KR101446049B1 - 뎅기 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

뎅기 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뎅기열(Dengue fever)의 원인이 되는 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성을 억제하는 새로운 저해소재를 개발한 것으로, NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 유전자를 미생물을 이용하여 발현 후 가상 스크리닝 방법을 이용하여 제시 된 활성 저해 후보물질의 활성을 측정 평가하여 뎅기 바이러스의 단백질 분해 효소의 활성을 억제할 수 있는 우수한 신규 소재를 제공함으로써 뎅기열 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

뎅기 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물{Compositions for treatment or prevention of dengue virus related deseases}
본 발명은 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 활성 저해물질의 스크리닝 방법 및 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 생산방법에 관한 것이다.
뎅기 바이러스는 모기에 의해서 전달이 되며 열대 또는 아열대 지역에서 발견되나, 최근, 전염이 도시와 인근 지역까지 확산되면서 국제적인 공공위생 우려의 대상이 되고 있다. Aedes aegypti 모기가 뎅기 바이러스의 주된 전달자(carrier)이며, 암컷 모기가 사람을 물면서 전염이 시작된다. 4 내지 10일 간의 배양기를 거치면 감염된 모기는 이 바이러스를 전 생애 기간 동안 전파를 할 수 있게 된다. 감염된 사람은 또한 주된 바이러스의 전달자(carrier)가 되고, 바이러스를 증식 시키게 되며, 이후 감염 안 된 모기가 감염된 사람을 물면 바이러스를 제공하는 주체가 된다. 이미 뎅기 바이러스에 감염된 환자는 처음 증상이 나타난 후 대략 4-5일, 최대 12일 후에 Aedes 모기를 매개로 바이러스를 전파할 수 있게 된다.
뎅기 바이러스(Dengue virus)는 플라비 바이러스(Flavivirus)속에 속하는 것으로, 뎅기 바이러스의 감염에 의해서 뎅기열(dengue fever), 뎅기 출혈열(dengue hemorrhagic fever) 등이 발병한다. 또한 Severe dengue(이전에는 뎅기출혈열로 알려짐)는 1950년대 필리핀과 태국에서 유행성 뎅기가 발생하면서 알려지기 시작하였다. 오늘날 대부분의 아시아와 라틴아메리카 국가들에 영향을 주고 있고, 최근에는 이 지역의 어린이들 사망과 입원의 가장 큰 요인이 되고 있다(http://www.who.int/topics/dengue/en/).
뎅기열과 밀접하게 관련된 뎅기열 바이러스의 4가지의 혈청형(serotype)은 DEN-1, DEN-2, DEN-3 그리고 DEN-4로, 특정 타입의 바이러스에 감염 후 회복되면 생애 전 기간 동안 그 타입에 대해서 면역이 생기게 된다. 하지만 다른 타입에 대한 면역은 일시적으로만 생기게 되어 다른 타입의 감염에 의해서 Severe dengue로 발전 될 수가 있다.
뎅기 바이러스는 단일 가닥으로 된 RNA 게놈(genome)을 가지고 있고, 바이러스 캡시드 단백질로 패키징되어 있고, 2가지의 당단백질 180 개로 둘러싸여 있다. 바이러스 크기는 지름이 50nm이고, 대략 10.7 kb의 하나의 당단백질을 코딩하는 (+)sense RNA 게놈을 가지고 있다. 바이러스의 5'-말단은 3가지의 구조적 단백질들을 암호화(encode)하는데, 캡시드(capsid: C), 성숙한 비리온(virion)의 세포막 단백질을 형성하기위해 호스트 단백질 분해효소인 퓨린(furin)에 의해서 분해되어 형성된 세포막 전구(precursor) 단백질(prM) 그리고 바이러스 입자의 외피(envelope)를 구성하는 envelope(E)이 그것들이다.
바이러스의 복제를 위하여 필수적인 7가지의 비구조적 단백질(non-structural proteins)들은 나머지 게놈에 의해 정보가 제공된다. 이들 단백질들의 순서는 5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′이다. 이중 NS3pro는 특히 바이러스의 복제와 성숙한 비리온(virion)을 만드는 역할을 한다. 비-구조적 3(NS3)은 다단백질의 프로세스와 게놈의 복제를 위하여 필요한 2가지 단백질 중 한 가지로 항바이러스 소재 개발의 목표 단백질로 여겨지고 있다.
한편, 최근 고-처리 가상스크리닝(high-throughput virtual screening)은 특히 구조-기반 가상스크리닝(structural-based virtual screening)으로, 신약 후보 리드 화합물의 발견에 있어 정확도가 높고, 비용이 저렴하며, 시간을 절약할 수 있는 방법으로 모든 화합물들의 효능을 일일이 확인하는 고-처리 가상스크리닝을 대신 할 방법으로 제시되고, 지속적으로 발전하고 있다. 이 방법은 효소의 새로운 활성 저해소재를 발견하는데 적용할 수 있어, 단백질 활성 저해 후보 물질인 리간드와 단백질 활성 부위와의 결합 가능 정도를 계산[도킹(docking)]하고, 결합이 우수한 정도를 비교하게 된다[ Bioorg . Med . Chem . Lett . 2011, 21, 3088]. 최근, 그리드활용 플랫폼(Grid application platform; GAP)과 그리드활용 플랫폼-작동 가상스크리닝 서비스(GAP-enabled virtual screening service)는 Autodock 3.0.5 docking engine을 이용하여 구축되었다[ Grid Computing 2010, 8, 529].
이에 본 발명자들은 숙주세포 내에서 뎅기 바이러스의 증식을 억제하는 물질을 찾고자 노력한 결과, 가상 스크리닝 후 얻은 결합에너지 데이터를 바탕으로 핵심 단백질 분해효소인 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 활성을 억제하는 새로운 화합물들을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
[Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 3088] [Grid Computing 2010, 8, 529]
본 발명의 목적은 뎅기 바이러스(Dengue virus) 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 활성 억제 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 4-(2,6-비스(3-하이드록시페닐)-1,3,5,7-테트라옥소-1,2,3,5,6,7-헥사하이드로피롤로[3,4-f]이소인돌-4-카보닐)벤조산; 5-((4-클로로-5-메틸-3-니트로-1H-피라졸-1-릴)메틸)-N-(1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H 벤조[d]이미다졸-2-릴)퓨란-2-카박스아미드; 1-(4-(2,5-디메틸페닐)피페라진-1-릴)-4-(10-메틸비스([1,2,4]트리아졸로)[4,3-a:1′,5′-c]퀴나졸린-3-릴)부탄-1-온; 2,6-비스(1,3-디옥소-2-페닐이소인돌린-5-릴)피롤로[3,4-f]이소인돌-1,3,5,7(2H,6H)-테드라온; 3-((8-벤조일-1-메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴노살린-4-릴)아미노)벤조산; 5,7-디메틸-6-(3-메틸벤조일)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-릴)(4-(2,5-디메딜페닐)피페라진-1-릴)메탄온; N-(2-벤조일-4-브로모페닐)-3-((6-브로모-4-페닐퀴나졸린-2-릴)아미노)벤즈아마이드; N-(3-(피페리딘-1-릴)프로필)-1-(6-(p-톨릴)이미다조[2,1-b][1,3,4]티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드; N-사이클로헵틸-3-(3-메톡시페닐)-4-옥소-3,4-디하이드로펩탈라진-1-카복스아마이드; [1,1′-비페닐]-4,4′-디일비스((3-아미노-4,5,6-트리메틸티에노[2,3-b] 피리딘-2-일)메탄온); 4-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-10-(4-(tert-부틸)페닐)-2,6,-트리옥소-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티아피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)부탄산; 2-(5-(4-플루오르페닐)-3-(티오펜-2-릴)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)-4- (4-(피페리딘-1-릴술포닐)페닐)티아졸; 5-(5,6-디브로모-1,3-디옥소헥사하이드로-1H-4,7-메타노이소인돌-2(3H)-릴)-2-모르폴리노벤조산; 4-(3-아세틸-5-(2-페닐퀴놀린-4-릴)-2,3-디하이드로-1,3,4-옥사디아졸-2-릴) 벤조산; 2-(4-((5-메틸-2-(m-톨릴)-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-7-릴)아미노)페닐)아세트산; 2-(1-이소부틸-5,5-디메틸-3-(나노프탈렌-1-릴)-2-옥소이미다졸리딘-4-릴)-4-(나프탈렌-1-릴)-1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디온; 3-(((1-메틸-1H-테트라졸-5-릴)티오)메틸)-7-(2-(5-메틸-4-니트로-1H-피라졸-1-yl)아세트아미도)-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클[4.2.0]옥트-2-엔-2-카르복산; 1-(5-(4-(4-(5-클로로-2-메틸페닐)피페라진-1-카르보닐)피페리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피롤리딘-2-온; 메틸 2-((1-(4,6-디(피페리딘-1-릴)-1,3,5-트리아진-2-릴)-1H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)아세테이트; N-(4-((2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-릴)-1,3-디옥소이소인돌-5-릴)옥시)페닐)-1-옥소-4-페닐-1H-이소크로메넨-3-카르복스아마이드; 2-(3-(2-(3,5-디페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)티아졸-4-릴)페닐)이소인돌린-1,3-딘; 5-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)-3,6-비스 (2,6-디메틸페닐)-2-티옥소-2,3-디하이드로티아졸로[4,5-d]피리미딘-7(6H)-온); N-(3-(4-시클로헥실피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드; 3-(3,7-디메틸-6-옥소-1-페닐-6,7-디하이드로-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-5-릴)-N-(2-(4-메틸피페라진-1-릴)에틸)프로판아마이드}; 4,4′-(1,1′-(1,4-페닐렌비스(메틸렌))비스(1H-벤조[d]이미다졸레-2,1-디릴))비스(1,2,5-옥사디아졸-3-아민); N-(1,5-디메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디하이드로-1H-피라졸-4-릴)-2-((5,9-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴놀린-1-릴)티오)아세트아마이드; 4-((3-(아제판-1-릴)-6-옥소-6H-안트라[1,9-cd]이소사졸-5-릴)아미노)부탄산; N-사이클로헵틸-2,5-디메틸-4-(4-(피리딘-2-릴)피페라진-1-릴)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아마이드; 3-((6-(3-플루오르페닐)피리다진-3-릴)아미노)-N-(2-(피페리딘-1-릴)에틸) 벤자마이드; N-(3-(4-에틸피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드; N2,N2-디메틸-6-(((4-메틸-5-((2-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-1-릴)메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)메틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민; N-(1-벤질-1H-벤조[d]이미다졸-2-릴)-5-((3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸-1-릴)메틸)퓨란-2-카복스아마이드; (E)-1,4-비스((5,6-디페닐-1,2,4-트리아진-3-릴)티오)부트-2-엔; 2-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-2,6,8-트리옥소-3,10-디페닐-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티오피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)아세트산; 3,3′-(에탄-1,2-디릴)비스(2-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)퀴나졸린-4(3H)-온); 및 2-(3-플루오르메틸)-7-((2-(3-플루오르페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-릴)메틸)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 화합물들은 NS2B-NS3 프로테아제 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) pPICZαA 벡터의 다중 클로닝 위치에 서열번호 1로 이루어진 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 유전자를 도입하여 α-factor 신호펩티드 바로 뒤에 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제를 포함하는 재조합 벡터(pPICZ αA-NS2B-NS3pro)를 제작하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 수득된 재조합 벡터(pPICZ αA-NS2B-NS3pro)를 이용하여 효모균을 형질전환 시키는 단계; 및
(3) 상기 단계(2)에서 수득된 형질전환된 효모를 배양한 뒤 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease), 기질인 N 말단 또는 C말단에 형광물질 및 형광소멸자(quencher)를 포함하는 펩타이드 및 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해 후보 물질을 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 반응 후, 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해물질을 선별하는 단계를 포함하는 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화합물 (1) 내지 (36) 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
(1) 4-(2,6-비스(3-하이드록시페닐)-1,3,5,7-테트라옥소-1,2,3,5,6,7-헥사하이드로피롤로[3,4-f]이소인돌-4-카보닐)벤조산 {4-(2,6-bis(3-hydroxyphenyl)-1,3,5,7-tetraoxo-1,2,3,5,6,7-hexahydropyrrolo[3,4-f]isoindole-4-carbonyl)benzoic acid};
(2) 5-((4-클로로-5-메틸-3-니트로-1H-피라졸-1-릴)메틸)-N-(1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H 벤조[d]이미다졸-2-릴)퓨란-2-카박스아미드 {5-((4-chloro-5-methyl-3-nitro-1H-pyrazol-1-yl)methyl)-N-(1-(2-(diethylamino)ethyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)furan-2-carboxamide};
(3) 1-(4-(2,5-디메틸페닐)피페라진-1-릴)-4-(10-메틸비스([1,2,4]트리아졸로)[4,3-a:1′,5′-c]퀴나졸린-3-릴)부탄-1-온 {1-(4-(2,5-dimethylphenyl)piperazin-1-yl)-4-(10-methylbis([1,2,4]triazolo)[4,3-a:1′,5′-c]quinazolin-3-yl)butan-1-one};
(4) 2,6-비스(1,3-디옥소-2-페닐이소인돌린-5-릴)피롤로[3,4-f]이소인돌-1,3,5,7(2H,6H)-테트라온 {2,6-bis(1,3-dioxo-2-phenylisoindolin-5-yl)pyrrolo[3,4-f]isoindole-1,3,5,7(2H,6H)-tetraone};
(5) 3-((8-벤조일-1-메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴노살린-4-릴)아미노)벤조산 {3-((8-benzoyl-1-methyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-yl)amino)benzoic acid};
(6) 5,7-디메틸-6-(3-메틸벤조일)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-릴)(4-(2,5-디메딜페닐)피페라진-1-릴)메탄온 {5,7-dimethyl-6-(3-methylbenzyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)(4-(2,5-dimethylphenyl)piperazin-1-yl)methanone};
(7) N-(2-벤조일-4-브로모페닐)-3-((6-브로모-4-페닐퀴나졸린-2-릴)아미노)벤즈아마이드 {N-(2-benzoyl-4-bromophenyl)-3-((6-bromo-4-phenylquinazolin-2-yl)amino)benzamide};
(8) N-(3-(피페리딘-1-릴)프로필)-1-(6-(p-톨릴)이미다조[2,1-b][1,3,4]티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드 {N-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1-(6-(p-tolyl)imidazo[2,1-b][1,3,4]thiadiazol-2-yl)piperidine-3-carboxamide};
(9) N-사이클로헵틸-3-(3-메톡시페닐)-4-옥소-3,4-디하이드로펩탈라진-1-카복스아마이드 {N-cycloheptyl-3-(3-methoxyphenyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazine-1-carboxamide};
(10) 1,1′-비페닐]-4,4′-diylbis((3-amino-4,5,6-trimethylthieno[2,3-b]pyridin-2-yl)methanone) {1,1′-biphenyl]-4,4′-diylbis((3-amino-4,5,6-trimethylthieno[2,3-b]pyridin-2-yl)methanone)};
(11) 4-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-10-(4-(tert-부틸)페닐)-2,6,8-트리옥소-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티아피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)부탄산 {4-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-10-(4-(tert-butyl)phenyl)-2,6,8-trioxo-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-decahydro-5,9-methanothiazolo[5′,4′:5,6]thiopyrano[2,3-f]isoindol-7(8H)-yl)butanoic acid};
(12) 2-(5-(4-플루오르페닐)-3-(티오펜-2-릴)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)-4- (4-(피페리딘-1-릴술포닐)페닐)티아졸 {2-(5-(4-fluorophenyl)-3-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)-4-(4-(piperidin-1-ylsulfonyl)phenyl)thiazole};
(13) 5-(5,6-디브로모-1,3-디옥소헥사하이드로-1H-4,7-메타노이소인돌-2(3H)-릴)-2-모르폴리노벤조산 {5-(5,6-dibromo-1,3-dioxohexahydro-1H-4,7-methanoisoindol-2(3H)-yl)-2-morpholinobenzoic acid};
(14) 4-(3-아세틸-5-(2-페닐퀴놀린-4-릴)-2,3-디하이드로-1,3,4-옥사디아졸-2-릴) 벤조산 {4-(3-acetyl-5-(2-phenylquinolin-4-yl)-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid};
(15) 2-(4-((5-메틸-2-(m-톨릴)-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-7-릴)아미노)페닐)아세트산 {2-(4-((5-methyl-2-(m-tolyl)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino)phenyl)acetic acid};
(16) 2-(1-이소부틸-5,5-디메틸-3-(나노프탈렌-1-릴)-2-옥소이미다졸리딘-4-릴)-4-(나프탈렌-1-릴)-1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디온 {2-(1-isobutyl-5,5-dimethyl-3-(naphthalen-1-yl)-2-oxoimidazolidin-4-yl)-4-(naphthalen-1-yl)-1,2,4-oxadiazolidine-3,5-dione};
(17) 3-(((1-메틸-1H-테트라졸-5-릴)티오)메틸)-7-(2-(5-메틸-4-니트로-1H-피라졸-1-yl)아세트아미도)-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클[4.2.0]옥트-2-엔-2-카르복산 {3-(((1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)thio)methyl)-7-(2-(5-methyl-4-nitro-1H-pyrazol-1-yl)acetamido)-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid};
(18) 1-(5-(4-(4-(5-클로로-2-메틸페닐)피페라진-1-카르보닐)피페리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피롤리딘-2-온 {1-(5-(4-(4-(5-chloro-2-methylphenyl)piperazine-1-carbonyl)piperidin-1-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyrrolidin-2-one};
(19) 메틸 2-((1-(4,6-디(피페리딘-1-릴)-1,3,5-트리아진-2-릴)-1H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)아세테이트
{methyl2-((1-(4,6-di(piperidin-1-yl)-1,3,5-triazin-2-yl)-1H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetate};
(20) N-(4-((2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-릴)-1,3-디옥소이소인돌-5-릴)옥시)페닐)-1-옥소-4-페닐-1H-이소크로메넨-3-카르복스아마이드 {N-(4-((2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-1,3-dioxoisoindolin-5-yl)oxy)phenyl)-1-oxo-4-phenyl-1H-isochromene-3-carboxamide};
(21) 2-(3-(2-(3,5-디페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)티아졸-4-릴)페닐)이소인돌린-1,3-딘 {2-(3-(2-(3,5-diphenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)thiazol-4-yl)phenyl)isoindoline-1,3-dione};
(22) 5-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)-3,6-비스 (2,6-디메틸페닐)-2-티옥소-2,3-디하이드로티아졸로[4,5-d]피리미딘-7(6H)-온) {5-(((7-chloro-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl)thio)-3,6-bis(2,6-dimethylphenyl)-2-thioxo-2,3-dihydrothiazolo[4,5-d]pyrimidin-7(6H)-one)};
(23) N-(3-(4-시클로헥실피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드 {N-(3-(4-cyclohexylpiperazin-1-yl)propyl)-1-(5-(2-oxopyrrolidin-1-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)piperidine-3-carboxamide};
(24) 3-(3,7-디메틸-6-옥소-1-페닐-6,7-디하이드로-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-5-릴)-N-(2-(4-메틸피페라진-1-릴)에틸)프로판아마이드 {3-(3,7-dimethyl-6-oxo-1-phenyl-6,7-dihydro-1H-pyrazolo[3,4-b]pyrazin-5-yl)-N-(2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethyl)propanamide};
(25) 4,4′-(1,1′-(1,4-페닐렌비스(메틸렌))비스(1H-벤조[d]이미다졸레-2,1-디릴))비스(1,2,5-옥사디아졸-3-아민) {4,4′-(1,1′-(1,4-phenylenebis(methylene))bis(1H-benzo[d]imidazole-2,1-diyl))bis(1,2,5-oxadiazol-3-amine)};
(26) N-(1,5-디메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디하이드로-1H-피라졸-4-릴)-2-((5,9-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴놀린-1-릴)티오)아세트아마이드 {N-(1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl)-2-((5,9-dimethyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinolin-1-yl)thio)acetamide};
(27) 4-((3-(아제판-1-릴)-6-옥소-6H-안트라[1,9-cd]이소사졸-5-릴)아미노)부탄산 {4-((3-(azepan-1-yl)-6-oxo-6H-anthra[1,9-cd]isoxazol-5-yl)amino)butanoic acid};
(28) N-사이클로헵틸-2,5-디메틸-4-(4-(피리딘-2-릴)피페라진-1-릴)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아마이드 {N-cycloheptyl-2,5-dimethyl-4-(4-(pyridin-2-yl)piperazin-1-yl)thieno[2,3-d]pyrimidine-6-carboxamide};
(29) 3-((6-(3-플루오르페닐)피리다진-3-릴)아미노)-N-(2-(피페리딘-1-릴)에틸) 벤자마이드 {3-((6-(3-fluorophenyl)pyridazin-3-yl)amino)-N-(2-(piperidin-1-yl)ethyl)benzamide};
(30) N-(3-(4-에틸피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드 {N-(3-(4-ethylpiperazin-1-yl)propyl)-1-(5-(2-oxopyrrolidin-1-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)piperidine-3-carboxamide};
(31) N2,N2-디메틸-6-(((4-메틸-5-((2-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-1-릴)메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)메틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민 {N2,N2-dimethyl-6-(((4-methyl-5-((2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)methyl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine};
(32) N-(1-벤질-1H-벤조[d]이미다졸-2-릴)-5-((3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸-1-릴)메틸)퓨란-2-카복스아마이드 {N-(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-5-((3-nitro-1H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl)furan-2-carboxamide};
(33) (E)-1,4-비스((5,6-디페닐-1,2,4-트리아진-3-릴)티오)부트-2-엔 {(E)-1,4-bis((5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-3-yl)thio)but-2-ene}
(34) 2-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-2,6,8-트리옥소-3,10-디페닐-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티오피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)아세트산 {2-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-2,6,8-trioxo-3,10-diphenyl-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-decahydro-5,9-methanothiazolo[5′,4′:5,6]thiopyrano[2,3-f]isoindol-7(8H)-yl)acetic acid};
(35) 3,3′-(에탄-1,2-디릴)비스(2-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)퀴나졸린-4(3H)-온) {3,3′-(ethane-1,2-diyl)bis(2-(((7-chloro-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl)thio)quinazolin-4(3H)-one)}; 및
(36)2-(3-플루오르메틸)-7-((2-(3-플루오르페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-릴)메틸)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온 {2-(3-fluorophenyl)-7-((2-(3-fluorophenyl)-4-oxo-4H-benzo[d][1,3]oxazin-6-yl)methyl)-4H-benzo[d][1,3]oxazin-4-one}.
본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 상기의 36가지의 화합물들 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 뎅기바이러스의 NS2B-NS3 프로테아제 활성의 저해를 나타낸다. 구체적으로 상기 36종의 화합물은 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 활성부위(active site)에서 소수성 상호작용 및 수소결합하여, 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제가 기질을 가수분해하는 것을 저해한다.
본 발명에서는 Chemdiv ligand library의 300,000개의 화합물을 그리드활용 플랫폼작동 가상스크리닝 서비스 플랫폼에서 Autodock 3.0.5 프로그램을 이용하여 도킹을 수행하고, NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 저해할 수 있는 화합물들을 선별하였다[Grid Computing 2010, 8, 529]. 선별한 화합물은 가상스크리닝 후 얻은 결합에너지 데이터를 바탕으로 선별한 것으로, 화합물과 표적 단백질간의 결합정도 계산은 AutoDock(version 3.0.5)을 가지고 수행하였다. 그리고 나서 본 발명에서는 NS2B-NS3Pro에 대한 저해 특성이 우수한 화합물을 확인하기 위해서, NS2B-NS3Pro의 활성 단백질을 발현하여, 선별된 화합물의 신규 저해 소재의 NS2B-NS3Pro에 대한 저해 특성을 확인함으로써 상기의 36가지의 화합물이 NS2B-NS3 프로테아제 활성의 저해를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분은 상기 화합물들 중 바람직하게는 (2), (5), (12), (14), (22), (27), 및 (29)의 화합물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 화합물들 중 (2), (14) 및 (22) 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
본 발명의 유효성분으로 포함되는 상기 36종의 화합물은 모두 뎅기바이러스의 NS2B-NS3 프로테아제 활성을 나타냄으로써 뎅기 바이러스 관련 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있으나, 이중 특히 (2), (5), (12), (14), (22), (27), 및 (29)가 NS2B-NS3 프로테아제의 저해 활성이 우수한 것을 본 발명의 일 실시예에서 확인할 수 있었으며, 또한 화합물 (2), (14) 및 (22)가 더욱 우수한 저해 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
화합물 (2), (14) 및 (22)의 구조식은 하기와 같다.
(2) 5-((4-클로로-5-메틸-3-니트로-1H-피라졸-1-릴)메틸)-N-(1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H 벤조[d]이미다졸-2-릴)퓨란-2-카박스아미드.
Figure 112013003426036-pat00001
(14) 4-(3-아세틸-5-(2-페닐퀴놀린-4-릴)-2,3-디하이드로-1,3,4-옥사디아졸-2-릴) 벤조산.
Figure 112013003426036-pat00002
(22) 5-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)-3,6-비스(2,6-디메틸페닐)-2-티옥소-2,3-디하이드로티아졸로[4,5-d]피리미딘-7(6H)-온.
Figure 112013003426036-pat00003
상기 화합물 (2), (14) 및 (22)의 Ki 값은 각각 4.04±0.43, 4.86±0.25 및 3.39±0.11 μM이다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 36종의 화합물이 NS2B-NS3 프로테아제 저해 활성을 나타내는 것을 I확인하였으며, 특히 (2), (5), (12), (14), (22), (27), 및 (29) 의 IC50 값은 3.90 ± 0.55 내지 86.69 ± 3.61 μM 으로 NS2B-NS3 프로테아제에 더욱 좋은 저해 활성을 보였다.
본 발명의 조성물은 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에 영향을 미치는 것으로 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 선별적 저해를 필요로 하는 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 뎅기 바이러스 관련 질환의 바람직한 일례로는 뎅기열이 있으며, 뎅기열은 구체적으로 고전적 뎅기열, 뎅기출혈열 증후군, 및 뎅기쇼크증후군으로 분류할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있고, 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제 및 멸균 분제 중에서 선택된 제형으로 제형화 될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 조성물은 경구, 직장, 코, 폐, 국소, 경피, 저장기(intracisternal), 복강 내, 질 및 비경구(피하, 근육 내, 관부 내(intrathecal), 정맥 내 및 피부 내를 포함) 경로와 같은 임의의 적합한 경로로 투여되기 위해 구체적으로 제형화 될 수 있으며, 바람직하게는 경구 경로로 투여한다. 바람직한 경로는 치료되는 대상의 일반적인 조건 및 연령, 치료되는 조건의 성질 및 선택되는 활성 성분에 따라 달라질 것이다.
상기 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정제(tablet), 캡슐, 파우더, 과립, 펠렛, 구내정, 당의정, 환약 또는 정제(lozenge), 수성 또는 비-수성 액체 내에 있는 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 경구 또는 주사액의 형태인 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여용 다른 약학적 조성물은 분산액, 현탁액 또는 에멀젼뿐만 아니라 사용하기 전의 멸균 주사용액 또는 분산액 내에 구성되는 멸균 파우더를 포함한다. 데폿(depot) 주사 제형물 또한 본 발명의 영역 내에 있는 것으로 여겨진다. 다른 적합한 투여형태는 좌약, 스프레이, 연고, 크림, 젤, 흡입제, 피부패치 등을 포함한다. 상기 조성물을 제조하기 위해서는 당해 기술분야에 공지된 방법이 이용될 수 있고, 또한 당해 기술분야에서 일반적으로 이용되는 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 희석제, 부형제 또는 다른 첨가제가 이용될 수 있다.
상기의 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 방부제, 안정도 개선 물질, 점도 개선이나 조절 물질, 용해도 개선물질, 감미료, 염료, 미감 개선 화합물, 삼투압을 변화시키는 염, 완충액, 항-산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
한편, 상기 조성물을 뎅기 바이러스 증식 억제용으로 사용하는 경우, 화합물의 양을 기준으로 1 ㎍/㎏ 체중 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 1일 용량으로 투여하는 것이 바람직하지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 상태의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 투약 양은 증감될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 함유되는 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량% 존재하며, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 생산방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 효모균에서 재조합 NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 이용하여 형질전환된 효모균을 배양하고, 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 생산, 분리 및 정제하는 것이다.
구체적으로 본 발명은 하기 단계 (1) 내지 (3)을 포함하는 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 생산방법에 관한 것이다.
(1) pPICZαA 벡터의 다중 클로닝 위치에 서열번호 1로 이루어진 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 유전자를 도입하여 α-factor 신호펩티드 바로 뒤에 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제를 포함하는 재조합 벡터(pPICZ αA-NS2B-NS3pro)를 제작하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 수득된 재조합 벡터(pPICZαA-NS2B-NS3pro)를 이용하여 효모균을 형질전환 시키는 단계; 및
(3) 상기 단계(2)에서 형질전환된 효모를 배양한 뒤 뎅기바이러스 NS2B-NS3 프로테아제를 분리하는 단계.
상기 단계(1)의 재조합 벡터(pPICZαA-NS2B-NS3pro)는 pPICZαA 벡터의 다중 클로닝 위치에 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 유전자를 도입하여 제조되는 것을 특징으로 하며, 상기 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 것이다.
상기 단계 (3)에서 효모균은 피시아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 실시예로 사용한 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)는 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 활성 도메인을 발현 정제한 것이며, 상기 활성 단백질을 발현하기 위하여 pPICZαA(인비트로젠, 미국) 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입하여 α-factor 신호 펩타이드 바로 뒤에 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 PICZαA-NS2B-NS3pro를 제작하였다(도 1 참조). 상기 재조합 벡터 pPICZαA-NS2B-NS3pro를 효모균(Pichia pastoris X-33)에 형질전환 후 배양하고, 이후 배양물을 원심 분리하여 회수된 상등액에 포함된 NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 획득할 수 있다.
상기 생산 방법에 따른 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 크기(kDa)를 웨스턴 블럿(Western Blot) 분석 등으로 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따라 생산된 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)는 약 45 kDa임을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명은 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
(a) 상기 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 생산방법으로 생산한 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease), 기질인 N 말단 또는 C말단에 형광물질 및 형광소멸자(quencher)를 포함하는 펩타이드 및 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해 후보 물질을 혼합하여 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 단계(a)의 반응 후, 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성 저해물질을 선별하는 단계.
상기 단계(a) 및 (b)에서 양성대조군으로 NS2B-NS3 프로테아제(protease)와 기질만을 혼합하여 반응한 것을 비교한다.
본 발명에 따른 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 활성 측정은 기질로서 형광발색이 가능한 테트라펩타이드와의 반응을 통해 확인하는 것으로, (a) 단계에서, 상기 기질은 벤조일-노르루신-리신-아르기닌-아르기닌-7-아미노-4-메틸쿠마린인 것이 바람직하지만, 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성을 확인할 수 있는 기질이라면 어느 것이든 무방하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 활성 저해 화합물을 유효성분으로 포함함으로써, 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용으로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 활성 저해제 스크리닝 방법은 뎅기 바이러스 활성 억제 및 부작용을 최소화할 수 있는 화학물질을 보다 간편하고 신속한 생물학적 방법으로 판별할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 포함하는 재조합 벡터(pPICZαA-NS2B-NS3pro)의 개별지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 정제된 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 웨스턴 블럿(Western Blot) 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
[ 실시예 1] 유전자 확보 및 재조합 발현 벡터 구축
뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 유전정보(도 1 참조)를 바탕으로 서열번호 1의 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 유전자를 합성하였다. 활성 단백질을 발현하기 위하여 pPICZαA(인비트로젠, 미국) 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입하여 α-factor 신호펩타이드 바로 뒤에 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 PICZαA-NS2B-NS3pro를 제작하였다. PICZαA-NS2B-NS3pro는 도 1에 나타낸 바와 같은 개열지도를 갖는다.
[ 실시예 2] 효모균의 형질전환
준비된 컴피턴트 세포인 효모균 Pichia pastoris GS115 (인비트로젠, 미국)에 240㎕ 50% 폴리에틸렌글리콜(poluethylene glycol) 3350, 36㎕의 1M LiCl, 25㎕의 단일가닥 salmon sperm DNA(2 mg/㎖) 그리고 상기 실시예 1에서 얻은 재조합 PICZαA-NS2B-NS3pro DNA(5㎍)를 넣고 1분 동안 격렬하게 혼합하였다. DNA를 삽입하기 위하여 30℃에서 25분 동안 방치 한 후 42 ℃에서 25분 동안 열충격을 가하였다. 그 후, 원심 분리하여 세포만 회수한 후 이를 다시 1 ㎖의 YPD 배지[1%(w/v) 효모 추출 액, 2%(w/v) 펩톤, 2%(w/v) 포도당]을 넣어주고 30℃에서 1시간 또는 4시간 배양하였다. 이 배양액을 제오신(Zeocin, 100 ㎍/㎖)이 첨가된 YPD 고체배지에서 30℃에서 이틀 동안 배양하였다.
[실시예 3] 재조합 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 의 생산
상기 실시예 2에서 배양된 형질전환 균주를 BMGY[1%(w/v) 효모 추출액, 2%(w/v) 펩톤, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4x10-5% Biotin, 1%(w/v)글리세롤] 배지에서 28℃에서 18시간 배양하였다. 상기 배양물을 원심 분리하여 회수한 세포를 BMMY[1%(w/v) 효모 추출액, 2%(w/v) 펩톤, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 6.0, 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4x10-5%바이오틴, 0.5%(w/v)메탄올] 배지에 OD 600이 1.0이 되도록 현탁한 후, 28℃ 에서 4일 동안 배양하였다. 효소 발현을 위해 최종농도 1.0% 메탄올을 24시간마다 배양액에 첨가하였다. 얻어진 배양액의 상등액을 PICZαA-NS2B-NS3pro 활성을 확인 하는데 사용하였다. 본 발명에 따른 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제는 알라닌을 시작으로 244개의 아미노산으로 구성되며(서열번호 2 참조), C-말단에는 6개의 히스티딘 태크(Histidine tag)가 붙어있어 단백질 정제가 용이하다.
[ 실시예 4] 재조합 뎅기 바이러스 NS2B - NS3 프로테아제( protease ) 의 분리 정제
상기 실시예 3에서 얻어진 2 ℓ의 배양 상등액으로부터 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 를 다음과 같은 방법으로 순수하게 분리 정제하였다. 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 이용하여 배양 상등액의 완충액을 20 mM Tris-Cl buffer (pH 7.5)로 교환하였다. 이를 암모늄 설페이트 침전 분획방법을 이용하여 60, 70, 80 및 85% 암모늄 설페이트를 첨가하면서 상등액의 단백질을 분리하였다. 각 암모늄 설페이트 분획에서 얻어진 단백질 침전물을 회수하여 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) 완충용액에 녹이고 염을 제거하기 위해 5 ℓ의 20 mM Tris-Cl (pH 7.5) 완충용액에 24시간 동안 투석을 실시하였다. 이후 샘플은 50mM NaCl이 포함되어 있는 40 mM Tris-Cl buffer (pH 7.5)로 평형화한 DEAE-Sepharose 컬럼을 이용하여 추가 정제를 하였다. 정제 효소의 활성은 하기 실시예 5와 동일한 방법으로 활성을 측정하였다.
본 발명에 따른 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)의 존재를 확인하기 위하여 12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 30 mA의 조건으로 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후, 젤을 염색 용액(쿠마시에 브릴리언트 블루 R-250 1 g, 아세트산 100 ㎖, 메탄올 450 ㎖, 증류수, 450 ㎖)으로 염색하고, 탈색용액(메탄올 100 ㎖, 아세트산 10 ㎖, 증류수 800 ㎖) 300 ㎖를 3 내지 5회 교환해주면서 탈색하였다. 도 4의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 단백질의 크기는 약 45 kDa임을 확인하였다. 레인 1, 2, 3은 induction 후 48, 72 및 96 시간 후의 상등액 샘플이 다. 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 는 C-말단에 6개의 히스티딘 태그가 붙어있어 이와 반응하는 anti-His 항체를 이용한 웨스턴 블럿(Western Blot) 분석을 통해 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease)를 확인하였다.
[ 실시예 5] 재조합 뎅기 바이러스 NS2B - NS3 프로테아제에 대한 저해활성을 갖는 화합물의 선별
(1) 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에 대한 활성 조사
뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 분석에 이용되는 기질은 합성 펩타이드 (tetrapeptide 벤조일-노르루신(norleucine)-리신(lysine)-아르기닌(arginine)-아르기닌-7-아미노-4-메틸 쿠마린(coumarin), Bachem, 스위스)이다 [Anal. Biochem. 2009, 395, 195].
재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 활성을 확인하기 위하여, 기질은 최종농도 20 μM 농도로 20 mM Tris 완충액(pH 7.5)에 녹여 사용하였다. 상기 실시예 4에서 수득한 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 3㎍을 각각의 최종농도 100 μM의 36종의 화합물(ChemDiv 사로부터 구입, San Diego, CA, USA)과 혼합하여 25℃에서 25분 반응시킨 후, 반응 산물은 형광 마이크로 플레이트 리더 SpectraMax Gemini XPS (Molecular Devices, USA) 기기를 이용하여 형광 세기(흡수(exitation) 380 nm, 방출(emission) 460nm)를 측정하여 모니터하였다. 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제에 의해 기질이 분해됨에 따라 형광세기가 증가하게 되는데 이를 이용하여 저해 후보물질들에 대한 활성저해를 측정하였다.
재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제 활성 저해를 비교하기 위하여, 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제와 기질만을 포함하는 반응액을 대조군으로 사용하였다.
하기 표 1에 36종의 화합물의 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 활성저해효과를 나타내었다. 또한 36종의 활성 저해 물질 중에서 보다 우수한 활성저해를 나타내는 7종의 화합물로 선별하여, 별도로 하기 표 2에 7종의 화학물질들의 명칭 및 상대적 활성저해 및 50% 저해 농도(IC50) 를 나타내었다. 활성 저해의 기준은 화합물을 첨가하지 않았을 때의 재조합 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제의 활성저해를 0%라 하고 화합물 첨가 후의 저해 효과에 의해 나타나는 활성을 %로 표시하였다. 즉 더 높은 %의 수치는 더 높은 효소 저해 특성을 나타낸다.
36종의 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성저해물질
화합물 번호 Chemdiv ID (http://eu.chemdiv.com) 활성
저해(%)
1 2036-0800 15.05
2 6049-2540 95.23
3 C684-0059 2.61
4 8007-4601 4.64
5 E881-0223 58.83
6 K785-0146 8.61
7 2688-0025 21.31
8 E626-0966 33.48
9 K979-0542 23.33
10 8009-4947 7.59
11 D008-0060 12.46
12 3011-0208 85.17
13 8011-5845 5.55
14 G642-2349 98.15
15 G608-0283 17.36
16 8004-3490 33.28
17 D052-0041 23.01
18 E017-0021 0.15
19 D385-0151 10.28
20 K953-0293 28.87
21 8005-2734 21.27
22 K286-0036 91.65
23 G397-0661 17.71
24 G426-0201 29.46
25 5692-1397 36.45
26 D308-0105 28.11
27 C090-0497 82.53
28 K823-2046 32.84
29 F575-0314 66.55
30 E017-0513 1.3
31 8016-9443 6.49
32 6228-1590 45.55
33 4486-0033 40.52
34 6193-0962 39.67
35 K284-2326 48.66
36 3952-0694 34.33
7종의 뎅기 바이러스 NS2B-NS3 프로테아제(protease) 활성저해물질
화합물 번호 화합물 명칭 활성
저해(%)		 IC50
(μM)
2 5-((4-chloro-5-methyl-3-nitro-1H-pyrazol-1-yl)methyl)-N-(1-(2-(diethylamino)ethyl)-1Hbenzo[d]imidazol-2-yl)furan-2-carboxamide 95.23 15.55 ± 0.91
5 3-((8-benzoyl-1-methyl-[1,2,4]triazolo[4,3-a]quinoxalin-4-yl)amino)benzoic acid 58.83 86.69 ± 3.61
12 2-(5-(4-fluorophenyl)-3-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)-4-(4-(piperidin-1-ylsulfonyl)phenyl)thiazole 85.17 32.18 ± 1.90
14 4-(3-acetyl-5-(2-phenylquinolin-4-yl)-2,3-dihydro-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzoic acid 98.15 12.50 ± 0.54
22 5-(((7-chloro-4-oxo-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl)thio)-3,6-bis(2,6-dimethylphenyl)-2-thioxo-2,3-dihydrothiazolo[4,5-d]pyrimidin-7(6H)-one 91.65 3.90 ± 0.55
27 4-((3-(azepan-1-yl)-6-oxo-6H-anthra[1,9-cd]isoxazol-5-yl)amino)butanoic acid 82.53 26.44 ± 2.61
29 3-((6-(3-fluorophenyl)pyridazin-3-yl)amino)-N-(2-(piperidin-1-yl)ethyl)benzamide 66.55 75.32 ± 1.94
상기 표 1에 기재된 바와 같이 화합물 2, 14 및 22 의 뎅기바이러스 NS2B-N3 프로테아제저해 활성이 특히 좋은 것을 확인할 수 있었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Compositions for treatement of prevention of Dengue virus related deseases <130> P12110251392 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinanat Dengue virus protease <400> 1 gctgatctta gtttagaaaa ggctgcttct gtccagtggg atgaaatggc tgacattacg 60 ggttcatccc caatcattga ggttaaacag gacgaagatg gatccttctc tattagagat 120 gttgaggaaa ccaacatgat aactctgggt ggtgggggtt ccggaggagg agggtcaggt 180 gcattatggg acgtaccctc tcccgcagcc actcaaaaag ccacactaag tgagggtgtc 240 tacaggatta tgcaacgagg cttgtttgga aaaactcaag tcggagtcgg aatacacatg 300 gagggagttt ttcacacaat gtggcatgta acaagaggtt ctgttatctg tcatgaaacc 360 ggtcgattgg aacctagttg ggctgatgtg agaaatgaca tgatatctta cggtggtgga 420 tggcgtctgg gagataagtg ggacaaagag gaggacgtgc aagtgttggc cattgaacca 480 ggcaaaaacc caaagcatgt tcaaaccaag cctggacttt tcaagacatt gactggcgag 540 atcggtgcag tcacacttga ctttaagcca ggtacttctg gatcacctat cattaacaaa 600 aagggcaagg ttataggtct gtacggaaat ggtgtggtta ccaaatctgg cgattatgtt 660 tccgccatta cgcaggctga acgtatcggg gaacctgatt atgaagtaga tgaagatatc 720 tttagaaaga aa 732 <210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinanat Dengue virus protease amino acid <400> 2 Ala Asp Leu Ser Leu Glu Lys Ala Ala Ser Val Gln Trp Asp Glu Met 1 5 10 15 Ala Asp Ile Thr Gly Ser Ser Pro Ile Ile Glu Val Lys Gln Asp Glu 20 25 30 Asp Gly Ser Phe Ser Ile Arg Asp Val Glu Glu Thr Asn Met Ile Thr 35 40 45 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Leu Trp Asp 50 55 60 Val Pro Ser Pro Ala Ala Thr Gln Lys Ala Thr Leu Ser Glu Gly Val 65 70 75 80 Tyr Arg Ile Met Gln Arg Gly Leu Phe Gly Lys Thr Gln Val Gly Val 85 90 95 Gly Ile His Met Glu Gly Val Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg 100 105 110 Gly Ser Val Ile Cys His Glu Thr Gly Arg Leu Glu Pro Ser Trp Ala 115 120 125 Asp Val Arg Asn Asp Met Ile Ser Tyr Gly Gly Gly Trp Arg Leu Gly 130 135 140 Asp Lys Trp Asp Lys Glu Glu Asp Val Gln Val Leu Ala Ile Glu Pro 145 150 155 160 Gly Lys Asn Pro Lys His Val Gln Thr Lys Pro Gly Leu Phe Lys Thr 165 170 175 Leu Thr Gly Glu Ile Gly Ala Val Thr Leu Asp Phe Lys Pro Gly Thr 180 185 190 Ser Gly Ser Pro Ile Ile Asn Lys Lys Gly Lys Val Ile Gly Leu Tyr 195 200 205 Gly Asn Gly Val Val Thr Lys Ser Gly Asp Tyr Val Ser Ala Ile Thr 210 215 220 Gln Ala Glu Arg Ile Gly Glu Pro Asp Tyr Glu Val Asp Glu Asp Ile 225 230 235 240 Phe Arg Lys Lys

Claims (9)

  1. 하기 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 고전적 뎅기열, 뎅기 출혈열 증후군 및 뎅기쇼크증후군으로 구성된 군에서 선택된 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
    4-(2,6-비스(3-하이드록시페닐)-1,3,5,7-테트라옥소-1,2,3,5,6,7-헥사하이드로피롤로[3,4-f]이소인돌-4-카보닐)벤조산;
    5-((4-클로로-5-메틸-3-니트로-1H-피라졸-1-릴)메틸)-N-(1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H 벤조[d]이미다졸-2-릴)퓨란-2-카박스아미드;
    1-(4-(2,5-디메틸페닐)피페라진-1-릴)-4-(10-메틸비스([1,2,4]트리아졸로)[4,3-a:1′,5′-c]퀴나졸린-3-릴)부탄-1-온;
    2,6-비스(1,3-디옥소-2-페닐이소인돌린-5-릴)피롤로[3,4-f]이소인돌-1,3,5,7(2H,6H)-테트라온;
    3-((8-벤조일-1-메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴노살린-4-릴)아미노)벤조산;
    5,7-디메틸-6-(3-메틸벤조일)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-릴)(4-(2,5-디메딜페닐)피페라진-1-릴)메탄온;
    N-(2-벤조일-4-브로모페닐)-3-((6-브로모-4-페닐퀴나졸린-2-릴)아미노)벤즈아마이드;
    N-(3-(피페리딘-1-릴)프로필)-1-(6-(p-톨릴)이미다조[2,1-b][1,3,4]티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드;
    N-사이클로헵틸-3-(3-메톡시페닐)-4-옥소-3,4-디하이드로펩탈라진-1-카복스아마이드;
    [1,1′-비페닐]-4,4′-디일비스((3-아미노-4,5,6-트리메틸티에노[2,3-b] 피리딘-2-일)메탄온);
    4-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-10-(4-(tert-부틸)페닐)-2,6,-트리옥소-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티아피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)부탄산;
    2-(5-(4-플루오르페닐)-3-(티오펜-2-릴)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)-4- (4-(피페리딘-1-릴술포닐)페닐)티아졸;
    5-(5,6-디브로모-1,3-디옥소헥사하이드로-1H-4,7-메타노이소인돌-2(3H)-릴)-2-모르폴리노벤조산;
    4-(3-아세틸-5-(2-페닐퀴놀린-4-릴)-2,3-디하이드로-1,3,4-옥사디아졸-2-릴) 벤조산;
    2-(4-((5-메틸-2-(m-톨릴)-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-7-릴)아미노)페닐)아세트산;
    2-(1-이소부틸-5,5-디메틸-3-(나노프탈렌-1-릴)-2-옥소이미다졸리딘-4-릴)-4-(나프탈렌-1-릴)-1,2,4-옥사디아졸리딘-3,5-디온;
    3-(((1-메틸-1H-테트라졸-5-릴)티오)메틸)-7-(2-(5-메틸-4-니트로-1H-피라졸-1-yl)아세트아미도)-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클[4.2.0]옥트-2-엔-2-카르복산;
    1-(5-(4-(4-(5-클로로-2-메틸페닐)피페라진-1-카르보닐)피페리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피롤리딘-2-온;
    메틸 2-((1-(4,6-디(피페리딘-1-릴)-1,3,5-트리아진-2-릴)-1H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)아세테이트;
    N-(4-((2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-릴)-1,3-디옥소이소인돌-5-릴)옥시)페닐)-1-옥소-4-페닐-1H-이소크로메넨-3-카르복스아마이드;
    2-(3-(2-(3,5-디페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)티아졸-4-릴)페닐)이소인돌린-1,3-딘;
    5-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)-3,6-비스 (2,6-디메틸페닐)-2-티옥소-2,3-디하이드로티아졸로[4,5-d]피리미딘-7(6H)-온);
    N-(3-(4-시클로헥실피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드;
    3-(3,7-디메틸-6-옥소-1-페닐-6,7-디하이드로-1H-피라졸로[3,4-b]피라진-5-릴)-N-(2-(4-메틸피페라진-1-릴)에틸)프로판아마이드};
    4,4′-(1,1′-(1,4-페닐렌비스(메틸렌))비스(1H-벤조[d]이미다졸레-2,1-디릴))비스(1,2,5-옥사디아졸-3-아민);
    N-(1,5-디메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디하이드로-1H-피라졸-4-릴)-2-((5,9-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴놀린-1-릴)티오)아세트아마이드;
    4-((3-(아제판-1-릴)-6-옥소-6H-안트라[1,9-cd]이소사졸-5-릴)아미노)부탄산;
    N-사이클로헵틸-2,5-디메틸-4-(4-(피리딘-2-릴)피페라진-1-릴)티에노[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아마이드;
    3-((6-(3-플루오르페닐)피리다진-3-릴)아미노)-N-(2-(피페리딘-1-릴)에틸) 벤자마이드;
    N-(3-(4-에틸피페라진-1-릴)프로필)-1-(5-(2-옥소피롤리딘-1-릴)-1,3,4-티아디아졸-2-릴)피페리딘-3-카복스아마이드;
    N2,N2-디메틸-6-(((4-메틸-5-((2-메틸-5-니트로-1H-이미다졸-1-릴)메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-릴)티오)메틸)-1,3,5-트리아진-2,4-디아민;
    N-(1-벤질-1H-벤조[d]이미다졸-2-릴)-5-((3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸-1-릴)메틸)퓨란-2-카복스아마이드;
    (E)-1,4-비스((5,6-디페닐-1,2,4-트리아진-3-릴)티오)부트-2-엔;
    2-((4aR,5R,5aR,8aR,9S)-2,6,8-트리옥소-3,10-디페닐-2,3,4a,5,5a,6,8a,9,9a,10-데카하이드로-5,9-메타노티아졸로[5′,4′:5,6]티오피라노[2,3-f]이소인돌-7(8H)-릴)아세트산;
    3,3′-(에탄-1,2-디릴)비스(2-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)퀴나졸린-4(3H)-온); 및
    2-(3-플루오르메틸)-7-((2-(3-플루오르페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-릴)메틸)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 뎅기 바이러스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
    5-((4-클로로-5-메틸-3-니트로-1H-피라졸-1-릴)메틸)-N-(1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H 벤조[d]이미다졸-2-릴)퓨란-2-카박스아미드;
    3-((8-벤조일-1-메틸-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]퀴노살린-4-릴)아미노)벤조산;
    2-(5-(4-플루오르페닐)-3-(티오펜-2-릴)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-릴)-4- (4-(피페리딘-1-릴술포닐)페닐)티아졸;
    4-(3-아세틸-5-(2-페닐퀴놀린-4-릴)-2,3-디하이드로-1,3,4-옥사디아졸-2-릴) 벤조산;
    5-(((7-클로로-4-옥소-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-2-릴)메틸)티오)-3,6-비스 (2,6-디메틸페닐)-2-티옥소-2,3-디하이드로티아졸로[4,5-d]피리미딘-7(6H)-온);
    4-((3-(아제판-1-릴)-6-옥소-6H-안트라[1,9-cd]이소사졸-5-릴)아미노)부탄산; 및
    3-((6-(3-플루오르페닐)피리다진-3-릴)아미노)-N-(2-(피페리딘-1-릴)에틸) 벤자마이드.
  3. 제 1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화합물은 NS2B-NS3 프로테아제 저해 활성을 갖는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 중에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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