KR20050068160A - 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물은 조골세포(osteoblast)를 증식시키고 파골세포(osteoclase)의 증식을 억제하므로, 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.

Description

혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising extract of herbal mixture for prevention or treatment of osteoporosis}
본 발명은 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14~18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이 때 IL-7 (interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수 (bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.
또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1,300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로젠(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있다. 또한 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사 (Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 라록시펜(raloxifene)을 골다공증 치료제로 개발한 바 있다.
한편, 종래 골다공증 치료제는 대부분 에스트로젠 계통의 물질로서, 에스트로젠 계통의 물질은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다. 그러나 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다. 따라서, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로젠을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 필요성이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 여러 가지 생약재를 적절히 조합한 생약 추출물이 조골세포를 증식시키고 파골세포의 증식을 억제하는 활성을 나타내어 부작용 없이 골다공증을 예방하고 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 골다공증의 예방 및 치료에 유용한 약학 조성물 및 건강식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명의 조성물에서 각각의 생약성분이 어떠한 작용을 나타내는지 구체적으로 설명한다.
갈근(葛根; 라틴명 Radix Puerariae, 학명 Pueraria thunbergiana BENTH., 과명 Legminosae)은 신농본초경(神農本草經)에 최초로 기록된 한약재로 감기와 갈증, 소갈(消渴), 발진성 질환, 설사, 고혈압으로 인한 뒷목의 불쾌감 등에 사용한다.
승마(升麻, 라틴명 Rhizoma Cimicifugae, 학명 Cimicifuga heracleifolia Kom., 과명 Ranunculaceae)는 삼엽승마(Cimicifuga heracleifolia Kom.), 눈빛 승마(Cimicifuga dahurica Maxim.) 또는 황새승마(Cimicifuga foetida L.)의 근경을 건조한 것으로 명의별록(名醫別錄)에 최초로 기록된 한약재이며, 명의별록에는 돌림병, 기생충질환, 복통, 유행성 질환, 두통, 종양, 후두(喉頭)통, 구내염에 승마를 사용하며, 승마를 장복하면 오래 살 수 있다고 기록되어 있다. 그밖에 본초강목(本草綱目)에는 반진(斑疹)을 없애주고 어혈(瘀血)을 치료하여 양기(陽氣)가 원활하지 못하여 발생하는 어지러움증, 가슴과 옆구리의 통증, 잦은 설사와 후중, 대하, 자궁출혈, 소변에 피가 섞여 나오는 증상, 성기능 장애와 발이 찬 증상에 사용한다고 하였다. 동의보감(東醫寶鑑)에는 승마의 작용에 대하여 원기가 부족한 때에 사용하면 양기를 북돋아 주는 작용을 한다고 하였다. 승마의 사용부위는 지하경이고 대한약전, 중국약전에 수재되어 있다.
본 발명의 조성물에서 생약성분의 조성비율은 각각의 건조중량을 기준으로 하며, 갈근과 승마의 비율을 5:1 ~ 1:5로 배합하여 사용하며, 바람직하게는 갈근과 승마의 비율을 5:1 ~ 2:1로 배합하여 사용한다. 이와 같은 조성비는 각각의 생약성분이 갖는 유효용량과 부작용 등을 고려하여 찾아낸 것이며, 그 비율의 범위를 벗어나는 경우에는 효과가 급격히 떨어지거나 부작용의 우려가 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 혼합 생약재는 물 또는 알콜로 추출하여 사용한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 혼합 생약재의 추출방법은 다음과 같다.
갈근과 승마를 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 중량비로 하여 섞은 후, 이들 혼합 생약재의 분말을 70% 에탄올 수용액에 넣고 실온에서 2일 동안 교반한 후, 상기 용액을 거름종이로 여과한다. 이 과정을 3회 반복한다. 여과액은 감압 농축하여 에탄올을 제거한 뒤 동결 건조하여 수분을 제거하여 혼합 생약재 추출물을 얻는다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물은 Saos-2 세포와 같은 조골세포(osteoblast)에 대하여 우수한 증식 효과가 있다. 또한, 조골세포는 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타내므로, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 조골세포에 대하여 우수한 ALP 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 농도가 증가할수록 파골세포 (osteoclase)의 증식을 효과적으로 억제한다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 폐경기 이후 타입 I(type I) 골다공증이 일어나는 SD(Sprague-Dawley)계 암컷 흰쥐의 난소 적출 상태에서는 주령의 증가에 따라 체중을 급격히 증가시키며, 난소적출 후 주령 증가에 따른 체중의 증가에는 아무런 영향을 미치지 않는다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 각 군의 실험동물에서 자궁을 제외한 모든 조직들의 무게에 별다른 차이를 나타내지 않아, 아무런 영향을 미치지 않는다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 각 군의 실험동물에서 조직 간에 병리학적인 차이는 관찰되지 않았으므로 시험 약물의 투여로 인한 생체 내 독성은 없는 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 소주골 면적을 크게 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 골다공증의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 혼합 생약재 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 혼합 생약재 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 혼합 생약재 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
혼합 생약재 추출물의 유효용량은 10 내지 1,000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 30 내지 3,000 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다.
본 발명의 조성물은 골다공증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 골다공증에 기인하는 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혼합 생약재 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 혼합 생약재 추출물이 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 혼합 생약재 추출물의 제조
갈근과 승마를 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 중량비로 하여 섞은 후, 이들 혼합 생약재의 분말 1.5 ㎏을 70% 에탄올 수용액 3ℓ에 넣고 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 2일 후 상기 용액을 거름종이로 여과한 후, 이 과정을 3회 반복하였다. 여과액은 감압 농축하여 에탄올을 제거한 뒤 동결 건조하여 수분을 제거하여 혼합 생약재 추출물을 얻었다.
비교예 : 생약재 추출물의 제조
혼합 생약재 대신 갈근 또는 승마를 사용하여 상기 실시예와 동일한 방법으로 추출하여 추출물을 얻었다.
실험예 1 : 조골세포 증식 분석
본 발명의 혼합 생약재 추출물이 조골세포(osteoblast)의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1-1. 조골세포의 선별 및 세포 배양
뼈의 구성 성분인 조골세포와 유사한 성질을 나타내는 Saos-2 세포주를 서울대학교 의과대학 암 연구소의 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다.
Saos-2 세포는 10% FBS, 페니실린 100 unit/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖를 포함하는 RPMI 1640배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 습식 조건에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 1주일에 2~3회 교환하였고, 1주일에 1회 계대배양하였다.
1-2. 추출물의 농도에 따른 세포 증식 실험 : MTT 실험
상기 1-1에서 배양한 Saos-2 세포주를 96-웰 플레이트에 접종하고, 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 건조약재해당 2 ~ 2×10-7 ㎎/㎖의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가하였다.
대조군으로는 혼합 생약재 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였고, Saos-2 세포주에서의 비교군으로서는 현재 골다공증 치료제로 주로 사용되고 있는 NaF, 17β-에스트라디올(이하, "E2"라 약칭한다) 및 1,25(OH)2D3 등을 사용하였다.
상기에서 세포주를 37℃ 배양기에서 3일간 배양하고, 여기에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Triazolyl Blue)를 0.05㎎/㎖ 농도로 가하여 같은 조건에서 4시간 더 배양하였다. 생성된 포르마잔 (formazan) 결정을 DMSO로 용해시켜 엘리자 판독기(ELISA reader)로 550㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
세포 증식율(%)은 혼합 생약재 추출물을 첨가하지 않은 대조군 웰의 흡광도에 대한 혼합 생약재 추출물 첨가 웰의 흡광도의 비(%)로서 계산하였다.
결과는 표 1에 나타내었다.
농도(㎎/㎖) 1×10-7 1×10-6 1×10-5 1×10-4 1×10-3
NaF 94.54 85.00 87.22 108.64 137.93
E2 98.69 108.07 112.31 113.98 116.57
1,25(OH)2D3 117.14 126.83 136.50 116.91 85.88
농도(㎎/㎖) 2×10-7 2×10-6 2×10-5 2×10-4 2×10-3 2×10-2 2×10-1 2×100
승마 추출물 101.06 101.38 98.53 96.29 99.68 99.45 111.07 25.39
갈근 추출물 90.18 115.03 94.48 97.55 88.96 106.44 98.16 142.63
갈근+승마(5:1) 102.75 104.27 94.37 13.51 102.78 95.70 101.82 84.68
갈근+승마(4:1) 97.11 109.56 95.70 100.79 98.87 92.18 93.83 76.24
갈근+승마(3:1) 85.08 92.27 92.55 93.05 92.89 90.43 94.56 76.61
갈근+승마(2:1) 92.66 91.39 94.46 101.54 106.10 102.47 101.51 72.17
갈근+승마(1:1) 98.07 103.32 98.91 99.09 104.95 107.73 101.66 17.66
갈근+승마(1:2) 16.75 113.17 107.90 108.52 113.76 109.60 111.51 17.14
갈근+승마(1:3) 90.70 100.45 98.53 95.83 94.69 95.00 96.36 10.43
갈근+승마(1:4) 91.55 97.84 96.59 97.40 96.71 95.62 99.88 7.26
갈근+승마(1:5) 100.17 105.59 105.30 100.07 103.53 96.44 102.13 9.74
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 갈근과 승마의 비율이 5:1 ~ 1:5 까지 세포증식 효과는 없었으나, 1:1 ~ 1:5 까지 승마의 비율이 증가함에 따라 고농도에서 대조군의 20% 이하로 세포독성을 유발하는 것으로 나타났으며, 이러한 독성은 승마에 기인하는 것으로 사료된다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 갈근:승마가 5:1 ~ 2:1로 혼합되었을때 Saos-2 세포와 같은 조골세포 유사 세포에 대하여 우수한 증식률을 나타내었고, 종래 골다공증 치료제로 사용되고 있는 NaF, E2 및 1,25(OH)2D3와 유사하였다.
1-3. ALP(alkaline phosphatase) 활성 검색
조골세포는 ALP 활성을 나타내므로, 본 발명의 혼합 생약재 추출물이 조골세포에서 ALP 활성에 미치는 영향을 하기와 같은 방법에 의해 알아보았다.
MTT 실험에서와 동일한 세포수의 Saos-2 세포주에 시험 물질을 동일한 농도로 처리하고 동일한 조건에서 3일간 배양 후 수확하였다.
비교군으로는 NaF, E2 및 1,25(OH)2D3 등을 사용하였다.
한편, ALP가 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀(p-nitrophenol)과 포스페이트(phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405㎚에서의 흡광도의 변화를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다.
결과는 표 2에 나타내었다.
농도(㎎/㎖) 1×10-7 1×10-6 1×10-5 1×10-4 1×10-3
NaF 94.81 94.56 93.02 87.17 87.05
E2 96.18 100.92 98.71 90.85 91.03
1,25(OH)2D3 192.15 93.92 99.51 182.73 167.46
농도(㎎/㎖) 2×10-7 2×10-6 2×10-5 2×10-4 2×10-3 2×10-2 2×10-1 2×100
승마 추출물 92.40 86.76 79.65 127.04 83.53 93.65 90.18 42.64
갈근 추출물 106.08 106.13 103.75 100.50 102.54 104.85 118.96 157.63
갈근+승마(5:1) 91.82 109.89 91.29 96.63 90.75 90.54 115.73 90.24
갈근+승마(4:1) 108.57 96.94 103.95 105.05 97.58 121.35 101.03 86.09
갈근+승마(3:1) 83.64 87.52 92.02 103.30 87.32 78.47 86.78 85.95
갈근+승마(2:1) 97.67 100.29 104.65 114.18 104.53 102.93 121.98 85.87
갈근+승마(1:1) 81.82 84.48 96.50 83.91 83.13 89.12 92.28 48.81
갈근+승마(1:2) 108.28 116.67 104.66 118.26 105.92 102.78 129.99 70.73
갈근+승마(1:3) 94.05 104.85 109.63 101.64 85.03 106.37 112.87 60.99
갈근+승마(1:4) 94.11 106.50 103.42 103.44 116.52 104.64 105.81 62.40
갈근+승마(1:5) 89.23 98.28 89.81 81.90 68.12 89.78 87.11 40.00
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 갈근과 승마의 비율이 4:1, 2:1, 1:2 일때 ALP 활성이 대조군에 비해 120% 이상 증가하였다 (p<0.05). 또한, 승마의 비율이 15% 이상이면 (갈근:승마 = 1:5) ALP 활성도는 감소하는 것으로 나타났다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물은 갈근과 승마의 비율이 1:2, 1:4 일때 Saos-2 세포에 대하여 우수한 ALP 활성을 나타내었으나, 갈근과 승마의 비율이 4:1, 2:1 일때 Saos-2 세포에 대하여 세포독성 없이 우수한 ALP 활성을 나타내었다.
또한, 종래 골다공증 치료제로 사용되고 있는 NaF와 E2에 비하여 조골세포의 활성을 나타내는 ALP 활성이 더 우수하였다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 조골세포의 세포의 활성을 증가시켜 골의 생성을 촉진시킬 수 있으므로, 골다공증 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 2 : 파골세포(osteoclast)의 세포증식 억제 실험
본 발명의 혼합 생약재 추출물이 파골세포(osteoclase)의 증식 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 골수세포(mouse bone marrow cell)와 ST-2 세포(ST-2 cell)를 공동 배양하여 파골세포를 얻어 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 골수세포와 ST-2 세포의 공동 배양
2-1-1. 골수세포의 배양
ICR 마우스(대한실험동물, 충북, 음성)의 대퇴골(femur)과 경골(bitia) 주위의 근육 조직을 깨끗이 떼어 내고 대퇴골과 경골을 분리하였다.
이것을 클린벤치(clean bench)로 옮기고, 미리 얼음에 넣어 두었던 10% FBS, 페니실린 100 unit/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 포함하는 α-MEM(α-minimum essential medium, Gibco BRL, 미국) 배지에 대퇴골과 경골을 각각 넣었다. 대퇴골과 경골의 끝을 자르고 골수(bone marrow)가 완전히 빠질 때까지 배지로 씻어 내렸다. 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻고, 이것을 상기 배양 배지에 재부유시켜 배양 플라스크에 분주한 후, 습식 조건인 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 점착되지 않은 세포들을 수집하여 프로나제(pronase) 용액에 재부유시켜 37℃에서 반응시켰다. 원심분리한 후, 침전된 세포를 상기 배양 배지에 부유시켜 ST-2 세포와의 공동 배양에 사용하였다.
2-1-2. ST-2 세포의 배양
ST-2 세포는 RIKEN 세포 은행(Tsukuba, 일본)에서 분양 받아 사용하였다.
10% FBS, 페니실린 100 unit/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여, 습식 조건인 37℃, 5% CO2 배양기를 이용하여 ST-2 세포를 배양하였다. 배지는 1주일에 2~3회 교환하였고, 1주일에 1회 계대배양하였다. ST-2 세포는 배양 플라크에 단일층을 형성하며 자라는 특성이 있기 때문에, 계대배양시에는 0.25% 트립신 용액으로 단일층을 벗겨 내었다.
2-1-3. 골수 세포와 ST-2 세포의 공동 배양
ST-2 세포를 트립신으로 처리하여 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지에 부유시켰다. 24-웰 플레이트에 상기 ST-2 세포 부유액을 5 ×104 세포수/㎠ 씩 가하여 24시간 동안 배양하였다. 점착하지 않는 골수 세포를 5 ×105 세포수/㎠ 씩 ST-2 세포가 들어 있는 24-웰 플레이트에 첨가하였다.
공동 배양 배지로는 10% FBS, 10-8M 1,25(OH)2D3, 10-7M 덱사메타손 (dexamethasone)을 포함하는 σ-MEM의 배지를 사용하였다. 배지는 1주일에 2회 교환하였다.
2-2. 파골세포(osteoclast)의 세포증식 억제 실험
골수 세포와 ST-2 세포를 공동 배양한 지 7일 째에, 상기 실시예에서 제조한 혼합 생약 추출물, 상기 비교예에서 제조한 갈근 추출물 및 승마 추출물을 첨가하여 2일간 처리한 후 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 염색하여 다핵 세포(multinucleated cell)의 수를 세어 측정하였다.
염색은 시판되는 킷트(Sigma사, 미국)를 사용하였으며, 3개 이상의 핵을 갖는 TRAP-양성 세포(TRAP-positive MNC)를 파골세포로 측정하여 대조군 세포에 대한 %로 나타내었다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 농도가 증가할수록 파골세포의 세포증식을 억제하였다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 농도에 비례하여 파골세포의 세포증식을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
실험예 3 : 골다공증 모델의 동물 실험난소 적출 흰쥐에 대한 동물 실험
본 발명자들은 골다공증에 대한 동물 실험을 하기 위하여, 폐경기 이후 타입 I(type I) 골다공증이 일어나는 SD(Sprague-Dawley)계 흰쥐의 암컷을 대상으로 하여 난소적출 실험을 수행하였다.
3-1. 난소 적출술 및 약물 투여
실험 재료로는 생후 10주된 체중 200~300g 정도의 암컷 흰쥐(Sprague Dawley rat)를 사용하였다. 난소 적출술은 샴(sham)군(정상군)을 제외하고 대조군과 시험군의 모든 흰쥐 암컷에서 양측 난소 적출술을 시행하였다.
케타민(ketamine; 유한양행, 대한민국) 5㎎/100g과 자일라진(xylazine; 한국바이엘, 대한민국) 1㎎/100g을 흰쥐의 좌측 및 우측 후지 대퇴근에 근육 주사하여 흰쥐 암컷을 전신 마취시켰다. 정중선(백선)을 중심으로 하복부를 절개하고, 좌우 난소를 적출하였다. 항생제(썰파포르테-4, 유니화학 주식회사) 0.3㎖을 복강 내에 주입하여 감염을 방지하였으며, 견사 및 나일론사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다.
샴군은 난소 적출을 제외한 모든 수술을 행한 동물들로, 난소를 적출하고 약물 투여를 하지 않은 대조군에 대한 비교군으로 난소 적출로 인한 변화를 대조군과 비교하기 위하여 존재한다. 반면에 대조군은 난소 적출술을 행하고 약물 투여를 실시한 투여군들의 동물들과 비교하여 약물 투여에 기인하는 변화를 비교하기 위한 것이다.
난소를 적출하고 나서 1주 후부터 샴군과 대조군은 음용수를 경구투여하였고, E2군은 17β-에스트라디올을 1㎍/㎏/day로 복강주사하였다.
또한, 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 5g/kg/day 또는 1g/kg/day, 승마 추출물을 5g/kg/day, 갈근 추출물을 1g/kg/day을 9주간 경구투여 하였다.
3-2. 약물투여에 의한 체중 및 조직무게의 변화 측정
상기 방법에 의해 난소가 적출된 후 약물이 투여된 실험동물의 체중을 매주 측정하고 일정기간 투여 후 조직무게를 측정하여 난소 적출을 제외한 모든 수술을 행한 샴군 및 난소를 적출하여 약물 투여를 하지 않은 대조군의 체중 및 조직무게를 본페로니 다중 비교법(boneferroni multiple comparison method)으로 비교하였다.
동물의 체중변화는 도 2에 나타내었으며, 조직무게는 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 샴군과 비교하여 급격한 체중의 증가를 나타내었으며, 갈근 5g/kg/day의 투여군과 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 5g/kg/day의 투여군은 샴군과 유사한 체중 증가를 나타내었다.
갈근 1g/kg/day의 투여군과 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 1g/kg/day의 투여군은 E2군과 유사한 체중의 증가를 나타내었다.
승마 5g/kg/day 투여군은 대조군과 유사한 체중의 증가를 나타내었다.
또한 도 3에 나타난 바와 같이, 자궁의 무게는 정상군(샴군)에 비해 대조군에서 급격히 감소하였고, E2의 투여군은 정상군의 1/2 수준 이상으로 회복되었다. 갈근 5g/kg/day의 투여군과 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 5g/kg/day의 투여군은 대조군에 비해 자궁의 무게가 증가하였으나, 갈근 1g/kg/day의 투여군과 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 1g/kg/day의 투여군 및 승마 5g/kg/day 투여군은 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 체중 및 자궁의 무게에 변화를 주지 않아 안전한 것으로 판단된다.
3-3. 병리조직학적 관찰
채취한 요추골 및 경골 조직을 10% 포르말린 용액에 고정한 후 포름산 내에서 탈회를 실시하였다. 골조직의 관찰 부위를 수술칼로 절단한 뒤 70~100% 알콜과 아세톤에 이르는 단계별 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 청명하고 파라핀 포매를 실시하였다. 파라핀 포매된 골조직을 마이크로톰으로 5㎛로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(hematoxyline & eosin, H&E) 염색을 실시하고, 광학 현미경으로 관찰하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 각 군의 골조직 간에 병리학적인 차이는 관찰되지 않았으므로 시험 약물의 투여로 인한 생체 내 독성은 없는 것으로 판단되었다.
또한, 각 군의 골조직의 소주골 증감을 나타내는 경골 골조직 단면사진을 보면 대조군에 비해 혼합 생약재 추출물의 투여군에는 소주골이 많이 존재함을 확인할 수 있다.
3-4. 소주골 면적의 형태계측학적 분석
각 군의 요추골 및 경골에서 하기와 같은 방법에 의해 형태계측학적 분석을 실시하였다.
정량적 영상 분석기(Quantitative image analysis system, Wild Leitz Co.)의 디지털화 장치(digitizer)를 이용하여 요추골 및 경골부에서 각 소주의 면적을 자동적으로 계산하고 이것으로 소주골(trabecula)의 면적을 구하였다. 각 경골의 근위부에서 성장판의 직하부의 부분 중 가로변의 길이가 성장판 길이의 약 2/3정도 되는 길이로 기준 면적 2 ×106 ㎛2인 직사각형의 내부에 있는 소주골의 면적을 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 난소 적출한 대조군은 정상군(Sham군)에 비해 소주골의 면적이 45%로 감소되어 골다공증이 유발되었음을 알 수 있다. 난소 적출로 인한 소주골 면적은 E2나 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 투여로 인해 증가되었다 (P<0.05). 승마의 5g/kg/day 투여군은 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다. 특히 갈근 5g/kg/day 또는 1g/kg/day 투여군보다 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 5g/kg/day 또는 1g/kg/day 투여군의 소주골 면적이 크게 증가되었다.
이는 갈근의 단독 투여보다는 갈근과 승마의 혼합약재 투여가 더 효과적인 것으로 갈근과 승마의 혼합으로 상승작용이 나타난 것으로 사료된다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 골다공증의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
실험예 4 : 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
본 발명의 혼합 생약재 추출물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.
실험동물로 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 혼합 생약재 추출물은 모두 랫트에서 10g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량(LD50)은 추출물 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
혼합 생약재 추출물 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
혼합 생약재 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
혼합 생약재 추출물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 2 : 식품의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 20 ~ 95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 0.5 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 0.1 ~ 5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 5 ~ 10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
7. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 혼합 생약재 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),
종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),
혼합 생약재 추출물의 건조분말(3 중량%),
영지(0.5중량%),
지황(0.5중량%)
제제예 3 : 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
2. 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 혼합 생약재 추출물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
3. 야채쥬스의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
4. 과일쥬스의 제조
본 발명의 혼합 생약재 추출물 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
본 발명의 혼합 생약재 추출물은 조골세포(osteoblast)를 증식시키고 파골세포(osteoclase)의 증식을 억제하므로, 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 혼합 생약재 추출물의 농도에 따른 파골세포의 세포증식 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 투여한 흰쥐의 체중변화를 본페로니 다중 비교법으로 비교한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 투여한 흰쥐의 자궁 무게를 본페로니 다중 비교법으로 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 투여한 각 투여군의 경골 골조직을 광학 현미경으로 관찰한 도이다.
도 5는 본 발명의 혼합 생약재 추출물을 투여한 골조직의 소주골 면적을 나타낸 도이다.

Claims (4)

  1. 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 갈근과 승마는 5:1 ~ 2:1의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
  3. 갈근과 승마의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 갈근과 승마는 5:1 ~ 2:1의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품 조성물.
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