KR20050061592A - 플라비비리대 바이러스 감염 치료용 조성물 - Google Patents

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베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물에게 투여함을 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물의 치료를 위한 조성물, 용도, 제품 및 방법이 제공된다.
화학식 I
상기 화학식 I에서,
A는 C1 내지 C6 알킬 및 C3 내지 C6 사이클로알킬로부터 선택되고;
B는 NH(R1) 및 NH(CO)R1[여기서, R1은 C1 내지 C6 알킬이다]로부터 선택된 그룹에 의해 임의로 치환된 페닐 및 티아졸릴로부터 선택되고;
R은 OH 또는 설폰아미드 유도체이다.

Description

플라비비리대 바이러스 감염 치료용 조성물{Composition for the treatment of infection by Flaviviridae viruses}
본 발명은 포유동물에서 플라비비리대(Flaviviridae) 바이러스 감염의 치료를 위한 화합물, 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 거대환 펩타이드 화합물 부류로부터 선택된 화합물을 투여함을 포함하는 용도 및 방법에 관한 것이다.
플라비비리대 과의 바이러스는 C형 간염 바이러스를 포함하는 헤파시바이러스(hepacivirus) 속의 바이러스, 뎅기열 바이러스(Dengue Fever virus), 뇌염 바이러스(encephalitis viruse), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus) 및 황열 바이러스(Yellow Fever virus)를 포함하는 플라비바이러스(flavivirus) 속의 바이러스, 및 둘다 동물 병원체인 소 바이러스성 설사 바이러스 및 보더병 바이러스를 포함하는 페스티바이러스(pestivirus)와 같은 다수의 사람 병원성 바이러스를 포함하는 외피 포지티브-쇄 RNA 바이러스이다. 가장 최근에 발견된 바이러스인 G형 간염 바이러스(HGV) 및 GB형 간염 바이러스(GBV-A, B, C)도 별개의 속에 속하는 플라비비리대 과의 일원인 것으로 잠정적으로 고려된다.
플라비비리대 과의 일원인 뎅기 바이러스는 모기에 의해 전염된다. 만연된 사람 질환을 유발하는 4가지 혈청형이 있는데, 이중 하나는 뎅기 출혈열이며, 세계의 열대 및 아열대 지역에 거주하는 집단의 약 40%가 감염 위험에 쳐해있다. 현재로서는 뎅기 질환으로부터 보호하기 위한 효과적인 백신이나 항바이러스 약물이 없다.
소 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus; BVDV), 전형적 돼지 열 바이러스(classical swine fever virus; CSFV) 및 보더병 바이러스(BDV)와 같은 페스티바이러스는 소, 돼지 및 양에 감염되는 경제적으로 중요한 동물 병원체의 그룹을 포함한다. 이러한 포지티브-센스 RNA 바이러스는 플라비비리대 과에서 개별적 속으로서 분류된다.
GB-바이러스는 플라비비리대 과의 일원으로서 분류되어 왔지만, 게놈 서열의 분석에 기초하여 아직 특정 속으로 배정되지 않았다. 사람을 감염시키는 것 이외에, 이들 RNA 바이러스는 실험적으로 감염된 타마린에서 급성 분해성 간염을 유발할 수 있다.
플라비비리대 과의 바이러스는 이의 일원 간에 전체 서열 상동성이 비교적 낮음에도 불구하고 수많은 유사성을 지니고 있다. 이들 바이러스의 게놈은 개방 판독 프레임(open reading frame; ORF)을 갖는 소형 일본쇄 RNA(~ 10킬로베이스의 길이)이다. ORF는 이의 5' 말단에 구조 단백질을 함유하며 이의 3' 말단에 비구조(NS) 단백질을 함유하는 약 3000개 아미노산의 폴리단백질을 암호화한다. 폴리단백질은 바이러스-암호화된 프로테아제 및 숙주-암호화된 프로테아제 둘다에 의해 성숙한 폴리단백질로 단백질분해적으로 프로세싱되며, 이러한 성숙한 폴리단백질은 HCV의 경우에 다음과 같다: NH2-{C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B}-COOH. 코어 단백질 또는 뉴클레오캡시드(C) 및 2개의 외피 당단백질(E1 및 E2)이 비리온의 대표적 구성적 구조 단백질이다. 이러한 구조 단백질은 적어도 일부가 바이러스의 RNA 복제에 필수적인 것으로 사료되는 비구조(NS) 단백질 다음에 존재한다.
효소적 활성은 이러한 NS 단백질 중 몇가지에 기인하는 것으로 사료되어 왔다. 특히, NS3 단백질은 페스티바이러스와 플라비바이러스의 세린 프로테아제 및 뉴클레오시드 트리포스페이트-결합 헬리카제와 유사한 서열을 함유한다. 서열 정렬 분석으로 플라비바이러스, 페스티바이러스, 헤파시바이러스 및 GB-바이러스의 N-말단 영역내에 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인이 존재하는 것으로 예측되었다. 플라비비리대 바이러스의 NS3 단백질분해 도메인들 간의 서열 유사성은 익히 정리되어 있다[참조: Ryan MD et al. 1998]. HCV NS3 프로테아제 도메인은 HCV 유전형 간에 약 77 내지 90%의 서열 유사성 및 플리비비리대 과의 다른 일원과 약 25 내지 50%의 서열 유사성을 공유한다. 3차원 구조와 관련하여, 입수가능한 다양한 결정화된 HCV 및 뎅기 NS3 프로테아제의 원자좌표는 트립신-유사 폴드의 특징적인 전체 구조를 보여준다[참조: Kim et al. 1996, Love et al. 1996; Murthy et al. 1999]. 많은 연구들은 현재 NS3 영역의 N-말단 부분이 플리비비리대에서의 바이러스 폴리단백질 프로세싱에서 매우 특이적이고 중심적인 역할을 하는 세린 프로테아제를 암호화함을 확고히 입증하고 있다. 헤파시바이러스, 페스티바이러스 및 GB 바이러스에서, 폴리단백질 프로세싱은 하부 NS4A 단백질에 대한 요건을 보여준다. NS4A 단백질은 NS3 프로테아제 분해 효능을 증진시키는 보조인자로서 작용한다[참조: Lin et al., 1995; Kim et al., 1996; Steinkuler et al., 1996]. 플라비바이러스에서, 이러한 NS3 프로테아제 활성의 증진을 위한 요건은 상부 NS2B 단백질에 의해 제공된다. GBV-B 및 HCV의 게놈 구성 및 구조는 GBV-B 및 HCV의 폴리단백질 서열 간에 서열 상동성이 약 25 내지 30%라는 사실에도 불구하고 유사하다.
플라비비리대 과의 바이러스 내의 바이러스의 명백한 유사성을 고려하면, 플라비비리대 바이러스에 대해 효과적인, 보다 특히 플라비비리대 과의 병원성 일원에 대해 효과적인 치료제를 개발하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 제1 측면에서, 하기 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항-플라비비리대 바이러스 조성물이 제공된다.
상기 화학식 I에서,
A는 C1 내지 C6 알킬 및 C3 내지 C6 사이클로알킬로부터 선택되고;
B는 NH(R1) 및 NH(CO)R1[여기서, R1은 C1 내지 C6 알킬이다]로부터 선택된 그룹에 의해 임의로 치환된 페닐 및 티아졸릴로부터 선택되고;
R은 OH 또는 설폰아미드 유도체이다.
제2 측면에서, 본 발명은 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물에게 상기 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료학적 유효량과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 동물의 치료방법을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물에게 상기 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물의 치료학적 유효량과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 항바이러스제, 면역조절제, HCV 억제제, HIV 억제제, HAV 억제제 및 HBV 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 추가 제제를 공동 투여함을 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 동물의 치료방법을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 화학식 I의 화합물과, 항바이러스제, 면역조절제, HCV 억제제, HIV 억제제, HAV 억제제 및 HBV 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 추가 제제와 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스에 의해 유발되는 포유동물의 감염 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5 측면에서, 플라비비리대 바이러스 감염 치료용 의약을 제조하기 위한 상기 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제6 측면에서, 플라비비리대 과의 바이러스를 억제하기에 유효한, 상기 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 포장재를 포함하는 제품이 제공되며, 당해 포장재는 당해 조성물이 플라비비리대 과의 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있음을 지시하는 표지를 포함한다.
임의의 특정한 작용 방식으로 국한됨에 없이, 일반적으로 상기 제시한 화학식 I로 표현되는 거대환 펩타이드 화합물 부류는 NS3 프로테아제 도메인내의 보존된 기질 결합 부위에서 상호작용하는 것으로 사료된다. 결정 구조 연구는, 본 거대환 화합물이 플라비비리대 바이러스 간에 기능면에서 보존된 영역인 HCV NS3 도메인내의 기질-결합 부위에서 상호작용함을 확인시킨다.
본 발명의 다른 목적, 잇점 및 특징은 첨부한 도면과 표를 참조로 하여 다음의 바람직한 양태의 비제한적 설명의 판독시 보다 명백해질 것이다.
표의 간단한 설명
표 4 내지 8은 플라비비리대 과의 일원 간의 서열 유사성 비교를 제공한다.
도 1은 플라비비리대 과에 속하는 바이러스의 폴리단백질의 비교를 제공한다(문헌[Ryan et al., 1998, J. Gen. Virology 79, 947-959]으로부터 발췌).
도 2는 HCV 유전형과 아형 간의 NS3 프로테아제 도메인의 서열을 비교한 것이다.
도 3A 및 도 3B는 각각 HCV 유전형 1a 및 1b의 NS3-NS4A 프로테아제에 대한화학식 I에 따른 거대환 펩타이드 화합물의 IC50 곡선이다.
도 4A 및 4B는 HCV 유전형 1a NS3-NS4A 프로테아제에 대한 도 3의 거대환 펩타이드의 딕손(Dixon) 및 코니쉬-보우덴(Cornish-Bowden) 플롯이다.
도 5A 및 5B는 HCV 유전형 1b NS3-NS4A 프로테아제에 대한 도 3의 거대환 펩타이드의 딕손 및 코니쉬-보우덴 플롯이다.
도 6은 배양물 중의 타마린 간세포에서 화학식 I에 따른 거대환 펩타이드에 의한 GBV-B 복제의 억제를 예시한 것이다.
도 7은 도 6의 화학식 III의 거대환 펩타이드에 의한 GBV-B 복제의 용량-의존적 억제를 그래프로 예시한 것이다.
도 8은 화학식 I에 따른 거대환 펩타이드와 복합체화된 HCV NS3-NS4A 펩타이드 구조의 3차원 결정 구조를 예시한 것이다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어와 명명법은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 세포 배양, 감염, 분자생물학 방법 등에 대한 과정은 당해 분야에서 사용되는 통상적 방법이다. 이러한 표준 기법은 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1994)]과 같은 참조 안내서에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 바이러스 과를 명명하기 위해 사용되는 "플라비비리대"란 용어는 C형 간염 바이러스와 같은 헤파시바이러스 속의 바이러스, 뎅기열 바이러스, 뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스 및 황열 바이러스와 같은 플라비바이러스 속의 바이러스, 및 소 바이러스성 설사 바이러스 및 보더병 바이러스와 같은 페스티바이러스 속의 바이러스를 포괄하여 의미한다. G형 간염 바이러스(HGV) 및 GB형 간염 바이러스도 이러한 바이러스 과에 포함되나, 이들 바이러스의 속은 아직 결정되지 않았다. 게다가, 예를 들어, HCV 1a, HCV 1b, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 및 HCV 6a, h, d 및 k 뿐만 아니라 GBV-A, B 및 C를 포함하여 상기 언급한 바이러스의 모든 아형 및 유전형도 플라비비리대 과내에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "포유동물"이란 용어는 사람 뿐만 아니라, 소, 돼지, 말, 개와 고양이 및 양과 같은 사육 동물을 포함하여 플라비비리대 바이러스 감염에 민감성인 비-사람 동물을 포괄하여 의미한다.
플라비비리대 감염의 치료시 투여되는 화학식 I의 화합물과 관련하여, 본원에서 사용되는 "C1-6 알킬" 또는 "C1-C6"은 단독으로 또는 다른 치환체와 함께, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 어사이클릭 직쇄 또는 측쇄 알킬 라디칼을 의미하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 헥실, 1-메틸에틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "C3-6 사이클로알킬"은 단독으로 또는 다른 라디칼과 함께, 3 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 사이클로알킬 치환체를 의미하며, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"이란 용어는 합리적 의학적 판단의 범주에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 적당한 이익/위험 비와 상응하고 일반적으로 또는 수용성 또는 지용성 또는 분산성이고 의도한 용도에 효과적인, 화학식 I의 화합물의 염을 의미한다. 상기 용어에는 약제학적으로 허용되는 산 부가 염 및 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염이 포함된다. 적합한 염의 목록은 예를 들어, 문헌[참조: S.M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19; 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다]에서 찾아볼 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 산 부가염"이란 용어는 유리 염기의 생물학적 효능 및 특성을 보유하며, 무기산(예: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 설팜산, 질산, 인산 등), 및 유기산(예: 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 부티르산, 캠퍼산, 캠퍼설폰산, 신남산, 시트르산, 디글루콘산, 에탄설폰산, 글루탐산, 글리콜산, 글리세로인산, 헤미설프산, 헵탄산, 헥산산, 포름산, 푸마르산, 2-하이드록시에탄설폰산(이세티온산), 락트산, 말레산, 하이드록시말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메시틸렌설폰산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 니코틴산, 2-나프탈렌설폰산, 옥살산, 파모산, 펙틴산, 페닐아세트산, 3-페닐프로피온산, 피발산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 설파닐산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 운데칸산 등)을 사용하여 형성된, 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직한 염을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는 염기 부가염"이란 용어는 유리 산의 생물학적 효능 및 특성을 보유하며, 무기 염기(예: 암모니아 또는 암모늄의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염) 또는 금속 양이온(예: 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등)을 사용하여 형성된, 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직한 염을 의미한다. 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘염이 특히 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 유기 무독성 염기로부터 유도된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 4차 아민 화합물, 천연의 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지의 염, 예를 들어 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트로메타민, 이소프로필아민, 트리프로필아민, 트리부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 테트라메틸암모늄 화합물, 테트라에틸암모늄 화합물, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르필린, 디사이클로헥실아민, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 특히 바람직한 유기 무독성 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
본원에서 사용되는 "설폰아미드 유도체"는 화학식 -NHSO2-R2[여기서, R2는 할로, 시아노, 니트로, O-(C1-6)알킬, 아미도, 아미노 또는 페닐에 의해 모두 임의로 1 내지 3회 치환된 -(C1-8)알킬, -(C3-7)사이클로알킬 또는 {-(C1-6)알킬-(C3-6)사이클로알킬}이거나, R2는 할로, 시아노, 니트로, (C1-6)알킬, O-(C1-6)알킬, 아미도, 아미노 또는 페닐에 의해 모두 임의로 1 내지 3회 치환된 C6 또는 C10 아릴이다]의 설폰아미드 그룹을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항바이러스제"란 용어는 포유동물에서 바이러스의 형성 및/또는 복제를 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 포유동물에서 바이러스의 형성 및/또는 복제에 필수적인 숙주 또는 바이러스 기작을 방해하는 제제를 포함한다. 항바이러스제에는 예를 들어, 리바비린, 아만타딘, VX-497(메리메포딥, 제조원: Vertex Pharmaceuticals), VX-498(제조원: Vertex Pharmacerticals), 레보비린, 비라미딘, 세플렌(맥사민), XTL-001 및 XTL-002(제조원: XTL Biopharmaceuticals)이 포함된다.
본원에서 사용되는 "면역조절제"란 용어는 포유동물에서 면역계 반응을 증진시키거나 상승시키는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 면역조절제에는 예를 들어, I형 인터페론(예: α-, β- 및 오메가 인터페론, tau-인터페론, 컨센서스 인터페론 및 아시알로-인터페론), II형 인터페론(예: γ-인터페론) 및 페길화된(pegylated) 인터페론이 포함된다.
본원에서 사용되는 "HCV NS3 프로테아제의 억제제"란 용어는 포유동물에서 HCV NS3 프로테아제의 작용을 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. HCV NS3 프로테아제의 억제제에는 예를 들어, 제WO 99/07733호, 제WO 99/07734호, 제WO 00/09558호, 제WO 00/09543호, 제WO 00/59929호, 제WO 03/064416호; 제WO 03/064455호; 제WO 03/064456호에 기술된 화합물 및 VX-950로 확인된 Vertex 개발전 후보 물질이 포함된다.
본원에서 사용되는 "HCV 억제제"란 용어는 포유동물에서 HCV의 형성 및/또는 복제를 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 포유동물에서 HCV의 형성 및/또는 복제에 필수적인 숙주 또는 바이러스 기작을 방해하는 제제를 포함한다. HCV 억제제에는 예를 들어, NS3 프로테아제, NS3 헬리카제, HCV 폴리머라제, NS2/3 프로테아제 또는 IRES로부터 선택된 표적을 억제하는 제제가 포함된다. HCV 억제제의 구체적 예에는 ISIS-14803(ISIS Pharmaceuticals)가 포함된다.
본원에서 사용되는 "HCV 폴리머라제의 억제제"란 용어는 포유동물에서 HCV 폴리머라제의 기능을 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 예를 들어, HCV NS5B 폴리머라제의 억제제를 포함한다. HCV 폴리머라제의 억제제에는 비-뉴클레오시드, 예를 들어, 다음에 기술된 화합물들이 포함되다:
제WO 03/010140호 (Boehringer Ingelheim),
제WO 03/010141호 (Boehringer Ingelheim),
제WO 03/007945호 (Boehringer Ingelheim),
제WO 02/100846 A1호 및 제WO 02/100851 A2호 (둘다 Shire),
제WO 01/85172 A1호 및 제WO 02/098424 A1호 (둘다 GSK),
제WO 00/06529호 및 제WO 02/06246 A1호 (둘다 Merck),
제WO 01/47883호 및 제WO 03/000254호 (둘다 Japan Tobacco) 및
EP 1 256 628 A2 (Agouron).
추가로, HCV 폴리머라제의 다른 억제제에는 또한 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어, 다음에 기술된 화합물이 포함된다:
WO 01/90121 A2(Idenix),
WO 02/069903 A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.) 및
WO 02/057287 A2 및 WO 02/057425 A2(둘다 Merck/Isis).
HCV 폴리머라제의 억제제의 구체적 예에는 JTK-002/003, JTK-109(제조원: Japan Tobacco) 및 NM283(Index)가 포함된다.
본원에서 사용되는 "HIV 억제제"란 용어는 포유동물에서 HIV의 형성 및/또는 복제를 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 포유동물에서 HIV의 형성 및/또는 복제에 필수적인 숙주 또는 바이러스 기작을 방해하는 제제를 포함한다. HIV 억제제에는 예를 들어, 뉴클레오시드 억제제, 비-뉴클레오시드 억제제, 프로테아제 억제제, 융합 억제제 및 인테그라제 억제제가 포함된다.
본원에서 사용되는 "HAV 억제제"란 용어는 포유동물에서 HAV의 형성 및/또는 복제를 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 포유동물에서 HAV의 형성 및/또는 복제에 필수적인 숙주 또는 바이러스 기작을 방해하는 제제를 포함한다. HAV 억제제에는 A형 간염 백신, 예를 들어, HavrixR(제조원: GlaxoSmithKline), VAQTAR(제조원: Merck) 및 AvaximR(제조원: Aventis Pasteur)이 포함된다.
"HBV 억제제"란 용어는 포유동물에서 HBV의 형성 및/또는 복제를 억제하는데 효과적인 제제(화합물 또는 생물학적 제제)를 의미한다. 이는 포유동물에서 HBV의 형성 및/또는 복제에 필수적인 숙주 또는 바이러스 기작을 방해하는 제제를 포함한다. HBV 억제제에는 예를 들어, HBV 바이러스 DNA 폴리머라제를 억제하는 제제 또는 HBV 백신이 포함된다. HBV 억제제의 구체적 예에는 라미부딘(Epivir-HBVR), 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, FTC(CoviracilR), DAPD(DXG), L-FMAU(ClevudineR), AM365(Amrad), Ldt(텔비부딘), 모노발-LdC(발토시타빈), ACH-126,443(L-Fd4C)(Achillion), MCC478(Eli Lilly), 라시비르(RCV), 플루로-L 및 D 뉴클레오시드, 로부스타플라본, ICN 2001-3(ICN), Bam 205(Novelos), XTL-001(XTL), 이미노-당(Nonyl-DNJ)(Synergy), HepBzyme; 및 면역조절제 제품, 예를 들어 인터페론 알파 2b, HE2000(Hollis-Eden), 테라딤(Epimmune), EHT899(Enzo Biochem), 티모신 알파-1(ZadaxinR), HBV DNA 백신(PowderJect), HBV DNA 백신(Jefferon Center), HBV 항원(OraGen), BayHepR(Bayer), Nabi-HB(Nabi) 및 항-B형 간염(Cangene); 및 HBV 백신 제품, 예를 들어 엔게릭스 B, 레콤비박스 HB, 겐헤박 B, 헤파케어, 바이오-헵 B, 트윈릭스, 콤박스, 헥사박이 포함된다.
본원에서 사용되는 "I형 인터페론"이란 용어는 수용체 I형에 모두 결합되는 모든 인터페론 그룹으로부터 선택된 인터페론을 의미한다. 이는 천연 및 합성 생성된 I형 인터페론을 둘다 포함한다. I형 인터페론의 예에는 α-, β-, δ-, 인터페론, tau-인터페론, 컨센서스 인터페론, 아시알로-인터페론이 포함된다.
본원에서 사용되는 "II형 인터페론"이란 용어는 수용체 II형에 결합되는 모든 인터페론 그룹으로부터 선택된 인터페론을 의미한다. II형 인터페론의 예에는 γ-인터페론이 포함된다.
또한, 화학식 I의 화합물과 관련하여 사용되는 "치료학적 유효량"이란 용어는 플라비비리대 바이러스 감염을 치료하는데 효과적인, 즉 바이러스 복제를 억제하거나 적어도 감소시키기에 효과적인 화합물의 양을 의미하지만, 치료될 포유동물에게 독성인 양 또는 포유동물에서 현저한 부작용을 유발할 수 있는 양은 아니다.
"담체"란 용어는 예를 들어, 희석제, 부형제, 보조제 및 비히클을 포함하여, 본 발명의 치료학적 화합물의 투여를 촉진시키고/시키거나 플라비비리대 과의 바이러스를 억제하는 당해 치료학적 화합물의 작용을 증진시키는, 당해 치료학적 화합물과 배합하기 위한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미하기 위해 사용된다. 안정화제, 착색제, 풍미제, 항-바이러스제 등도 당해 치료학적 화합물과 배합할 수 있다. 또한, 일부 경우에, 제형의 pH를 약제학적으로 허용되는 산, 염기 또는 완충제를 사용하여 조절함으로써 제형화된 화합물 또는 이의 전달 형태의 안정성을 증진시킬 수 있다. 다른 적합한 첨가제에는 당해 배합물의 특징을 향상시키는 작용을 하지만 이의 작용에 악영향을 미치지 않는, 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 것들이 포함된다. 본 발명의 치료학적 화합물과의 혼합물로서 사용하기에 적합한 담체에 대해서 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985]을 참조한다. 본원에서 담체 화합물과 관련하여 사용되는 "약제학적으로 허용되는"이란 용어는 포유동물에게 투여하기에 적합한, 즉 담체로서 작용하기에 적절한 양으로 사용되는 경우에 비-독성이며 어떠한 부작용도 유발하지 않는 담체를 나타낸다.
바람직한 양태
항-플라비비리대 바이러스 조성물
본 발명의 제1 양태에서, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물을 치료하는데 효과적인 조성물이 제공된다. 당해 조성물은 하기 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
화학식 I
상기 화학식 I에서,
A는 C1 내지 C6 알킬 및 C3 내지 C6 사이클로알킬이고;
B는 NH(R1) 및 NH(CO)R1[여기서, R1은 C1 내지 C6 알킬이다]로부터 선택된 그룹에 의해 모두 임의로 치환된 페닐 및 티아졸릴로부터 선택되고,
R은 OH 또는 설폰아미드 유도체이다.
하나의 양태에서, 화학식 I의 A는 측쇄 C4 내지 C6 알킬 또는 C4 내지 C6 사이클로알킬 그룹이다. 바람직한 양태에서, A는 사이클로펜틸 또는 3급-부틸이다.
다른 양태에서, 화학식 I의 B는 2번 위치가 NH(R1) 또는 NH(CO) R1[여기서, R1은 C1 내지 C4 알킬이다]에 의해 치환된 페닐 또는 티아졸이다. 바람직한 양태에서, B는 2번 위치가 NH(R1) 또는 NH(CO) R1[여기서, R1은 C1 내지 C4 알킬이다]에 의해 치환된 티아졸이다. 보다 바람직하게는, B는 2번 위치가 NH(CO)CH3 또는 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 4-티아졸이다.
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 R은 OH 또는 화학식 -NHSO2-R2[여기서, R2는 할로 또는 페닐에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 -(C1-6)알킬 또는 -(C3-6)사이클로알킬이거나, R2는 할로 또는 (C1-6)알킬에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 C6 아릴이다]의 설폰아미드 그룹이다. 보다 바람직하게는, R은 OH 또는 설폰아미드 그룹[여기서, R2는 메틸, 사이클로프로필 또는 페닐이다]이다.
보다 바람직한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물에 제시한 바와 같이 A가 3급-부틸이고 B가 페닐인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
다른 보다 바람직한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물에 제시한 바와 같이 A가 3급-부틸이고 B가 2번 위치에서 NH(CO)CH3에 의해 치환된 4-티아졸인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IV의 화합물에 제시한 바와 같이 A가 사이클로펜틸이고 B가 2번 위치에서 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 4-티아졸인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 VI의 화합물에 제시한 바와 같이 A가 사이클로펜틸이고 B가 2번 위치에서 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 4-티아졸이며 R이 설폰아미드 그룹[여기서, R2는 페닐이다]인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 화학식 VII의 화합물에 제시된 바와 같이 A가 사이클로펜틸이고 B가 2번 위치에서 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 4-티아졸이며 R 이 설폰아미드 그룹[여기서, R2은 메틸이다]인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 화학식 VIII의 화합물에 제시된 바와 같이 A가 사이클로펜틸이고 B가 2번 위치가 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 4-티아졸이며 R이 설폰아미드 그룹[여기서, R2는 사이클로프로필이다]인 화학식 I의 화합물로 실시한다.
치료방법
본 발명의 제2 측면에서, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물에게 상기 정의한 바와 같은 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물의 치료학적 유효량과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스로 감염된 포유동물의 치료방법이 제공된다.
본 발명에의 방법에 따라서, 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물의 치료학적 유효량이 플라비비리대 바이러스로 감염된 포유동물에게 투여된다. 치료학적으로 유효하기 위해, 1일당 화합물 약 0.01 내지 약 100mg/체중 kg, 바람직하게는 1일당 약 0.1 내지 50mg/체중 kg의 용량이 감염된 포유동물에게 투여된다. 전형적으로, 당해 방법은 당해 화합물을 1일당 약 1회 내지 약 5회 투여하거나 연속적 주입으로서 투여함을 포함할 것이다. 이러한 투여법은 만성 또는 급성 요법으로서 사용될 수 있다.
당해 분야의 숙련가가 인지할 수 있는 바와 같이, 상기 언급한 투여량보다 보다 낮거나 높은 투여량이 요구될 수 있다. 특정 투여량 및 치료 섭생은 사용되는 특정 화합물의 활성, 감염된 포유동물의 연령, 체중, 전반적 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 배출율, 감염의 중증도 및 경과, 감염에 대한 환자의 소인 및 주치의의 판단을 포함하는 많은 요인에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 치료는 최적 투여량보다 실질적으로 적은 소량 투여량으로 개시한다. 이후에, 상황하에 최적 효과에 도달할 때까지, 소량씩 증분하여 투여량을 증가시킨다. 일반적으로, 화합물은 어떠한 유해하거나 유독한 부작용을 유발하지 않으면서, 일반적으로 치료학적 효과를 제공하는 농도 수준에서 가장 바람직하게 투여된다.
플라비비리대 바이러스 감염의 치료시 치료학적 화합물의 투여는 경구, 비경구 투여 또는 이식된 저장소(reservoir)을 통한 투여를 포함하는 수가지 경로 중 어느 하나로 투여할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비경구"란 용어는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척수강내 및 병변내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 경구 투여 또는 주사에 의한 투여가 바람직하다. 경구용으로 허용되는 투여형태는 캡슐제, 정제 및 수성 현탁제 및 액제를 포함한다.
상기 제시한 바와 같이, 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 담체(들)의 성질은 물론 투여형태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 경구용 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여하기 위해서, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁제를 경구 투여하는 경우, 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합한다. 경우에 따라, 특정한 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제를 첨가할 수 있다. 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액을 포함하는 주사 제제는 당해 분야에 공지된 기술에 따라서 적합한 분산제 또는 습윤제(예: Tween 80) 및 현탁화제를 사용하여 제형화시킬 수 있다.
담체 물질과 배합되어 단일 투여형태를 생성시키는 당해 치료학적 화합물의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여방식에 따라 달라질 것이다. 전형적 제제는 약 5% 내지 약 95%의 치료학적 화합물(중량/중량)을 함유할 것이다. 바람직하게는, 이러한 제제는 약 20% 내지 약 80%의 치료학적 화합물을 함유한다.
다른 측면에서, 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 항바이러스제, 면역조절제, HCV 억제제, HIV 억제제, HAV 억제제, HBV 억제제 및 바이러스 감염의 증상을 치료하기에 효과적인 치료제로부터 선택된 하나 이상의 추가 제제와 공동 투여하는 배합 요법이 고려된다. 이러한 제제들의 예는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이들 추가 제제는 본 발명의 화합물과 배합하여 단일 약제학적 투여형태를 생성할 수 있다. 대안으로, 이들 추가 제제를 예를 들어, 키트를 사용하여 다중 투여형태의 일부분으로서 감염된 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 이러한 추가 제제는 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 투여하기 전에, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 환자에게 투여할 수 있다.
배합 요법이 사용되는 경우, 당해 화합물과 추가의 치료제 둘다 및/또는 예방제는 일반적으로 단일치료 섭생법으로 투여된 투여량의 약 10 내지 100% 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 80%의 투여량 수준으로 존재해야 한다.
제품
본 발명의 추가적 측면에서, 플라비비리대 과의 바이러스를 억제하기에 유효한 조성물을 내부에 함유하는 포장재를 포함하는 제품이 제공되며, 당해 포장재는 당해 조성물이 플라비비리대 과의 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있음을 지시하는 표지를 포함하고, 당해 조성물은 상기 정의한 바와 같은 화학식 I, II, III, IV, VI, VII 또는 VIII의 화합물을 포함한다.
플라비비리대 바이러스
특히, 본 발명의 상이한 양태는 별개의 바이러스, 특히 포유동물에서 병원성인 바이러스에 관한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 언급한 조성물의 화합물은 C형 간염 바이러스와 같은 헤파시바이러스 속의 치료를 위해 사용될 수 있다. HCV 바이러스의 바람직한 예는 유전형 1, 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택된다. HCV 바이러스의 보다 바람직한 예는 유전형 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된다. 바람직하게는, HCV 바이러스는 아형 HCV 1a, HCV1b, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 및 HCV 6a,h,d 및 k로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, HCV 바이러스는 아형 HCV 1a, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 및 HCV 6a,h,d 및 k로부터 선택된다.
대안으로, 본 발명의 화합물은 뎅기열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 및 황열 바이러스와 같은 플라비바이러스 속의 바이러스에 대해 지시될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 뎅기 바이러스에 의해 유발된 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 일본 뇌염 바이러스에 의해 유발된 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 황열 바이러스에 의해 유발된 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 웨스트 나일 바이러스에 의해 유발된 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 전형적 돼지 열 바이러스(CSFV) 및 보더병 바이러스(BDV)와 같은 페스티바이러스 속의 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 BVDV에 의해 유발되는 소의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 CSFV에 의해 유발되는 돼지의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 BDV에 의해 유발되는 양의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다.
추가로, GB 바이러스도 본 발명의 조성물로 치료할 수 있다. 이러한 바이러스 과에는 G형 간염 바이러스(HGV) 및 GB형 간염 바이러스가 포함된다. 바람직한 예는 GBV-A, GBV-B 및 GBV-C로부터 선택된다. 바람직하게는, 본 발명은 GBV-C에 의해 유발되는 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 GBV-A에 의해 유발되는 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다. 대안으로, 본 발명은 HGV에 의해 유발되는 사람의 바이러스 질환의 치료에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 하기의 구체적 실시예에 의해 예시되며, 이러한 실시예는 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예에서 사용되는 약어는 다음을 포함한다:
Abu: 아미노부티르산; DABCYL: 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산; DMEM: 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium); DMSO: 디메틸 설폭시드; EDANS: 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-설폰산; HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피; IPTG: 이소프로필-b-D-티오갈락토시드; LB: Luria-Bertoni(LB 브로쓰에서와 같음); Nva: 노르발린; PenStrep: 페니실린/스트렙토마이신; PCR: 폴리머라제 연쇄 반응; r.m.s.: 제곱평균제곱근; RT-PCR: 실시간 폴리머라제 연쇄 반응; 및 TCEP: 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드.
화학식 I의 화합물의 합성
화학식 I의 화합물은 2000년 10월 12일자로 공개된 제WO 00/059929호에 개요된 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 특히, 화학식 IV의 화합물의 제조에 대해 제89면의 실시예 34C를 참조한다.
실시예 1- 화학식 II, III 및 IV의 화합물에 의한 상이한 유전형의 HCV NS3-NS4A 프로테아제의 억제
HCV NS3/4A 1a 및 1b
HCV 유전형 1b NS3-NS4A 이종이량체 단백질의 제조를 위해, 전체길이 HCV cDNA를 HCV 유전형 1b로 감염된 개체의 혈청으로부터 추출된 RNA(버나드 윌름스(Bernard Willems, Hopital St-Luc, Montreal, Canada) 박사에 의해 공급됨)를 사용하여 RT-PCR로 클로닝하였다. NS3-NS4A 이종이량체 단백질을 암호화하는 DNA 영역을 전체길이 HCV cDAN로부터 PCR로 증폭시키고(정방향 프라이머: 5'CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTAC3'(서열번호 1); 역방향 프라이머: 5'CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCAT CGAA3'(서열번호 2)), pFastBacTM HTa 배큘로바이러스 발현 벡터(Gibco/BRL)내로 서브클로닝시켰다. HCV 유전형 1a의 경우, NS3-NS4A 이종이량체 단백질을 암호화하는 DNA를 HCV 유전형 1a 균주 H77 (공급원: ViroPharma Inc., Exton, PA, US)으로부터 PCR로 증폭시키고(정방향 프라이머: 5'CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAACTC3'(서열번호 3); 역방향 프라이머: 5'CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAA3'(서열번호 4)), 상기한 바와 같이 서브클로닝시켰다. pFastBacTM HTa 배큘로바이러스 발현 벡터내로 클로닝시켜, 헥사히스티딘 태그와 rTEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 추가의 N-말단 28개 잔기를 함유하는 재조합 융합 단백질을 생생시켰다. Bac-to-BacTM 배큘로바이러스 발현 시스템(Gibco/BRL)을 사용하여 단백질 발현용 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다.
106개 세포/mL의 밀도의 Sf21 곤충 세포(Invitrogen)를 27℃에서 재조합 배큘로바이러스로 0.1 내지 0.2의 감염다중도로 감염시켜 His-태그된 NS3-NS4A 이종이량체 프로테아제를 발현시켰다. 감염된 배양물을 48시간 내지 64시간 후에 4℃에서 원심분리하여 수거하였다. 세포 펠렛을 50mM 인산나트륨, pH 7.5, 40% 글리세롤(w/v), 2mM β-머캅토에탄올 속에서 균질화시켰다. 이어서, His-NS3-NS4A 이종이량체 프로테아제를 1.5% NP-40, 0.5% Triton X-100, 0.5M NaCl 및 DNase 처리를 이용하여 세포 용해물로부터 추출하였다. 초원심분리(4℃에서 30분 동안 100,000xg) 후, 가용성 추출물을 50mM 인산나트륨, pH 7.5, 0.5M NaCl 속에 4배로 희석시키고 Pharmacia Hi-Trap Ni+2-킬레이트화 컬럼에 부하하였다. His-NS3-NS4A 이종이량체 단백질을 50mM 인산나트륨, pH 7.5, 10% (w/v) 글리세롤, 0.1% NP-40, 0.5M NaCl에서 생성된 50 내지 400mM 이미다졸 구배를 사용하여 용출시켰다. 성숙한 NS3 및 NS4A 단백질 복합체의 공동-정제를, 당사에서 제조한 항-NS3 및 항-NS4A 항혈청를 사용한 정제된 단백질의 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 각각 NS3 및 NS4A에 대해 특이적인 항혈청의 생산을 위해, 정제된 NS3 프로테아제 도메인 및 펩타이드 H2N-PDREVLYREFDEMEEC-OH(서열번호 5)를 사용하여 토끼를 면역화시켰다. N-말단 아미노산을 서열분석(PE Biosystems 491/491C Procise Sequencer)하여 두 단백질 모두의 적절한 N-말단 아미노산을 확인하였다. 정제된 효소를 -80℃에서 50mM 인산나트륨, pH 7.5, 10%(w/v) 글리세롤, 0.5M NaCl, 0.25M 이미다졸, 0.1% NP-40 중에서 저장하였다.
HCV NS3/4A 2b 및 3a
HCV 유전형 2b 및 3a의 NS3-NS4 프로테아제 유전자를 RT-PCR을 사용하여, 슈타인만 박사(G. Steinmann, Germany)로부터 수득한 HCV-감염된 환자의 임상 샘플로부터 분리된 RNA로부터 증폭시켰다. RT-PCR용으로 사용되는 프라이머는, HCV 유전형 2b의 NS3-NS4A의 경우에 정방향 프라이머로서는 5'CTCGGATCCGGCTCCCATTACTGCTTAC3'(서열번호 6)이고, 역방향 프라이머로서는 5'GACGCGTCGACGCGGCCGCTCAGCACTCTTCCATTTCACTGAA3'(서열번호 7)이며, HCV 유전형 3a의 경우에 정방향 프라이머로서는 5'CTCGGATCGGGCCCCGATCACAGCATACGCC3'(서열번호 8)이고 역방향 프라이머로서는 5'CACCGCTCGAGTCAGCATTCTTCCATCTCATCATATTGTTG3'(서열번호 9)였다. 각 프라이머는 세균 발현 벡터 pET11a내 단편을 서브클로닝하기 위한 고유한 제한 부위를 함유하였다. 상기 벡터내로 클로닝하여, 헥사히스티딘 태그와 rTEV 프로테아제 절단 부위를 포함하는 추가의 N-말단 28개 잔기를 함유하는 재조합 융합 단백질을 생성시켰다. 재조합 플라스미드를 사용하여 단백질 발현용 세균 균주 BL21 DE3 pLysS를 형질전환시키고, IPTG을 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 발현 후, 세포를 4℃에서 원심분리하여 수집하고, 세포 펠렛을 50mM 인산나트륨, 0.5M NaCl, 40% 글리세롤, 1.5% NP-40, 0.5% Triton X-100을 함유하는 완충액 속에 용해시키고, 가용성 단백질 분획을 상기한 바와 같은 5ml HiTrap 킬레이트화 친화성 컬럼을 통해 통과시켰다. 분해 산물 및 오염물을 제거하기 위해, 폴리(U)-세파로스 정제 단계를 임의로 수행할 수 있다.
시험관내 HCV NS3 프로테아제 검정
HCV 1a, 1b, 2b, 2a-c 및 3a NS3-NS4A 이종이량체 단백질의 프로테아제 활성의 억제를 평가하는데 사용되는 형광성 뎁시펩타이드 기질은 안트라닐릴-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH(서열번호 10)이었다. 상기 기질은 아미노부티르산(Abu) 및 알라닌 잔기 사이에서 절단된다. 서열 DDIVPAbu-AMYTW(서열 번호 11)은 NS5A/NS5B 천연 절단 부위에 상응하는 서열 DDIVPC-SMSYTW(서열번호 12)로부터 유래된다. 위치 P1에 아미노부티르산 잔기를 도입시킨 결과, N-말단 산물 억제가 현저하게 감소된 반면에, 위치 P3에서의 세린 잔기의 결실은 내부 소광 효율을 개선시켰다. 프로테아제 활성을 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.25M 나트륨 시트레이트, 0.01% n-도데실-b-D-말토시드, 1mM TCEP에서 검정하였다. 검정은 MicrofluorR White U-Bottom MicrotiterR 플레이트에서 수행하였다. 5μM의 기질과 다양한 농도의 시험 화합물을 1.5nM의 HCV 1a 또는 HCV 1b NS3-NS4A 이종이량체 단백질과 함께 온화하게 교반하면서 23℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 최종 DMSO 함량은 5.25%를 초과하지 않았다. pH 5.8에서 1M 2-[N-모르폴리노]에탄설폰산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
형광을 320nm의 여기 필터와 405nm의 방출 필터를 갖는 BMG POLARstar Galaxy 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 모니터링하였다. 시험 화합물을 함유하는 각 웰의 억제 수준(억제율(%))은 다음 수학식을 사용하여 계산하였다(FU= 형광 단위): . 이어서, 계산된 억제율(%) 값을, 다음 수학식을 사용하여 SAS의 비선형 회귀 수법 NLIN 과정에 의해 IC50, 기울기 계수(n) 및 최대 억제(Imax)을 측정하는데 사용하였다: .
억제 상수(Ki) 측정 및 억제 방식
형광성 뎁시펩타이드 기질 안트라닐릴-D(d)EIVP-Nva[C(O)-O]AMY(3-NO2)TW-OH (서열번호 13)를 사용하여 HCV NS3-NS4A 프로테아제에 대한 화학식 IV의 화합물의 작용 기작 및 억제상수를 평가하였다. 이를 노르발린과 알라닌 잔기 사이에서 절단하였다. 기질 작용 용액을 DMSO 중에서 기질 모액(DMSO 중의 2mM, -20℃에서 저장함)으로부터 200μM의 농도로 제조하였다. 검정시 최종 기질 농도는 0.25 내지 8μM로 다양하였다. 화학식 IV의 화합물의 억제 상수(Ki)는 항정상태 속도 방법[참조: Morrisson et al. 1985]을 사용하여 측정하였다. 프로테아제 활성은 내부 소광된 형광성 기질의 절단과 관련되는 형광 변화를 SLM-AMINCOR 8100 형광 분광계(325nm에서 방출 및 420nm에서 여기)를 사용하여 모니터링함으로써 측정하였다. 절단 반응을 0.25 내지 8μM의 기질, 0.3nM의 HCV 1a 또는 1b NS3-NS4A 이종이량체 단백질 및 다양한 농도의 시험 화합물(IV)의 존재하에 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.25M 나트륨 시트레이트, 0.01% n-도데실-b-D-말토시드, 1mM TCEP 속에서 모니터링하였다. HCV 유전형 1a 및 1b NS3-NS4A 이종이량체 프로테아제의 항정상태 분석을 딕손(Dixon) 및 코니쉬 보우덴(Cornish-Bowden) 그래프 방법을 사용하여 수행하였다. 딕손 그래프 방법에서, 속도의 역수 1/V를 몇가지 기질 농도(S)에서 시험 화합물 농도에 대해 플롯팅한다. 코니쉬-보덴 그래프 방법에서, 비 S/V를 몇가지 S 농도에서 시험 화합물 농도에 대해 플롯팅한다. 두 방법 모두에서, 점들은 각 S 값에서 직선상에 위치한다. 경쟁적 시험 화합물의 경우, 딕손 플롯은 한점에서 교차하는 상이한 S 값을 나타내는 반면, 코니쉬-보우덴 플롯은 상이한 S 값에서 평행선을 나타낸다. Ki는 데이타를 경쟁적 결합을 기술하는 다음의 수학식에 핏팅(fitting)시켜 산정하였다: .
HCV NS3 프로테아제의 억제
HCV 유전형 1a, 1b, 2b, 2a-c 및 3a NS3/NS4A 이종이량체 프로테아제의 활성을 화학식 IV의 화합물의 존재하에 시험관내 효소적 형광 검정을 사용하여 측정하였다. IC50 곡선을 SAS NLIN 과정에 의해 개별적으로 분석하였다. HCV 1a NS3-NS4A 프로테아제의 경우, 화합물(IV)의 2개 뱃치의 분석으로부터 4.3nM의 평균 IC50 값이 수득되었다. HCV 1b NS3-NS4A 프로테아제의 존재하에서의 화합물(IV)의 2개의 뱃치의 분석으로부터 3.4nM의 평균 IC50 값이 수득되었다.
상이한 유전형의 HCV에서 상이한 NS3 프로테아제 억제제의 IC50
화합물 HCV-1a HCV-1b HCV-3a HCV-2a-c HCV-2b
II 7.8 nM 8.9 nM 360 nM 680 nM 1000 nM
III 4.1 nM 4.2 nM 190 nM 490 nM 510 nM
IV 4.3 nM 3.4 nM 280 nM 200 nM 260 nM
V 23 nM 10 nM 930 nM 1800 nM 3000 nM
n/d= 수행하지 않음
도 3A 및 3B는 각각 HCV 1a 및 1b NS3-NS4A 프로테아제에 대한 화합물(IV)의 IC50 곡선을 예시한 것이다.
화합물(IV)은, 데이타를 경쟁적 결합을 기술하는 수학식에 핏팅시킨 후 및 또한 딕손 및 코니쉬-보우덴 그래프 방법으로부터 HCV 유전형 1a 및 1b NS3-NS4A 프로테아제의 경쟁적 시험 화합물인 것으로 밝혀졌다. 두 HCV 유전형 효소 모두에 있어, 딕손 플롯은 상이한 S 값에서의 직선이 한점에서 교차하고 있음을 나타낸 반면, 코니쉬-보우덴 플롯은 상이한 S 값에서 평행선을 나타낸다. 화합물(IV)에 있어, HCV 유전형 1a NS3-NS4A 프로테아제의 경우에 항정상태 속도 분석으로부터 0.30nM의 Ki가 수득된 반면에, HCV 유전형 1b NS3-NS4A 프로테아제의 경우에는 0.66nM의 Ki가 수득되었으며, HCV 유전형 3a, 2a-c 및 2b의 경우에는 각각 90nM, 86nM 및 83nM의 Ki가 수득되었다. 도 4 및 5는 각각 HCV 유전형 1a 및 1b NS3-NS4A 프로테아제에 대한 화합물(IV)의 딕손 및 코니쉬-보우덴 플롯이다.
실시예 2-HCV 레플리콘 1a 및/또는 1b의 억제
세포-기본 HCV 1a 및 1b RNA 레플리콘 검정
HCV RNA 복제를 HCV 1a 및 1b 레플리콘을 함유하는, Huh-7-유래의 세포주[ Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd., R & D에서 개발됨(WO 02/052015)]에서 입증하였다. 이 세포를 사용하여, 후보 시험 화합물을 시험하기 위한 민감성 HCV RNA 복제 세포-기본 검정을 확립시켰다.
서브게놈 HCV 레플리콘을 안정하게 유지하는 Huh7 세포를 이미 기술된 바와 같이 확립시켰다[참조: Lohman et al. 1999; WO 02/052015]. 상기 세포를 10% FBS, PenStrep(Life Technologies) 및 1mg/mL 제네티신이 보충된 DMEM 중에서 웰당 1 X 104 개 세포로 96웰 세포 배양물 일단에 씨딩하였다. 세포를 다양한 농도의 시험 화합물을 첨가할 때까지 5% CO2 항온처리기내에서 37℃로 항온처리하였다.
검정에서 사용하기 위한 시험 화합물을 다음과 같이 제조하였다. 100% DMSO 중의 시험 화합물을 최종 DMSO 농도가 0.5%가 되도록 검정 배지에 첨가하여 희석시키고, 용액을 15분 동안 초음파 처리하고 0.22μM 밀리포어 필터 유닛트를 통해 여과하였다. 검정 배지(0.5% DMSO를 함유함)를 사용하여 시험 화합물의 일련의 희석액을 제조하였다.
세포 배양 배지를 당해 세포를 함유하는 96웰 플레이트로부터 흡입하고, 검정 배지 중의 시험 화합물의 적절한 희석액을 세포 배양 플레이트의 독립적 웰로 옮기고, 이를 37℃에서 5% CO2와 함께 항온처리하였다.
3일간의 항온처리 기간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 전체 세포성 RNA를 RNeasy Mini KitR 및 Qiashredder(제조원: Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 각 웰로부터의 RNA를 H2O 50mL 중에서 용출시켰다. RNA를 Cary 1ER UV-가시광선 분광광도계상에서 260nm에서의 흡광도에 의해 정량하였다. HCV RNA 레플리콘 복사체 수를 실시간 RT-PCR과 Abi PrismR 7700 서열 검출 시스템으로 평가하였다. TAQMAN EZR RT-PCR 키트는 RNA의 검출 및 분석용 시스템을 제공한다. 염료-표지된 DNA 프로브의 형광의 증가를 모니터링하여 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 산물을 하부 프로세싱 없이 직접적으로 검출하였다. 프라이머와 프로브 둘다의 뉴클레오타이드 서열을 HCV 게놈의 5' 영역에 위치시켰다. 이어서, 레플리콘 복사체 수를 동일한 반응 혼합물에서 검정한 레플리콘 복사체의 공지된 양(야생형 Huh-7 RNA 50ng가 보충됨)으로 작도한 표준 곡선을 이용하여 평가하였다. 다음의 열 사이클 파라메터를 ABI PrismR 7700 서열 검출 시스템상에서의 RT-PCR 반응을 위해 사용하였다. 조건은 HCV 검출을 위해 최적화시켰다. 증폭 플롯이 정의된 형광 역치와 교차되는 경우 정량화는 역치 사이클에 기초한다. 역치 사이클의 비교는 상이한 샘플 중의 상대적 주형 농도의 매우 민감한 척도를 제공한다. 초기 사이클 동안의 모니터링은 PCR 정확도가 가장 높을 때 정밀한 정량화에 대한 정확한 데이터를 제공한다. 상대적 주형 농도는 HCV의 표준 곡선과 공지된 복사체 수를 사용하여 실수로 전환시킬 수 있다.
SAS의 NLIN 과정을 이용한 EC 50 곡선 핏팅
시험 화합물을 함유하는 각 웰의 억제 수준(억제율(%))은 다음 수학식을 사용하여 계산하였다(CN= HCV 레플리콘 복사체 수): . 이어서, 계산된 억제율(%) 값을, 다음 수학식을 사용하여 SAS의 비선형 회귀 수법 NLIN 과정에 의해 EC50, 기울기 계수(n) 및 최대 억제(Imax)를 측정하는데 사용하였다: .
상이한 유전형의 HCV에서 상이한 NS3 프로테아제 억제제의 EC50(nM)
화합물 HCV 레플리콘 1a HCV 레플리콘 1b
II 34 27
III 4.5 4.7
IV 2.1 1.0
V 76 39
VI 2.2 3.0
VII 3.2 3.3
VIII 0.7 1.1
HCV 레플리콘 세포-기본 검정에서, 화합물(V)은 HCV 레플리콘-함유 세포를 사용한 경우에 EC50이 각각 2.1nM 및 1nM로서 용량 의존적 억제를 나타냈다. 1000nM보다 높은 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 화학식 II, III, IV, VI, VII 및 VIII의 화합물이 세포-기본 HCV RNA 복제의 강력하며 특이적인 억제제임을 나타낸다. 화합물(V)는 상이한 부류로부터 유래되었으나 구조적으로 관련되는 화합물이며, 또한 NS3 프로테아제에 대해 활성이나 덜 강력하다. 상기 화합물은 이후에 억제 활성 수준을 비교하기 위한 대조군으로서 사용될 것이다.
화학식 VI, VII 및 VIII의 화합물은 다음과 같은 구조를 갖는다.
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
실시예 3- 화학식 II, III 및 IV의 화합물에 의한 GBV-B NS3/4A 프로테아제의 억제
GBV-B NS3/NS4A 프로테아제의 클로닝
전체길이 GBV-B NS3/NS4A 프로테아제 유전자를 감염된 타마린 혈청으로부터 분리하였다. 전체 RNA를 표준 프로토콜에 따라서 QiagenR 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 상기 혈청으로부터 분리하였다. 역전사 및 PCR 반응용 프라이머는 공개된 서열[참조: Muerhoff, A.S et al. 1995] 및 진뱅크(GeneBank) 승인번호 제U22304호를 토대로 하여 선별하였다(정방향: 5'CGCATATGGCACCTTTTACGCTGCAGTGTC3(서열번호 14); 역방향: 5'CGCGCGCTCGAGACACTCCTCCACGATTTCTTC3(서열번호 15)). 증폭된 RT-PCR 산물을 폴리히스티딘 태그를 갖는 프레임내의 NdeI 및 XhoI 부위 사이에서 폴리히스티딘 태그-함유 pET-29 플라스미드내로 클로닝하였다. 이 작제물은 C-말단에 폴리 His 태그를 갖는 재조합 단백질을 생산하였다. 플라스미드를 단백질 발현을 위해 BL21 DE3 pLysS로 형질전환시켰다.
이. 콜라이(E. coli) 클론 pGBV-B를 LB 배지에서 0.6의 세포 밀도(OD600)까지 증식시키고, 이때 IPTG를 0.2mM의 농도로 첨가하였다. 유도를 23℃에서 4시간 동안 수행하였다. GBV-B NS3/NS4A-His 단백질을 문헌[참조: Zhong et al., 1999]에기술된 방법에 따라서 정제하였다. 가용성 분획을 50 내지 400mM 이미다졸 구배를 사용하여 PharmaciaR Hi-Trap Ni+2-킬레이트화 친화성 컬럼상에서 정제하였다. 이 단계를 수행한 후, 단백질 제제를 SuperdexR 200 겔 여과 컬럼에서 크로마토그래피하였다. 상기 단백질 제제의 농도를 브래드포드(Bradford) 단백질 검정을 사용하여 측정하였다.
시험관내 GBV-B NS3 프로테아제 검정
GBV-B NS3-NS4A 이종이량체 단백질의 프로테아제 활성의 억제를 평가하는데 사용된 뎁시펩타이드 기질은 Ac-DED(EDANS)EE-Abu[C(O)-O] ASK(DABCYL)-NH2(서열번호 16)이었다. 상기 기질을 아미노부티르산(Abu)과 알라닌 잔기 사이에서 절단하고, 분해 산물을 HPLC로 분석하였다. 프로테아제 활성을 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.25M 나트륨 시트레이트, 0.01% n-도데실-b-D-말토시드, 1mM TCEP 중에서 평가하였다. 검정은 MicrofluorR White U-Bottom MicrotiterR 플레이트에서 수행하였다. 5μM의 기질과 다양한 농도의 시험 화합물을 0.4nM의 GBV-B NS3-NS4A 이종이량체 단백질 함께 온화하게 교반하면서 23℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 최종 DMSO 함량은 5.25%를 초과하지 않았다. pH 5.8에서 1M 2-[N-모르폴리노]에탄설폰산 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 정량화를 위해, 절단 산물 및 기질을 Perkin-ElmerR 3x3CR C8 컬럼에서 HPLC로 분리시켰다. 초기에 0.05% 인산 및 3mM SDS를 함유하는 수용액으로 3.5mL/분에서 용출시켜 분리시켰다. 이어서, 0.05% 인산 중의 0 내지 45% 아세토니트릴 선형 구배를 10분 동안 적용시켰다. 흡광도를 210nm에서 모니터링하였다.
검정은 화학식 II, III, IV 및 V의 시험 화합물의 존재하에 수행하였다. GBV-B NS3-4A 단백질의 존재하에 각 시험 화합물에서 수득된 IC50은 하기 표 3에 제시한다.
화합물 IC50(μM) GBV-B
화합물(II) 36.5
화합물(III) 31
화합물(IV) 16
화합물(V) 63
화학식 V의 화합물은 상이한 부류로부터 유래되나 구조적으로 관련된 화합물이며, 또한 NS3 프로테아제에 대해 활성이나 화학식 II, III 및 IV의 화합물에 비해 덜 활성이다. 화학식 II, III 및 IV의 화합물의 활성 등급화가 HCV와 GBV-B 간에 유지되었는지를 입증하기 위해 이 화합물을 포함시켰다.
배양물 중 타마린 간세포에서의 GBV-B 복제의 억제
비감염된 타마린으로부터 분리된 간세포를 수일 동안 한정된 배지 중의 배양물에서 유지시켰다. 세포 배양 배지는 문헌[참조; Beames et al. 2000]에 기재된 바와 같다. 플레이팅한지 3일 후, 세포를 GBV-B-함유 혈장으로 감염시켰다. 바이러스 흡착 후, 바이러스를 제거하고 세포를 10μM 농도의 후보 시험 화합물의 존재 및 부재하에 항온처리하였다. 상기 세포를 감염 7일 후에 수거하였다. GBV-B RNA의 수준을 GBV-B 캡시드 유전자의 일부분을 인식하는 프라이머-프로브 배합물[참조: Beames et al. 2000]을 사용하여 실시간 RT-PCR에 의해 전체 세포성 RNA로부터 정량화하였다.
효소 검정에서 수득된 IC50이 낮았음에도 불구하고, 도 6에 예시된 결과는, 세포를 화학식 III의 화합물의 존재하에 항온처리한 경우에 바이러스 RNA 수준의 3-로그 이상의 감소가 관찰되었으며 화학식 V의 화합물의 존재하에서는 바이러스 RNA 수준의 2-로그 이상의 감소가 관찰되었음을 보여준다(당해 결과는 g.e.(게놈 당량)/RNA ㎍으로 표현하였다). 이러한 보다 대표적인 바이러스 복제 검정으로 수득된 결과는 이들 화합물이 GBV-B 바이러스 생산을 감소시키기에 효과적인 항바이러스제임을 입증한다.
실시예 4- 플라비비리대 과에서 NS3 프로테아제의 서열 비교
플라비비리대 과 바이러스의 다른 바이러스로부터의 프로테아제의 서열을 NCBI의 BLAST 분석[참조: Altschul et al.1997]에 이어서 분류법 보고(taxonomy report)로부터 수득하였다. 프로테아제 서열에 대한 조사는, HCV 서열 자체를 제외한, HCV 프로테아제에 대한 유사성을 갖는 모든 플라비비리대 서열을 회수할 수 있는 특수한 기준을 사용하여 수행하였다. 이들 "NP_" 서열이 "참조" 서열(RefSeq)이었기 때문에, 가능하다면 NCBI로부터의 "NP_" 서열을 사용하여 관련 바이러스의 특정 그룹을 나타내었다. 추가로, 공지되지 않은 경우, HCV NS3 프로테아제로부터 프로테아제에 대한 NS3 N-말단 및 C-말단을 결정하였다.
상이한 그룹의 바이러스와 대조하여 6개의 HCV 균주에 대한 프로테아제의 서열 정렬을 CLUSTALW[참조: Thompson, JD, et al., 1994]에 기초한 ALIGNX (VectorNTI)를 사용하여 수행하였다.
이러한 정렬로부터, 유사성(%)를 모든 개별적 서열들 간에 계산하고 표 4 내지 8에 나타내었다. 유사성은 다음과 같은 아미노산 그룹 분류에 기초하였다: [ILVM], [FWY], [KR], [DE], [GA], [NQ], [ST].
표 4에는 HCV의 몇가지 유전형 및 아형 간의 동일성 및 유사성을 제시한다. 동일성이 70% 내지 89%의 범위인 반면, 유사성은 77% 내지 95%의 범위임을 알 수 있으며, 이는 NS3 프로테아제가 HCV 간에 고도로 보존되어 있음을 입증한다. 또한, 다양한 대표적 HCV 유전형의 NS3 프로테아제 도메인의 아미노산 서열 정렬(도 2) 및 3차원 구조상의 보존된 잔기의 위치(도 8)로부터, 활성 부위의 잔기가 HCV 유전형 및 아형 간에 고도로 보존되어 있음을 알 수 있다.
표 5는 GB 바이러스 NS3 프로테아제 및 HCV NS3 프로테아제 도메인 간의 유사성을 분석한 것이다. 유사성은 43 내지 49%의 범위인 반면에, HCV와 페스티바이러스 NS3 도메인 간의 유사성은 25 내지 30%의 범위이다(표 6). HCV와 뎅기 바이러스 간의 유사성도 약 30%이고(표 7), HCV와 플라비비리디 간의 유사성(표 8)도 마찬가지이다.
대조적으로, 표 9에는 HCV의 NS3 프로테아제 도메인과 사람 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 프로테아제 간의 유사성이 약 20% 근처임을 보여준다. HCMV는 헤르페스 비리대의 바이러스로서 플라비비리대 프로테아제와 상이한 촉매 트라이어드(catalytic triad)를 갖는 세린 프로테아제를 갖는다. 따라서, HCMV 바이러스는 플라비비리대 NS3 프로테아제와 유사한 것으로 고려되지 않는다. 이러한 차이는 플라비비리대 및 HCMV에서 본 발명의 억제제와 접촉된 아미노산 간의 유사성을 비교할 때에 추가로 예시될 것이다.
실시예 5-3차원 구조 결정 분석
플라비비리대 간의 유사성을 추가 분석하기 위해, 억제제와 복합체화된 HCV NS3 프로테아제의 결정 구조를 수득하고, 당해 억제제와 직접적으로 접촉된 아미노산을 다른 플라비비리대에서 분석하여 이들 중요한 접촉 지점의 유사성 정도를 평가하였다.
X-선을 2.75Å 분해능까지 회절시킨, 거대환 화합물(II)와 복합체화된 HCV NS3 프로테아제-NS4A 펩타이드의 공결정을 수득하였다. 상기 거대환 화합물(II)은 NS3 프로테아제 활성 부위에서 발견되었으며 상이한 전자 밀도로 명백하게 한정되었다. 이 구조는 시험 화합물이 상기 활성 부위와 어떻게 상호작용는지에 관한 분자적 세부사항을 보여주며 HCV NS3 프로테아제의 억제 기작에 대한 부가적 식견을 제공한다.
시험 화합물(II)와의 NS3 프로테아제 복합체의 구조(도 8)는 당해 기질-기본 시험 화합물 부류의 결합 부위를 보다 잘 규정한다. 이러한 공복합체의 구조로부터, 시험 화합물과 직접적으로 접촉된, 즉 3Å 이내의 잔기(H57, G137, S139, A156 및 A157)는 활성 부위를 지시해 주며, 이는 경쟁적 억제 방식과, HCV 유전형 및 다양한 아형의 대표적 서열 간의 이 부위에서의 보존으로 예측되는 바와 같다.
시험 화합물과 4Å 이내로 접촉된 다른 잔기는 표 10에 열거한다. 비교 실험은 이들 아미노산이 59% 내지 76%의 범위로 플라비비리대 간에 고도로 보존되어 있음을 보여준다. 플라비비리대 간의 이들 잔기의 보존은 HCV NS3 프로테아제의 억제제가 플라비비리대 과의 바이러스의 다른 일원도 억제할 수 있음을 지시해준다. 대조적으로, HCMV 프로테아제 촉매 부위의 유사성 수준과 표 10의 접촉 지점은 전체 프로테아제에 대한 유사성과 동일한 범위(약 20%)에 있으며, 이는 비-플라비비리대로부터의 다른 세린 프로테아제가 화학식 I의 화합물에 의해 표적화되지 않음을 다시 한번 예시한다.
HCV와 뎅기 바이러스 프로테아제 도메인 간에 수행된 다른 구조 연구는 C-말단 도메인 억제제 결합 부위의 모든 6개의 쇄가 강력하게 보존되어 있으며 유사한 길이임을 제시한 바 있다. Den2 프로테아제의 C-말단 도메인(잔기 87번 내지 167번)과 표 10의 대부분의 잔기를 포함한 HCV(잔기 69번 내지 189번)의 68α 탄소원자가 중첩됨으로써 0.9Å의 r.m.s. 편차가 산출되었다[참조: Murthy et al., 1999].
논의
플라비비리대 과의 바이러스들은 이의 일원 간의 전체 서열 상동성이 비교적 낮음에도 불구하고 수많은 유사성(도 1)을 지니고 있다(표 4 내지 8). 특히, NS3 단백질은 페스테바이러스와 플라비바이러스의 프로테아제 및 뉴클레오시드 트리포스페이트-결합 헬리카제에 대한 유사성을 갖는 서열을 함유한다. HCV NS3 프로테아제 도메인은 HCV 유전형 간에 약 77 내지 95%의 서열 유사성(도 1)을 공유하며, 플라비비리대 과의 다른 일원과 약 25 내지 50%의 서열 유사성을 공유한다(표 4 내지 8). 또한, GBV-B 및 HCV의 게놈 구성 및 구조는 GBV-B 및 HCV의 폴리단백질 서열 간에 서열 상동성이 약 25 내지 30%라는 사실에도 불구하고 유사하다. 그러나, 이러한 낮은 유사성은 억제제와 접촉되게 되는 잔기가 플라비비리대의 프로테아제 도메인내에 고도로 보존되어 있다는 사실에 의해 압도되며, 이는 이러한 부류의 화합물은 다른 플라비비리대에도 결합할 수 있다는 사실을 강력하게 암시한다. GBV-B에 대해 수득된 화학식 IV의 화합물의 활성은 본 가설을 명백히 입증한다.
3차원 구조와 관련하여, 입수가능한 다양한 결정화된 HCV 및 뎅기 NS3 프로테아제의 원자좌표는 트립신-유사 폴드의 특징적인 전체 구조를 보여주었다. 많은 연구들은 현재 NS3 영역의 N-말단 부분이 플리비비리대에서의 바이러스 폴리단백질 프로세싱에서 매우 특이적이고 중심적인 역할을 하는 세린 프로테아제를 암호화함을 확고히 입증하고 있다.
상기 실험들에서 수득된 모든 결과는 화학식 I의 화합물이 플리비비리대 과의 바이러스의 일원에 대해 활성이라는 논점을 뒷받침한다:
6가지의 관련 화합물은 HCV 1b에 대해 활성이며 HCV 1a에 대해 유사한 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 2);
이들 화합물 중 3개는 HCV 3a, 2a-c 및 2b에 대해 또한 시험하였으며 역시 활성인 것으로 밝혀졌다(표 1);
이들 3개의 동일한 화합물은 GBV-B에 대한 효소 검정에서 시험하였으며 활성인 것으로 밝혀졌다(표 3);
이들 화합물 중 1개는 타마린 세포내의 GBV-B의 복제에 대해 세포 배양물 중에서 시험하였으며 활성인 것으로 밝혀졌다(도 6);
이들 화합물 중 1개는 플라비비리대의 모든 일원 간에 고도로 보존된 영역내에 위치하는 결합 방식을 나타낸다(도 8);
연구는 HCV와 뎅기 바이러스 NS3 프로테아제 간의 강력한 기능적 및 구조적 유사성을 입증하였다.
플라비비리대 과의 바이러스내의 바이러스들의 모든 유사성을 고려하면, 화학식 I의 화합물이 플라비비리대 과의 바이러스의 일원에 대해 효과적일 수 있고, 보다 특히, 플라비비리대 과의 병원성 일원에 대해 효과적일 수 있는 것으로 보인다.
참조문헌
플라비비리대 과로부터의 GB NS3와 HCV NS3 프로테아제 도메인(181 AA)의 유사성(%)
GBV-BNP_056931 HepGNP_043570 GBV-ANP_045010 GBV-CNP_059446
1aAF271632 45 49 44 48
1bD90208 46 49 45 48
2aD00944 44 48 45 47
2bD10988 46 47 45 46
3aD17763 44 45 43 45
10aD63821 43 45 45 46
4aY11604 44 46 45 45
5aY13184 46 48 44 46
6aY12083 45 47 46 46
11aD63822 44 49 45 48
매트릭스: [ILVM],[FWY],[KR],[DE],[GA],[NQ],[ST]
플라비비리대 과로부터의 페스티바이러스 NS3 프로테아제와 HCV NS3 프로테아제 도메인(181 AA)의 유사성(%)
페스티 1NP_040937 BVDV2NP_044731 페스티 2NP_075354 페스티 3NP_620062
1aAF271632 28 28 28 28
1bD90208 28 28 28 28
2aD00944 26 26 26 26
2bD10988 26 25 26 26
3aD17763 29 28 28 28
10aD63821 28 27 28 28
4aY11604 28 28 28 28
5aY13184 29 29 29 29
6aY12083 30 29 29 29
11aD63822 29 28 29 29
BVDV-2= 소 바이러스성 설사 바이러스
플라비비리대 과로부터의 모기-유래된 플라비바이러스 NS3 프로테아와 HCV NS3 프로테아제 도메인(181 AA)의 유사성(%)
뎅기 1NP_059433 뎅기 2NP_056776 뎅기 3NP_040961 뎅기 4NP_073286
1aAF271632 26 27 28 29
1bD90208 29 29 30 31
2aD00944 27 29 28 28
2bD10988 29 29 29 29
3aD17763 27 29 29 29
10aD63821 28 29 30 29
4aY11604 27 27 28 30
5aY13184 29 30 31 30
6aY12083 29 30 30 31
11aD63822 29 29 30 30
플라비비리대 과로부터의 플라비바이러스 NS3 프로테아제와 HCV NS3 프로테아제 도메인(181AA)의 유사성(%)
WNVNP_041724 JEVNP_059434 쿤진POLG_KUNJM YFVNP_041726 MVEVNP_051124
1aAF271632 29 30 29 29 30
1bD90208 29 31 30 29 31
2aD00944 28 28 28 28 28
2bD10988 29 30 29 30 30
3aD17763 27 27 27 28 28
10aD63821 27 27 27 28 27
4aY11604 28 29 29 29 30
5aY13184 29 30 30 30 30
6aY12083 29 30 30 28 30
11aD63822 28 29 28 29 29
WVN= 웨스트 나일 바이러스JEV= 일본 뇌염 바이러스Kunjin= 쿤진 바이러스YFV= 황열 바이러스MVEV= 머레이 밸리 뇌염 바이러스
사람 사이토메갈로바이러스 프로테아제 도메인(256 aa)과 HCV 프로테아제 도메인(181 aa)의 유사성(%)
HCMV 프로테아제
1aAF271632 20
1bD90208 20
2aD00944 21
2bD10988 20
3aD17763 18
10aD63821 18
4aY11604 19
5aY13184 19
6aY12083 19
11aD63822 19
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Claims (15)

  1. 포유동물의 플라비비리대(Flaviviridae) 바이러스 감염 치료용 의약을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
    화학식 I
    상기 화학식 I에서,
    A는 C1 내지 C6 알킬 및 C3 내지 C6 사이클로알킬로부터 선택되고;
    B는 NH(R1) 및 NH(CO)R1[여기서, R1은 C1 내지 C6 알킬이다]로부터 선택된 그룹에 의해 임의로 치환된 페닐 및 티아졸릴로부터 선택되고;
    R은 OH 또는 화학식 -NHSO2-R2[여기서, R2는 할로, 시아노, 니트로, O-(C1-6)알킬, 아미도, 아미노 또는 페닐에 의해 모두 임의로 1 내지 3회 치환된 -(C1-8)알킬, -(C3-7)사이클로알킬 또는 {-(C1-6)알킬-(C3-6)사이클로알킬}이거나, R2는 할로, 시아노, 니트로, (C1-6)알킬, O-(C1-6)알킬, 아미도, 아미노 또는 페닐에 의해 모두 임의로 1 내지 3회 치환된 C6 또는 C10 아릴이다]의 설폰아미드 그룹이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I의 A가 측쇄 C4 내지 C6 알킬 또는 C4 내지 C6 사이클로알킬 그룹이고; 화학식 I의 B가 2번 위치가 NH(R1) 또는 NH(CO) R1[여기서, R1은 C1 내지 C4 알킬이다]에 의해 치환된 페닐 또는 티아졸이며; 화학식 I의 R이 OH 또는 화학식 -NHSO2-R2[여기서, R2는 할로 또는 페닐에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 -(C1-6)알킬 또는 -(C3-6)사이클로알킬이거나, R2는 할로 또는 (C1-6)알킬에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 C6 아릴이다]의 설폰아미드 그룹인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, A가 사이클로펜틸 또는 3급-부틸이고; B가 2번 위치에서 NH(R1) 또는 NH(CO)R1[여기서, R1은 C1 내지 C4 알킬이다]에 의해 치환된 티아졸이며; R이 OH 또는 설폰아미드 그룹[여기서, R2는 메틸, 사이클로프로필 또는 페닐이다]인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, R이 OH인 화학식 I의 화합물의 용도.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, R이 화학식 -NHSO2-R2[여기서, R2는 할로 또는 페닐에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 -(C1-6)알킬 또는 -(C3-6)사이클로알킬이거나, R2는 할로 또는 (C1-6)알킬에 의해 1회 또는 2회 임의로 치환된 C6 아릴이다]의 설폰아미드 그룹인 용도.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, A가 사이클로펜틸이고; B가 2번 위치에서 NHCH(CH3)2에 의해 치환된 티아졸이며; R이 OH 또는 설폰아미드 그룹[여기서, R2는 메틸, 사이클로프로필 또는 페닐이다]인 용도.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 사람이고, 플라비비리대가 황열 바이러스(Yellow Fever virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Fever virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), GB 바이러스 A 또는 C 및 G형 간염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  8. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 소이고, 플라비비리대가 BVDV 및 보더병 바이러스로부터 선택되는 용도.
  9. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 돼지이고, 플라비비리대가 전형적 돼지 열 바이러스(Classical Swine Fever Virus)인 용도.
  10. 제5항에 있어서, 포유동물이 사람이고, 플라비비리대가 C형 간염 바이러스인 용도.
  11. 제6항에 있어서, 포유동물이 사람이고, 플라비비리대가 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, GB 바이러스 A 또는 C 및 G형 간염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  12. 제6항에 있어서, 포유동물이 소이고, 플라비비리대가 BVDV 및 보더병 바이러스로부터 선택되는 용도.
  13. 제6항에 있어서, 포유동물이 돼지이고, 플라비비리대가 전형적 돼지 열 바이러스인 용도.
  14. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 플라비비리대 바이러스가 H57, G137, S139, A156 및 A157로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 NS3 프로테아제를 포함하는 용도.
  15. 제1항에서 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물을 포함하는, 플라비비리대 과의 바이러스를 억제하기에 유효한 조성물을 내부에 함유하고 당해 조성물이 플라비비리대 과의 바이러스 감염을 치료하는데 사용될 수 있음을 지시하는 표지를 포함는 포장재를 포함하는 제품.
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