하게 사용된다. 본원에 기재된 유전자 발현의 변화 방법에서 사용되는 효소 활성을 갖는 핵산 서열은 10-23 DNA 효소이다(산토로 및 조이스의 상기 문헌[1997]). 효소 서열은 2가지 위치, 예를 들어 (a) IR과 SOI 내부 사이(NotI 부위) 또는 (b) IR의 3' 및 PBS의 5'에 위치한 제2의 SOI의 내부(PacI/BamHI 부위들)중 어느 하나 또는 둘다에서 카세트에 삽입된다. 어떠한 방식으로든, 생성된 ssDNA는 DNA 또는 mRNA 스플라이싱 메카니즘을 억제하거나 변화시키기 위해, 또는 심지어는 특이적인 방식으로 세포 게놈을 직접 변화시키기 위해, 표적 DNA 서열(들), mRNA 서열(들) 또는 임의의 기타 적합한 기질에 대해 특이적이다. 당업계에 숙련된 자라면 본 개시내용으로부터 효소 활성을 갖는 임의의 DNA 서열이 본 발명의 카세트내로 삽입될 때 의도된 목적으로 기능할 것임을 인식할 것이다. 하기 서열들을 비롯하여 효소 활성을 갖는 다수의 핵산 서열들이 문헌들에서 보고되어 왔다:
소위 "10-23" 및 "8-17 효소"(산토로(Santoro, S.W.) 및 조이스(G.F. Joyce)의 상기 문헌[1997]) 및 기타 금속-의존성 RNase(브리커(Breaker, R. R.) 및 조이스(G. F. Joyce)의 문헌[Biol. Chem., 1, 223-229, 1994] 및 브리커 및 조이스의 문헌[Biol. Chem., 2, 655-660, 1995]) 및 히스티딘-의존성 RNase(로쓰(Roth, A.) 및 브리커의 문헌[Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 6027-6031, 1998])와 같이 RNase 활성을 갖는 서열들;
구리-의존성 DNase(카르미(Carmi, N.) 등의 문헌[Chem. Biol., 3, 1039-1046, 1996], 카르미 등의 상기 문헌[1997] 및 센(Sen, D.) 및 게이어(C. R. Geyer)의 문헌[Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 680-687, 1998]) 및 이가 금속 이온을 보조인자로서 요구하거나 폴해머(Faulhammer, D.) 및 파물록(M. Famulok)(문헌[J. Molec. Bio., 269, 18-203, 1997])에서 보고된 이가 금속 이온과는 무관하게 기질을 가수분해하는 DNase와 같이 DNase 활성을 갖는 서열들;
구리-의존성 DNase(브리커의 문헌[Chem. Rev., 97, 371-390, 1997]) 및 아연-의존성 E47 리가제(쿠에나우드(Cuenoud, B.) 및 스조스탁(J. W. Szostak)의 문헌[Nature, 375, 611-613, 1995])와 같이 DNA 리가제 활성을 갖는 서열들; 및
칼슘-의존성 DNA 키나제(리(Li, Y.) 및 브리커의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 2746-2751, 1999])와 같이 DNA 키나제 활성을 갖는 서열들.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 한 성분을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 카세트에서 사용하기에 바람직한 것은 생리학적 상태로부터 유래하는 효소 활성을 갖는 DNA 서열들이다. 당업계에 숙련된 자라면 전술한 바와 같이 본 발명의 발현 벡터가 단지 생체내에서 안티센스 서열을 생산할 목적으로만 사용되는 것이 아니고, 안티센스 서열은 효소 활성을 갖는 핵산 서열을 반드시 함유해야 할 필요는 없으며, 억제성 핵산 서열은 또한 상기 억제성 핵산 서열들의 임의의 다른 유형일 수도 있음을 인식할 것이다.
또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터가 벡터를 지니는 세포의 확인을 촉진시키고(시키거나) 카세트를 포함하는 유전 요소 세트의 발현 수준을 증가시키기 위해 기타 특정 유전 요소들을 함유하는 것이 유리할 수 있다. 상기 특정 유전 요소는 벡터가 원핵계에서 형질전환되거나 증폭될 수 있도록 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli))에게 제오신(이하에 기재됨), 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신(네오마이신) 또는 테트라사이클린과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자와 같은 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터내로 상기 성분들을 도입시키면, 도 1에 도시된 바와 같이 ssDNA의 생산 후에 예정된 벡터 서열들을 제거하는데 있어서 2가지 이상의 편리한 방법들을 이용할 수 있게 된다. 첫번째 방법에서는, IR 사이의 SOI가, IR을 포함하는 뉴클레오티드가 쌍을 지어 스템-루프 벡터의 스템을 형성할 때(이때, 스템은 RE 부위를 포함한다) 생산되는 ssDNA 스템-루프 중간체의 루프 부분을 포함하도록, 발현 벡터의 일부를 포함하는 카세트를 감염된 세포에서 PBS로부터 역전사시킨다. 적절한 RE로 절단한 후에, 루프는 플랭킹 서열이 없는(및(또는) 최소한으로 갖는) 선형화된 단일-가닥 cDNA로서 방출된다. 두번째 방법에서는, 카세트가 PBS로부터 역전사되고 카세트의 IR의 3'에 포함된 SOI도 마찬가지로 전사되나, 역전사는 IR의 뉴클레오티드가 쌍을 이룸에 따라 형성된 스템-루프 구조의 스템에서 종결된다. 어떠한 방식으로든, 생성된 ssDNA는 플랭킹 서열이 없이(및(또는) 최소한으로 존재하도록) 생산된다. 두번째 방법을 사용하여 ssDNA를 생산하는 것이 바람직한 경우, 카세트는 카세트의 전사체가, ssDNA가 본 발명의 제1 태양에 따라 스템을 절단함으로써 생산될 때 생산된 스템보다 더욱 안정한 스템을 형성하는 IR(예를 들어, IR이 RE 부위를 포함하지 않도록 고안함으로써)을 포함하도록 고안된다. 카세트를 본 발명의 제1 태양에 따라 쉽게 변성되는 스템을 형성하는 IR을 생산하도록 고안하는 경우, 역전사는 제2의 SOI(심지어 이것이 카세트내로 고안되는 경우)로부터 IR 사이에 위치한 SOI까지 계속 진행한다. 따라서, 스템 구조의 3' 측면에서 역전사효소 cDNA 전사체의 이러한 "조숙한 종결"은 생체내-생산된 ssDNA와 함께 함유된 매개 벡터 서열을 제한하는 제2의 방법을 제공한다. 중간 정도로 안정한 스템은 제1 및 제2의 SOI 둘다를 생산할 수 있다.
또한, 당업계에 숙련된 자라면 본 기재내용으로부터 손상되지 않은 스템-루프 ssDNA 구조가 많은 적용분야들에서 선형화된 ssDNA 형태와 유사하게 기능할 수 있음을 분명하게 이해할 것이다. 따라서, 제한 엔도뉴클레아제 유전자 및 연관된 조절 요소들이 없고(없거나) 상응하는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 없는 관심 서열을 갖는 카세트도 유리하게 사용된다.
또한, 당업계에 숙련된 자라면 본 기재내용으로부터 "다듬어진(trimmed)" 스템-루프 구조를 갖는 ssDNA를 코딩하는 카세트를 제조할 수 있음을 분명하게 이해할 것이다. SOI 양편의 IR에서 코딩되는 RE 부위는, 스템 부분(듀플렉스 형성 후)이 상응하는 RE로 절단되어 스템의 일부 및 연관된 플랭킹 서열들은 제거되나 전사체가 상기 스템-루프 구조를 보유하기에 충분한 듀플렉스 DNA는 남기도록 하는 방식으로 스템을 포함하는 dsDNA를 절단하도록 고안된다. 이러한 ssDNA 구조는 ssDNA의 "말단"을 이중-가닥 형태로 보유함으로써 세포내 뉴클레아제에 대해 더욱 내성으로 될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 특정 SOI를 카세트 (역 탠덤 반복구조와, 또는 PBS와역 탠덤 반복구조 사이)내로 스플라이스하는 공지의 절단 및 라이게이션 기술을 사용해 제작된다. 본 기재의 이익을 누릴 당업계에 숙련된 자는 또한 진핵 세포내 발현을 위해 사용된 상기 신호가 특정 숙주 세포 및 표적될 서열에 따라 업계에서 공지된 방식으로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 프로모터를 변화시켜 SOI를 발현하기에 바람직한 시스템내 카세트상에 유익한 발현 특성을 부여한 변형이 가능하다.
발현 벡터는 환부에 국소 도포에 의해 HSV-감염된 세포로 전달된다. 국소 도포는 환부 도포용 적절한 부형제와 발현 벡터를 제제화하여 달성된다. 환부의 위치는 부형제의 제제화에 중요한 요소이다. 예를 들면, 많은 환부가 환자의 피부에서 일어나나, 피부는 국소 도포에 특정 도전이 된다. 본 발명의 조성물용 전달 부형제의 한 예(피부 외피를 통해 수송을 제공하므로)는 미국 특허 제5,837,289호에 기술된 2-파트 겔 유형인데, 미국 특허 제5,837,289호의 명세서는 상기 구체적 참조로 그 전체가 본 명세서에 도입된다. 간단히, 상기 특허는 두개의 소위 "침투 증강제" 및 경피적으로 투여될 수 있는 의약으로 구성된 조성물을 기술한다. 상기 특허에 기술된 바람직한 태양에서, 유기겔은 지방산 인지질 유화제, 예를 들면 지방산 또는 그의 에스테르, 예를 들면 이소프로필 팔미테이트 또는 이소프로필 미리스테이트를 가진 레시틴을 블렌딩하여 유기겔을 형성한 후 폴리옥시머, 예를 들면 폴리옥시알킬렌 중합체와 블렌딩하여 제조되고, 의약은 용매, 예를 들면 물, 알콜, 또는 기타 적절한 용매로 가용화되고 유기겔 및 중합성 성분과 혼합된다. 그러나, 특허 제5,837,289호의 명시와 반대로, 본 발명의 조성물의 한 성분을 포함하는 발현 벡터는 본 발명의 방법에 따라 환부에 유효적으로 전달될 유기겔 및 중합성 성분과 혼합되기 전에 가용화될 필요가 없음이 발견되었다. 사실, 본 발명의 조성물을 포함하는 발현 벡터는 매우 커서 그의 가용화가 임의의 공지된 용매에 유효적으로는 불가능하지만, 상기 발현 벡터가 환부에의 성공적 전달을 위해 상기 도입된 특허에 의해 알게 된 유기겔 및 중합성 성분의 블렌드내에 현탁될 수 있음이 발견되었다.
결론적으로, 한 태양에서, 발현 벡터를 위해 전달 부형제로서 사용된 2-파트 겔은 플루로닉 (PLURONIC)TM (완도트 케미칼 코 (Wyandotte Chemical Co.)) 레시틴 유기겔, 또는 플루로닉TM 겔 및 대두 레시틴의 조합인 PLO이다. 플루로닉TM 겔은 폴리(에틸렌 옥시드)-b-폴리(프로필렌옥시드)-b-폴리(에틸렌-옥시드)로 구성된 폴록사머이다. 제약 제조에 사용된 가장 통상의 플루로닉TM 겔 형태는 플루로닉TM F-127 (바스프 코포레이션(BASF Corporation))이다. 레시틴은 2-파트 겔에서 양쪽성 계면활성제로 작용하는 침투 증강제이므로, 발현 벡터의 피부층내로의 침투를 용이하게 하고, 2-파트 겔의 레시틴 농도는 2-파트 겔의 다양한 벌크 성질, 예를 들면 요변성, 점도 및 겔화 온도의 조정을 초래한다.
본 조성물은 하기 변형을 가진 상기 도입된 미국 특허 제5,837,289호에 기술된 동일한 일반 제제에 따라 일반적으로 만들어진다. 상기 특허는 약 < 1 내지 20중량부 의약 및 약 < 1 내지 20중량부 의약용 용매, 20 내지 40중량부 제1 침투 증강제 (유기겔), 및 40 내지 70중량부 제2 침투 증강제 (폴리옥시머)로 구성된 제제를 기재한다. 본 발명에서, 조성물은 상기 도입된 특허에 기술된 동일한 비 (약 20 내지 약 40 중량부 유기겔 및 약 40 내지 약 70 중량부 폴리옥시머)의 제1 및 제2 침투 증강제의 혼합물을 포함하나, 발현 벡터는 약 0.01% 내지 약 20% (중량%), 및 바람직하게 약 0.1% 내지 5% 조성물을 포함한다. 발현 벡터의 각 부 (중량부)에 대해, 2-파트 겔은 예를 들면, 주사기 기술, 수동 회전자 도구 (hand-held rotor tool), 일렉트로 모터 (ELECTRO MOTOR) 또는 연고 압연기로 전단력을 적용하면서 약 10 내지 약 40 중량부 유기겔 및 약 20 내지 약 70 중량부 폴리옥시머의 부로 2-파트 겔의 두개 성분을 조금씩 증가시키면서 첨가하여 바람직하게 제조된다.
구체적 구성성분을 참조하면서, 2-파트 겔의 한 태양이 현재 기술될 것이다. 약 4 내지 약 8 부(중량부) 이소프로필 팔미테이트를 비이커 또는 기타 적절한 용기에 넣고, 약 4 내지 약 8부의 대두 과립 레시틴 및 약 0.05 내지 약 0.5부 소르브산을 진탕 없이 비이커에 분산했다 (레시틴은 시간에 따라 용해됨). 용기를 그 후 약 40 ml 내지 약 60ml로 눈금조정하고 약 8 내지 약 12부 폴리옥시머, 예를 들면 카르보폴 (CARBOPOL)TM 또는 플루로닉TM (완도트 케미칼 코)을 눈금조정된 용기에 넣었다. 냉수를 첨가하여 약 40 내지 약 60 ml의 총부피로 만들고 용기를 정상 냉장 온도에 저장하기 전에 폴리옥시머가 용해되기 충분하도록 진탕했다(밤새). 2-파트 겔을 제조하기 위해, 제조된 레시틴의 약 20% (부피%) 및 약 80% (부피%) 폴리옥시머 겔을 주사기로 빼고, 두 혼합물을 균일해질 때까지 루어 록 (LUER LOK)TM-대-루어 록TM 커넥터를 사용해 한 주사기에서 또다른 주사기로 전이했다.
활성 성분으로서 SOI를 함유하는 바람직한 발현 벡터를 멸균수에 용해 또는 분산했다. 최종 부피의 10%를 초과하지 않는 최종 농도 0.1%의 활성 성분에 그 후 10 cc 주사기에 넣어진 2.2 ml 레시틴/이소프로필 팔미테이트 용액을 첨가했다. 혼합물을 와류했다. 플루로닉 F-127, 20%를 충분한 양 10 ml가 되도록 두번째 주사기에 첨가했다. 혼합용 주사기 대 주사기 기술의 사용은 미셀 형성을 촉진한다. 제2 제제에서, 살리실산 USP, 2gm을 베이스 PCCA 코스메틱 HRT(Base PCCA Cosmetic HRT (프로페셔널 컴파운딩 센터스 오브 아메리카, 인크(Professional Compounding Centers of America, Inc.), 텍사스주 휴스턴 소재))와 100 gm이 충분히 되도록 비타민 E 아세테이트 (125 U/ml) 2 ml과 혼합했다. SOI 가진 발현 벡터를 멸균수에 희석한 후 최종 농도 0.01중량%의 활성 구성성분(부피대)가 되도록 베이스 PCCA 코스메틱 HRT에서 10 ml이 충분히 되도록 하고 주사기 대 주사기 기술을 사용해 혼합했다.
또다른 태양에서, 문헌[T.M. Klibanov (Enhancing polyethylenimine's delivery of plasmid DNA into mammalian cells, 99 Proc. Natl Acad. Sci. USA 14640-5 (2002)) 및 W.T. Godbey, et al. (Size matters: molecular weight affects the efficiency of poly(ethylenimine) as a gene delivery vehicle, 45 J. Biomed Mater. Res. 268-75 (1999))]에 기술된 바와 같이 네트워크 폴리(아미노 에스테르) (n-PAE) 및 기타 변형된 폴리에틸렌이민 (PEI) 지질중합체가 본원에 기술된 발현 벡터의 전달용 부형제로서 유리하게 사용된다. 별법적으로, 문헌[C.L. Gebhardt, et al. (Design and formulation of polyplexes based on pluronic-polyethyleneimine conjugates for gene transfer, 1 Bioconjug. Chem. 937-44 (2002)) 및 P. Lemieux, et al. (Block and graft copolymers and NanoGel copolymer networks for DNA delivery into cell, 8 J. Drug Target 91-105 (2000))]에 기술된 바와 같이 PEI 및 플루로닉 겔의 그래프트 공중합체가 본 발명의 조성물의 전달 부형제로서 유리하게 사용된다.
또다른 태양에서, 상기 발현 벡터는 문헌[A. Caputo, et al. (Micellar-type complexes of tailor-made synthetic block copolymers containing the HIV-1 tat DNA for vaccine application, 20 Vaccine 2303-2317 (2002))](상기 구체적 참조로 본원에 그 전체가 도입됨)에 기술된 유형의 양이온성 블록 공중합체내에서 환부로 전달된다. 문헌[M. Harada-Shiba, et al. (Polyion complex micelles as vectors in gene therapy--pharmacokinetics and in vivo gene transfer, 9 Gene Ther. 407-14 (2002))]에 기술된 바와 같이 기타 유형의 미셀, 예를 들면 다가이온 착물 (PIC) 미셀은 또한 본 발명의 조성물에서 전달 부형제로서 유리하게 사용된다. 유사하게, 발현 벡터는 문헌[D.A. Wang, et al. (Novel Branched Poly(Ethylenimine)-Cholesterol Water-Soluble Lipopolymers for Gene Delivery, 3 Biomacromolecules 1197-1207 (2002))]에 기술된 수용성 지질중합체로 형성된 미셀내에서 환부로 전달된다. 상기 두 문단에서 언급된 모든 참고문헌은 상기 구체적 참조로 본원에 그 전체가 도입되고, 발현 벡터는 그에 따라 도입된 참고문헌에 기재된 방법에 따라 및 부로 부형제와 혼합된다.
또다른 태양에서, 본 발명의 전달 부형제는 또한 구성성분, 예를 들면 환부에서의 증상의 치료용 항생제, 진통제, 및(또는) 마취제를 포함한다. 예를 들면, 바이러스 발생의 부위에의 국소 도포용 본 발명의 조성물의 제제는 통증 완화를 위한 마취제, 예를 들면 리도카인을 포함할 수 있고; 별법적으로, 환부가 또한 박테리아 감염의 부위인 경우, 본 발명의 조성물은 국소적으로 유리하게 도포되는 항생제, 예를 들면 카나마이신 또는 임의의 많은 공지의 항생제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "HSV"라는 용어는, 공지된 단순 허피스 및(또는) 기타 바이러스 균주, 및 앞으로 발견되고(되거나) 동정될 단순 허피스 및(또는) 기타 바이러스 균주를 비롯한 모든 공지된 단순 허피스 바이러스 균주, 및 앞으로 발견되고(되거나) 동정될 단순 허피스 바이러스 균주, 뿐만 아니라 동일한 게놈 및(또는) 감염 및 복제 방식을 일부 공유하는 인간 파필로마(HPV) 및 바리셀라 조스터(VZ) 바이러스를 지칭하기 위한 것이다. "HSV-관련 병리상태"라는 용어는, HSV 또는 기타 관련 바이러스가 병리상태의 원인이 아니라고 하더라도(예를 들면, HSV 감염이 병리학적 상태의 증상이고(이거나) 결과인 경우), HSV 또는 기타 관련 바이러스가 원인이 되고(되거나) 상기 바이러스가 관련되었고(되었거나) 장래 언젠가는 관련될 임의의 병리학적 상태를 지칭하기 위한 것이다.
대부분의 HSV-관련 병리상태들은 생명에 위협이 되는 것은 아니지만, 성병으로 병원을 찾는 경우의 상당한 비율을 차지한다. 병에 걸린 사람들은 흔히 HSV로 초래되는 병변으로 인한 불쾌감을 없애기 위해 개선적 치료법을 시도한다. 보다 심각하고 심지어는 생명에 위협이 되는 HSV-관련 병리상태도 발생한다. 예를 들면, 50% 초과의 신생아들이 HSV-관련 CNS 장애에 고생하고 있으며, 적절하게 치료하지 않으면 신생아의 CNS 감염은 60% 초과의 사망률을 야기한다. 심지어 치료를 한 경우에도, 발병된 신생아들은 상당한 사망률을 나타낸다. 신생아 허피스 감염은 4000건의 출생 당 약 1 건 꼴로 추산된다. 신생아 허피스의 2/3는 HSV-II가 원인이다. HSV-II에 감염된 여성의 비율(미국에서 20%)의 증가로 인해, 신생아 허피스는 공중 보건상 심각한 문제가 되고 있으며, 현재까지 알려진 바로는 이러한 병리상태에 대한 효과적인 치료법은 없다.
따라서, 이러한 병리상태 및 기타 HSV-관련 병리상태에 대한 효과적인 치료법이 충족되지 않은 채 끊임없이 요구되어 왔다. 공지의 치료법은 단순히 이러한 요구를 해결하고 있지 못하고, 본 발명의 1차적인 목적은 환부에 국소적으로 도포하는 HSV-관련 병리상태에 대한 효과적인 치료법을 제공하고, 구체적으로는 숙주 면역계에 대한 HSV의 자기-보호 및 복제에 관련된 유전자의 발현을 변화시키는 치료법을 제공하는 것이다.
HSV 게놈은 1.5 x 105 염기쌍으로 구성되는 이중가닥의 폐쇄 환형 DNA 분자로서, 75개가 넘는 폴리펩티드를 코딩한다(B. Roizman and A.E. Sears, Herpes simplex viruses and their replication, in B. N. Fields and D. M. Knipe (Eds. ), Fundamental Virology, 2nd Ed., pp. 849-895, Raven Press (1991)). 감염성 HSV의 생활사는 최조기(immediate-early, IE), 중기(middle) 및 말기(late)로 지칭되는(α, β 및 γ로도 지칭되는) 3단계 유전자의 발현에 의해 좌우된다. 상기 단계는 각각 HSV 생활사의 후속적인 현상에 필요한 생성물의 유전자를 발현시켜, 감염성 HSV 비리온이 생산되고 방출되어 절정에 달한다.
HSV 비리온이 세포 내로 들어가면, 단백질 외피가 벗겨져 캡시드 구조가 방출되고, 바이러스 게놈이 핵공 및 핵 내로 운반된다. 핵 내로의 유입이 최조기 단계의 시작이다. 생산적 감염 주기의 가장 조기 단계에서는 α4--ICP4, α0--ICP0, α27--ICP27/UL 54, α22--ICP22/US1, 및 α47--ICP47/US12의 5개의 IE 유전자가 발현되고 기능한다. 이러한 최조기 단계의 감염은 유전자 발현의 "α"기라 불리며, 개별적인 α-전사체 프로모터와 연계된 특정 인핸서 요소에서 세포 전사 인자와의 상호작용을 통한 α-TIF의 작용에 의해 매개된다. 상기 유전자의 3종 이상의 단백질 생성물, ICPO, ICP4 및 ICP27은 HSV 유전자 발현의 조절과 관련된 인자이다(ICP, 감염된-세포 폴리펩티드). 이러한 조절 인자는 바이러스 생활사 전체에 걸쳐 발현되며, HSV의 증식 경로를 결정하는 유전자 활성화, 억제 및 억제해제의 복잡한 패턴을 조절하는 역할을 한다. 중기(β) 유전자는 주로 DNA 복제와 관련된 단백질을 코딩하고, 말기(γ) 유전자는 성숙한 비리온의 팩키징 및 조립과 관련된 구조 단백질을 코딩한다.
ICP4 단백질은 HSV 유전자 발현의 주요한 전사 조절자이다(Roizman and Sears, 상기 문헌 참조). ICP4 유전자(α4 유전자로도 알려져 있음)는 예측 분자량 133,000 달톤의 1298 아미노산 폴리펩티드를 코딩한다. 성숙한 ICP4 단백질은 350,000 달톤의 동종이량체로서 존재하는데, 이러한 큰 분자량은 번역후의 변형을 반영하는 것이다. ICP4 동종이량체는 HSV 유전자 발현의 전사 억제자 및 활성자 모두로서 기능하는 이중가닥 DNA 결합 단백질이다(Beard, P., S. Faber, K. Wilcox, and L. Pizer, Herpes simplex virus immediate-early infected-cell polypeptide 4 binds to DNA and promotes transcription, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:4016-4020 (1986); Pizer, L., D. Tedder, J. Betz, and K. Wilcox, Regulation of transcription in vitro from Herpes simplex virus genes, J. Virol. 60:950-959 (1996)). ICP4가 전사에 영향을 미치는 실제 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 가장 잘 규명된 DNA 결합 부위는 ICP4가 억제자로서 작용하는 곳이다.
ICP4는 HSV 증식에 필요한 기능을 갖는 필수적인 유전자 생성물이다. 2카피의 ICP4 유전자가 모두 없는(게놈 내에는 2개의 상이한 유전자좌가 존재함) HSV-1 돌연변이는, DNA를 복제하여 새로운 비리온을 만들지 못한다(DeLuca, N. A., A. M. McCarthy, and P. A. Schaffer, Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-early regulatory protein ICP4, J. Virol. 56:558-570 (1995)). ICP4 이외에 기타 필수적인 단백질은 당단백질 B 및 D (gB 및 gD), ICP27, 및 DNA 복제와 관련된 여러 가지 단백질이다(Matthews, J. T., B. J. Terry, and A. K. Field, The structure and function of the HSV DNA replication proteins: defining novel antiviral targets, Antiviral Res. 20:89-114 (1993); Olivo, P. D., N. L. Nelson, and M. D. Challberg, herpes simplex virus type 1 gene products required for DNA replication: identification and overexpression, J. Virol. 63:196-204 (1989); Roizman, B., and A. E. Sears, 상기 문헌 참조). 상기 언급된 바와 같이, ICP4는 바이러스 유전자의 발현에 필수적인 역할을 하기 때문에 HSV 생활사 전체에 걸쳐 작용할 필요가 있다.
ICP4에 대한 생화학적 및 분자 유전학적 문헌은 대부분 HSV-1에 초점을 맞추고 있다. HSV-1의 분자 생물학이 HSV-2보다 더 많은 주목을 받아 왔지만, 이 두 가지는 밀접하게 관련된 단백질을 사용하여 동일한 방식으로 가장 중요한 기능을 수행한다는 것이 통상적으로 일치되는 견해이다. 두 바이러스 간의 유전적 재조합 실험에 기초하면, HSV-1 및 HSV-2의 ICP4 단백질이 기능적으로 상호교환될 수 있음은 놀라운 사실이 아니다(Smith, C. A., and P. A. Schaffer, Intertypic recombinants of herpes simplex virus types 1 and 2 infected cell polypeptide 4, Virology. 160:176-182 (1987)). 이러한 실험들은 실질적으로 두 유전자의 임의 영역이 기능의 변화없이 상호 교환될 수 있음을 입증하고 있다. 이러한 데이터와 일치하듯이, HSV-1 및 -2는 그들 각각의 유전자 서열의 분석에 기초하면 거의 동일한 ICP4 아미노산 서열을 갖는다(McGeoch, D. J., and S. Cook, Molecular phylogeny of the alphaherpesvirinae subfamily and a proposed evolutionary timescale, J. Mol. Biol. 238:9-22 (1994)).
ICP47은 클래스 I MHC에 의해 제시되도록 지정된 펩티드의 세포질로부터 ER로의 TAP 이종이량체 매개 운반을 방해하는 것으로 보이는 세포질 단백질이다. 연구 결과, ICP47은 TAP 운반을 차단하고 TAP-클래스 I 복합체와 직접적으로 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. ICP47의 작용은 숙주의 펩티드와 유사한 표면 펩티드를 생산함으로써 HSV 바이러스가 스스로를 "은폐"하여 숙주 면역계를 피할 수 있도록 하고, 이로써 숙주는 바이러스를 외래 물질로 인식하지 않아 파괴하지 않는다. 기타 바이러스도 숙주 면역 반응의 일부를 차단하는 성분을 생산하는 것 같다(Hill, A. et al., Nature, 375 (6530):41, 1-5 (1995)).
본 발명의 조성물은 (a) HSV 복제 또는 융합과 관련된 표적 서열(들)을 표적으로 하는 ssDNA 서열 pr 서열을 생체내에서 생산하도록 코딩하는, 하나 이상의 관심 서열(sequences of interest, SOI), 상기 표적 서열(들)의 하나 이상의 전사 생성물(들), 또는 상기 표적 서열(들)의 하나 이상의 번역 생성물(들), 및 (b) 상기 ssDNA 서열(들)을 생체내에서 생산하기 위한 신호전달 지시 및 효소적 기능(들)을 생체내로 전달하고 후속적으로 발현시키기 위한 정보를 포함하는, 전달 부형제 중의 플라스미드 또는 기타 발현 벡터를 포함한다. 전달은 SOI, 신호전달 지시 및 효소적 기능을 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 예를 들어 리포좀, 또는 플라스미드에 도입하고, 크림, 연고, 로션, 겔, 에어로졸 스프레이, 또는 환부에 국소적으로 도포하기 위한 부형제로서 사용하기 위한 유사 물질들 중의 상기 벡터를 전달함으로써 달성된다. 상기 정보가 바이러스 벡터에 의해, 플라스미드 및 전달 비히클에 의해, 또는 기타 메커니즘에 의해 전달되고(되거나) 발현되는지에는 관계없이, "발현 벡터"라는 구절은 숙주 세포에서 유전자 기능의 변화를 야기하는 정보를 전달하고 발현하기 위한 시스템을 지칭하기 위해 사용된다. 환부에 국소적으로 도포하기 위해 부형제 내에 혼입되는 본원에 기술된 특정 발현 벡터는 pssXE 및 pssXV로 명명된 플라스미드이고, HSV의 복제 또는 HSV의 숙주 세포 내로의 융합과 관련된 하나 이상 유전자를 표적으로 하는 임의의 관심 서열이 상기 플라스미드 내에 포함된다. 본 발명의 조성물 중의 플라스미드 또는 기타 발현 벡터 내에 포함될 수 있는 상기 관심 서열들은, 예를 들어
안티센스 올리고뉴클레오티드로서 작용하여 ICP0, ICP22 및 ICP27과 같은 ICP4 및 ICP47 이외에 HSV의 하나 이상 표적 서열, 또는 HSV의 표적 서열로부터 전사된 mRNA 분자에 결합하는 서열;
미국 특허 제5,795,721호에 기술된 바와 같이, 전사 조절 인자의 발현을 저해하는 서열;
바이러스 구조 단백질의 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드;
HSV 게놈의 통합 후 숙주 세포의 하나 이상 표적 서열에서 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)로서 작용하여, 예를 들면 숙주 세포가 바이러스 증식 및(또는) 숙주 면역계로부터의 바이러스의 보호와 관련된 ICP4, ICP47, ICP0, ICP22 및 ICP27, 또는 기타 단백질을 생산하는 부위를 하향 조절하는 서열;
HSV의 번역 개시 부위, 코딩 영역 또는 5' 비번역 영역과 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드는 단순 허피스 바이러스 타입 1(HSV-1), 단순 허피스 바이러스 타입 2(HSV-2), 인간 허피스 바이러스 6, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 또는 바리셀라 조스터바이러스(VZV) 중 1종으로부터의 DNA, 또는 바람직하게는 RNA와 특이적으로 혼성화되도록 설계된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 편리하고 바람직하게는, 미국 특허 제5,514,577호에 기술된 바와 같이 제약학상 허용되는 담체 중의 제약 조성물로서 제공된다. 본원으로 이익을 얻는 당업자는, HSV에 대해 기술된 특정 유전자의 등가물(counterpart)이 다른 바이러스에서 발견됨을 인식할 것이다. 따라서, 단순 허피스 바이러스 타입 2, 인간 허피스 바이러스 타입 6, EBV 및 VZV 각각은 유사한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는다. 따라서, 본 발명은 ODN이 상기 임의의 바이러스를 표적으로 하는 ODN-매개 치료를 의도하고 있다.); 및(또는)
표적 분자, 예를 들어 HSV 단백질 외피를 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하여 단백질 외피의 조립을 억제하는 단백질-결합 올리고뉴클레오티드(앱타머)
를 포함한다.
상기 목록은 모두 포함된 것은 아니다. 본 발명에 따라 임의의 HSV-감염된 세포 내로 형질감염되어 임의의, 또는 적어도 매우 다양한 유전자를 표적으로 하고(하거나) HSV 복제 및(또는) 융합에 관련된 유전자의 기능을 조절하여 표적 유전자(들)의 기능을 변화시킬 수 있는 서열을 생산할 수 있는 발현 벡터가 제작될 수 있는 것으로 생각된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 숙주 세포 내에서 핵산 서열을 생산하는 주형으로 사용하기 위한 하나 이상의 상기 서열이 혼입되고, HSV-감염된 세포 내에서 하나 이상의 표적 유전자(들)에 결합하거나 이들과 상호작용하는 플랭킹 서열이 없는(또는 최소한도로 갖는) 단일가닥 DNA(ssDNA) 서열(들)로서 후속적으로 발현되어 상기 표적 유전자(들)의 발현을 변화시키는, 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 감염된 세포 내에서 생산된 ssDNA는 HSV의 복제 또는 융합과 관련된 표적 유전자 또는 유전자들의 일부를 포함하는 하나 이상 핵산 서열(들)에 상보적이고(이거나) 그에 결합하여, 상기 표적 유전자(들)의 발현을 방해하거나 발현을 변화시키도록 설계되고, 이러한 이유로 본원에서 때로는 올리고뉴클레오티드, 또는 ODN이라 지칭된다. 본 명세서에 사용된 "ODN"이라는 용어는, 1) DNA-계 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드(TFO), 안티센스 ODNs, DNA 효소 및 앱타머 및 2) RNA-계 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 리보자임 및 안티센스 RNA를 지칭하기 위한 것이다. 이러한 분자들은 모두 서열-특이적 방식으로 DNA 또는 mRNA와 상호작용함으로써 유전자 발현을 조절한다. 또한, "환부"라는 용어는 감염 부위가 어디이든 관계없이, 예를 들면 피부 상, 체강 또는 신체의 개구부 내, 또는 심지어 내부임에 관계없이, 그리고 감염된 조직의 성질에 관계없이, 본 발명의 조성물을 국소적으로 도포하여 치료될 수 있는 HSV 감염이 나타나는 임의의 부위를 지칭하기 위한 것이다.
따라서, 본 발명의 또다른 목적은 예를 들면, 핵산 서열을 인식하는 단백질에 결합함으로써 HSV의 복제 또는 융합과 관련되는 하나 이상 유전자 생성물(들) 및(또는) 바이러스 유전자(들)을 하향 조절하는 억제성 핵산으로서 기능하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 뉴클레오티드 서열의 ssDNA를 세포내적으로 생체내 생산하기 위한 발현 벡터를 환부에 투여하는 것을 포함하는, HSV-관련 병리상태의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 예를 들면, 하나 이상 표적 염색체 서열에 결합함으로써 HSV의 복제 또는 융합을 억제하기 위한 하나 이상 유전자(들)의 생산을 증가시키거나 하나 이상의 표적 유전자(들)을 "스위치 온"시키기 위한 흥분성 핵산으로서 기능하는(이에 한정되는 것은 아님) 임의의 뉴클레오티드 서열의 ssDNA를 생체내에서 생산하기 위한 발현 벡터를 환부에 국소 도포하기 위한 부형제 중에 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 바이러스 게놈을 포함하는 내인성(천연 DNA) 또는 이중가닥 DNA 듀플렉스에 결합하여 HSV의 복제 또는 융합과 관련된 하나 이상 표적 유전자(들)의 정상적인 유전자 전사 및 조절을 방해하는 트리플렉스 구조를 형성하기에 유리하게 설계된 ssDNA를 생체내에서 생산하기 위한 발현 벡터를 환부에 국소 도포하기 위한 부형제 중에 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 HSV 복제 또는 융합에 필요한 하나 이상의 세포 기능을 파괴하고(하거나) 변화시키기 위해, 하나 이상 표적 세포 집단에서 ssDNA를 생산하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 조성물 및 방법을 제공하는 것이고, 여기서 ssDNA를 생산하기 위한 발현 벡터에는 하나 이상의 표적 세포 집단에서 벡터에 의해 생산되는 ODN이, 단백질의 촉매 작용 또는 핵산과 단백질의 상호작용, 예를 들어 전사, 번역 또는 DNA 복제에 의해 좌우되는 HSV의 증식 또는 융합에 있어서 다양한 세포 물질에 결합하고(하거나) 아니면 다양한 세포 기능을 억제 또는 활성화하도록 2차 구조가 설계되어 들어간다.
본 발명의 또다른 목적은 환부에 국소 도포하기에 적절한 부형제 중에서 전달시 리포펙션, 직접 세포 흡수(uptake) 및(또는) 미세주입에 의해 직접 투여시 전달의 장애를 극복하는, HSV-감염된 세포 내로 형질감염시 바이러스 복제 또는 융합과 관련된 유전자(들)의 mRNA 표적에 대해 촉매 활성을 나타내는 서열을 포함하는 ssDNA를 생체내에서 생산하기 위한 발현 벡터를 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 환부에 국소 도포하기 위한 배지 중에 현탁되어 리포펙션, 직접 세포 흡수 및(또는) 미세주입으로 직접 투여시 잘 알려진 전달의 장애를 극복하는, HSV-감염된 세포 내로 형질감염시 바이러스 증식, 융합 또는 기타 바이러스 기능과 관련된 특정 유전자 또는 유전자들에 의해 생산되는 하나 이상의 mRNA 표적에 대해 촉매 활성을 나타내는 서열을 포함하는 ssDNA를 생체내에서 생산하기 위한 발현계를 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 HSV-감염된 세포에 국소 도포될 수 있는 부형제 중에서 HSV-감염된 세포 내로의 형질감염시 바이러스 복제 또는 융합과 관련된 유전자(들)의 mRNA 표적에 대한 촉매 활성을 나타내는 서열을 포함하는 ssDNA를 생체내에서 생산하기 위한 발현 벡터를 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 국소 연고를 환부에 도포하는 것을 포함하고, HSV의 증식 또는 융합과 관련된 dsDNA 서열을 표적으로 하는 하나 이상의 ssDNA 서열(들)의 생체내 발현에 필요한 정보를 포함하는, 국소 연고 중에 포함된 발현 벡터와 환부를 접촉시키는 것을 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 효소 활성을 갖는 서열을 포함하는 억제성 또는 흥분성 핵산 서열을 치료 효과를 나타내는 방식으로 HSV-감염된 세포에 전달하기 위한, 제약학상 허용되는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적에 대한 이러한 목록에 본 발명의 모든 목적이 열거된 것은 아니다. 복제에 의해 유리하게 사용되는 다수의 기타 세포 기능들 및(또는) 세포 게놈으로 매개되는 잠복성 HSV 바이러스가 존재하는데, 이들은 본 발명의 교시에 따라 변화될 수 있고 ssDNA의 생체내 생산으로 조절될 수 있다. 간결함 및 실용성 때문에, 본 발명에서는 그러한 다수의 기타 기능들은 언급하지 않았다. 대신, 본 발명의 목적 중 일부에 대한 목록은 예시를 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
이러한 목적들은 HSV의 복제 또는 융합에 관련되는 하나 이상 핵산 표적 서열(들)을 표적으로 하거나 아니면 그와 상호작용하는 ssDNA 서열을 생체내 발현하는데 필요한 정보를 포함하는 벡터를 환부에 국소 도포하기에 적절한 부형제 중에 포함하는, HSV-관련 병리상태를 치료하기 위한 조성물에 의해 제공된다. 하나의 태양에서, 본 발명의 조성물을 포함하는 벡터는 역 탠덤 반복구조로 플랭킹되는 관심 서열, 3' 프라이머 결합 부위 (PBS), 및 상기 PBS로부터 카세트의 mRNA 전사체를 전사하여 발현 벡터가 혼입된 환부 세포에 단일가닥 cDNA 전사체가 방출되도록 하는 역전사효소를 코딩하는 유전자로 구성되는 카세트를 포함한다. 관심 서열은 표적 서열(들)의 발현을 변화시키기 위해 역전사되었을 때, HSV의 증식 또는 융합과 관련되는 하나 이상 표적 핵산 서열(들)을 표적으로 하거나, 그에 결합하거나, 아니면 그와 상호작용하는 핵산 서열을 생산하는 핵산 서열로 구성된다.
달리 언급된 곳을 제외하고, 문헌[J. Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press (1989), 하기 "Maniatis, et al.(1989)"로 언급) 및 F.M. Ausubel, et al. (Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons (1987))](모두 상기 구체적 참조로 그 전체가 본원에 도입됨)에 기술된 바와 같이 표준 기술을 하기 실시예에 사용했다. 상이한 효소 제품 또는 시스템을 사용한 고안된 인공법 및 천연 공정에 의한 ssDNA 생산의 기타 방법은 또한 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있고, 본원에 기재된 실시예가 예시의 목적을 위해 기재된 것이고 본 명세서 또는 본원에 기술된 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
플라스미드의 제작은 하기 구체적 참조로 그 전체가 본 명세서에 도입된 2002년 5월 1일 출원된 미국 공동출원 제10/136,218호에 기술되었다. 구체적으로, 본 발명의 명시에 따라 제작된 발현 벡터는 도 3 및 4에 보여진 pssXE (세포 배양 연구용) 및 pssXV (인간을 비롯한 동물용) 플라스미드이다. pssXE 및 pssXV를 만들기 위해, 상기 도입된 공동 출원에 기술된 pssXB 및 pssXD 플라스미드를 NheI 및 XhoI로 이중 절단했다. pssXD로부터 절단된 DNA 단편 (RT, PBS, 및 ssDNA의 합성에 필요한 기타 성분 함유)을 동일한 효소로 pssXB로부터 이중 절단된, CMV 프로모터 함유 벡터내로 서브클로닝했다. 관심 서열의 플라스미드내로의 서브클로닝을 용이하게 하기 위해, 4개의 신규한 제한 효소 인지 부위, EcoRI, SacII, PstI 및 PacI를 생성하도록 pssXD 플라스미드의 PacI 및 XhoI 부위내로 하기 서열을 어닐링 및 서브클로닝하여 복수 클로닝 부위 (MCS)를 생성했다.
하기 서열을 pssXE 및 pssXV의 PacI 및 EcoRI 부위내로 클로닝했다:
서열 [3]은 프로모터 영역에 결합함으로써 많은 HSV 유전자의 발현을 조절하고 ICP4가 HSV1 및 HSV2 모두의 유전자 프로모터와 상호작용하는 것을 억제하기 위해 경쟁적 방식으로 작용하는 ICP4 전사 인자에 결합한다. 서열을 BGHRev 프라이머를 사용해 자동 서열화에 의해 확인했다.
서열 [3]을 함유하는 발현 벡터를 pssXE(59)(도 3A)로서 지칭했다. [3]의 상보 서열을 함유하는 대조군 벡터(상기에서 서열 [4]로 열거)를 또한 제작하여 pssXE(59)S (도 3B)로 지칭했다. 양 제작물을 문헌[Maniatis, et al. (1989)]에 따라 아프리칸 그린 몽키 키드니 (Vero) 세포내로 형질감염했다. 다수의 클론을 무작위로 선택하고 확장했다. 상기 세포주를 24-웰 배양 접시에 열-불활성화 10% 신생 송아지 혈청 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies), 메릴랜드주 게티스버그 소재) + 50 ㎍ 페니실린/ml, 50 ㎍ 스트랩토마이신/ml, 및 0.15 ㎍ 펀가이존/ml 함유 둘베코 변형 이글스 배지내에서 접종하고 밤새 배양했다. 배지를 흡입하고 50 PFU의 HSV1, ATCC 균주 17 또는 HSV2, ATCC 균주 186을 함유하는 배양 배지 0.2 ml로 대체했다. 1시간 흡수 후, 1 ml 블로킹 배지 (0.3% 인간 감마 글로불린으로 보충된 성장 배지)를 각 웰에 첨가했다. 3일 후, 잘 정의된 플라크가 가시화될 때, 세포를 메탄올로 고정하고 0.8% 크리스탈 바이올렛 (시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스 소재)로 염색하고, 세정한 후 대기건조했다. 플라크 계수를 3번 기록한 후 평균을 계산했다. 도 5에서 보여진 것 처럼, HSV1 바이러스 감염의 다양한 정도의 감소를 pssXE(59)로 형질감염된 세포에서 관찰했다. 특히, 500배 이상의 감소를 비형질감염된 Vero 세포에 대비해 클론 r4 및 r8에서 관찰했다. 그러나, 대조군 벡터인 pssXE(59)S로 형질감염된 세포내 HSVI 바이러스 감염의 유의한 감소가 없었다 (도 6). 별도의 실험에서, 상기 동일한 클론을 또한 HSV2, 균주 186로 감염했다. 도 7에서 처럼, HSV2 바이러스 감염의 감소를 pssXE(59)로 형질감염된 세포에서 관찰했다. 바이러스 감염의 1000배 감소를 대조군 비로 세포에 대비해 클론 r4에서 관찰했다. 유사하게, 대조군 벡터인 pssXE(59)S로 형질감염된 세포내 HSV2 바이러스 감염의 유의한 감소가 없었다 (도 8).
서열 [5] 및 [6]을 HSV-1의 단백질 ICP47-1을 표적으로 하는 DNA 효소를 포함하도록 고안했는데, 서열 [5]는 12nt 내지 26nt의 위치에서 ICP-47 mRNA 서열에 결합하고 서열 [6]은 56nt 내지 70nt의 위치에서 결합한다. 유사하게, 서열 [7] 및 [8]을 HSV-2의 단백질 ICP47-2를 표적으로 하는 DNA 효소를 포함하도록 고안했는데, 서열 [7]은 21nt 내지 35nt의 위치에서 ICP-47 mRNA 서열에 결합하고 서열 [8]은 58nt 내지 72nt의 위치의 mRNA 서열에 결합한다. 또한, 서열을 BGHRev 프라이머를 이용해 확인했다.
* * * *
상기 실험은 HSV 복제 또는 HSV의 표적 세포내로의 융합에 관련된 유전자의 유전자 기능을 변하게 하는, 진핵 RT 반응 및 다양한 cDNA 프라이밍 반응을 이용한 다단계별 반응에 의한 HSV-감염된 세포내 ssDNA 생산용 발현 벡터의 용도를 증명했다. 당업자는 본 발명이 본원에 기술된 상기 발현 벡터의 구체적 태양에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 예를 들면, 많은 핵산 서열이 구체적 표적 서열 및(또는) SOI의 억제 활성의 방식에 따라 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 유사하게, SOI는 예를 들면, IR와, 및(또는) PBS와 IR의 3' 측면 사이 2곳의 위치 중의 하나 또는 모두에 위치할 수 있다. 유사하게, SOI는 특정 표적 서열 및(또는) SOI의 활성 방식 및(또는) DNA 효소 서열에 따라 DNA 효소 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 도면 및 구체적 실시예를 참고로 하여 기술되었지만, 당 분야의 숙련자들은 이들 요소가 의도된 각 결과를 달성하도록 기능하는 방식을 변경하지 않고 본원에 기재된 구체적 요소에 임의의 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 본원에서 기술된 카세트는 3개의 유전 요소, 관심 서열, 텐덤 역 반복구조 및 프라이머 결합 부위를 포함하고, 표적 세포내로 적절한 프로모터의 조절하의 역전사효소 유전자와 함께 형질감염되면 본원에서 기술된 억제성 핵산 서열을 생성한다. 그러나, 당 분야의 숙련자들은, 예를 들면 카세트의 역전사효소 유전자가 기타 역전사효소 유전자(인간 면역결핍 바이러스 유래의 역전사효소 유전자가 상기 논의된 그러한 유전자 중의 하나임)로 대체할 수 있으며, 본원에 기술된 CMV 프로모터 이외의 프로모터가 이롭게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 상기한 바와 같이, 형성된 스템-루프 중간체는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고 그의 변성에 대한 민감성은 그 중간체로부터 생성될 특정 관심 서열에 따라 이롭게 조작된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 상기 기술의 변형에 의해 당업자에 명백해질 이러한 모든 변경 및 기타는 하기의 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (21)

  1. HSV의 복제 또는 숙주 세포내로의 HSV의 융합에 관련된 하나 이상의 DNA 서열 또는 그 하나 이상의 표적 서열의 전사 또는 번역 생성물을 표적으로 하는 ssDNA 서열의 생체내 발현에 필요한 정보를 포함하는 벡터를 환부에 도포하기 위해 부형제와 함께 제제화하여 포함하는 HSV-관련 병리상태의 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체내 생성된 ssDNA가, 표적 서열의 발현을 변하게 하는 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드, 앱타머, DNA 효소, 또는 안티센스 ODN으로서 기능하는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체내 발현된 ssDNA가 표적 서열에 실질적으로 상동적이거나 상보적인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체내 발현된 ssDNA가 앱타머이며 DNA 효소인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생체내 발현된 ssDNA가 HSV의 증식 또는 숙주 면역계로부터의 바이러스의 보호에 관련된 유전자의 발현을 억제하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 ssDNA가 HSV 복제 또는 표적 세포내로의 HSV의 융합에 관련된 유전자의 적어도 일부에 실질적으로 상동적이거나 상보적인 안티센스 서열인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 항생제를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 마취제 또는 진통제 또는 모두를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 비타민 A, D 및 E중 1종 이상을 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 부형제가 2-파트 겔 또는 베이스 PCCA 코스메틱 HRT를 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, ssDNA 서열의 생체내 발현을 위해 필요한 정보가 관심 서열, PBS 및 상기 벡터내로 도입된 역 반복구조를 포함하는 카세트에 포함되는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 플라스미드가 플라스미드 pssXE 또는 pssXV를 포함하는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 조성물의 약 0.01% 내지 약 20% (중량%)로 포함되는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 조성물의 약 0.1% 내지 약 5% (중량%)로 포함되는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터가 부형제에 현탁되는 조성물.
  17. HSV의 복제 또는 환부 세포내 HSV의 융합에 관련된 하나 이상의 염색체 부위를 표적으로 하는 ssDNA 서열의 생체내 발현을 위해 필요한 정보를 포함하는 벡터와 환부를 접촉시킴을 포함하는, 국소 연고의 환부 도포를 수반하는 HSV-관련 병리상태의 개선된 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 국소 연고가 환부상에 분무되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 발현 벡터의 환부내 침투를 증강시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 플라스미드 pssXV.
  21. 플라스미드 pssXE.
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