KR20050071448A

KR20050071448A - 노루오줌 추출물 또는 이로부터 분리된 아스틸빅산 및펠토보이키놀릭산 유도체를 함유하는 항염증 또는 항알러지조성물

Info

Publication number: KR20050071448A
Application number: KR1020050052041A
Authority: KR
Inventors: 장현욱; 강삼식; 배기환; 김현표; 손건호; 박재돈
Original assignee: 학교법인 영남학원
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2005-06-16
Publication date: 2005-07-07
Also published as: KR100523462B1

Abstract

본 발명은 항염증 및 항알러지활성을 갖는 노루오줌(Astilbe rubra) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 노루오줌 추출물로부터 분리한 아스틸빅산 (Astilbic acid, ACH53c) 또는 펠토보이키놀릭산(Peltoboykinolic acid) 유도체를 함유함으로써 각종 염증 질환의 원인이 되는 혈소판활성화인자(PAF, platelet activating factor)의 전구물질인 리소PAF(lysoPAF)로부터 PAF를 합성하는 효소인 리소PAF-아세틸트란스페라제(lysoPAF-acetyltransferase)의 활성을 저해하여 PAF의 생성을 억제하는 활성을 갖는 동시에, 리폭시게나제(5-LO, 5-lipoxygenase)의 활성을 저해하여 염증성 에이코사노이드(eicosanoid)의 생성을 방지함으로써 각종 염증 및 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

노루오줌 추출물 또는 이로부터 분리된 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산 유도체를 함유하는 항염증 또는 항알러지 조성물 {Composition comprising the extract of Astilbe rubra or Astilbic acid and Peltoboykinolic acid derivatives having anti-inflammatory or anti-allergic activity}

본 발명은 생약추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 염증 및 알러지성 질환에 관련이 있는 혈소판활성화인자 및 류코트리엔 C₄(LTC₄)의 생성 저해 활성이 있는 노루오줌(Astilbe rubra HooK f. et Thomas) 추출물 및 이로부터 분리 정제한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산을 함유하는 염증 및 알러지성 질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

염증이란 신체 국소에 일어나는 상해에 대하여 생체조직의 방어반응이다. 즉, 각종의 유해한 자극(stressor)에 응답하여, 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어반응이 염증반응이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극 등이 있다. 염증반응에 관련된 생체구성인자는 자유라디칼(free radical), 단백질, 당질, 지질 등의 저분자나 고분자의 화학물질과, 혈장, 혈구, 혈관 및 결합조직 등이 있다. 염증의 과정은 보통 2가지로 나누며, 급성 과 만성 염증으로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.

알러지성 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 및 혈액의 호염기성 세포 및 호산구에서 유리되는 매개체들 (주로 histamine, leukotrienes, TNF-α, cytokines 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알러지 치료 약물들의 용도는 증상완화에 머무르고 있기 때문에 보다 근본적인 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다.

염증 및 알러지성 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 프로스타타글란딘류 (prostaglandindes), 류코티리엔류 (leukotriens), 혈소판활성화인자 (PAF) 등은 포스포리파제 A2 (phospholipase A2) 및 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase) 및 리폭시게나제 (lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산 (arachidonic acid)로부터 생성된다.

상기의 염증성 질환을 치료하기 위하여, 여러 종류의 염증성 질환치료제가 개발되었는데, 현재까지 보고된 염증성 질환 치료물질은 급성염증에서 손상된 조직세포, 염증에 관여하는 세포 또는 주화인자 (Chemotactic factor)에 의해 유도되는 백혈구의 세포막으로부터 에이코사노이드이 생성을 억제하는 약물이다. 또한 알러지제도 항원-항체 반응시 유리되는 히스타민 유리 억제, 히스타민 수용체 차단, 류코트리엔 생성 억제 및 류코트리엔 수용체 차단을 억제하는 약물들이다.

한편, 최근에는 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다.

한편, 노루오줌 (Astilbe rubra HooK f. et Thomas)은 전국의 산골짜기에서 흔히 볼 수 있고, 일본, 만주, 중국, 아무르, 우수리에 분포하는 여러해살이풀, 높이 30-70cm, 긴 갈색 털이 있으며 뿌리줄기는 굵고 짤게 옆으로 벋는다. 잎은 3개씩 2-3회 갈라지며, 작은잎은 타원형, 길이 3-8cm 나비 2-4cm, 종이처럼 얇고 가장자리에 겹톱니 또는 결각상의 톱니가 있고 잎자루가 길다. 꽃은 7-8월에 피고 홍자색, 줄기 끝의 원추꽃차례에 많은 꽃이 달리고, 화축에는 갈색 털이 많고, 꽃받침은 5개로 갈라지고 갈라진 조각은 달걀모양이며 꽃잎은 5개로서 선형이고 수술은 10개이며 암술대는 2개이고 삭과는 길이 3-4mm이다. 전초를 채취하여 말린 것을 소승마(赤小麻) 또는 적승마(赤升麻)라고도 부른다. 혈액순환을 좋게 하고, 어혈(瘀血)을 풀어주며, 열을 내리고, 독을 풀어주며, 경련을 멎게하고, 통증을 멎게하는 효능이 있어서 과로로 오는 병, 근육과 뼈마디가 시리고 아픈 증상, 타박상, 관절통, 수술후 통증, 뱀에게 물린 독을 푸는 데 사용한다(한국의 약용식물, 교학사, 2000, p204,배기환저)

한국특허등록 특1996-14989호에서는 노루오줌의 근경에서 분리한 진통효과가 있는 3베타-하이드록시올레안-12엔-27오인산 화합물에 대해 개시하고 있다. 그러나 노루오줌의 추출물이 항염증 또는 항알러지 활성이 있다고 상기 문헌에 교시되거나 개시된 바는 없다.

이에 본 발명자들은 노루오줌추출물 및 이들에서 헥산 가용성 추출물에서 정제한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산이 랫트 비만세포 세포주인 RBL 2H3 세포에서 혈소판 활성화인자의 합성 효소인 리소PAF 아세틸 트랜스퍼라제 (lysoPAF-acetyltransferase) 활성을 강력하게 억제하며 동시에 류코트리엔 C₄ (LTC₄) 생성을 강력하게 억제하는 효능을 보유함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항 염증 효과를 나타내는 노루오줌 추출물 및 이로부터 정제분리한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산을 제공하는 것이다. 또한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증, 항알러지용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PAF 생성억제 및 5-리폭시게나아제 저해활성을 나타내는 노루오줌(Astilbe rubra) 조추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물을 의미한다.

또한, 본 발명은 PAF 생성억제 및 5-리폭시게나아제 저해활성을 나타내는 노루오줌 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 비극성용매 가용추출물은 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성용매, 바람직하게는 헥산에 가용한 추출물을 의미한다.

상기 노루오줌은 노루오줌의 전초(全草), 뿌리, 잎 또는 줄기를 포함한다.

또한, 본 발명은 PAF 생성억제 및 5-리폭시게나아제 저해활성을 나타내는 아스틸빅산 또는 펠토보이키놀릭산 유도체 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 염증 질환 또는 알러지성 질환은 일반적인 염증 질환, 기관지천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식, 알러지성 피부염 등을 포함한다.

또한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증제 또는 항알러지제를 제공하는 것이다.

본 발명의 노루오줌으로부터 조추출물, 비극성용매 가용추출물 및 아스틸빅산 또는 펠토보이키놀릭산 유도체 화합물들은 하기와 같이 제조될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 노루오줌 조추출물은, 건조된 노루오줌의 뿌리 또는 지상부(잎, 줄기)를 세절하여 무게(㎏)의 약 3배 내지 20배, 바람직하게는 약 5배 내지 10배의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로, 20 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 3일 내지 8일간 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 바람직하게는 냉침 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 진공회전농축하여 극성용매 가용추출물인 조추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 조추출물들을 포함하는 염증 질환 또는 알러지질환 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 비극성 용매 가용 추출물은 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액이 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름와 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp 6-7, 1998).

본 발명의 바람직한 실시예로 상기 노루오줌의 메탄올 조추출물을 증류수에 현탁시키고 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물 순으로 분획하여 각 용매분획을 제조한다. 헥산층을 재결정하여 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산을 제조할 수 있다.

상기 본 발명의 화합물은 상기 비극성용매 가용추출물을 가지고 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 같은 흡착크로마토그래피를 수행하며, 바람직하게는 실리카겔컬럼에 헥산/에틸아세테이트 혼합용매 또는 클로로포름:메탄올 혼합물, 바람직하게는 1:0 내지 10:1(w/w)비 갖는 전개용매를 컬럼에 전개시켜 분획 후, 다시 실리카겔컬럼크로마토그래피 또는 Rp-18 컬럼크로마토그래피와 같은 역상크로마토그래피 또는 재결정을 반복 수행하여 하기 화학식 1의 아스틸빅산 및 화학식 2의 펠토보이키놀릭산을 분리할 수 있다.

상기 전개용매 대신 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 증류수 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행할 수도 있다.

본 발명은 노루오줌으로부터 상기 제법에 의해 수득된 PAF 생성 저해활성 또는 5-리폭시게나아제 저해활성을 갖는 노루오줌의 조추출물 및 비극성용매 가용추출물을 제공한다.

본 발명은 상기 제법에서 얻어지는 PAF 생성저해 또는 5-리폭시게나아제 저해활성을 갖는 상기 노루오줌의 조추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 노루오줌으로부터 상기 제법에 의해 수득된, 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 5-리폭시게나아제(5-LO, 5-lipoxygense) 저해제로서의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제법에서 얻어지는 PAF 생성저해 또는 5-리폭시게나아제 저해활성을 갖는 상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증 질환 또는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물을 이용하여 예방 및 치료할 수 있는 염증 질환 또는 알러지성 질환으로는 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 곤충알러지, 식품알러지, 약품알러지, 과민증, 두드러기, 기관지천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식, 알러지성 피부염 등을 포함한다.

본 발명의 화학식 1의 아스틸빅산의 효능을 조사하기 위하여, 즉 혈소판활성화인자(PAF) 생성에 관련한 리소PAF 아세틸트랜스퍼라제의 저해능을 알기 위하여 실험한 결과, 아스틸빅산은 용량 의존적으로 혈소판활성화인자의 생성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도(IC₅₀)는 20.5 ㎍/㎖ 이었다.

또한 기관지 천식 및 알러지반응을 일으키는 류코트리엔 C₄(LTC₄)의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제의 저해활성을 본 것으로 아스틸빅산은 용량 의존적으로 LTC₄의 생성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도(IC₅₀)는 1 ㎍/㎖ 이었다.

또한, 노루오줌은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출 분리된 본 발명의 화합물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다. 따라서, 본 발명의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 염증 질환 또는 알러지성 질환 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 국소 적용을 위해서는 본 발명의 추출물 또는 화합물을 연고나 크림으로 제형화할 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 노루오줌의 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 노루오줌 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능 식품류 등이 있다.

또한 염증 질환 또는 알러지성 질환 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강기능식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100㎖를 기준으로 1 ∼ 30g, 바람직하게는 3 ∼10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 노루오줌 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 노루오줌 조추출물 제조

1-1. 조추출물 제조예 1

경동시장에서 구입한 건조된 노루오줌 뿌리 1.3 ㎏을 세절하여 메탄올 10 ℓ에 침지시킨 후 실온에서 추출액을 수득하고, 다시 5ℓ의 메탄올을 가하여 1회 더 추출하였고, 상기 각 추출액을 여과한 후, 여과액을 혼합하였다. 상기 메탄올 추출물을 감압, 농축 및 건조하여 총 추출물 100g을 수득하였다.

1-2. 조추출물 제조예 2

경동시장에서 구입한 건조된 노루오줌 지상부(줄기, 잎) 1.0 ㎏을 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하여 총 추출물 78g을 수득하였다.

1-3. 조추출물 제조예 3

경동시장에서 구입한 건조된 노루오줌 지상부(줄기, 잎) 1.0 ㎏을 세절하여 70% 메탄올 10 ℓ에 침지시킨 후, 약 60 ℃에서 12 시간 환류냉각하면서 1회 추출한 후 70% 메탄올 5 ℓ로 상기와 같은 조건에서 2회 추출하여 총 추출액을 와트만 여과지로 여과하고, 여액을 65℃에서 회전감압농축하여 메탄올을 제거하고, 건조하여 토후박 조추출물 110 g을 얻었다.

1-4. 조추출물 제조예 4

61경동시장에서 구입한 건조된 노루오줌 지상부(줄기, 잎) 1.0 ㎏을 10ℓ의 증류수에 가하여 잘 교반한 다음, 90 내지 95℃를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였고, 같은 방법으로 3회에 걸쳐 여액을 모아 55~65℃에서 생약추출물을 감압농축한 후, 동결건조시켜 생약조성물 분말 엑스 115g을 얻었다.

실시예 2. 노루오줌 추출물의 분획물 제조

2-1. 노루오줌 헥산 분획물 제조

상기 실시예 1-1의 노루오줌 뿌리 조추출물 또는 실시예 1-2의 노루오줌 지상부 조추출물 중 60g을 각각 1ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축 및 건조하여 헥산 가용성분획물 32g 및 수가용성 분획물 28g을 수득하였다.

2-2. 노루오줌 에틸아세테이트 분획물 제조

상기 실시예 2-1의 노루오줌 수가용성 분획물에 각각 1 ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 에틸아세테이트 10 ℓ를 가하여 3회 추출하였으며, 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축 및 건조하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 12.5g 및 수가용성 분획물 15.5g을 수득하였다.

2-3. 노루오줌 부탄올 분획물 제조

상기 실시예 2-2의 노루오줌 수가용성 분획물에 각각 1 ℓ의 증류수에 현탁시킨 다음, 부탄올 10 ℓ를 가하여 3회 추출하였으며, 부탄올 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하여 각각을 감압, 농축하여 부탄올 가용성분획물 9.0g 및 수가용성 분획물 6.5g을 수득하였다.

실시예 3. 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산 유도체의 분리

3-1. 노루오줌 헥산 가용추출물의 분획

상기 실시예 2-1의 노루오줌 헥산 가용부 30g을 동량의 실리카겔 (Merck사)에 흡착시킨 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10 x 90㎝)를 시간당 1000㎖로 수행하였다. 이때 전개용매로서 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 초기 용매로 하여 점점 극성을 증가시키면서(n-헥산:에틸아세테이트(9:1)→클로로포름:메탄올(7:3)) 용출시켰으며, 최종적으로 메탄올로 극성분획을 세척하여 PAF 생성 억제 및 리폭시게나제 저해활성 물질을 용출시켜 8개의 분획으로 나누었다.

72각각의 분획에 대해 실리카겔크로마토그래피, Rp-18(ODS) 컬럼크로마토그래피 또는 재결정을 반복적으로 행하여 하기 2개의 화합물을 얻었다.

도 1에 노루오줌으로부터 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산 분리과정을 간단한 도로 나타내었다.

(1) 화합물 1 : 아스틸빅산(ACH53c)

화합물 1 아스틸빅산은 실시예 2-1의 헥산 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10 x 9O㎝, 전개용매; n-헥산:에틸아세테이트(9:1)→클로로포름:메탄올(7:3))를 수행하여 시간당 1000㎖로 수행하여 8 개 분획물을 얻었다. 이중 5번째 분획물(1.1g)을 다시 상기 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시간당 300㎖로 수행하여 4개의 분획물을 얻었다. 이 중 3번째 분획물을 재결정시켜 아스틸빅산(astilbic acid) 0.2 g을 수득하였으며, 화합물을 NMR 분석기기로 분석한 결과는 하기와 같다.

¹³C-NMR (75MHz, MeOH-d4)

δ : 17.9(C-25), 18.1(C-24), 20.3(C-26), 23.1(C-7), 23.6(C-11), 23.8(C-30), 28.5(C-16), 28.5(C-23), 28.5(C-2), 28.6(C-28), 31.2(C-20), 33.4(C-29), 33.4(C-17), 34.7(C-21), 37.1(C-22), 37.3(C-10), 39.6(C-8), 40.4(C-4), 41.5(C-1), 44.5(C-19), 45.0(C-15), 48.1(C-9), 50.0(C-18), 56.1(C-5), 56.9(C-14), 67.4(C-6), 78.5(C-3), 125.9(C-12), 138.1(C-13), 178.7(C-27)

(2) 화합물 2 : 펠토보이키놀릭산(10-히드록시-2,2,4a,6b,9,9,12a-헵타메틸-2,3,4,4a,5,6,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-옥타데카히드로-1H-피센-6a-카르복실산 메틸 에스테르)

화합물 2 펠토보이키놀릭산은 실시예 2-1의 헥산 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(10 x 9O㎝, 전개용매; n-헥산:에틸아세테이트(9:1)→클로로포름:메탄올 (7:3))를 수행하여 시간당 1000㎖로 수행하여 8 개 분획물을 얻었다. 이중 5번째 분획물(1.1g)을 다시 상기 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시간당 300㎖로 수행하여 4개의 분획물을 얻었다. 이 중 1번째 분획물을 재결정시켜 펠토보이키놀릭산(peltoboykinolic acid) 0.1 g을 수득하였으며, 화합물을 NMR 분석기기로 분석한 결과는 하기와 같다.

¹³C-NMR (75MHz, MeOH-d4)

δ : 15.8(C-25), 16.5(C-24), 18.1(C-26), 18.3(C-6), 22.3(C-15), 22.9(C-11), 23.8(C-30), 27.1(C-2), 27.6(C-16), 28.2(C-28), 28.3(C-23), 31.2(C-20), 33.0(C-16), 33.0(C-17), 33.4(C-29), 34.4(C-21), 36.4(C-22), 36.7(C-8), 37.1(C-10), 38.8(C-1), 39.9(C-4), 44.0(C-19), 47.3(C-18), 49.2(C-9), 50.8(-OCH3), 55.4(C-5), 56.0(C-14), 79.3(C-3), 125.9(C-12), 137.9(C-13), 179.5(C-27)

실험예 1. 혈소판 활성화 인자 생합성에 대한 영향 조사

상기 실시예의 노루오줌 추출물 및 이들에서 정제한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산의 PAF 생합성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.

RBL 세포추출물은 RBL2H3 세포(일본 Showa 대학 약학부 Kudo Ichiro 교수 제공)를 대량 배양한 후 분쇄하여 균질화(homogenize)한 후 100,000Xg 원심분리하여 수득한 펠렛(pellet)을 효소원으로 사용하였다.

구체적인 실험 방법은 RBL 세포추출물(cell lysate), [³H] 아세틸 CoA(Sigma 사), 리소PAF(Sigma 사) 및 100 mM Tris-HCl (pH 6.9)(Sigma 사)를 가한 후, 37℃에서 10분 반응시켜 생성되는 [³H] 아세틸 PAF를 유기 용매법으로 추출한 다음, 액체 신틸레이션 카운터(scintillation counter, Beckman 사)로 측정하였다. 이 때 아스틸빅산은 미리 10분간 전처리하여 [³H]PAF 생성량을 측정하였다.

실험결과, 하기 표 1에 추출물 및 분획물들의 각각의 PAF 생성억제율이 나타나 있으며, 아스틸빅산은 용량 의존적으로 PAF의 생합성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도는 20.5 ㎍/㎖ 이었다(도 2 참조).

실험예 2. 류코트리엔 생성에 대한 영향 분석 실험

상기 실시예에서 제조된 노루오줌 추출물 및 이들에서 정제한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산의 류코트리엔 C₄(LTC₄) 생성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)를 BALB/C 마우스로부터 무라카미 등의 방법 [Murakami et al.; J. Biol. Chem. 269, pp22269-22275, (1994)]으로 골수에서 분리하여, IL-3 생산 세포인 WEHI-3 세포(일본 Showa 대학 약학부 Kudo Ichiro 교수 제공)의 배양상등액을 함유한 50% WEHI-3 조건하 배지(conditioned medium, 10% FCS함유)로 배양하였다.

배양 3주 후 비만세포에 SCF/LPS 혼합자극제(Sigma 사)를 30분처리 처리하였다. 세포 자극 후의 상층액의 LTC₄ 정량은 LTC₄ 분석 키트(Cayman 사)를 이용하여 EIA(Enzyme linked immuno assay)로 측정하였다. 아스틸빅산은 미리 15분간 전처리 한 후 자극제를 가하여 생성되는 LTC₄의 생성량을 측정하였다.

실험결과, 하기 표 1에 추출물 및 분획물들의 각각의 LTC₄생성억제율이 나타나 있으며, 아스틸빅산은 용량 의존적으로 LTC₄의 생성을 저해하였으며, 50% 저해하는데 필요한 농도는 1 ㎍/㎖ 이었다(도 3 참조).

시료	분획	혈소판활성화인자 억제	류코트리엔 생성 억제
시료	최종농도	50㎍/㎖	25㎍/㎖
억제능 (5%)
뿌리	헥산 분획물	26.5	98.4
	에틸아세테이트 분획물	69.7	0
	부탄올 분획물	81.7	0
	물 분획물	20.6	0
	메탄올 분획물	71.1	0
지상부	헥산 분획물	35.6	99.6
	에틸아세테이트 분획물	34.4	97.5
	부탄올 분획물	29.6	0
	물 분획물	0.0	0
	메탄올 분획물	16.9	0
아스틸빅산		73.4	98.3
펠토보이키놀릭산 유도체		50.7	99.5

실험예 3. 동물모델에서의 항 알러지 억제 효과

상기 실시예 아스틸빅산에 대한 생체 (in vivo)의 항알러지 능력을 알기 위하여 실험을 실시하였다. 실험군 당 5마리씩 웅성 스프라그-도올리 랫트 (Splague-Dawley rat, 효창사이언스)를 이용하여 대표적인 Ⅰ형 알러지 모델인 랫트에 대한 수동피부 감작 아나필락시스 (passive cutaenous anaphylaxis)법 [Katayama S, Shionoya H and Ohtake S, Microbiol Immunol 22, pp89-101, (1978)]으로 검정하였다.

스프라그-도올리 랫트에 단일클론 항 DNP 마우스 IgE(Monoclonal anti DNP mouse IgE, Sigma 사, (100㎕, 1000 배 희석한 용액))를 48시간 전에 투여한 후, 항원(DNP, Sigma 사) 투여 30분 전에 아스틸빅산 (ACH53C, CMC에 녹임)을 50 ㎎/㎏/100㎕를 경구로 투여하였다. 이 때 양성대조군으로써 프레드니솔론 (prednisolone, Sigma 사)을 50 ㎎/㎏/100㎕를 경구로 투여하였다. 그 다음 1 mg DNP-BSA(항원용액)/1% 에반스 블루(Evans blue) 용액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 30분 후 피부에 유출된 색소를 측정하여 그 결과를, 도 4에 나타내었다.

하기 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 물질은 생체내의 알러지 모델에서도 유의성있는 항 알러지 작용을 나타내었다.

실험예 4. 급성독성 실험

1. 경구투여

ICR계 마우스와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 노루오줌 추출물을 각각 500, 725, 1000 및 5000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과, 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25 ±5 g)와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 노루오줌 추출물을 각각 25, 250, 500 및 725 ㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과, 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 노루오줌 추출물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

본 발명의 노루오줌 추출물 또는 아스틸빅산 또는 펠토보이키놀릭산은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 주사제제의 제조

아스틸빅산...............................100㎎

소디움 메타비설파이트....................3.0㎎

메틸파라벤...............................0.8㎎

프로필파라벤..............................0.1mg

주사용 멸균증류수..........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 2-1의 노루오줌 건조추출물.......200㎎

유당...................................100㎎

전분...................................100㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

아스틸빅산..........................100㎎

유당.................................50㎎

전분.................................50㎎

탈크.................................2㎎

스테아린산 마그네슘..................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1-1의 노루오줌 건조추출물......1000㎎

설탕..................................20g

이성화당..............................20g

레몬향................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 5. 건강 식품의 제조

실시예 1-1의 노루오줌 건조추출물...........1000 ㎎

비타민 혼합물..............................적량

비타민 A 아세테이트...............70 ㎍

비타민 E..........................1.0 ㎎

비타민 B1.........................0.13 ㎎

비타민 B2.........................0.15 ㎎

비타민 B6.........................0.5 ㎎

비타민 B12........................0.2 ㎍

비타민 C..........................10 ㎎

비오틴............................10 ㎍

니코틴산아미드....................1.7 ㎎

엽산..............................50 ㎍

판토텐산 칼슘.....................0.5 ㎎

무기질 혼합물...............................적량

황산제1철.........................1.75 ㎎

산화아연..........................0.82 ㎎

탄산마그네슘......................25.3 ㎎

제1인산칼륨.......................15 ㎎

제2인산칼슘.......................55 ㎎

구연산칼륨........................90 ㎎

탄산칼슘..........................100 ㎎

염화마그네슘......................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

실시예 1-1의 노루오줌 건조추출물..............1000 ㎎

구연산........................................1000 ㎎

올리고당......................................100 g

매실농축액.....................................2 g

타우린.........................................1 g

정제수를 가하여..............................전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 노루오줌추출물과 이들로부터 정제한 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산을 유효성분으로하는 조성물은 염증, 알러지반응 및 각종 질환에 관련된 혈소판활성화인자 및 류코트리엔 C₄의 생성을 억제함으로써 항염증 및 항알러지 효과를 나타내며, 또한 생체내에서도 유의적으로 항알러지 효과를 나타내어 각종 알러지성 염증 질환에 유의적으로 사용될 수 있다 .

도 1 은 본 발명의 노루오줌 추출물에서 아스틸빅산 및 펠토보이키놀릭산 유도체를 분리하는 전체 과정을 도식한 것이고,

도 2 는 본 발명의 노루오줌 추출물에서 분리한 아스틸빅산의 혈소판 활성화인자의 생합성효소인 리소-PAF 아세틸트랜스퍼라제의 저해활성 실험결과이고,

도 3 은 기관지 천식 및 알러지반응을 일으키는 류코트리엔 C4의 합성에 관여하는 5-리폭시게나제의 저해활성 실험결과이고,

도 4 는 아스틸빅산에 대한 생체 (in vivo)의 항알러지 능력을 알기 위하여 대표적인 Ⅰ형 알러지 모델인 렛트에 대한 수동피부 감작 아나필락시스 (passive cutaenous anaphylaxis) 억제반응 결과도이다.

Claims

노루오줌의 조추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 조추출물은 메탄올 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산 추출물인 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 아스틸빅산 또는 그들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용하는 담체를 포함하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
하기 화학식 2로 표시되는 펠토보이키놀릭산 유도체 화합물 또는 그들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용하는 담체를 포함하는 염증 질환 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1 항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 질환 또는 알러지성 질환은 기관지 천식, 알러지성 비염, 알러지성 천식, 알러지성 피부염인 약학조성물.
제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.01 ~ 50% 포함하는 약학조성물.