KR20050053796A

KR20050053796A - 면역 치료법 및 개량 백신

Info

Publication number: KR20050053796A
Application number: KR1020057008602A
Authority: KR
Inventors: 종 제이. 김; 빈 왕; 진 디. 보이어; 데이비드 비. 웨이너; 벨판디 아이야부
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2005-06-08
Also published as: JP2001507216A; AU5002297A; CN1242045A; CA2745736C; KR20050008860A; CA2751712A1; WO1998017799A1; CA2751712C; CA2745736A1; CN1868545A; EP0958364A4; KR20070108418A; CN1257976C; CA2269074A1; AU729579B2; EP0958364A1; JP2009232860A; JP2008194046A; BR9712852A; KR100780158B1

Abstract

본 발명에는 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및(또는) BL-1를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개량된 백신이 개시되어 있다. 개량된 백신에는 DNA 백신, 외래 항원을 수송하는 재조합 백신 및 약독화된 생백신이 포함된다. 개체의 면역화 방법도 개시되어 있다. IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18, 및 BL-1로 구성된 군으로부터 선택된 면역조절 단백질 1종 이상을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물이 개시되어 있다. 면역조절 단백질, BL1, 및 BL1을 코딩하는 핵산 분자도 개시되어 있다. BL1의 제조 방법 및 용도도 개시되어 있다.

Description

면역 치료법 및 개량 백신 {Immunotherapy and Improved Vaccines}

본 발명은 면역 치료용 조성물 및 면역 치료법, 및 개량된 방어용 및 치료용 백신, 및 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 개량된 예방법 및(또는) 치료법에 관한 것이다.

<배경기술>

백신은 병원체 항원 또는 사람 질병에 연루된 세포와 연관된 항원과 같은 표적 항원에 대해 개체를 면역화하는데 유용하다. 사람 질병에 연루된 세포 관련 항원에는 암 관련 종양 항원 및 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이 포함된다.

어떠한 면역화법이든 총괄적 목적은 면역화된 개체를 그의 생애에 걸쳐 임의의 병원체로부터 방어하는 특정 면역 반응을 유도하는 것이다. 상기 목적을 충족시키는데 있어서 하나의 주된 문제는 각각의 병원체에 대한 방어의 상관 인자가 감염제마다 다르다는 것이다. 따라서, 임상적으로 더욱 효과적인 백신은 표적 병원체에 대해 보다 특이적인 면역 반응을 유도해야만 한다. 면역화법은 특정 병원체에 대한 공지된 방어의 상관 인자에 따라 "집중(focused)"될 수 있도록 고안되야 한다.

이러한 백신 디자인에서, 백신접종한 개체의 세포 내에서 표적 항원을 생산하는 백신이 면역계의 세포 무기화(cellular arm)를 유도하는데 효과적임은 공지되어 있다. 구체적으로, 약독화된 생백신, 비독성 벡터를 사용하는 재조합 백신 및 DNA 백신은 모두 백신접종된 개체의 세포 내에서 항원 생성을 유도하여 면역계의 세포 무기화를 유도한다. 반면에, 체액 반응을 유도하는, 단백질 및 죽은 또는 불활성화된 백신만을 함유하는 서브 유닛 백신은, 양호한 세포 면역 반응을 유도하지 못한다.

세포의 면역 반응은 병원체 감염에 대한 방어 및 병원체 감염의 치료를 위한 효과적인 면역 매개 치료법을 제공하는데 흔히 필수적이다. 따라서, 백신접종된 개체의 세포에서 표적 항원을 생성하는 백신, 예를 들어, 약독화된 생백신, 비독성 벡터를 사용하는 재조합 백신 및 DNA 백신이 바람직하다.

핵산 면역화는 특정 면역원을 코딩하는 DNA 작제물을 숙주에게 수송하는 새로운 백신접종 기술이다. 항원 특이적 세포 및 체액의 면역 반응을 모두 유도할 수 있는 DNA 백신의 능력 외에, 이러한 기술은 면역학적으로 중요한 분자들을 동반 수송함으로써 유발되는 면역 반응을 조절하는 잠재력을 갖는다.

이러한 백신이 병원체 감염 또는 사람의 질병에 대해 개체를 예방적 또는 치료적으로 면역화하는데 흔히 효과적이지만, 개량 백신에 대한 요구가 존재하며, 증진된 면역 반응을 생성시키는 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.

<발명의 요약>

본 발명은 예방적 또는 치료적 백신접종법, 또는 치료적 면역조절법 하에 개체에 투여될 수 있는, 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물에 관한 것이다. 면역조절 단백질에는 사람의 단백질 IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18, 및 BL-1으로 명명된 신규 분자가 포함된다.

본 발명은 IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18, 또는 BL-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18, 또는 BL-1 중 2개 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물에 관한 것이다. 유전자 작제물은 동일한 뉴클레오티드 서열의 다중 카피를 포함할 수 있다.

본 발명은 1종 이상의 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물과 함께 면역원을 개체에 주입하여 증진되고(되거나) 더욱 바람직한 면역 반응을 일으키기 위한 것인, 백신 조성물을 투여함으로써 개체를 백신접종하는 방법에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 1종 이상의 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 투여하여 개체의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 면역 반응의 조절은 먼저 백신 조성물을 하나의 면역 반응 형태를 선호하는 면역조절 단백질과 함께 동반 투여한 후, 백신 조성물을 다른 면역 반응 형태를 선호하는 면역조절 단백질과 함께 추가접종함으로써, 환자의 면역 반응이 주로 Th1에서 Th2 반응으로 또는 그 역으로 스위칭되는 백신접종법 중 하나의 단계일 수 있다.

백신 조성물은 바람직하게는 개체에게 직접 주입되는 플라스미드이다. 유사하게, 1종 이상의 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물은 바람직하게 플라스미드이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결되는 면역성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 면역성 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다. 특정 실시양태에서, 플라스미드는 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 단일쇄 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단일쇄 IL-12 단백질은 단일 코딩 서열에 의해 코딩되고 2개의 서브유닛을 연결시키는 링커를 포함하는 단일 단백질이다. 링커는 단일 단백질이 생물학적으로 활성인 형태(기능적인 천연의 2개의 서브 유닛 IL-12 단백질에 의해 추정됨)로 폴딩되기에 충분히 크고 유연하다.

본 발명은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 항원에 대한 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 표적 항원은 병원체 항원이고, 암 관련 항원 또는 자가면역 관련 세포와 연관된 항원이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원에 대해 유도되는 면역 반응은 항원-항체 면역 반응이 관여하고(하거나) 방어적 면역 반응이 병원체, 또는 항원에 대해 발생되는 면역 반응과 교차 반응하는 단백질을 갖는 세포에 대해 유도되는, 단백질과 관련된 감염, 질병, 장애 및 질환에 있어서 치료적 잇점을 제공한다. 특정 실시양태에서, 사람의 IL-12 단백질은 단일쇄 IL-12 단백질이다.

본 발명은 사람의 IL-12의 2개의 서브 유닛 및 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 집합적으로 포함하고, 각 코딩 서열은 유전자 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 다수의 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2개의 플라스미드, 즉 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 플라스미드는 면역원성 표적 단백질 및 사람 IL-12의 한 서브유닛을 코딩하는 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 플라스미드는 사람 IL-12의 다른 서브 유닛을 코딩하는 소정의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 3개의 상이한 플라스미드, 즉 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드, 사람의 IL-12의 p35 서브 유닛을 코딩하는 플라스미드, 및 사람의 IL-12의 p40 서브 유닛을 코딩하는 플라스미드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2개의 플라스미드, 즉 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 포함한다.

본 발명은 사람의 IL-12의 2개의 서브 유닛 및 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 집합적으로 포함하는 다수의 플라스미드를 포함하며, 각 코딩 서열은 유전자 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 개체에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기된 2개 또는 3개의 플라스미드는 사람의 IL-12 단백질의 2개의 서브 유닛 및 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함께 포함하며, 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원에 의해 유도된 면역 반응은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원과 교차 반응한다. 본 발명은 병원체, 암 또는 자가면역 질환에 대해 개체를 면역화하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다. 특정 실시양태에서, 사람의 IL-12는 단일쇄의 IL-12 단백질이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 및 IL-10 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 면역원성 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다.

본 발명은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 개체에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원에 대해 유도된 면역 반응은 항원-항체 면역 반응이 관여하고(하거나) 방어적 면역 반응이 병원체, 또는 항원에 대해 발생되는 면역 반응과 교차 반응하는 단백질을 갖는 세포에 대해 유도되는, 단백질과 관련된 감염, 질병, 장애 및 질환에 있어서 치료적 잇점을 제공한다.

본 발명은 2개의 플라스미드, 즉 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 비롯한 다수의 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 플라스미드를 비롯하여 3개의 플라스미드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 플라스미드, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 플라스미드를 비롯하여 4개의 플라스미드를 포함한다.

본 발명은 2개의 플라스미드, 즉 유전자에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 플라스미드, 및 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 비롯한 다수의 플라스미드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 면역 반응을 개체에서 유도하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원에 의해 유도된 면역 반응은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원과 교차 반응한다. 본 발명은 병원체, 암 또는 자가면역 질환에 대해 개체를 면역화하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다. 특정 실시양태에서, 방법은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 플라스미드 비롯한 3개의 플라스미드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 플라스미드, 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 또는 IL-10 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 플라스미드를 비롯하여 4개의 플라스미드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개량된 재조합 백신 벡터에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 유전자는 IL-12를 단일쇄 단백질로서 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원이다.

본 발명은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백신 벡터(여기서, 표적 항원은 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원임)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원체, 암 또는 자가면역 질환에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 개량된 약독화 생백신에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 약독화된 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원체, 암 또는 자가면역 질환에 대해 개체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명은 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12의 p35 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다른 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12의 p40 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 한쌍의 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10, 또는 BL1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드, 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질 p35 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다른 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질 p40 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 한쌍의 플라스미드, 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 단일쇄 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음), 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 반응, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질의 p35 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다른 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질의 p40 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 한쌍의 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 반응, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 반응, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, Th1 유형의 면역 반응에 대해 개체에서 면역 반응을 증진 또는 구동시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12의 p35 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다른 하나는 진핵세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12의 p40 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 한쌍의 플라스미드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 Th1 유형의 면역 반응을 증진시키거나, Th1 유형의 면역 반응에 대해 개체에서 면역 반응을 구동시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 Th1 유형의 면역 반응을 증진시키거나, Th1 유형의 면역 반응에 대해 개체에서 면역 반응을 구동시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람 IL-12, GM-CSF, IL-1α, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5, IL-10 또는 BL-1 단백질 중 1종 이상을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 단일쇄 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음), 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 반응, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기 반응, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 Th1 유형의 면역 반응을 증진시키거나, Th1 유형의 면역 반응에 대해 개체에서 면역 반응을 구동시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 단일쇄의 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터(여기서, 단일쇄의 사람 IL-12 단백질은 p35 및 p40 서브유닛이 링커 서열에 의해 서로 연결된 단일 단백질이고, 이때 발현된 단일쇄 단백질은 생물학적으로 활성인 IL-12 분자를 형성할 수 있음)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 Th1 유형의 면역 반응을 증진시키거나, Th1 유형 면역 반응에 대해 개체에서 면역 반응을 증진 또는 구동시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 1종 이상의 사람의 전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 1차 작용제로 포함하는 조성물, 및 상기 핵산 분자를 개체에 투여함으로써 면역 반응을 구동 및 유도하기 위한 상기 조성물의 이용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 DNA 백신 작제물과 같이 표적 면역원을 도입시키는 백신과 함께 IL-5 또는 IL-18을 동반 수송함으로써 항원 특이적 체액 반응을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 DNA 백신 작제물과 같이 표적 면역원을 도입시키는 백신과 함께 IL-2, IL-5, IL-10, IL-18, TNF-α 또는 TNF-β를 동반 수송하여 항원 특이적 T 헬퍼 세포의 증식을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 DNA 백신 작제물과 같이 표적 면역원을 도입시키는 백신과 함께 TNF-α 또는 IL-15의 동반 투여로 인한 세포독성 반응의 증진 방법에 관한 것이다.

본 발명은 사람의 GM-CSF를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물, 및 GM-CSF를 코딩하는 유전자 작제물을 수송 또는 동반 수송하여 면역 반응을 유도 및 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 GM-CSF 유전자를 DNA 백신 작제물과 함께 동반 투여함으로써, 항원 특이적 항체 및 T 헬퍼 세포 증식을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 실질적으로 순수한 BL1 및 그의 면역조절 단편에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 및 그의 면역조절 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 핵산 분자에 대해 특이적으로 유도된 핵산 프로브 및 프라이머에 관한 것이다.

본 발명은 BL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 특정 영역에 상보성인 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전적 치료용 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 상에서 특정 에피토프에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.

본 발명은 BL1 및 그의 면역조절 단편의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 각각의 BL1 또는 그의 면역조절 단편, 또는 BL1 단백질 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라, BL1 코딩 서열을 포함하는 벡터는 면역 반응을 조절하기에 충분하다.

본 발명은 면역원 및 BL1 단백질, 또는 그의 면역조절 단편의 수송용 백신 조성물, 또는 BL1 단백질 또는 그의 면역조절 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 증진 및 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라, BL1 코딩 서열을 포함하는 벡터는 면역 반응을 조절하기에 충분하다.

본원에서 사용된, 용어 "면역조절 단백질"이란 사람의 IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-15, IL-18, IL-4, IL-5 및 IL-10, 및 BL-1로 명명된 신규 분자 중 하나를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "IL-12 유전자 작제물"은 사람의 IL-12 단백질 서브 유닛 및(또는) 면역원성 표적 단백질 중 하나 또는 모두를 코딩하며, 진핵 세포에서 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 플라스미드를 말한다. DNA 발현을 위한 조절 인자에는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날가 포함된다. 이 외에, 다른 인자, 예를 들어, 코작크(Kozak) 영역도 유전자 작제물에 포함될 수 있다. 개시 신호 및 종결 신호는 종종 코딩 서열의 일부로 간주되는 필요한 조절 인자이다. 본 발명의 유전자 작제물의 코딩 서열에는 기능적 개시 신호 및 종결 신호가 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "목적하는 IL-12 단백질"은 2개의 서브 유닛이 단일 코딩 서열에 의해 코딩되며, 2개의 서브 유닛을 연결하는 링커 서열을 갖는 단일 단백질로서 발현되는, 단일쇄 IL-12 단백질을 포함하는 사람의 IL-12 서브 유닛 중 하나 또는 모두를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "목적하는 단백질"은 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신의 코딩 서열에 의해 코딩되는 면역원성 표적 단백질을 말한다.

본원에서 사용된 용어 "단일쇄 단백질" 및 "단일쇄 IL-12 단백질"은 IL-12 p35 및 p40 서브 유닛이 충분히 길고 유연한 아미노산 링커에 의해 서로 연결되는, 단일 단백질의 2개의 서브 유닛 영역이 서로 작용하여 생물학적으로 활성인 복합체 형태, 즉 IL-12로 추정되는 단일쇄 단백질을 형성한다. 단일쇄 IL-12는 p35 및 p40으로 구성된 IL-12와 본질적으로 동일하게 기능한다. 본 발명은 IL-12가 사용된 모든 경우에 단일쇄 IL-12의 용도가 포함된다. 단일 단백질은 단일 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

인터루킨-12(IL-12), 즉 헤테로 이량체 시토킨은 주로 대식세포 및 B 세포에 의해 생성된다. IL-12는 p35 및 p40으로 명명되는 2개의 상이한 서브 유닛으로 구성된다 (Podlaski, F.J. et al. (1991) Arch. Biochem. Biophysics. 294(1):230-237, 본원에 참고문헌으로 인용됨).

상이한 면역 반응은 T 세포 집단에 관여한다. 구체적으로, 2개의 상이한 유형의 T 세포, 유형 1의 T-헬퍼 세포(Th1) 및 유형 2의 T-헬퍼 세포(Th2)가 있으며, 이들은 시토킨 생성에 있어서 서로 상이하다. IL-12는 Th1 관련 시토킨 인터페론-감마(IFN-gamma)의 생성을 주로 유도함으로써 Th1 면역 반응에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다. IFN-감마를 비롯한 다양한 시토킨의 유도 및 방출을 통하여 천연 킬러(NK) 및 T 세포를 활성화시킨다.

본 발명의 특징은 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 면역조절자로서의 용도에 관한 것이다. 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 1차 활성제로서, 즉 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신과 같은 유전자 치료용 백신, 또는 백신 조성물의 일부 또는 혼합되어 수송될 수 있다.

1차 작용제로서 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 용도에 있어서, 본 발명은 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 개체에 투여함으로써 면역 반응을 구동시키거나 Th1 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 특징에 따라, 알레르기 질환, 병원체 감염, 암 또는 자가면역 질환 환자는 핵산이 개체의 세포에서 발현되도록 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 사람의 IL-12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 상기 환자에게 투여함으로써 치료될 수 있다. 핵산 분자는 세포에 흡수되고, 사람의 IL-12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현된다. 세포에 의해 이렇게 생성된 사람의 IL-12는 생물학적으로 활성이고, 그의 활성으로 개체에 의해 유발되는 면역 반응은 유도 및(또는) 증진된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 사람 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 플라스미드이다.

본 발명의 다른 측면에는 과립구-대식세포 콜로니 증진 인자(GM-CSF)를 코딩하는 핵산 분자의 사용이 포함되고, GM-CSF는 호중구성 단세포/대식세포, 및 호산구 콜로니 형성을 촉진하는 조혈 증식 인자이다. 또한, 적혈구 및 거핵구 증식 세포의 증식 및 분화를 유도한다. 또한, GM-CSF는 호중구, 호산구, 및 대식세포의 항체 의존적 세포 매개된 세포독성을 증가시키나, 생체 내에서 CTL 반응을 유발하는데 직접적인 역할을 하는 것으로 보고되지는 않았다. 본 발명은 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체에 투여함으로써 면역 반응을 구동시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 핵산 분자는 세포에 흡수되어 GM-CSF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현되고 세포에 의해 생성된다. GM-CSF는 생물학적으로 활성이고, 그의 활성으로 개체에 의해 유발되는 면역 반응은 유도 및(또는) 증진된다. 특정 바람직한 실시양태에서, GM-CSF를 코딩하는 핵산 분자는 플라스미드이다.

본 발명의 다른 측면에는 사람의 전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 1차 작용제로 사용하는 것이 포함된다. 본 발명은 사람의 전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10)을 코딩하는 핵산 분자를 개체에 투여함으로써, 면역 반응을 구동시키거나 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 측면에 따라, 핵산 분자가 개체의 세포에서 발현되도록 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 투여하여 개체를 치료한다. 핵산 분자는 세포에 의해 흡수되고 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 발현된다. 이렇게 세포에 의해 생성된 사람 단백질은 생물학적으로 활성이고, 그의 활성은 개체에 의해 유발되는 면역 반응을 유도 및(또는) 증진시킨다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자는 플라스미드이다.

면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 일부로서 또는 함께, 즉 면역원성 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신의 일부로서 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 사용하는데 있어서, 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신의 성분이거나, 면역원성 표적을 포함하는 백신의 성분이거나, 면역원성 표준 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 백신이거나, 또는 면역원성 표적을 포함하는 백신과 함께 동반 투여되는 분리된 조성물일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 플라스미드이고, 백신은 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 플라스미드를 포함하는 DNA 백신이다. 바람직한 실시양태에서, DNA 백신은 면역원성 표적 단백질 및 사람의 IL-12 단백질을 코딩하는 플라스미드를 포함한다.

IL-12는 1990년 5월17일자로 공개된 PCT 출원 제WO90/05147호(본원에 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다. 문헌[Wolf, S.F. et al., 1991, J. Immunol. 146(9); 3074-3081](본원에 참고문헌으로 인용됨)에서는 IL-12를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 IL-12 단백질의 예견된 아미노산 서열을 개시하고 있다. 사람의 천연 IL-12 단백질은 2개의 서브 유닛, 즉 p35 및 p40으로 구성된다. 2개의 서브 유닛은 생물학적으로 활성인 헤테로 이량체 복합물을 형성한다.

본 발명의 실시양태에 따라, IL-12의 각 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단일 플라스미드, 또는 플라스미드가 아닌 핵산 분자, 또는 바이러스성 또는 세균성 게놈 상에 존재하며, 여기서 각 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자신의 조절 인자에 의해 조절된다. 바람직한 실시양태에서, IL-12의 서브 유닛 모두에 대한 코딩 서열은 단일 플라스미드 상에 존재하며, 각 코딩 서열은 그 자신의 조절 인자와 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 면역원성 단백질의 코딩 서열은 2개의 서브 유닛에 대한 코딩 서열과 동일한 플라스미드에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 면역원성 단백질의 코딩 서열은 2개의 서브 유닛에 대한 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 분리된 플라스미드 상에 존재하며, 2개의 플라스미드는 개체에게 수송된다.

본 발명의 실시양태에 따라, p35 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 제1 플라스미드 상에, p40 서브 유닛을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 플라스미드 상에 존재하며, 2개의 플라스미드는 개체에서 동일한 부위에 동반 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 표적 면역원성 단백질에 대한 코딩 서열은 p35 서브 유닛에 대한 코딩 서열과 동일한 플라스미드 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 표적 면역원성 단백질에 대한 코딩 서열은 p40 서브 유닛에 대한 코딩 서열과 동일한 플라스미드 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 표적 면역원성 단백질에 대한 코딩 서열은 각 서브 유닛에 대한 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 분리된 플라스미드 상에 존재하고, 3개의 플라스미드는 개체에 수송된다.

IL-12 단백질, 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 서브 유닛이 단일 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며 단일쇄 (융합) 단백질 분자로 발현되도록 개량될 수 있다. 본 발명에 따라, 링커 아미노산 서열은 2개의 서브 유닛이 본질적으로 결합되나, 단일쇄 단백질의 상이한 영역들이 복합체를 이루어 생물학적으로 활성인 단백질을 형성할 수 있을 정도로 유연하다. 도 8A는 단일쇄 단백질에 대한 코딩 서열이 사람의 시토메갈로바이러스 프로모터에 의해 조절되는 단일쇄 단백질의 예를 도시하고 있다. 단일쇄 단백질의 코딩 서열에는, 5'부터 3' 방향으로, p35 서브 유닛의 코딩 서열, 링커의 코딩 서열 및 p40 서브 유닛의 코딩 서열이 단일 코딩 서열로서 포함된다. 다른 배열로, 단일쇄 단백질의 코딩 서열에는 p40 서브 유닛의 코딩 서열, 링커의 코딩 서열 및 p35 서브 유닛의 코딩 서열이 단일 코딩 서열로서 포함된다. 링커는 단일 단백질의 2개의 부분이 생물학적으로 활성인 복합체를 형성할만큼 서로 밀접하게 위치하도록 충분히 길고 유연해야 한다.

본 발명의 특정 실시양태에 따라, 2개의 서브 유닛이 링커에 의해 결합되어 단일 단백질을 형성하는 단일쇄 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진핵 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 플라스미드 또는 플라스미드가 아닌 핵산 분자, 또는 바이러스성 또는 세균성 게놈으로 혼입된다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 서브 유닛이 링커에 의해 결합되어 단일 단백질을 형성하는 단일쇄 단백질을 코딩하는 단일쇄 IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 플라스미드로 혼입된다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 표적 면역원성 단백질의 코딩 서열은 단일쇄 IL-12 단백질의 코딩 서열과 동일한 플라스미드 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 표적 면역원성 단백질의 코딩 서열은 단일쇄 단백질의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드로부터 분리된 플라스미드 상에 존재하며, 2개의 플라스미드는 개체로 수송된다.

백신접종를 위한 개량법 및 개량 조성물에 관한 본 발명의 측면에 따라, 특정 DNA 백신접종에서 표적 면역원을 코딩하는 DNA는 개체에 투여되어, DNA가 흡수되고 발현되어 면역원에 대한 면역 반응이 유발된다. 본 발명의 측면에 따라. 면역조절 단백질을 코딩하는 DNA는 개체에게 동반 수송되고, 이러한 DNA가 발현되어 면역조절 단백질을 생성하며, 이 조절 단백질은 더욱 밀접한 면역화를 통하여 다양한 질병에 대해 방어될 수 있도록, 특정 면역 반응을 유도하기 위한 면역 반응의 정도 및 방향을 조절한다.

표적 항원을 발현시키는 백신접종된 개체의 세포에서 IL-12 단밸질의 공동 생산은 표적 항원에 대한 면역 반응을 놀랍게도 증진시킨다는 것을 발견하였다. IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 형태를 제공함으로써, 백신접종된 개체의 세포에서 표적 항원을 발현시킴으로써 기능하는 백신, 예를 들어, DNA 백신, 재조합 벡터 백신 및 약독화된 백신을 개량시킨다.

항원을 생성하는 세포에서 IL-12의 공동 생산은 항원에 대한 세포 면역원을 증진시킨다. 따라서, 본 발명은 백신에서 발현에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된 IL-12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 DNA 백신, 비독성 재조합 벡터 백신 및 약독화된 생백신과 같은 백신의 일부로서 제공함으로써, 개량된 백신을 제공한다.

본 발명은 GM-CSF를 코딩하는 유전자 작제물의 동반 수송으로부터 면역 반응의 유도 및 조절을 제공한다. GM-CSF 유전자와 DNA 백신 작제물의 동반 투여는 항원 특이적 항체 및 T 헬퍼 세포 증식 반응을 증진시킨다.

본 발명은 전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10)을 코딩하는 유전자 작제물의 동반 수송로부터 면역 반응의 유도 및 조절을 제공한다.

본 발명의 특정 측면은 IL-5 또는 IL-18의 동반 수송에 의해 항원 특이적 체액 반응의 의미있는 증진을 제공한다.

본 발명의 특정 측면은 IL-2, IL-5, IL-10, IL-18, TNF-α 또는 TNF-β의 동반 수송에 의한 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식을 증가시키는 것이다.

본 발명의 특정 측면은 TNF-α 또는 IL-15 유전자의 동반 투여에 대한 세포독성 반응의 증진을 제공하는 것이다.

따라서, T 세포 매개 반응이 탁월한 경우에는, 체액의 반응은 필요하지 않거나 유해하기까지 하고, IL-12 유전자는 특정 DNA 면역원과 함께 동반 수송되는 면역조절자로서 바람직하다. 반면에, 표적 세포외 세균에 대한 백신을 제조하기 위하여, 예를 들어 IL-4, IL-5 또는 IL-10 유전자는 동반 투여될 수 있다. 더욱이, CD4+ T 헬퍼 세포 및 항체가 방어에 더욱 중요한 기능을 하는 경우에는, GM-CSF 및 IL-2는 동반 수송될 수 있다. 최근에, 모든 3개의 면역 반응 무기가 중요한 경우에는, TNF-α는 동반 주입되어 항체, T-헬퍼 세포 및 CTL 반응을 함께 증진시킬 수 있다.

사람의 IL-1α의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Telford, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:9955-9963, Furutani, et al. (1985) Nucl. Acids Res. 14:3167-3179, March, et al.(1985) Nature 315:641-647], 및 기탁 코드 스위스프로트(swissprot) PO1583에 제시되어 있다.

사람의 IL-2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Holbrook, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1634-1638, Fujita, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7437-7441, Fuse, et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:9323-9331, Taniguchi, et al. (1983) Nature 302:305-310, Maeda, et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115:100-1047, Devos, et al. (1983) Nucl. Acids Res. 111:4307-4323], 및 기탁 코드 스위스프로트 PO1585에 제시되어 있다.

사람의 IL-4의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Arai, et al. (1989) J. Immunol. 142:274-282, Otsuka et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:333-344, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5894-5898, Noma, et al. (1984) Nature 319:640-646, Lee, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2061-2063], 및 기탁 코드 스위스프로트 05112(쥐의 IL-4의 기탁 코드는 스위스프로트 07750임)에 제시되어 있다.

사람의 IL-5의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Campbell, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6629-6633, Tanabe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16580-16584, Campbell, et al. (1988) Eur. J. Biol. Chem. 174:345-352, Azuma et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:9149-9158, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7388-7392], 및 기탁 코드 스위스프로트 P05113에 제시되어 있다.

사람의 IL-10의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 문헌 [Viera, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1172-1176], 및 기탁 코드 스위스프로트 P22301에 제시되어 있다.

사람의 IL-15의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Grabstein, et al. (1994) Science 264:965-968], 및 기탁 코드 스위스프로트 U03099에 제시되어 있다.

사람의 IL-18의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Ushio, et al. (1996) J. Immunol. 156:4274-4279], 및 기탁 코드 스위스프로트 D49950에 제시되어 있다.

사람의 TNF-α의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Pennica, (1984) Nature 312: 724-729], 및 기탁 코드 스위스프로트 PO1375에 제시되어 있다.

사람의 TNF-β의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Gray, (1984) Nature 312: 721-724], 및 기탁 코드 스위스프로트 PO1374에 제시되어 있다.

DNA 백신은 미국 특허 제5,593,972호, 동 제5,589,466호, PCT 출원 제PCT/US90/01515호, 동 제PCT/US93/02338호, 동 제PCT/US93/048131호, 및 동 제PCT/US94/00899호에 기재되어 있고, 상기 특허 및 공개물에서 인용된 우선권 출원은 본원에 참고문헌으로 인용된다. 상기 출원에 기재된 수송 방법 외에, DNA 수송의 별법은 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있다.

본 발명의 개선점은 DNA 백신의 핵산 서열에 의해 코딩되는 항원 표적의 생산 외에, 면역조절 단백질의 공동 생산을 위한 유전 물질을 함유한다는 것이다.

본 발명은 유전물질에 의해 코딩되는 단백질 및 펩티드에 대한 면역반응을 유도하기 위하여 개체의 세포에 유전물질을 주입시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체의 조직에 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 핵산 분자, 또는 1개는 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다른 1개는 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 2개의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 분자는 플라스미드 DNA, 재조합 벡터의 핵산 분자 또는 약독화된 백신에서 제공되는 유전물질의 일부일 수 있다.

본 발명에 따라, 병원체 또는 비정상적, 질병 관련 세포에 대해 개체를 예방적 및(또는) 치료적으로 면역화시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 유전 물질은 표적 단백질, 즉 표적화될 병원체 또는 세포 상에서 발견되는 면역원성 단백질과 적어도 에피토프를 공유하는 펩티드 또는 단백질을 코딩하며, 또한 유전적 물질은 면역조절 단백질을 코딩한다. 유전 물질은 개체의 세포에 의해 발현되며, 면역 반응을 일으키는 면역원성 표적으로 작용한다. 생성된 면역 반응은 표적화될 병원체 또는 세포와 반응하고, 체액의 면역 반응 외에, 2개의 세포 면역 반응을 유발하는데 기초한다. 본 발명의 방법은 예방적 및(또는) 치료적 면역화를 부여하는데 유용하다. 따라서, 면역화 방법에는 개체를 병원체 침투, 또는 특정 세포의 발생 또는 증식으로부터 방어하는 방법, 및 병원체 감염, 과증식성 질병 또는 자가면역 질환 환자를 치료하는 방법이 포함된다.

본원에서 사용된 "표적 단백질"이란 면역 반응에 있어서 표적 단백질로 작용하는, 본 발명의 유전자 작제물에 의해 코딩되는 펩티드 및 단백질을 말한다. 용어 "표적 단백질"은 면역 반응을 유발할 수 있는 단백질을 말한다. 표적 단백질은 병원체 또는 바람직하지 못한 세포 유형, 예를 들어 암 세포 또는 면역화가 요구되는 자가면역 질환에 관련된 세포로부터의 단백질과 적어도 에피토프를 공유하는 면역원성 단백질이다. 표적 단백질에 대한 면역반응은 표적 단백질이 관련된 특정 감염 또는 질병에 대해 개체를 방어 및 치료할 것이다. 표적 단백질은 면역 반응이 요구되는 단백질과 동일할 필요는 없다. 오히려, 표적 단백질은 면역 반응이 바람직한 단백질과 교차 반응하는 면역 반응을 유도할 수 있어야 한다.

본 발명은 표적 단백질, 즉 병원체 또는 개체의 "비정상적" 세포와 특정되게 관련된 단백질에 대한 광범위한 면역반응을 유발하는데 유용하다. 본 발명은 병원체 단백질에 대한 면역반응이 병원체에 대해 방어적 면역화를 제공하는, 병원체 및 미생물에 대해 개체를 면역화하는데 유용하다. 본 발명은 과증식성 세포와 특정 관련된 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유발함으로써, 과증식성 질병 및 장애, 예를 들어 암과 대항하는데 유용하다. 본 발명은 자가면역 질환 관련 세포와 구체적으로 관련된 표적 단백질에 대한 면역반응을 유발하여 자가면역 질환 및 장애와 대항하는데 유용하다.

본 발명에 따라, 표적 단백질 및 면역조절 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는 개체의 조직 세포로 주입되고, 여기서 발현되어 표적 단백질을 생성한다. 표적 단백질 및 면역조절 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는 개체의 세포에서 발현에 필요한 조절 인자와 연결된다. DNA 발현에 필요한 조절 인자에는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날가 포함된다. 이 외에, 다른 인자, 예를 들어 코작 영역은 또한 유전자 작제물에 포함될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "발현가능한 형태"란 필요한 조절 인자가 유전자 작제물 내에서 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작용가능하게 연결되어 있어서 개체의 세포내에 존재할 때 코딩 서열이 발현되는 유전자 작제물을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "에피토프를 공유하는"이란 다른 단백질의 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 에피토프를 하나 이상 포함하는 단백질을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한 에피토프"란 그 구조가 소정의 단백질의 에피토프와 일치하지는 않지만 그 단백질과 교차 반응하는 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유발하는 구조를 갖는 에피토프를 의미한다.

유전자 작제물은, 유전자 발현을 위해 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 표적 단백질 및(또는) 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따라, 하나는 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형태를 포함하며, 하나는 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 가능한 형태를 포함하는, 유전자 작제물의 배합물이 제공된다. 유전자 작제물의 배합물을 포함하는, DNA 또는 RNA 분자를 살아있는 세포 내로 혼입하여 DNA 또는 RNA의 발현, 및 표적 단백질 및 면역조절 단백질의 생산을 가능하게 한다. 그 결과, 표적 단백질에 대한 면역 반응이 증진된다.

상기 유전자 작제물(들)이 세포 내로 흡수되면 기능성 염색체외 분자로 세포 내에 남아있거나 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. DNA는 플라스미드(들)의 형태로 세포 내에 주입되어 별도의 유전 물질로서 남아있을 수 있다. 또한, 염색체에 통합될 수 있는 선형 DNA도 세포내로 도입될 수 있다. DNA를 세포내로 도입할 때 염색체 내로 DNA의 통합을 촉진하는 시약을 첨가할 수 있다. 통합을 촉진하는데 유용한 DNA 서열이 DNA 분자 내에 포함될 수도 있다. 또한 RNA도 세포에 투여될 수 있다. 또한 유전자 작제물을 동원체, 텔로미어, 복제 개시점을 가진 선형 미니 염색체로 제공하는 것도 고려된다. 유전자 작제물은 약독화된 생백신 미생물내의 유전 물질의 일부로서 또는 세포내에서 생존하는 재조합 미생물 벡터일 수 있다. 유전자 작제물은 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부일 수 있으며, 여기서 유전 물질은 세포의 염색체 안으로 통합되거나 염색체외의 것으로 남는다.

유전자 작제물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 인자를 포함한다. 그런 인자로는 프로모터, 개시 코돈, 중지 코돈, 폴리아데닐화 시그날 등이 있다. 또한 종종 인핸서가 면역원성 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코딩하는 서열의 유전자 발현에 요구된다. 상기 인자들은 원하는 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되어야 하며, 조절 인자는 그것이 투여될 개체에서 작동 가능해야 한다.

일반적으로 개시 코돈 및 중지 코돈은 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주된다. 그러나 이들 인자가 유전자 작제물이 투여될 개체에서 기능적일 필요가 있다. 개시 및 종료 코돈은 코딩 서열의 프레임 내에 있어야 한다.

사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 기능적이어야 한다.

본 발명을 실시하는데 있어서, 특히 인체용 유전자 백신의 제조에 있어서 유용한 프로모터의 예로는 원숭이 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 시토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들면 CMV 조기 발현 프로모터 (immediate early promoter), 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 로우스 사코마 바이러스 (RSV) 뿐만 아니라, 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나, 이것으로 제한되지는 않는다.

본 발명을 실시하는데 있어서, 특히 인체용 유전자 백신의 제조에 있어서 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다. 그 중에서도 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로 불리는 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재) 내의 SV40 폴리아데닐화 시그날을 사용한다.

DNA 발현에 필요한 조절 인자 이외에 다른 인자도 DNA 분자에 포함될 수 있다. 그러한 추가의 인자로는 인핸서가 있다. 인핸서는 사람 액틴, 사람 미오신, 사람 헤모글로빈, 사람 근육 크레아틴과, CMV, RSV, 및 EBV와 같은 바이러스성 인핸서를 포함하는 군에서 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되지는 않는다.

유전자 작제물을 염색체외의 것으로 유지하면서 세포내에서 다중 카피를 생성시키기 위해서, 포유동물의 복제 오리진을 제공할 수 있다. 플라스미드 pCEP4 및 pREP4 (Invitrogen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)는 엡스타인 바 바이러스의 복제 오리진과 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함하며, 이 영역은 통합되지 않고도 다중 카피의 에피좀 복제를 일으킨다.

면역 분야에 관련된 몇가지 바람직한 실시태양에서는, 표적 단백질, IL-12 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 추가로 이런 표적 단백질에 대한 면역 반응을 더욱 증진시키는 단백질을 위한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)가 수송된다. 상기 유전자의 예로는 시토킨 및 림포카인, 예를 들면 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래의 성장 인자 (PDGF), GC-SF, GM-SCF, TNF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, 및 B7.2을 코딩하는 것들이 있다. 일부 실시태양에서는 GM-CSF의 유전자가 면역 조성물에 사용되는 유전자 작제물에 포함되는 것이 바람직하다.

여하튼, 유전자 작제물이 수용된 세포를 제거할 필요가 있다면 세포 파괴를 위한 표적으로 기능하는 추가의 인자를 첨가할 수 있다. 허피스 티미딘 키나아제 (tK) 유전자는 발현 가능한 형태로 유전자 작제물에 포함될 수 있다. 약제인 강사이클로비어 (gangcyclovir)를 개체에 투여할 수 있는데, 이 약품은 tK를 생산하는 모든 세포를 선택적으로 죽이기 때문에 유전자 작제물을 갖고 있는 세포를 선택적으로 파괴하는 수단이 된다.

단백질 생산을 최대화하기 위해서는 조절 서열은 작제물이 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합한 것으로 선택할 수 있다. 또한 코돈을 그 세포에서 가장 효과적으로 전사되는 것으로 선택할 수 있다. 당업자라면 세포에서 기능적인 DNA 작제물을 생산할 수 있을 것이다.

2가지 유형의 예로는 2개의 플라스미드에서 사용되는 유형, 및 단일 플라스미드에서 사용되는 유형이 포함된다. 2개의 플라스미드계에서는, 하나의 플라스미드는 발현 가능한 형태의 표적 코딩 서열을 지니며, 다른 하나는 발현 가능한 형태의 IL-12 코딩 서열을 갖는다. 단일 플라스미드계에서는, 단일 플라스미드는 발현 가능한 형태의 표적 코딩 서열 및 IL-12 코딩 서열을 포함한다.

본 발명의 방법은 개체의 조직에 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서는 핵산 분자가 근육내, 비강내, 복강내, 피하, 피내, 정맥내, 폐 조직으로의 에어로졸 투여 또는 국부 투여, 또는 질, 직장, 요도, 구강, 및 설하로 구성된 군에서 선택된 점막 조직으로 세척 (lavage)에 의해 투여된다.

일부 실시태양에서는, 핵산 분자가 촉진제를 투여하여 함께 수송된다. 촉진제는 또한 폴리뉴클레오티드 기능 향상제 또는 유전자 백신 촉진제로 불리기도 한다. 촉진제는 본원에 참고로 도입된, 미국 특허 출원 제08/008,342호 (1993년 1월 26일 출원), 미국 특허 출원 제08/029,336호 (1993년 3월 11일 출원), 미국 특허 제5,593,972호 (1997년 1월 14일 특허 허여), PCT 출원 제PCT/US94/00899호 (1994년 1월 26일)에 기재되어 있다. 또한 촉진제는 본원에 참고로 도입된 PCT 출원 제PCT/US95/1502호 (1995년 9월 28일) 및 제PCT/US95/04071호 (1995년 3월 30일)에 기재되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 촉진제는 핵산 분자와의 혼합물로서 투여되거나, 핵산 분자와 별개로 동시에 또는 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 또한, 형질감염제 및(또는) 복제제 및(또는) 염증화제로 기능하는 다른 작용제를 촉진제와 함께 또는 촉진제 없이 동반 투여할 수 있으며, 그 예로는 α-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래의 성장 인자 (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 B7.2 등의 성장 인자, 시토킨 및 림포카인 뿐만 아니라, 섬유아세포 성장 인자, 면역-자극 복합체 (ISCOMS) 등의 계면 활성제, 프로인트 불완전 보조제, 모노포스포릴 리피드 A (MPL)를 비롯한 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 스쿠알렌 등의 베지클 (vesicle) 및 스쿠알렌, 및 히알루론산이 포함된다.

일부 바람직한 실시태양에서는 본 발명의 유전자 작제물은 국소 마취제의 군에 속하는 것과 같은, 벤조산 에스테르, 아닐리드, 아미딘, 우레탄, 이들의 히드로클로라이드염으로 이루어진 군에서 선택된 촉진제와 함께 제조되거나 함께 투여된다. 일부 바람직한 실시태양에서의 촉진제는 다음 식 중 하나를 갖는 화합물일 수 있다.

Ar-R¹-O-R²-R³

또는

Ar-N-R¹-R²-R³

또는

R⁴-N-R⁵-R⁶

또는

R⁴-O-R¹-N-R⁷.

식 중, Ar은 벤젠, p-아미노벤젠, m-아미노벤젠, o-아미노벤젠, 치환된 벤젠, 치환된 p-아미노벤젠, 치환된 m-아미노벤젠, 치환된 o-아미노벤젠 (아미노벤젠화합물의 아미노기는 아미노, C₁-C₅ 알킬아민, C₁-C₅, C₁-C₅ 디알킬아민일 수 있고, 치환된 화합물에서 치환체는 할로겐, C₁-C₅ 알킬, 및 C₁-C₅ 알콕시임)이고,

R¹은 C=O이고,

R²는 분지된 알킬들을 포함하는 C₁-C₁₀ 알킬이고,

R³은 수소, 아민, C₁-C₅ 알킬아민, C₁-C₅, C₁-C₅ 디알킬아민이고,

R² + R³은 시클릭 알킬, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C₁-C₁₀ 알킬 N-치환 헤테로사이클을 포함하는 C₁-C₁₀ 알킬 치환된 헤테로사이클을 형성할 수 있고,

R⁴는 Ar, R² 또는 C₁-C₅ 알콕시, 시클릭 알킬, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 헤테로사이클, C₁-C₁₀ 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C₁-C₁₀ 알콕시 치환된 헤테로사이클이고,

R⁵는 C=NH이고,

R⁶은 Ar, R² 또는 C₁-C₅ 알콕시, 시클릭 알킬, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 헤테로사이클, 및 C₁-C₁₀ 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C₁-C₁₀ 알콕시 치환된 헤테로사이클이고,

R⁷은 Ar, R² 또는 C₁-C₅ 알콕시, 시클릭 알킬, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭알킬, 시클릭 지방족 아민, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 시클릭 지방족 아민, 헤테로사이클, C₁-C₁₀ 알킬 치환된 헤테로사이클, 및 C₁-C₁₀ 알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C₁-C₁₀ 알콕시 치환된 헤테로사이클이다.

에스테르의 예로는 벤조산 에스테르 (피페로카인, 메프릴카인, 이소부카인 등), 파라아미노벤조산 에스테르 (프로카인, 테트라카인, 부테타민, 프로폭시카인, 클로로프로카인 등), 메타아미노벤조산 에스테르 (메타부타민, 프리마카인 등), 파라에톡시벤조산 에스테르 (파르에톡시카인 등) 등이 있다. 아닐리드의 예로는 리도카인, 에티도카인, 메피바카인, 부피바카인, 피로카인, 프릴로카인 등이 있다. 그러한 화합물의 다른 예로는 디부카인, 벤조카인, 디클로닌, 프라목신, 프로파라카인, 부타카인, 베녹시네이트, 카르보카인, 메틸 부피바카인, 부타신 피크레이트, 페나카인, 디오탄, 루카인, 인트라카인, 누페르카인, 메타부톡시카인, 피리도카인, 비펜아민, 식물성 비사이클 (예: 코카인, 신나모일코카인, 트룩실린, 코카에틸렌) 및 이들 모든 화합물의 히드로클로라이드와의 착물 등이 있다.

바람직한 실시태양에서는, 촉진제가 부피바카인이다. 부피바카인과 메피바카인 사이의 차이점은 부피바카인은 메피바카인의 N-메틸기 대신에 N-부틸기를 갖고 있는 것이다. 화합물은 그 N에 C₁-C₁₀을 갖고 있다. 화합물들은 프로카인과 클로로프로카인처럼 할로겐으로 치환될 수 있다. 아닐리드가 바람직하다.

촉진제는 유전자 작제물 보다 먼저 또는 유전자 작제물과 동시에 또는 유전자 작제물 보다 나중에 투여한다. 촉진제와 유전자 작제물은 동일한 조성물 내에서 조제될 수 있다.

부피바카인-HCl의 화학명은 2-피페리딘카르복사미드, 1-부틸-N-(2,6-디메틸페닐)-모노히드로클로라이드, 일수화물이며 제약용으로 여러 공급처 (Astra Pharmaceutical Products Inc. (미국 매사추세츠주 웨스트보로 소재), Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (미국 뉴욕주 뉴욕 소재), Eastman Kodak (미국 뉴욕주 로체스터 소재) 등)로부터 널리 구입할 수 있다. 부피바카인은 메틸파라벤과 함께 또는 이것 없이, 에피네프린과 함께 또는 이것 없이 상업적으로 조제된다. 그러한 제제 모두가 사용될 수 있다. 제약용으로 0.25 %, 0.5 %, 0.75 % 농도가 시판되며, 이를 본 발명에 사용할 수 있다. 필요하다면, 다른 범위의 농도, 그 중에서도 바람직한 효과를 유도하는 0.05 내지 1.0 %의 농도를 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면 부피바카인 약 250 ㎍ 내지 약 10 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 250 ㎍ 내지 약 7.5 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 0.05 mg 내지 약 5.0 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 0.5 mg 내지 약 3.0 mg을 투여한다. 일부 실시태양에서는 약 5 내지 50 ㎍을 투여한다. 예를 들면, 일부 실시태양에서는 등장 제약 담체 중의 0.25 - 0.50 % 부피바카인-HCl 및 0.1 % 메틸파라벤 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 약 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml을 백신이 투여되기 전에 또는 백신 투여와 동시에 또는 백신 투여후 동일한 위치로 투여한다. 이와 유사하게 일부 실시태양에서는 등장 제약 담체 중의 0.25 - 0.50 % 부피바카인-HCl 약 50 ㎕ 내지 약 2 ml, 바람직하게는 약 50 ㎕ 내지 약 1500 ㎕, 더욱 바람직하게는 약 1 ml을 백신이 투여되기 전에 또는 백신 투여와 동시에 또는 백신 투여후 동일한 위치로 투여한다. 부피바카인 및 임의의 다른 유사한 활성 화합물, 특히 국소 마취제의 친족에 속하는 것들을 세포의 유전자 작제물 획득의 필요한 촉진율을 제공하는 농도로 투여할 수 있다.

본 발명의 일부 실시태양에서는 개체에 유전자 작제물을 투여하기 전에 우선 촉진제를 주입한다. 다시 말하면, 예를 들어 유전자 작제물을 투여하기 약 1 주일 내지 약 10일 전까지 촉진체를 먼저 개체에 주입한다. 일부 실시태양에서는 유전자 작제물을 투여하기 전후의 약 1 내지 5일에, 어떤 실시태양에서는 24시간에 촉진제를 주입한다. 또한 이왕 사용한다면 촉진제는 유전자 작제물과 동시에 투여하거나 유전자 작제물을 투여하기 전후 수분내에 투여한다. 따라서 촉진제와 유전자 작제물을 합해서 단일한 제약 조성물을 제조할 수 있다.

일부 실시태양에서는 유전자 작제물을 촉진제 없이 투여하며, 다시 말하면 유전자 작제물의 투여를 촉진제의 투여와 동반하지 않는 투여 프로토콜을 사용하기 때문에, 제제 내에 촉진제가 없다.

본 발명에 따라 세포로 운반되는 핵산 분자는 예방적 및(또는) 치료적 면역제로 기능하는 단백질을 위한 유전자 주형으로 기능할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는 핵산 분자가, 동물 세포 내에서 코딩 영역이 전사 및 번역되기 위해 필요한 조절 서열을 포함한다.

본 발명은 바이러스, 원핵생물, 단세포 병원성 유기체 및 다세포 기생충 등의 병원성 진핵생물 등의 모든 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 세포를 감염시키는 병원체로서 바이러스 및 임균, 리스테리아, 시겔라 등의 원핵생물처럼 캡슐화되지 않은 병원체에 대해 개체를 면역시키는데 특히 유용하다. 또한 본 발명은 자신이 세포내 병원체로 존재하는 곳에서 생활 주기 중 한 단계를 갖는 원생동물 병원체에 대해 개체를 면역시키는데도 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "세포내 병원체"란 바이러스 또는 병원성 유기체 중에서 그 번식 또는 생활 주기 중 적어도 일부가 숙주 세포내에 이루어지며, 그 안에서 병원성 단백질을 생산하거나 생산시키는 것을 의미한다. 표 1은 본 발명에 따른 백신이 만들어질 수 있는 바이러스과 및 속의 일부를 나열한 목록이다. 이 표에 열거된 항원과 같은 병원체 항원 상에 나타나는 에피토프와 동일하거나 실질적으로 유사한 에피토프를 적어도 하나 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 포함된 DNA 작제물이 백신에 유용하다. 더욱이 본 발명은 원핵 및 진핵 원생동물 병원체 뿐만 아니라 표 2에 열거된 것과 같은 다세포 기생충을 포함하는 다른 병원체에 대해서 개체를 면역시키는데도 유용하다.

병원체 감염으로부터 방어하기 위한 유전자 백신을 제조하기 위해서는, 방어 면역 반응을 유발시키는 면역원성 단백질을 코딩하는 유전 물질을 표적의 코딩 서열로서 유전자 작제물에 포함시켜야 한다. 병원체가 세포내로 감염시키든 (이 경우에 본 발명이 특히 유용함) 또는 세포외로 감염시키든, 모든 병원체 항원이 방어 반응을 유도하는 것은 아닐 것이다. DNA와 RNA는 둘다 상대적으로 작고 상대적으로 용이하게 제조될 수 있기 때문에, 본 발명은 복수의 병원체 항원으로 접종할 수 있다는 추가의 이점이 있다. 유전자 백신에 사용되는 유전자 작제물에는 다수의 병원체 항원을 코딩하는 유전 물질이 포함될 수 있다. 예를 들면 여러 바이러스 유전자를 하나의 작제물에 포함시킴으로써 다수의 표적을 제공할 수 있다.

표 1과 2는 병원성 매개 및 유기체 중에서 이들에 의한 감염으로부터 개체를 방어하기 위해 이들에 대한 유전자 백신을 제조할 수 있는 것들 일부의 목록을 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서는, 병원체에 대해 개체를 면역시키는 방법이 HIV 또는 HTLV 또는 HBV에 대한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은 과증식성 질병에서 특징적으로 나타나는 과증식 세포에 대한 광범위한 근거에서 출발된 (broad based) 방어 면역 반응을 유발하는 방법 및 과증식성 질병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "과증식성 질병"이란, 세포의 과증식에 의해 특징지워지는 질병 및 장애를 의미한다. 과증식성 질병의 예로는 모든 형태의 암 및 건선이 있다.

면역원성 "과증식성 세포" 관련 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체에게 주입하는 것은 개체의 백신접종된 세포에서 단백질을 생성하게한다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 용어 "과증식성 연관 단백질"이란 과증식성 질병과 연관된 단백질을 말한다. 과증식성 질병에 대해 면역화하기 위하여, 개체에게 과증식성 질병과 연관된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 개체에 투여한다.

과증식성 관련 단백질이 효과적인 면역원성 표적이 되기 위하여, 단백질은 정상 세포와 비교하여 과증식성 세포에서만 배타적으로 또는 고농도로 생성되야 한다. 표적 항원에는 상기와 같은 단백질, 그의 단편 및 이와 같은 단백질 상에서 발견되는 에피토프를 적어도 포함하는 펩티드가 포함된다. 특정 경우에는, 과증식성 관련 단백질은 단백질을 코딩하는 유전자의 변이화 생성물이다. 변이화된 유전자는 정상 단백질 상에서 발견되지 않는 에피토프를 초래하는 약간 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 점을 제외하고는, 정상 단백질과 거의 동일한 단백질을 코딩한다. 이러한 표적 단백질에는 myb, myc, fyn과 같은 종양 유전자, 및 트랜스로케이션 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 코딩되는 단백질이 포함된다. 종양 유전자 생성물 외에, 표적 항원으로서 항암 치료 및 방어적 양생법을 위한 표적 단백질에는 B 세포 림프구 및 T 세포 림프구의 다양한 영역의 T 세포 수용체에 의해 생성된 항체의 가변 영역이 포함되고, 특정 실시양태에서 이들은 또한 자가면역 질환에 대한 표적 항원으로 사용된다. 다른 종양 관련 단백질은 단일클론 항체 17-1A에 의해 인지되는 단백질 및 폴레이트 결합 단백질을 비롯하여 종양 세포에서 고농도로 발견되는 단백질과 같은 표적 단백질로 사용될 수 있다.

본 발명이 1종 이상의 암 형태에 대해 개체를 면역화하는데 사용할 수 있지만, 특히 본 발명은 특정 암이 발병될 소인을 지니거나 암이 발병되었던 그래서 재발의 가능성이 있는 개체를 예방적으로 면역화시키는데 유용하다. 유전 공학 및 피부학의 발전은 개체에서 암의 발병에 대한 확률 및 위험성 판단을 결정할 수 있게 한다. 유전적 스크리닝 및(또는) 가계의 병력을 이용하여, 특정 개체에서 수가지 유형의 암 중 어느 하나가 발병될 가능성을 예측할 수 있다.

유사하게, 이미 암이 발병했거나, 암 퇴치를 위해 치료를 받았거나, 병이 소강된 개체들은 특히 재발의 가능성을 지닌다. 치료 양생법의 일부로서, 이러한 개체들은 재발을 방지하기 위하여 이미 발병된 것으로 진단되는 암에 대해 면역화될 수 있다. 따라서, 소정의 암이 발병되었던 그리고 재발의 위험이 있는 개체는 그 사실이 알려지는 경우에, 미래에 임의의 암이 발현되는 것을 방지하는 그들의 면역계를 준비하기 위하여 면역화될 수 있다.

본 발며은 과증식성 질병으로부터 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 유전자 작제물의 주입은 면역 치료적이며 표적 단백질을 생성하는 과증식성 세포와 대항하기 위하여 개체의 면역계를 지휘 및 증진시키는 작용을 한다.

본 발명은 세포 수용체 및 "자가"-지시적 항체를 생성하는 세포 수용체 및 세포를 비롯하여 자가면역화와 연관된 표적물에 대해 광범위한 방어적 면역 반응을 부여함으로써, 자가면역 질환 및 장애 환자의 치료 방법을 제공한다.

T 세포 매개된 자가면역 질환에는 류마티스성 관절염(RA), 다중 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역 갑상선염, 리엑티브 관절염, 강직성 척추염, 공피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 맥관염, 웨그너 육아종증, 크론 질병 및 궤양성 대장염이 포함된다. 각 질병은 내인성 항원에 결합하고 자가면역 질환과 연관된 염증성 캐스캐이드를개시하는 T 세포 수용체에 의해 특성화된다. T 세포의 가변 영역에 대한 백신접종는 T 세포를 제거하는 CTL를 비롯한 면역 반응을 유발시킨다.

류마티스성 관절염에서는, 질병에 관여하는 T 세포의 수개의 특정 가변 영역(TCR)은 특성화되었다. 이 TCR에는 Vβ-3, Vβ-14, Vβ-17 및 Vα-17이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 작제물로의 백신접종는 류마티스성 관절염에 관여하는 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유발시킬 것이다 [참조: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253:325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-333, 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 인용됨].

다발성 경화증에서는, 질병에 관여하는 TCR의 수가지의 특정 가변 영역이 특성화되어 있다. 이 TCR에는 Vβ-7 및 Vα-10이 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 작제물로의 백신접종는 다발성 경화증에 관여하는 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유발시킬 것이다 [참조: Wucherpfenning, K.W. et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature:345:344-346; 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 인용됨].

경화증에서, 질병에 관여하는 TCR의 수개의 특정 가변 영역이 특성화되어있다. 이 TCR에는 Vβ-6, Vβ-8, Vβ-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-2β 및 Vα-12가 포함된다. 따라서, 상기 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA 작제물로의 백신접종는 류마티스성 경화증에 관여하는 T 세포를 표적화하는 면역 반응을 유발시킬 것이다.

T 세포 매개된 자가면역 질환, 특히 TCR의 가변 영역이 아직 특성화되지 않은 질병 환자를 치료하기 위하여, 활액의 생물 검사를 수행할 수 있다. 존재하는 T 세포의 시료를 취하여, TCR의 가변 영역을 표준 기술을 사용하여 확인하였다. 유전자 백신은 이러한 정보를 사용하여 제조될 수 있다.

B 세포 매개된 자가면역 질환에는 낭창(SLE), 그라브병, 근무기력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판감소증, 천식, 한성글로불린혈증, 1차 담낭 경화증 및 악성 빈혈이 포함된다. 각 질병들은 내인성 항원에 결합되고 자가면역 질환과 연관된 염증성 캐스캐이드를 개시하는 항체에 의해 특성화된다. 항체의 가변 여역에 대한 백신접종는 항체를 생성하는 B 세포를 제거하기 위하여, CTL을 비롯하여 면역 반응을 유발시킬 것이다.

B 세포 매개된 자가면역 질환 환자를 치료하기 위하여, 자가면역 활성에 관여하는 항체의 가변 영역은 확인되야 한다. 생체검사를 수행하여, 염증 부위에 존재하는 항체 시료를 채취할 수 있다. 이와 같은 항체의 가변 영역은 표준 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 유전적 백신은 이러한 정보를 사용하여 제조될 수 있다.

낭창의 경우에는, 하나의 하원은 DNA로 믿어진다. 따라서, 낭창에 대해 면역화된 환자에서, 이들의 혈청은 항-DNA 항체에 대해 스크리닝되고, 이러한 혈청에서 발견되는 상기 항-DNA 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 작제물을 포함하는 백신을 제조할 수 있다.

TCR과 항체 모두의 가변 영역 중 공통적인 구조적 특징은 공지되어 있다. 특정 TCR 또는 항체를 코딩하는 DNA 서열은 문헌[Kanat, et al., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 기재된 일반적으로 공지된 방법에 따라 발견될 수 있다. 이 외에, 항체로부터의 기능적 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 방법은 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에서 발견될 수 있다.

유전자 백신을 개량하기 위하여 면역조절 단백질 코딩 서열의 발현가능한 형태를 사용하는 것 외에, 본 발명은 개량된 약독화 생백신 및 항원을 코딩하는 외래 유전자를 수송하기 위한 재조합 벡터를 사용하는 개량된 백신에 관한 것이다. 약독화된 생백신 및 외래 항원을 수송하기 위한 재조합 벡터를 사용하는 백신은 미국 특허 제4,722,848호, 동 제5,017,487호, 동 제5,077,044호, 동 제5,110,587호, 동 제5,112,749호, 동 제5,174,993호, 동 제5,223,424호, 동 제5,225,336호, 동 제5,240,703호, 동 제5,242,829호, 동 제5,294,441호, 동 제5,294,548호, 동 제5,310,668호, 동 제5,387,744호, 동 제5,389,368호, 동 제5,424,065호, 동 제5,451,499호, 동 제5,453,364호, 동 제5,462,734호, 동 제5,470,734호, 및 동 제5,482,713호에 기재되어 있고, 상기 문헌들은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 조절 인자와 작동 가능하게 연결되어 백신에서 발현될 수 있는, 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공한다. 유전자 작제물을 약독화된 생백신 및 재조합 백신에 주입하여 본 발명에 따른 개량된 백신을 생성한다.

본 발명은 DNA 백신, 약독화된 생백신 및 재조합 백신을 비롯하여 백신 조성물의 일부로서 개체의 세포에 유전자 작제물을 수송하는 단계를 포함하는 개체를 면역화하는 개량 방법을 제공한다. 유전자 작제물은 조절인자와 작동 가능하게 연결되어 백신에서 발현될 수 있는, 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 개량된 백신은 증진된 세포 면역 반응을 일으킨다.

본 발명의 특정 측면에서, 사람의 면역조절 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 면역원성 표적 또는 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 동반 투여하지 않고 유전자 치료제로서 수송된다. 유전자 치료법은 면역 반응을 구동시키는 면역조절자 단백질의 기능으로부터 초래된다.

유전적 치료제로서 수송되는 유전자 작제물은 사람의 IL-12를 코딩하는 핵산 분자이다. 이러한 유전자 작제물은 바람직하게는 플라스미드이다. 또한, 다른 핵산 기재 벡터, 예를 들어 재조합 바이러스, 재조합 미생물 및 선형 핵산 분자가 고려되며, 이들 모두는 당업자에게 공지되어 있다. 개체에 투여되기에 유용한 플라스미드는 투여되어 조직에서 흡수되고, 발현된다는 것이 공지되어 있다. 고려된 재조합 바이러스에는 재조합 백시니아 바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 바이러스 벡터, 및 재조합 레트로바이러스 벡터가 포함된다. 고려된 재조합 미생물에는 재조합 BCG 벡터, 및 재조합 살모넬라(Salmonella) 벡터가 포함된다. 선형 핵산 분자 및 플라스미드 DNA 분자는 마이크로스피어 및 리포좀에 캡슐화될 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서, 사람의 면역조절 단백질을 코딩하는 플라스미드는 상기된 바와 같이 유전적 작제물이다. 본질적으로, 사람의 면역조절 단백질을 코딩하는 유전자 치료제에 대해, 유전자 치료법 조성물은 면역 표적 단백질에 대한 코딩 서열을 함유하지 않는 다는 점을 제외하고는 상기 유전적 면역화 조성물 및 방법에 기재된 바와 동일한 조성물 및 방법이 사용될 수 있다.

이러한 개시물은 상기 유전자 작제물을 언급함으로써 사람의 면역조절 단백질을 코딩하는 유전자 치료제를 기재하고 있다. 발현시에 필요한 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, 사람의 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 유전자 작제물은 유전자 치료제를 기재하기 위한 것이다. 이러한 작제물은 면역 반응을 개량 및(또는) 구동시키기 위하여 개체에 투여될 수 있다.

예를 들어, IL-12는 알레르기, 암, 자가면역 질환 또는 감염 환자를 치료하기 위하여 수송될 수 있다. IL-12를 코딩하는 유전자 작제물을 촉진제의 존재 또는 부재 하에 투여한다. 특정 실시 양태에서, 유전자 작제물을 상기된 촉진제 1종 이상과 함께 투여한다. 특정 실시 양태에서, 유전자 작재물을 임의의 촉진제 없이 수송한다, 특정 바람직한 실시양태에서, IL-12를 코딩하는 유전자는 임의의 감염제가 없다. 특정 실시양태에서, 유전자 작제물을 주사가아닌 주입 장치를 사용하여 투여한다. 특정 실시양태에서, IL-12를 코딩하는 유전자를 현미경주사를 사용하여 수송한다. 특정 실시양태에서, IL-12를 코딩하는 유전자는 임의의 고체 입자없이 수송한다.

유전자 백신 또는 유전자 치료법 조성물인 본 발명에 따른 제약 조성물은 약 1 ng 내지 약 1000 ㎍의 DNA를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 10 ng 내지 약 800 ㎍의 DNA를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 100 ㎍의 DNA를 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제조된다. 당업자는 유전자 작제물을 포함하는 제약 조성물을 쉽게 제조할 수 있다. 투입 경로로 정맥내 투입을 사용하는 경우, 등장액 제형이 사용되는 것이 바람직하다. 일반적으로 등장액에 대한 첨가제로는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함된다. 특정 경우에, 인산염 완충 염수와 같은 등장액 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 특정 실시양태에서, 혈관수축제를 제형에 가한다. 본 발명에 따른 제약 제제는 멸균 및 발열원이 제거된 것이 제공된다.

본 발명의 방법은 의학 및 수의학 모두에서 유용하다. 따라서, 본 발명은 표유동물, 가금 및 어류의 유전적 면역화에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 사람, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이 종을 비롯한 포유류 종에 특히 유용할 수 있다.

신규한 면역조절자인 사람의 BL1을 발견하였다. DNA 및 예견된 아미노산 서열을 도 14에 도시하고 있다. 이러한 단백질 및 그의 단편은 면역원을 개체에게 주입할 수 있는 백신 조성물과 동반 투여되는 경우에 면역 반응을 증진시킨다. 본원에서 사용된 용어 "면역조절 단편"이란 도 14에 도시된 전길이 서열보다는 짧으나 전길이 화합물의 면역조절 활성을 보유하는 BL1의 단편을 말한다. 본 발명에 따라, BL1 유전자 서열의 수송은 면역 조절을 초래한다. 특정 실험에서, 단백질 발현은 검출되지 않으나 그럼에도 불구하고 면역 반응은 동반 수송에 의해 영향을 받는 것은 BL1 DNA의 수송이 면역 반응을 조절 및 지휘하는데 중요한 단계임의 나타내는 것이다. 본원에서 제시된 개시물은 단백질 생산에 관계없이 면역조절 조성물 및 방법에서 BL1 DNA를 사용하는 것을 개시한다. 따라서, 개시물은 1차 활성제로서, 또는 면역원 또는 면역원을 코딩하는 DNA와 함께 투여되는 조작용제로서 면역 반응을 조절 및 지휘하는데 유용한 면역조절 조성물 내에 면역 조절제로서 BL1 DNA 및 이를 포함하는 벡터를 사용하는 방법에 관한 것이다.

BL1 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 단리하고 정제하고, 단백질에 결합되는 항체를 생성하는 하이브리도마를 생성하고, 상기 단백질을 코딩하는 cDNA을 단리하고, 서열화하고, 발현 벡터를 비롯하여 벡터 내로 주입하고, 숙주 세포 내로 주입하여 단백질을 재조합적으로 발현시킨다. 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 벡터의 동반 투여는 면역원에 대한 면역 반응을 증진시킨다.

BL1의 발견은 면역 반응을 증진, 구동 및 지휘하는 백신 프로토콜을 디자인 및 이용하는 수단을 제공한다.

BL1을 코딩하는 단리된 cDNA는 BL1 또는 그의 면역조절 단편을 생성할 수 있는 재조합 발현 벡터의 작제에서 출발 물질로 유용하다. cDNA는 발현 벡터를 비롯한 벡터 내로 혼입되고, 이는 숙주 세포로 도입되어 단백질을 재조합적으로 발현시킨다. 핵산 분자 및 그의 단편은 BL1 코딩 서열의 존재를 검출하는 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 BL1 코딩 서열과 특이적으로 혼성화된다. 본원에서 사용된 용어 "특이적 BL1 서열"이란 BL1에 대해 유일한 서열을 말한다. BL1을 코딩하는 cDNA의 특이적 단편에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를, mRNA의 번역을 억제하고 유전자 서열을 증폭시키기 위한 안티센스 분자 및 프라이머로서 각각 사용할 수 있다.

cDNA에 의해 코딩되는 BL1 및 예견된 아미노산 서열은 도 14에 도시되어 있다. BL1 코딩 서열은 통상적으로 합성될 수 있고, BL1 단백질은 재조합 DNA 방법에 의해 생성되거나 표준 단백질 합성법에 의해 합성될 수 있다.

표준 방법 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용하여 BL1을 코딩하는 핵산 분자를 제조할 수 있다. 본 발명은 BL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 도 14의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 면역조절 단편을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 BL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 도 14의 코딩 서열로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 핵산 분자는 도 14에 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 본 발명의 단리된 핵산 분자는 작제물 및 재조합 발현 벡터를 제조하는데 유용하다.

BL1에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 16개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 24개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다. 프로브 또는 프라이머는 표준 혼성화법을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다.

BL1을 코딩하는 cDNA는 PCR 프라이머를 디자인하거나 핵산 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. PCR법은 당업자의 숙련가에 의해 통상적으로 수행되고, 진단학에서 그의 용도는 공지 및 허용되어 있다. PCR법의 수행 방법은 문헌["PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications", Innis, M.A., et al. Eds. Academic Press, Inc. 캘리포니아주 샌디에고 소재 (1990), 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 개시되어 있다. PCR법의 응용은 문헌["Polymerase Chain Reaction", Erlich, H.A., et al., Eds. Cold Spring Harbor Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버 소재 (1989), 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 개시되어 있다. 일부 간단한 규칙으로 효율적인 프라이머를 디자인한다. 통상의 프라이머는 50% 내지 60% G+C 조성을 갖는 18개 내지 28개의 뉴클레오티드이다. 전체 프라이머는 바람직하게는 혼성화될 서열과 상보적인 것이 바람직하다. 바람직하게, 프라이머는 100 bp 내지 2000 bp의 PCR 생성물을 생성한다. 그러나, 50 bp 내지 10 kb 이상의 PCR 생성물을 생성할 수도 있다.

PCR법은 핵산 분자에 존재하는 서열을 혼성화하는 5' 및 3' 프라이머를 제공하고 유리 뉴클레오티드 및 효소를 추가로 제공하여, 상기 뉴클레오티드 서열의 상보성 염기를 프라이머들 사이에 유리 뉴클레오티드로 채워 상보적인 DNA 가닥을 생성함으로써 뉴클레오티드서열의 다중 카피수를 신속히 생성하는 것을 가능하게 한다. 효소는 프라이머에 인접한 상보성 서열을 채우게 된다. 5' 프라이머 및 3' 프라이머 모두가 핵산의 동일한 단편의 상보성 가닥 상에서 뉴클레오티드 서열에 대해 혼성화되는 경우에, 특정 이중 가닥 생성물의 지수적 증폭이 일어난다. 단일 프라이머만이 핵산 분자에 혼성화되는 경우, 선형 증폭은 가변적 길이의 단일 가닥 생성물을 생성한다.

본 발명은 도 14의 아미노산 서열을 포함하는 BL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 발현 벡터"는 플라스미드, 파아지, 바이러스성 입자 또는 다른 벡터를 의미하고, 이들은 적절한 숙주로 도입되는 경우에, BL1을 코딩하는 코딩 서열의 직접 발현에 필요한 유전적 인자를 함유한다. 당업자들은 표준 기술 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용하여 BL1을 코딩하는 핵산 분자를 발현 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 코딩 서열은 필요한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 발현 벡터는 공지되어 있고, 쉽게 구입할 수 있다. 발현 벡터의 예로는 플라스미드, 파아지, 바이러스성 벡터, 및 숙주 세포를 형질전환시키고 코딩 서열의 발현을 용이하게하는 다른 핵산 분자가 포함된다. 특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 도 14에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 플라스미드이다.

본 발명은 BL1를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 도 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 단백질 생산에 있어서 공지된 재조합 발현계에서 사용되는 숙주 세포는 공지되어 있고, 쉽게 구입할 수 있다. 숙제 세포의 예로는 이. 콜리(E. Coli)와 같은 세균 세포, 에스. 세레비지에(S. cerevisias)와 같은 효모 세포, 에스. 프루기페르다(S. frugiperda)와 같은 곤충 세포, 사람이 아닌 포유동물의 조직 배양 세포, 중국산 햄스터 난소 세포 및 HeLa 세포와 같은 사람의 조직 배양 세포가 포함된다.

특정 실시양태에서, 예를 들어, 당업자는 공지된 기술을 사용하여 공지된 발현계 내에서 사용되는 시판 발현 벡터 내로 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 플라스미드 pSE420 (인비트로겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 이. 콜리에서 BL1를 생산하는데 사용될 수 있다. 시판되는 플라스미드 pYES2(인비트로겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 효모 균주인 에스. 세레비지에에서 BL1를 생산하는데 사용될 수 있다. 시판되는 MAXBAC(등록상표) 컴플리트 바큘로바이러스 발현계(인비트로겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 곤충 세포에서 생산하는데 사용될 수 있다. 시판되는 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA 3(인비트로겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 예를 들어, 중국산 햄스터 난소 세포와 같은 포유 동물 세포에서 생산하는데 사용될 수 있다. 당업자는 시판되는 이들 발현 벡터 및 발현계, 또는 hVIP를 생성하기 위한 통상적인 방법 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용할 수 있다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold spring Harbor Press (1989), 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 따라서, 목적하는 단백질은 원핵계 및 진핵계 모두에서 제조되어, 단백질을 광범위하게 프로세싱된 형태로 얻을 수 있다.

당업자는 다른 시판되는 발현 벡터 및 발현게 또는 공지된 방법을 사용하고 쉽게 구입되는 출발 물질을 사용하여 벡터를 생성한다. 목적하는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날, 및 바람직하게는 인헨서를 함유하는 발현계는 쉽게 구입할 수 있고, 다양한 숙주에 대해 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Shambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]를 참조한다.

BL1를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 상용성 숙주를 형질전환시킨 후, 외부 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에 배양하고 유지시킨다. 이렇게 생성된 본 발명의 단백질은 세포를 용해시킴으로써, 또는 경우에 따라 당업자에게 공지된 대로 배지로부터 회수한다. 당업자는 이러한 발현계를 사용하여 생성된 BL1을 공지된 방법으로 단리할 수 있다. 상기된 바와 같이 BL1에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 공급원으로부터 BL1을 정제하는 방법은 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 BL1를 정제하는데 동일하게 사용될 수 있다.

유전자 작제물의 예로는 상기 제시된 바와 같이 사람, 또는 작제물이 형질감염되는 세포주에서 작용하는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 BL1 코딩 서열이 포함된다. 구성적 프로모터의 예로는 시토메가바이러스 또는 SV40으로부터의 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예로는 마우스의 포유류 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다.

재조합법에 의해 BL1을 생성하는 것 외에, 또한 자동화된 펩티드 합성기를 BL1을 생성하는데 사용할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, DNA 코딩된 단백질 생산에 있어서 제공되지 않는 치환체를 갖는 유도체인 경우에 유용하다.

BL1을 코딩하는 핵산 분자는, 개체 또는 상용성 숙주 세포에서 도입 및 발현시키기 위하여, 직접 플라스미드 투여, 재조합 바이러스성 발현 벡터 또는 다른 적절한 수송 수단과 같은 다양한 수송 성분 중 임의의 하나를 사용하여 수송할 수 있다. 일반적으로, 바이러스성 벡터는 DNA 바이러스, 예를 들어 재조합 아데노바이러스 및 재조합 백시니아 바이러스, 또는 RNA 바이러스, 예를 들어, 재조합 레트로바이러스일 수 있다. 다른 재조합 벡터에는 세포를 감염시킬 수 있고 재조합 유전자를 발현시킬 수 있는 재조합 원핵생물이 포함된다. 재조합 벡터 외에, 다른 수송 성분들이 또한 고려되며, 그 예로는 리포좀에의 캡슐화, 트랜스페린 매개된 형질감염 및 다른 수용체 매개된 수단이 있다. 본 발명에는 동일하게 기능하며 당업자에게 지금까지 공지된 다른 형태의 발현 벡터 및 다른 적절한 수송 수단이 포함된다.

또한, 본 발명은 BL1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 트랜스제닉이며 사람이 아닌 포유류에 관한 것이다. 재조합 단백질을 생성하는데 유용한 트랜스제닉이며 사람이 아닌 포유류는 공지되어 있고, 트랜스제닉 동물을 생성하기 위해 필요한 발현 벡터 및 방법도 공지되어 있다. 일반적으로 트랜스제닉 동물은, BL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 유(乳)세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 포함하여서, 코딩 서열이 유세포에서만 발현되고, 이렇게 발현된 재조합 단백질은 동물의 우유로부터 수거된다. 당업자는 문헌[와그너에게 1989년 10월 10일에 허여된 미국 특허 제4873191호 및 리더에게 1988년 4월 12일에 하여된 미국 특허 제4736866호, 상기 문헌 모두는 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 교시된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 BL1을 생성하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. 바람직한 동물로는 염소, 양 또는 설치류, 특히 래트 및 마우스가 있다.

BL1 단백질 또는 이를 생성하기 위한 발현 벡터는 제약 조성물로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물에는 핵산 분자와 혼합되어 수송 성분이 포함되고, 추가로 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클, 예를 들어 염수가 포함된다. 핵산을 성공적으로 수송하기 위하여 임의의 매질을 사용할 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용될 수 있는 제약학적으로 허용 가능한 매질을 다수 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 제약학적 담체는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, 당 분야에서의 표준 참고서로 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 본 발명의 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 때문에, 비경구적 투여, 즉 정맥내, 피하, 경피, 근육내로 투여하는 것이 통상적으로 흡수를 최적화할 것이다. 정맥내 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 에멀젼으로 제형될 수 있다. 별법으로, 이들은 비강내 또는 흡입 투여를 위해 에어로졸 제약으로 제형될 수 있다. 어떤 경우에는 국부 투여가 바람직할 수 있다.

투여량은 약물동력학적 특성, 투여 형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화된다. 통상적으로, 펩티드의 투여량은 체중 50 ㎏ 당 1 내지 3000 ㎎, 바람직하게는 체중 50 ㎏ 당 10 내지 1000 ㎎, 더욱 바람직하게는 체중 50 ㎏ 당 25 내지 800 ㎎일 수 있다. 통상적으로 1일 8 내지 800 ㎎을 1회 내지 6회 개체에 투여하거나 서방형이 목적하는 결과를 얻기에 효과적이다. 국부 투여용 제형에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 통상의 제약학적 담체, 수상 또는 분말상 또는 오일상 기재, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 경구 투여용 조성물로는 분말 또는 과립, 좌약 또는 수용액 또는 비수성 매질, 캡슐, 사켓트 또는 정제가 포함된다. 증점제, 방향제, 희석제, 유화제, 분산제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 비경구용, 정맥내, 포막내 또는 심실내 투여를 위한 조성물에는 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 포함하는 멸균 수용액이 포함될 수 있고, 바람직하게는 멸균되고 발열원이 없다. 본 발명에 따른 정맥내 투여에 적합한 제약 조성물은 멸균되고 발열원이 없다.

비경구 투여용으로, 본 발명의 펩티드 예를 들어, 제약학적으로 허용 가능한 비경구용 비히클과 함께 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로 제형될 수 있다. 이러한 비히클의 예로는 물, 염수, 링거의 용액, 덱스트로즈 용액, 및 5% 사람 혈청 알부민이 있다. 리포좀 및 고정용 오일과 같은 비수성 비히클도 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결 건조된 분말은 등장제(예: 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정화제(예: 완충제 및 보존제)를 함유할 수 있다. 제제는 통상적인 방법은 멸균된다. 예를 들어, 주사 투여에 적합한 비경구용 조성물은 0.9% 염화나트륨 용액 중에 활성 물질 1.5 중량%를 용해시켜 제조한다.

본 발명의 제약 조성물은 활성 물질이 포유 동물의 체내의 작용 부위에 도달할 수 있는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신적 치료가 바람직한지에 따라, 그리고 치료될 영역에 따라 수가지 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(안구, 질, 직장, 비강, 경피 포함), 경구 또는 비경구적으로 수행될 수 있다. 비경구적 투여에는 정맥내 드립, 피하, 복막내 또는 근육내 주사, 폐를 통한 투여, 예를 들어 흡입 또는 취입, 또는 포막내 또는 심실내 투여가 포함된다.

BL1와 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마, 및 그들의 항체는 BL1, 및 BL1을 포함하는 단백질 복합체의 단리 및 정제에 유용하다. 이 외에, 항체는 BL1 활성의 특이적 억제제이다. hVIP에 특이적으로 결합하는 항체는 공지된 기술 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용하여 천연 공급원으로부터 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 항체는, 재조합 DNA 기술에 의해 단백질을 생성하는 경우에 존재하는 물질로부터 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체"란 완전하고 무상의 항체, 그의 Fab 단편 및 F(ab)₂ 단편을 말한다. 완전하고 무상의 항체에는 쥐의 단일클론 항체, 키메릭 항체 및 사람화된 항체와 같은 단일클론 항체가 포함된다. 에피토프에 결합되는 항체는 공지된 기술, 예를 들어 친화 크로마토그래피(즉, 항체는 다른 단백질과는 교차 반응하지 않음)를 이용하여 천연 공급원 또는 제조합 발현계 모두로부터 단백질을 단리 및 정제하는데 유용하다. 이러한 항체는 시료 중에 상기의 단백질의 존재를 검출하고, 세포가 단백질을 발현시키는지를 검출하는데 유용하다.

항체의 생산, 및 완전하고 무상의 항체, 그의 Fab 단편 및 F(ab)₂ 단편의 단백질 구조, 및 상기의 분자를 코딩하는 유전적 서열의 조직화는 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow, E. and D. Lane (19880 ANTIBODIES; A Laboratory Manual, Col Spring Harbor Laboratory, 뉴욕 콜드 스프링 하버 소재, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 기재되어 있다. 요컨대, 예를 들어 BL1 또는 그의 면역원 단편은 마우스에 주입된다. 쥐의 비장을 제거하고, 비장 세포를 단리하고 무한증식 마우스의 세포에 융합시킨다. 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마를 배양하고, 항체를 방출하는 세포를 선별한다. 항체를 분석하고, BL1에 특이적으로 결합하는 것이 발견되는 경우, 이들을 생성하는 하이브리도마를 배양하여 항체를 연속적으로 공급한다.

하기의 실시예들은 본 발명을 예시한 것이다. 본 실시예는 본 발명의 영역을 제한하려는 것이 아니라, 예시하려는 것이다. 또한, 본 발명의 다양한 측면은 하기 기재에 의해 요약될 수 있다. 그러나, 이러한 기재는 본 발명의 영역을 제한하려는 것이 아니라, 본 발명의 다양한 측면에 관한 것이다. 당업자는 본 발명의 추가적 측면 및 실시 태양을 쉽게 이해할 수 있다.

<실시예 1>

하기는 본 발명에 사용된 작제물을 목록이다. 하기 목록화된 다양한 작제물을 생성하는데 출발 물질로서 사용되는 벡터 pBabe·puro는 원조로 작제되고, 문헌[Morgenstern, J.P., and H. Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18912):3587-3596, 본원에 참고문헌으로 인용됨]에 보고되어 있다. pBabe·puro 플라스미드는 특히 포유동물의 세포에서 외생 유전자의 발현에 유용하다. 발현될 DNA 서열은 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스 (MoMuVL)의 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터의 조절 하에 클로닝 부위에 삽입된다. 플라스미드는 푸로마이신 내성에 대한 선택적 마커를 포함한다.

플라스미드 pBa·Vα3-IL-12는 pBabe·puro의 EcoRI 부위 내에 클로닝된, L, V 및 J 단편을 포함하는 T 세포 수용체 Vα3 영역을 코딩하는 2.7 kb EcoRI 게놈 단편 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. T 세포 수용체 유래의 표적 단백질은 T 세포 매개의 자가면역 질환 및 클로노타입(clonotype) T 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pBa·gagpol-vpr-IL-12은 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV/MN으로부터 gag/pol 및 vif 유전자를 포함하는 플라스미드이다. vpr 유전자는 결손되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. HIV DNA 서열은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. human Retro. 8:1549]에 개시되어 있다. 서열은 본원에 참고로 인용된, 진뱅크 제M17449호로 기탁되어 있다.

플라스미드 pM160은 HIV-I/3B 인벨롭 단백질을 코딩하는 2.3kb PCR 단편 및 pMAMneoBlue 내에 클로닝된 rev/tat 유전자를 함유하는 플라스미드이다. nef 영역은 결손되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. HIV -1/3B의 DNA 서열은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Fisher, A. 1985, Nature 316:262]에 개시되어 있다. 서열은 본원에 참고로 인용된, 진뱅크 제K03455호로 기탁되어 있다.

플라스미드 pBa·VL-IL-12는 XbaI EcoRI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 항-DNA 항체의 VL 영역을 코딩하는 PCR 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. 항체 유래의 표적 단백질은 B 세포 매개의 자가면역 질환 및 클로로타입 B 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 항체로부터 기능적 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 방법은, 본원에서 참고문헌으로 인용된 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066]에서 발견될 수 있다.

플라스미드 pOspA·B-IL-12는 pBabe·puro 내의 BamHI 및 SalI 부위에 클로닝된 라임 질병의 원인인 스피로헤타균 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)의 OspA 및 OspB 항원을 코딩하는 코딩 영역, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 본원에 참고로 인용된 문헌[Williams, W.V., et al. 1992, DNA and Cell. Biol. 11(3); 207]을 참조한다. 표적 단백질을 코딩하는 병원체 유전자를 함유하는 플라스미드는 라임 질병에 대한 면역화에 유용하다.

플라스미드 pBa·Rb-G-IL-12는 pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 광견병 G 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 광견병 G 단백질을 코딩하는 상기의 병원체 유전자를 함유하는 플라스미드는 광견병의 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크의 제M32571호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Anilionis, A. et al., 1981, Nature, 294: 275]을 참조한다.

플라스미드 pBa·HPV-L1은 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 HPV 균주 16, 18, 31 및 33을 비롯한 사람의 파필로마바이러스(HPV)의 L1 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인한 암에 대한 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M15781호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Howley, P., 1990 Fields Virulogy, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 58:1625; and Shah, K. and P. Howley, 1990 Fiels Virology, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 59]을 참조한다.

플라스미드 pBa·HPV-L2-IL-12는 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 HPV 균주 16, 18, 31 및 33을 비롯한 사람의 파필로마바이러스(HPV)의 L2 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인한 암에 대한 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M15781호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Howley, P., 1990 Fields Virulogy, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 58:1625; and Shah, K. and P. Howley, 1990 Fiels Virology, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 59]을 참조한다.

플라스미드 pBa·MNp7-IL-12은 BamHI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV MN gag (코어 단백질)을 비롯한 p7 코딩 영역을 코딩하는 PCR 유발 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pGA733-2-IL-12는 결장직장암 세포주 SW948로부터 pCDM8 벡터 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Seed, B. and A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365]) 내의 BstXI 부위에 클로닝된 GA733-2 종양 표면 항원, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질병에 대한 면역화 및 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733-2 항원은 결장암에 대한 유용한 표적 항원이다. GA733 항원은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Szala, S. et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3542-3546]에 보고되어 있다.

플라스미드 pT4-pMV7-IL-12는 EcoRI 부위에서 pMv7 벡터 내로 클로닝된 사람의 CD4 수용체를 코딩하는 cDNA, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. CD4 표적 단백질은 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 플라스미드 pT4-pMV7은 AIDS 보관 목록 번호 제158로부터 구입가능하다.

플라스미드 pBa·RAS-IL-12는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고, BamHI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 ras 코딩 영역, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. ras 표적 단백질은 시토플라즘 시그날용 분자의 예이다. ras의 클로닝 방법은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. Ras 코딩 플라스미드는 암, 특히 ras 관련 암, 예를 들어 방광암, 근육암, 폐암, 뇌종양 및 골암과 같은 과증식성 질병의 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pDJGA733-IL-12는 BamHI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 GA733 종양 표면 항원, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질병에 대한 면역화 및 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733 항원은 결장암에 대한 유용한 표적 항원이다.

플라스미드 pBa·MNp55-IL-12은 BamHI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV MN gag (코어 단백질)을 비롯한 p55 코딩 영역을 코딩하는 PCR 유발 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·MNp24-IL-12은 BamHI 및 EcoRI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 전체 HIV MN gag 코딩 영역을 비롯한 p24 코딩 영역을 코딩하는 pMN-SF1 주형으로부터 PCR 유발 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·MNp17-IL-12은 BamHI 및 EcoRI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV MN gag (코어 단백질)을 비롯한 p17 코딩 영역을 코딩하는 PCR 유발 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·SIVenv-IL-12는 pBR322 중에 SIV 239를 함유하는 작제물로부터 증폭되어 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.7 kb의 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 AIDS 리써치 및 레퍼런스 레전트 프로그램으로부터 입수가능하다 (목록 번호 제210호).

플라스미드 pcTSP/ATK·env-IL-12는 pcDNA1/neo 벡터 내로 서브클로닝된 HTLV-1/TSP 및 /ATK 단리물로부터 완전한 HTLV 인벨롭 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 플라스미드 pcTSP/ATK·env는 본원에 참고로 인용된 문헌 [1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3599]에 보고되어 있다. HTLV 인벨롭 표적 단백질은 HTLV에 의한 감염 및 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pBa·MNgp160-IL-12는 pSP72 중에 MNenv을 함유하는 작제물로부터 증폭되어 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.8 kb의 PCR 생성 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pC·MNp55-IL-12는 MN 단리물의 gag 영역으로부터 증폭되어 pCEP4 벡터 내로 클로닝된 1.4 kb의 PCR 생성 단편을 함유하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 이 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pC·Neu-IL-12는 LTR-2/erbB-2 작제물로 부터 잘라져 pCEP4 벡터 내로 서브클로닝된 사람의 neu 종양원 코딩 영역을 함유하는 3.8 kb DNA 단편, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드이다. pC·Neu 플라스미드는 본원에 참고로 인용된 문헌[DiFiore, 1987, Science 237:178]에 보고되어 있다. neu 종양원 표적 단백질은 암, 특히 결장암, 유방암, 폐암 및 뇌암과 같은 과증식성 질환의 면역화 및 치료에 있어서 표적 단백질로서 유용한 증식 인자 수용체의 예이다.

플라스미드 pC·RAS-IL-12는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고, pCEP4 내의 BamHI 부위에 클로닝된 ras 종양유전자 코딩 영역을 함유하는 1.4 kb의 DNA 단편, 및 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 서열과 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열을 포함하는 플라스미드이다. pC·RAS 플라스미드는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. ras 표적 단백질은 시토플라즘 시그날용 분자의 예이다. Ras 코딩 플라스미드는 암, 특히 ras 관련 암, 예를 들어 방광암, 근육암, 폐암, 뇌종양 및 골암과 같은 과증식성 질병의 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pNLpuro-IL-12는 HIV gag/pol 및 SV40-puro 삽입물을 함유하는 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자, 및 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

<실시예 2>

플라스미드 pCSIL-12는 CMV 프로모터와 작동 가능하게 연결된 IL-12 코딩 서열, 및 SV 40 폴리아데닐화 서열을 포함한다.

<실시예 3>

본 발명의 실시양태에 따른 조성물은 하기 플라스미드 중 하나와 플라스미드 pCSIL-12를 함께 배합하여 제조할 수 있었다.

플라스미드 pBa·Vα3은 pBabe·puro의 EcoRI 부위 내에 클로닝된, L, V 및 J 단편을 포함하는 T 세포 수용체 Vα3 영역을 코딩하는 2.7 kb EcoRI 게놈 단편을 포함하는 7.8 kb 플라스미드이다. T 세포 수용체 유래의 표적 단백질은 T 세포 매개의 자가면역 질환 및 클로노타입 T 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pBa·gagpol-vpr은 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV/MN으로부터 gag/pol 및 vif 유전자를 포함하는 9.88 kb 플라스미드이다. vpr 유전자는 결손되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. HIV DNA 서열은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Reiz, M.S., 1992, AIDS Res. human Retro. 8:1549]에 개시되어 있다. 서열은 본원에 참고로 인용된, 진뱅크 제M17449호로 기탁되어 있다.

플라스미드 pM160은 HIV-I/3B 인벨롭 단백질을 코딩하는 2.3kb PCR 단편 및 pMAMneoBlue 내에 클로닝된 rev/tat 유전자를 함유하는 11.0 kb 플라스미드이다. nef 영역은 결손되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. HIV -1/3B의 DNA 서열은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Fisher, A. 1985, Nature 316:262]에 개시되어 있다. 서열은 본원에 참고로 인용된, 진뱅크 제K03455호로 기탁되어 있다.

플라스미드 pBa·VL은 pBabe·puro 내의 XbaI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 항-DNA 항체의 VL 영역을 코딩하는 PCR 단편을 포함하는 5.4 kb 플라스미드이다. 항체 유래의 표적 단백질은 B 세포 매개의 자가면역 질환 및 클로노타입 B 세포 임파종 및 백혈병에 대한 면역화 및 치료에 유용한 표적 단백질의 일례다. 항체로부터 기능적 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 방법은, 본원에서 참고문헌으로 인용된 문헌[Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066]에서 발견될 수 있다.

플라스미드 pOspA·B는 pBabe·puro 내의 BamHI 및 SalI 부위에 클로닝된 라임 질병의 원인인 스피로헤타균 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)의 OspA 및 OspB 항원을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 6.84 kb의 플라스미드이다. 본원에 참고로 인용된 문헌[Williams, W.V., et al. 1992, DNA and Cell. Biol. 11(3); 207]을 참조한다. 표적 단백질을 코딩하는 이들 병원체 유전자를 함유하는 상기 플라스미드는 라임 질병에 대한 면역화에 유용하다.

플라스미드 pBa·Rb-G는 pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 광견병 G 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 7.10 kb의 플라스미드이다. 광견병 G 단백질을 코딩하는 상기의 병원체 유전자를 함유하는 플라스미드는 광견병의 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크의 제M32751호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Anilionis, A. et al., 1981, Nature, 294: 275]을 참조한다.

플라스미드 pBa·HPV-L1은 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 HPV 균주 16, 18, 31 및 33을 비롯한 사람의 파필로마바이러스(HPV)의 L1 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 6.80 kb의 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인한 암에 대한 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M15781호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Howley, P., 1990 Fields Virulogy, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 58:1625; and Shah, K. and P. Howley, 1990 Fiels Virology, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 59]을 참조한다.

플라스미드 pBa·HPV-L2는 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 HPV 균주 16, 18, 31 및 33을 비롯한 사람의 파필로마바이러스(HPV)의 L2 캡시드 단백질을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 6.80 kb 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 HPV 감염 및 그로 인한 암에 대한 면역화에 유용하다. DNA 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M15781호에 개시되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Howley, P., 1990 Fields Virulogy, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 58:1625; and Shah, K. and P. Howley, 1990 Fiels Virology, Volume 2, Eds.; Channock, R.M. et al. Chapter 59]을 참조한다.

플라스미드 pBa·MNp7은 pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 HIV MN gag (코어 단백질) 서열을 비롯한 p7 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 5.24 kb의 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이들 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pGA733-2는 결장직장암 세포주 SW948로부터 pCDM8 벡터 내의 BstXI 부위에 클로닝된 GA733-2 종양 표면 항원을 포함하는 6.3 kb의 플라스미드이다 (Seed B. and A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3356, 본원에 참고로 인용됨). 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질병에 대한 면역화 및 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733-2 항원은 결장암에 대한 유용한 표적 항원이다. GA733 항원은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Szala, S. et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3542-3546]에 보고되어 있다.

플라스미드 pT4-pMV7은 pMV7 벡터 내의 EcoRI 부위에 클로닝된 사람의 CD4 수용체를 코딩하는 cDNA를 포함하는 11.5 kb의 플라스미드이다. CD4 표적 단백질은 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 플라스미드 pT4-pMV7은 AIDS 보관 목록 제158로부터 입수가능하다.

플라스미드 pDJGA733은 pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 GA733 종양 표면 항원을 포함하는 5.1 kb의 플라스미드이다. 종양 관련 표적 단백질은 암과 같은 과증식성 질병에 대한 면역화 및 치료에 유용한 표적 단백질의 예이다. GA733 항원은 결장암에 대한 유용한 표적 항원이다.

플라스미드 pBa·RAS는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고, pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 ras 코딩 영역을 포함하는 6.8 kb의 플라스미드이다. ras 표적 단백질은 시토플라즘 시그날용 분자의 예이다. ras의 클로닝 방법은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. Ras 코딩 플라스미드는 암, 특히 ras 관련 암, 예를 들어 방광암, 근육암, 폐암, 뇌종양 및 골암과 같은 과증식성 질병의 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pBa·MNp55는 pBabe·puro 내의 BamHI 부위에 클로닝된 HIV MN gag 전구체 (코어 단백질) 서열을 비롯한 p55 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 6.38 kb의 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이들 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·MNp24는 BamHI 및 EcoRI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 전체 HIV MN gag 코딩 영역을 비롯한 p24 코딩 영역을 코딩하는 pMN-SF1 주형으로부터 PCR 유발 단편을 포함하는 5.78 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·MNp17은 BamHI 및 EcoRI 부위에서 pBabe·puro 내로 클로닝된 HIV MN gag (코어 단백질)을 비롯한 p17 코딩 영역을 코딩하는 PCR 유발 단편을 포함하는 5.5 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pBa·SIVenv는 pBR322 중에 SIV 239를 함유하는 작제물로부터 증폭되어 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.71 kb의 PCR 생성 단편을 포함하는 7.8 kb 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 AIDS 리써치 및 레퍼런스 레전트 프로그램으로부터 입수가능하다 (목록 번호 제210호).

플라스미드 pcTSP/ATK·env는 pcDNA1/neo 벡터 내로 서브클로닝된 HTLV-1/TSP 및 /ATK 단리물로부터 완전한 HTLV 인벨롭 코딩 영역을 코딩하는 PCR 생성 단편을 포함하는 8.92 kb 플라스미드이다. 플라스미드 pcTSP/ATK·env는 본원에 참고로 인용된 문헌 [1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3599]에 보고되어 있다. HTLV 인벨롭 표적 단백질은 HTLV에 의한 감염 및 T 세포 임파종에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pBa·MNgp160은 pSP72 중에 MNenv을 함유하는 작제물로부터 증폭되어 pBabe·puro 내의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝된 2.8 kb의 PCR 생성 단편을 포함하는 7.9 kb 플라스미드이다. 본원에 참고문헌으로 인용된, 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이들 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pC·MNp55는 MN 단리물의 gag 영역으로부터 증폭되어 pCEP4 벡터 내로 클로닝된 1.4 kb의 PCR 생성 단편을 포함하는 11.8 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 이들 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 상기 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다. 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549]을 참조한다. 상기 서열은 본원에 참고로 인용된 진뱅크 제M17449호에 개시되어 있다.

플라스미드 pC·Neu는 LTR-2/erbB-2 작제물로 부터 잘라져 pCEP4 벡터 내로 서브클로닝된 사람의 neu 종양원 코딩 영역을 함유하는 3.8 kb DNA 단편을 포함하는 14.2 kb 플라스미드이다. pC·Neu 플라스미드는 본원에 참고로 인용된 문헌 [DiFiore, 1987, Science 237:178]에 보고되어 있다. neu 종양원 표적 단백질은 암, 특히 결장암, 유방암, 폐암 및 뇌암과 같은 과증식성 질환의 면역화 및 치료에 있어서 표적 단백질로서 유용한 증식 인자 수용체의 예이다.

플라스미드 pC·RAS는 먼저 pZIPneoRAS로부터 서브클로닝되고, pCEP4 내의 BamHI 부위에 클로닝된 ras 종양유전자 코딩 영역을 함유하는 1.4 kb의 DNA 단편을 포함하는 11.7 kb 플라스미드이다. pC·RAS 플라스미드는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Weinberg, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 1577]에 보고되어 있다. ras 표적 단백질은 시토플라즘 시그날용 분자의 예이다. Ras 코딩 플라스미드는 암, 특히 ras 관련 암, 예를 들어 방광암, 근육암, 폐암, 뇌종양 및 골암과 같은 과증식성 질병의 면역화 및 치료에 유용하다.

플라스미드 pNLpuro는 HIV gag/pol 및 SV40-puro 삽입물을 함유하는 15 kb 플라스미드이다. HIV 표적 단백질을 코딩하는 HIV 바이러스 유전자를 포함하는 플라스미드는 HIV 감염 및 AIDS에 대한 면역화 및 치료에 유용하다.

<실시예 4>

백신을 개량하기 위하여 면역 반응을 특이적으로 조절하는 것이 중요할 수 있다. 면역 반응의 유형 (Th1 대 Th2)은 감염성 질병, 자가면역 질환, 및 알레르기를 비롯한 다양한 질환의 모델에서 주용한 것으로 보고되었다. HIV 감염에 대한 강하고 안정한 세포 매개의 면역 반응을 유도하기 위하여, 면역화와 함께 면역학적 보조제 및 시토킨과 같은 면역 조절자를 사용하는 것은 세포 면역 반응을 증진시키고, Th2 내지 Th1 유형의 항원 의존적 면역 반응을 조절할 수 있게 한다.

생체 내에서 면역반응을 엔지니어링하기 위하여, 사람의 시토킨 유전자, IL-12 유전자 또는 GM-CSF 유전자를 HIC 작제물과 함께 동반 수송하였다. HIV-1 DNA 백신과 함께 상기 3가지 유전자의 동반 수송에 의해 유도된 면역 반응을 검증하였고, 세포 면역화의 유도, 구체적으로 항바이러스성 CTL 반응을 연구하였다.

IL-12 및 GM-CSF의 유전자를 CMV 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 내로 개체적으로 클로닝하였다. 이어서, 유전자 플라스미드 발현 카셋트를 HIV-1에 대한 DNA 백신 카셋트와 함께 쥐에 주입하였다 (본원에 참고로 인용된 1996년 5월 6일자로 출원된 미국 출원 번호 제08/642045호에 언급됨). 항원 특이적 면역 반응의 크기에 대한 유전적 보조제 카셋트의 동반 면역화의 면역학적 효과를 분석하였다. IL-12의 동반 수송으로 체액 반응의 감소를 관찰한 반면, IL-12 동반 면역화로 체액 반응의 온화한 증진을 관찰하였다. IL-12 또는 GM-CSF로의 동반 면역화로 항원 특이적 T 헬퍼 세포 증식의 증가를 관찰하였다. 직접 CTL 분석을 사용하여 IL-12에 대한 유전자의 동반 투여로 의미있는 CTL 유도를 관찰한 것은 중요하였다. 이와 대조적으로, 이 연구에서 GM-CSF에 대한 유전자로는 CTL 유도에 대한 효과를 거의 관찰하지 못했다. 이러한 결과는 특정 면역 반응의 조절된 생산에 대한 DNA 백신의 유용성을 입증하였다. 또한, 이들은 분자 특이적 경향으로 기본적 면역학적 기능을 밝히는 방법의 유용성을 입증하였다.

<재료 및 방법>

- 쥐:

6 내지 8주된 Bab/c 암컷 쥐를 할란 스프라그 덜리사(인디애나주, 인디애나폴리스 소재)에서 구입하였다. 쥐를 온도가 조절되고, 빛이 사이클되는 방에서 키웠다. 이들은 국립 보건원 및 펜실바니아 대학의 주도 하에 방어받고 있다.

- 시약:

DNA 백신 제제 pCMN160, pCGN160, pCGag/Pol을 제조하였다. IL-12 및 GM-CSF 유전자를 클로닝하고, CMV 프로모터가 존재하는 발현 벡터내로 삽입하였다. 재조합 백시니아 (vMN462. vVK1, VV; gag 및 vSC8)를 국립 보건원 AIDS 리써치 및 레퍼런스 레전트 프로그램으로부터 얻었다.

- DNA 접종:

생체 내로 플라스미드 수송된 유전자로부터 생체내 단백질 발현 수준을 증가시키는 용이한 DNA 접종법을 사용하였다. 구체적으로, BALB/C 쥐의 근육에 27 게이지 바늘을 사용하여 0.25% 부피바케인-HCl(시그마사, 세인트 루이스 소재)을 함유하는 용액 100 ㎕을 주사하였다. 2일 후에, 인산염 완충액 중에 목적하는 DNA 작제물 50 g을 부피바케인과 동일한 부위의 근육에 주사하였다. 다양한 유전자 발현 카셋트를 동반 투여하기 위해 주사하기 전에 선택된 플라스미드들을 혼합하였다.

- FACS 분석:

세포(1×10⁵)을 FACS 완충액(1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS)으로 3회 세척하고, 포화 조건 하에 얼음 상에서 30분 동안 FITC 및(또는) PE-컨쥬게이트된 mAb와 함게 인큐베이션하였다. FACS 완충액으로 3회 세척한 후, 세포를 FACScan(벡톤 디킨슨사) ELISA를 사용하여 분석하였다.

- ELISA:

0.1 M 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.5) 중의 2 ㎍/㎖의 gp120 또는 gp41 (인트라셀사, 매사추세츠주 캠브릿지 소재)를 상기 기재된 바와 같이 4℃에서 밤새 마이크로티터 웰 상에 흡착시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈-20으로 세척하고, 0.05% 트윈-20을 함유한 PBS 중 3% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 후, HRP-컨쥬게이트된 염소의 항쥐 IgG 또는 IgA (시그마사, 미주리주 세인트루이스 소재)의 제조자의 지시에 따른 희석물과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TM 블루 완충액(시그마사)으로 현상하였다. OD 450 nm를 디나테크 MR5000 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

- T 세포 증식 분석법:

마우스의 비장으로부터 수확된 림프구를 제조하였다. 단리된 세포 현탁액을 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 1×10⁵ 세포를 함유하는 분취액 100 ㎕을 즉시 바닥이 평평한 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하였다. 단백질 10 ㎕를 웰에 20 ㎍/㎖로 3배수로 가하였다. 세포를 5% CO₂ 중 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. ³H 티미딘 1 μCi를 각 웰에 가한 후, 세포를 37℃에서 12 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 수확하고, 혼입된 ³H 티미딘을 베타 플레이트 판독기에서 측정하였다 (왈락사, 핀란드 투르쿠 소재). 세포가 활성적임을 확인하기 위하여, PHA 10 g/㎖을 다클론성 촉진제 양성 대조구로 사용하였다.

- 세포독성 T 림프구 분석법:

5시간 동안 크롬(⁵¹Cr) 방출하는 CTL 분석을 수행하였다. 림프구를 비장으로부터 수확하고, 적혈구를 제거하고 신선한 배지로 수회 세척하여, 이펙터 세포로 제조하였다. 3×10⁶의 p815 세포를 16시간 동안 37℃에서 감염시킴으로써, 백시니아 감염된 표적을 제조하였다. 표적 세포를 100 μCi/㎖의 Na₂ ⁵¹CrO₄로 90분 동안 표지하였고, 촉진된 비장 세포를 37℃에서 4 내지 7시간 동안 인큐베이션하는데 사용하였다. CTL를 50:1 내지 12.5:1 범위의 이펙터:표적(E:T) 비에서 시험하였다. 상등액을 수확하고, LKB 클리니감마 감마 계수기 상에서 계수하였다. 비용해도를 하기 식으로부터 결정하였다.

100×{(실험시 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)}

최대 방출은 1% 트리톤 X-100을 함유하는 배지에서 표적 세포를 용해시킴으로써 결정하였다. 분석법은 "자발적 방출" 계수에 대한 값이 "최대 방출"의 20%를 초과하는 경우에 타당하지 않는 것으로 간주된다.

<결과>

- 쥐의 비장의 표현형화:

동반 접종을 수행한 후, 각 실험 군으로부터 수거된 비장은 상이한 것으로 관찰되었다. 따라서, 모든 면역화된 동물로부터 수거된 비장을 칭량하고, 시각적으로 관찰하였다. 이러한 동물들의 비장 질량은 도 1A에 도시되어 있다. 단일 제형 대조구를 주사한 마우스로부터의 비장은 면역화되지 않은 대조구 마우스의 질량과 유사(약 100 ㎎)한 반면, Gag/Pol+IL-12 유전자가 주입된 마우스로부터의 비장은 대조구 비장 질량의 약 3배였다. 한편, Gag/Pol+GM-CSF 면역화된 마우스의 비장은 확대되지 않았다. Gag/Pol 또는 IL-12만으로 면역화된 경우에 비장이 현저히 확장되지 않음은 흥미로운 것이다. 항원 및 IL-12 유전자 카셋트를 동반 투여하는 경우에만 비장 확대 결과를 보이는 것은, 이 현상이 2개의 유전자 생성물의 배합된 효과임을 암시한다. 더욱이, 도 1B에 도시된 바와 같이, Gag/Pol+IL-12 비장 유래의 림프구의 수는 대조구 비장 유래의 수의 3배를 초과하였다. 다시 말해, Gag/Pol 및 GM-CSF 면역화된 쥐의 비장은 대조구 비장 세포수를 초과하도록 임의의 현저한 림프구 수의 증가를 일으키지 않았다. 대표적인 비장의 사진을 도 2에 도시하였다. 이들의 질량에 따라, 항원+IL-12 비장은 다른 비장 보다 수배 크다는 것을 관찰하였다. IL-12의 p35 쇄가 여러 세포 유형에서 구성적으로 발현된다는 것은 보고되어 있다. 따라서, 단일 p40 쇄 및 DNA 면역원만이 효과를 나타낼 수 있다. 이를 시험하기 위하여, 2개의 IL-12 헤테로 이량체 유전자(p35 및 p40) 각각을 Gag/Pol과 함께 동반 투여하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 비장 크기의 확장은 어떠한 경우에도 관찰되지 않았다. 이 자료는 DNA 백신과 2개의 p35 및 p40 IL-12 유전자의 동반 투여가 비장의 크기를 증가시키고, 이에 상응하여 비장 세포수를 증가시킨다는 것을 나타내었다. 이 자료는 플라스미드가 생체 내에서 동일한 세포 내로 주입되고, 모든 3개의 성분들, 즉 p35 쇄 및 p40 쇄, 및 특이적 항원의 전사를 조절하여, 관찰되는 생물학적 변화를 유도하는 것을 증명한다.

-FACS 분석법:

확장된 비장의 세포 조성을 규명하기 위하여, FACS 분석법을 수행하였다. 표 3은 CD3에 대한 항체, 및 B220, CD4 및 CD8에 대한 항체로 비장 세포를 이중염색함으로써 얻은 FACS 결과를 나타내고 있다. 기재된 바와 같이, 면역화되지 않은 대조구 비장(25.43%)에서 B 세포의 백분율에 비해 인벨롭+IL-12 또는 Gag/Pol+IL-12 작제물(각각 17.46% 및 21.62%)로 면역화된 군에서 B220 양성 B 세포군 밀도가 약간 감소하는 것을 관찰하였다. 또한, 면역화되지 않은 군(13.69%)에서의 백분율에 비해 인벨롭+IL-12 또는 Gag/Pol+IL-12 작제물로 면역화된(각각 21.72% 및 16.88%) 군에서의 CD8+ T 세포의 백분율이 다소 증가하였다.

- 체액 반응

면역화된 마우스로부터의 항혈청을 회수하고, ELISA에 의해 HIV-1 항원에 대한 특이적 항체 반응을 분석하였다. 도 4는 면역화한 지 28일째 수거된 시료로부터의 ELISA 결과를 도시하고 있다. 1:100의 희석비에서, pCEnv+pCGM-CSF로 면역화된 군으로부터의 혈청은 pCEnv만으로 면역화된 군에서의 값을 초과하는 HIV-1 gp120 단백질에 대한 항체 반응을 나타내었다. 반면에, pCEnv+pCIL-12로 면역화된 군은 동일한 기간 동안 현저히 낮은 체액 반응을 보였다. 반복 실험에서, IL-12는 일반적으로 1 내지 20 %만큼 특이적 항체 반응을 억제하는 반면, GM-CSF는 반대 효과를 갖는다. 이 체액 반응은 FACS 분석에서 밝혀진 바와 같이 비장 세포에서 B 세포수의 관찰된 변화와 연관될 수 있다.

- T 세포 증식

T 헬퍼 림프구의 활성화 및 증식은 항원-활성화된 B 세포의 증가를 통한 체액 면역 반응, 및 CD8+ 세포 독성 T 림프구의 증가를 통한 세포 면역 반응을 모두 유도하는 중요한 역할을 한다. DNA 면역화한지 2주 후에, 비장을 면역화된 마우스로부터 수거하고, 그의 림프구를 단리하였다. 이어서, 이 세포를 상기 기재된 바와 같이 T 세포 증식에 대해 시험하였다. 도 5는 HIV-1 gag/pol(pCGag/Pol)을 코딩하는 DNA 백신으로 면역화된 마우스 및 pCGag/Pol 및 IL-12 또는 GM-CSF로 동반 면역화된 마우스에 대한 증식 분석 결과를 도시하고 있다. 재조합 p55 단백질 20 g/㎖의 렉틴 PHA를 다클론성 촉진제 양성 대조구로 사용하였다. 도시된 바와 같이, 1:2의 희석비에서 1.2의 촉진 지수로 천연 마우스의 비장으로부터의 대조군에서 낮은 기저 수준의 증식을 관찰하였고, 1:2 희석비에서 촉진 지수 9.2로 pCGag/Pol만으로 면역화된 군에서 적당한 수준의 증식을 관찰하였다. pCGag/Pol 및 IL-12 유전자로 동반 면역화된 군에서 촉진 지수 17.1로 극적인 증식 증가가 관찰되었고, pCGag/PoL 및 GM-CSF 유전자로 동반 면역화된 군에서 촉진 지수 15.6으로 극적인 증식 증가가 관찰되었다.

- 시험관 내 촉진하지 않은 CTL 분석법

세포 활성의 증진을 관찰하기 위하여, 직접 CTL 분석법을 수행하였다. CTL 분석법은 비장 세포 상에서 유도된 시험관 내 촉진 없이, 상기된 바와 같이 면역화된 쥐로 부터 수확된 비장 세포 상에서 수행하였다. 분석법은 비장 수확한 날에 특이적 및 비특이적 백시니아로 감염된 표적으로부터 크롬 방출을 측정함으로써 수행하였다. Gag/PoL+IL-12 면역화된 비장 세포로부터 특이적 CTL 활성의 극적인 증가 (도 6)을 관찰하였다. IL-12 유전자 카셋트만으로 면역화된 대조구는 기저 수준을 초과하는 표적 세포의 비용해도를 나타내지 않았다. 또한, 이펙터:표적의 비가 50:1로 Gag/Pol만으로 면역화된 경우에 낮은 수준(3%)의 비용해도를 관찰하였다. 대조적으로, 50:1의 이펙터:표적의 비에서 Gag/Pol+IL-12를 동반 투여하는 경우에는 62%의 비용해도를 관찰하였고, 12.5:1의 이펙터:표적의 비에서는 9%로 판정되었다. 반면에, Gag/Pol 및 GM-CSF 플라스미드로 면역화된 것은 검출가능한 CTL 활성을 보이지 않았다. 유사한 결과를 HIV-1 인벨롭 작제물 및 시토킨 유전자로 동반 면역화된 쥐로부터 관찰하였다 (도 7). 인벨롭만으로, 그리고 인벨롭+GM-CSF로 면역화된 군락은 각각 4% 및 1%로 낮은 수준의 특이적 CTL을 나타내었다. 한편, 인벨롭+IL-12를 사용한 경우에는 59% 용해로 CTL 활성의 극적인 증진을 관찰하였다. Gag/Pol 및 인벨롭의 동반 투여에 있어서(도 6 및 7), 부적절한 항원-발현 백시니아로 제조된 표적에 대해 수행된 동일한 CTL 분석은 유의한 CTL 반응을 초래하지 못했다. 따라서, 항원 및 IL-12 DNA 면역화 결과로부터 CTL 활성의 극적인 증진은 항원 특이적 결과에서와 같이 NK 활성에서 기인하지 않았다.

<토의>

DNA 접종을 사용하여 생체 내에서 면역 반응을 유발하는 것은 상이한 치료적 표적물 및 수송법을 사용하는 것으로 보고되었다.

세포 매개 면역화의 유도는 다양한 백신에 중요한 특징일 수 있다. 예를 들어, 천연적으로 감염되는 동안, 항-HIV-1 CTL 반응은 바이러스 감염 시점의 확립과 관련되어 매우 초기에 일시적으로 나타난다. CTL T 세포는 바이러스 감염된 세포를 표적화하고 파괴함으로써 바이러스를 제거하는데 중요한 역할을 한다. 특이적 CTL 반응의 발생을 통해 바이러스성 단백질에 대한 면역 반응을 조절하여 바이러스 내의 다중 항원 표적물에 대한 광범위한 면역 반응을 유도하도록 한다. 바이러스에 대한 CTL 활성은 AIDS 환자에 비해 건강한 감염 환자에서 더욱 쉽게 측정되고, 특이적 CTL은 질병 병리학이 바람직한 임상 상태에서 관련 CTL 반응을 명확하게 증가시킴에 따라 감소되는 것으로 보고되었다. 이와 관련하여, 높은 특이적 CTL 및 낮은 항체 반응도를 지닌 꼬리 짧은 원숭이(macaque)는 키메릭 SIV/HIV (SHIV) 항원 투여에 대해 방어되는 반면, 낮은 CTL 및 높은 항체 반응을 지닌 동물은 바이러스 복제를 제어하였으나 완전히 방어되지 않았다. 특이적 CTL 반응은 HIV-1 감염의 비증상적 단계를 유지하는데 기여하는 것으로 나타났다. 따라서, DNA 면역화를 통한 생체 내에서 강한 HIV-1 특이적 CTL의 유도는 숙주에서 HIV 감염이 진행되는 것을 궁극적으로 방어하는데 중요한 역할을 담당할 수 있다.

유전적 보조물로서 IL-12 및 GM-CSF 유전자의 동반 수송을 통한 HIV-1에 대한 DNA 백신으로부터 면역 반응의 잠재적 증진, 특히 CTL 반응의 잠재적 증진을 조사하였다. IL-12 및 GM-CSF에 대한 유전자를 발현 벡터 내로 클로닝하고, HIV-1에 대한 DNA 백신 카셋트와 함께 마우스에 주사하였다. HIV-1에 대한 DNA 백신과 함께 IL-12를 코딩하는 플라스미드의 동반 면역화는 항원 특이적 CTL 반응을 극적으로 증가시켰다. GM-CSF 동반 수송은 체액 반응을 증진시키는 반면, IL-12 동반 수송은 체액 반응을 약 20% 억제하였다.

HIV-1에 대한 DNA 백신과 시토킨 유전적 보조제의 동반 수송은 많은 의미있는 면역학적 효과를 갖는다. 먼저, DNA 백신 및 IL-12 유전자가 주입된 쥐로부터의 비장의 크기 및 질량은 대조구 비장의 거의 3배였다. 또한, 상기 비장으로부터의 백혈구 세포수는 대조구 비장으로부터의 세포수의 2배였다. 이러한 결과는 쥐에서 재조합 IL-12의 생체 내 투여는 비장 확대를 초래한다는 선행 발견과 일치하는 것이었다. 카르 등은 IL-12 주입은 야생형 쥐에서의 비장 질량을 5배 증가시킨다는 것을 발견하였다. 야생형 쥐에서 IL-12 유도성 변화는 현저하게 증가된 INF-감마 혈청 수준과 관련되었다. 그러나, IL-12 투여는 또한 IFN-감마 수용체 결핍성 쥐에서 비장 크기를 질적으로 유사한(정상치의 2배) 증가를 유도하였다. 이러한 선행 연구는 IL-12 단백질을 주입한 후 비장 확대를 보고하였다. 생체 내로 수송된 소량의 IL-12 유전자는 재조합 IL-12 단백질을 사용한 공개된 실험과 필적할만한 수준으로 비장확대를 유도하였다. 재조합 IL-12를 쥐에 생체 내 주입하여 주입된 쥐에서 체중 감소 및 심하면 사망과 같은 독성 효과를 나타낼 수 있다고 보고되어 있다. IL-12 유전자의 동반 투여가 투여된 쥐에서 임의의 가시적 역변화를 일으키지 않고 비장 확대를 유도하였다는 것은 중요하다. 이는 플라스미드 접종을 통한 천연 유사 프로세싱 및 지속적인 낮은 수준의 수송이 임상적으로 유익하다는 것을 암시한다. 의미있는 전신적 면역 반응을 유도하기 위한 DNA 수송법은 본원에서는 독성이 없는 것으로 입증되었다.

비장 확대의 유도 외에, Th2에서 Th1으로의 특이적 면역 반응은 DNA 백신과 함께 IL-12의 동반 투여를 통해 조작될 수 있다. 이와 관련하여, DNA 백신과 IL-12 유전의 동반 수송은 특이적 항체 반응을 감소시키는 반면, GM-CSF 유전자의 동반 주입은 특이적 항체 반응을 증진시킨다. 이러한 결과는 IL-12가 Th2에서 Th1 유형으로의 면역 반응을 조절하는데 중요한 시토킨이라는 선행 보고와 일치된 것이었다. 이러한 항체 결과는 또한 면역원(HIV-1 인벨롭 또는 GaG/Pol) 및 IL-12 유전자로 면역화된 쥐에서 B220 + B 세포의 비율의 감소가 관찰되는 비장 세포 FACS 자료와 일치하였다.

DNA 동반 투여에 대한 T 세포 반응을 추가로 밝히기 위하여, 수확된 비장 세포의 시험관내 촉진없이 직접 CTL 분석을 수행하였다. CTL 반응의 증진은 DNA 면역원을 통해 Th2에서 Th1 유형의 반응으로 면역 반응을 조절하는 능력을 입증하는 중요한 증거이다. 특이적 CTL 반응의 극적인 증가는 DNA 백신 및 IL-12 유전자의 공동 면역화된 군으로부터 관찰되었다. 요약하여, 면역원, 및 Th1 유형의 면역 반응을 생성하는데 중요한 시토킨인 IL-12를 코딩하는 유전자를 생체 내로 동반 투여하고, T 세포 증식 및 CTL 분석에 의해 측정된 세포 면역 반응을 증진시키는 것을 관찰하였다.

면역 반응의 유형 및 방향을 조절하기 위하여, 예를 들어 반응을 Th2에서 Th1으로 향하게 하기 위하여, 면역학적으로 중요한 분자의 유전자의 동반 수송은 임상적으로 더욱 효과적인 면역 반응을 일으키는데 사용될 수 있다. DNA 면역원과 IL-12 유전자의 동반 투여에 의해. 체액 반응은 온화하게 억제되고, CTL 반응은 극적으로 증가되었다. 또한, 쥐에서 재조합 단백질 IL-12의 생체 내 투여에서 특징적으로 나타나는 비장 확대가 일어났다. 따라서, 더욱 효과적인 백신의 새로운 제조 방법 및 면역 기능의 메카니즘의 분자에 대한 분석 방법에 대한 생체 내에서의 DNA 수송력은 입증되었다.

<실시예 5>

추가로 생체 내에서 면역 반응을 조절하기 위하여, HIV-1 DNA 면역원 작제물과 함께 광범위한 시토킨 유전자의 동반 수송으로부터 면여 반응의 유도 및 조절을 관찰하였다. 시토킨이 면역화에서 조절 및 시그날 기능에서 주요한 역할을 담당하기 때문에, 시토킨 유전자 동반 수송을 선택하였다. 면역계 외에, 시토킨은 다양한 세포에 의해 방출됨에도 불구하고, 림프구에 의해 생성된 시토킨은 면역계에서 세포를 조절하는 기능 때문에 특이 주목된다. 예를 들어, IL-2, IFN-γ 및 IL-12의 존재는 Th0 전구체 세포를 활성화하여 Th1 염증성 T 세포가 되게 한다. 반면에, IL-4, IL-5 또는 IL-10의 방출은 Th0 전구체를 초래하여 무기화된 Th2 헬퍼 세포가 되게 한다. 또한, IL-1, TNF-α 및 TNF-β와 같은 전-염증성 시토킨은 염증 반응의 개시에 중요한 역할을 담당한다.

전-염증성 시토킨 (IL-1α, TNF-α 및 TNF-β), Th1 시토킨 (IL-2, IL-15 및 IL-18), 및 Th2 시토킨 (IL-4, IL-5 및 IL-10)의 기능을 조사하였다. 구체적으로 이들 염증성 Th1 및 Th2 시토킨의 유전자를 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 내로 각각 클로닝하였다. 유전자 플라스미드 발현 카셋트를 상기된 바와 같이 HIV-1에 대한 DNA 백신 카셋트와 함께 주입하였다. 항원 특이적 면역 반응의 방향 및 크기에 대해 이들 유전적 보조제 카셋트와 동반 주입하는 면역학적 효과를 분석하였다.

항원 특이적 면역 반응은 DNA 면역원 카셋트와 함께 시토킨 유전자를 동반 주입함으로서 조절될 수 있다. 더 구체적으로, 임상적 효능 및 유용성에 있어서 증진된 잠재력을 지닌 DNA 백신 개발을 위한 비히클로서 면역학적으로 중요한 유전자의 동반 수송법의 저력을 입증하였다.

<재료 및 방법>

- DNA 플라스미드:

HIV-1 인벨롭 단백질(pCEnv) 및 gag/pol 단백질(pCGag/Pol)을 발현하는 DNA 백신 작제물을 표준 방법 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용하여 제조하였다. 사람의 IL-1α, IL-2, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, TNF-β, 및 쥐의 IL-4 및 IL-18에 대한 유전자를 표준 기술 및 쉽게 구입할 수 있는 출발물질을 사용하여 pCDNA3 발현 벡터 (인트로겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재) 내로 클로닝하였다. 사람의 IL-1α, IL-2, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, TNF-β는 쥐 세포엣 활성인 것으로 보고되엇다. 플라스미드 DNA를 세균에서 생성하고, 퀴아겐 막시 프렙 키트(퀴아겐사, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 정제하였다.

- 시약 및 세포주:

사람의 라브도마이오사르코마(RD) 및 마우스의 유방세포증 P815 세포주를 ATCC (매릴랜드주 록빌 소재)로부터 얻었다. HIV-1 인벨롭 (vMN462), gag/pol (vVK1), 및 갈락토시다제(vSC8)를 발현하는 재조합 백시니아는 국립 보건원 AIDS 리써치 및 레퍼런스 레전트 프로그램으로부터 얻었다. HIV-1 인벨롭 펩티드 (RIHIGPGRAFYTTKN)을 표준 기술 및 쉽게 구입할 수 있는 출발 물질을 사용하여 합성하였다. 재조합 Pr55 또는 gp120 단백질을 퀄리티 바이올로지칼(매릴랜드주 게이터스버그 소재)로부터 얻었다. 재조합 P24 단백질은 인트라셀(마이애미주 캠브릿지 소재)로부터 구입하였다. IL-1α, IL-2, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α 및 TNF-β에 대한 항체는 R&D 시스템즈 (미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 얻었다.

- 시토킨 유전자 작제물의 발현:

시토킨 작제물의 발현은 RD 세포 내로의 형질감염 후에 면역침전법 또는 시토킨 ELISA에 의해 입증되었다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 혈청, 메티오닌 및 시스테인이 결핍된 DMEM에서 1시간 동안 양분없이 배양한 후, 200 μCi/㎖ (1200 Ci/밀리몰)의 ³⁵S 단백질 표지 혼합물(NEN/듀퐁)로 표지하였다. 표지된 세포를 얼음 상에서 0.5 ㎖의 RIPA 완충액(50 mM 트리스 HCl, pH 7.6; 150 mM NaCl; 0.2% 트리톤 X-100; 0.2% 데옥시콜산; 0.1% SDK 및 1mM PMSF) 중에서 용해시킨 후, 15000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 청정화하였다. 청정된 용해물을 얼음 상에서 적절한 항체(R&D 사)와 함께 90분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 A 세파로스를 항원-항체 복합체에 가하고, 4℃에서 90분 동안 진탕하여 혼합하였다. 단백질 펠릿을 50 ㎕의 1X 시료 완충액에 재현탁시키고, 다량의 염 및 BSA를 함유하는 완충액 중에서 격렬하게 세척한 후 100℃로 3 내지 5분 동안 가열하였다. 단백질 시료의 분획을 SDS 12%-PAGE에 의해 분석하였다. 플루로그래피를 위해, 겔을 10% 글리세롤을 함유하는 1M 살리실산나트륨 중에서 15분 동안 침지시키고, 건조시키고, 코닥 X-오마트-AR 필름을 사용하여 오토라디오그래피하였다. 형질감염된 RD 세포로부터의 상등액을 수거하고, 시토킨 ELISA 키트(파르밍겐사, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 발현에 대해 시험하였다.

- 쥐의 DNA 접종:

6 내지 8주된 BALB/C 쥐(할란 스프가르 덜리사)의 근육에 인산염 완충액 중에 목적하는 DNA 작제물 50 g 및 0.25% 부피바케인(시그마사, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 주사하였다. 다양한 유전자 발현 카셋트를 동반 투여하기 위해 주사하기 전에 선택된 플라스미드들을 주사당 총 100 ㎍이 되도록 혼합하였다.

- ELISA:

0.1 M 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.5) 중에서 2 ㎍/㎖의 농도로 희석된 50 ㎕의 p24 또는 gp120 단백질을 4℃에서 밤새 마이크로티터 웰 상에 흡착시켰다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈-20으로 세척하고, 0.05% 트윈-20을 함유한 PBS 중 3% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 마우스의 항혈청을 0.05% 트윈-20으로 희석하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, HRP-컨쥬게이트된 염소의 항쥐 IgG 또는 IgA (시그마사, 미주리주 세인트루이스 소재)와 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 3'3'5'5' TMB 완충액(시그마사)으로 현상하였다. 450 nm에서의 광학밀도를 디나테크 MR5000 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

- T 헬퍼 세포 증식 분석법:

림프구를 비장으로부터 수확하고, 적혈구를 제거하고 신선한 배지로 수회 세척하여, 이펙터 세포를 제조하였다. 단리된 세포 현탁액을 5×10⁶ 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 5×10⁵ 세포를 함유하는 분취액 100 ㎕을 즉시 바닥이 평평한 96웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하였다. 재조합 Pr55 또는 gp120 단백질을 최농농도가 5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖이 되도록 3배수로 웰에 가하였다. 세포를 5% CO₂ 중 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. ³H 티미딘 1 μCi를 각 웰에 가한 후, 세포를 37℃에서 12 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 수확하고, 혼입된 ³H 티미딘을 베타 플레이트 판독기에서 측정하였다 (왈락사, 핀란드 투르쿠 소재). 촉진 지수를 하기 식으로부터 결정하였다.

촉진 지수(SI) = (실험시 계수/자발적 계수)

자발적 계수 웰은 비관련 단백질 대조구로 작용하는 10% 송아지 혈청을 포함한다. 또한, pCEnv 또는 대조구 면역화된 동물에서 통상적으로 Pr55 단백질에 대한 SI값은 1이다. 유사하게, pCGag/poL 또는 대조구에서 통상적으로 gp120 단백질에 대한 SI값은 1이다. 세포가 활성이 있다는 것을 확인하기 위하여, PHA 또는 con A (시그마)를 다클론성 촉진제 양성 대조구로서 사용하였다. PHA 또는 conA 대조구 시료는 20 내지 40의 SI값을 갖는다.

- 세포독성 T 림프구 분석법:

백시니아 감염된 표적 또는 펩티드 처리된 표적을 사용하여 5시간 동안 크롬(⁵¹Cr)을 방출하는 CTL 분석을 수행하였다. 시험관 내 이펙터 촉진의 존재 및 부재 하에 분석법을 수행하였다. 시험관 내 촉진 분석법에서, 이펙터는 목적하는 백시니아 감염된 세포 (인벨롭에 있어서는 vMN462, gag/pol에 있어서는 vVK1)에 의해 촉진되고, 0.1% 글루타르알데히드 또는 인벨롭 특이적 펩티드(RIHIGPGRAFYTTKN)을 1M 농도에서 4 내지 5일 째에 CTL 배지에서 ㎖ 당 5×10⁶ 세포로 고정시켰다. CTL 배지는 10% 송아지 혈청 1640 및 10% RAT-T-STIM (깁코-BRL, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)의 존재 하 및 Con A (벡톤 디킨슨 랩웨어, 매사추세츠주 배드포드 소재)의 부재 하에 1:1의 이스코브 개량된 둘베코 미디아 (깁코-BRL) 및 한크의 균형맞춘 염 용액 (깁코-BRL)으로 구성된다. 백시니아 감염된 표적은 10-20의 다중 감염(MOI)에서 3×10⁶ PB15 세포를 37℃에서 5 내지 12시간 동안 감염시켜 제조하였다. 펩티드 처리된 표적물은 P815 세포를 1μM 농도의 펩티드와 함께 인큐베이션하여 제조하였다. 표준 크롬 방출 분석을 수행하였다. 여기서, 표적 세포를 100 μCi/㎖의 Na₂ ⁵¹CrO₄로 60 내지 120분 동안 표지하였고, 이를 촉진된 이펙터 비장 세포와 함께 37℃에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하는데 사용하였다. CTL 용해를 50:1 내지 12.5:1 범위의 이펙터:표적(E:T) 비에서 시험하였다. 상등액을 수확하고, LKB 클리니감마 감마 계수기 상에서 계수하였다. 비용해도를 하기 식으로부터 결정하였다.

100×{(실험시 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)}

- CD8+ T 세포의 컴플리먼트 용해

CD8+ T 세포를 항-CD8 단일클론 항체(파르밍겐사)로 처리하여 비장세포로부터 제거한 후, 토끼의 컴플리먼트(시그마)로 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.

<결과>

- 시토킨 유전자 카셋트의 발현

시토킨 유전자를 pCDNA3 플라스미드 발현 벡터(도 10) 내로 클로닝하였다. 전체 삽입물(5' 및 3' 모두에서)의 서열 분석에 의해 시토킨 발현 카셋트를 확인하였다. 또한, 이 시토킨 유전자를 시험관 내에서 RD 세포 내로 형질감염시키고, 이 작제물의 발현은 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 적절한 항체를 사용한 면역침전법 또는 시토킨 ELISA에 의해 확인하였다.

-시토킨 유전자의 동반 투여 후의 체액 반응:

pCGag/pol 면역화된 쥐로부터의 항혈청을 수거하고, ELISA에 의해 HIV-1 항원에 대한 특이적 항체 반응에 대해 분석하였다.

이 실험에서, 각 DNA 50 ㎍을 0 및 14일째에 근육내로 동반 투여하였다. 주사하기 전 및 주사한지 28일째에, 마우스(군락당 4마리)를 출혈시키고, 혈청을 수거하였다. 일련의 희석은 1:100. 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 및 1:3200이었다. ELISA에 대한 기저 수준의 광학 밀도는 0.015 미만이었다. 이 실험은 유사한 결과로 반복되었다. 자료에 도시된 바와 같이, 면역화된 군에 대한 항체 역가의 종말점을 p24 gag 단백질에 대한 ELISA를 사용하여 결정하고, 면역화된 군에 대한 항체 역가의 종말점을 gp120 인벨롭 단백질에 대한 ELISA를 사용하여 결정하였다. 하기 자료는 DNA 면역화한지 28일 후에 수거된 혈청으로부터 gag/pol-특이적 항체 역가에 대한 것이다.

항- p24 항체 역가

pCGag/pol 400

pCGag/pol + IL-1α 1600

pCGag/pol + TNF-α 1600

pCGag/pol + TNF-β 1600

pCGag/pol + 1L-2 3200

pCGag/pol + 1L-15 800

pCGag/pol + 1L-18 3200

pCGag/pol + 1L-4 3200

pCGag/pol + 1L-5 3200

pCGag/pol + 1L-10 600

높은 값의 역가 종말점이 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-18 동반 투여군으로부터의 혈청을 사용한 경우에 관찰되었다. 또한, 체액 반응의 극적인 증진이 pCGag/pol만을 사용하여 면역화된 군에 비해 IL-1α, TNF-α, TNF-β, 및 IL-10을 사용한 동반 투여군을 사용한 경우에 관찰되었다. 유사한 결과를 pCEnv로 면역화된 군에서 얻었다.

항- gp120 항체 역가

pCEnv 200

pCEnv + IL-1α 800

pCEnv + TNF-α 800

pCEnv + TNF-β 400

pCEnv + 1L-2 800

pCEnv + 1L-15 400

pCEnv + 1L-18 800

pCEnv + 1L-4 1600

pCEnv + 1L-5 1600

pCEnv + 1L-10 1600

*또한, 높은 값의 역가 종말점이 IL-4, IL-5 및 IL-10 동반 투여군으로부터의 혈청을 사용한 경우에 관찰되었다.

- T 헬퍼 세포의 생성

T 헬퍼 림프구의 활성화 및 증식은 B 세포를 통한 체액 면역 반응 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 통한 세포 면역 반응을 모두 유도하는 중요한 역할을 한다. 2개의 DNA로 면역화(각각 50 ㎍)된 마우스를 2주 후에 분리하였다. 재접종한지 1주 후에 마우스를 희생시키고, 비장을 수확하고, 림프구를 단리하고, T 헬퍼 세포에 대해 시험하였다.

- 전-염증성 시토킨 동반 투여

증식 분석법을 pCEnv 또는 pCGag/pol 및 전-염증성 시토킨인 IL-1α, TNF-α 및 TNF-β와 동반 투여된 쥐로부터의 비장 세포로 수행하였다.

전-염증성 시토킨인 IL-1α, TNF-α, 및 TNF-β와 동반 투여한 후 T 헬퍼 세포 증식 반응을 측정하는 실험에 있어서, 그 방법은 하기와 같다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 재조합 gp120 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대해 시험하였다. pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 Pr55 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대한 T 세포 증식 반응을 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다. 하기 자료를 얻었다.

항원 특이적 T 세포 증식성 반응

gp120 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCEnv 2.2 1.3

pCEnv + IL-1α 2.3 0.1

pCEnv + TNF-α 6.1 2.7

pCEnv + TNF-β 3.1 1.8

대조구 0.5 0.2

p24 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCGag/pol 2.4 0.8

pCGag/pol + IL-1α 2.8 1.4

pCGag/pol + TNF-α 12.4 2.2

pCGag/pol + TNF-β 4.0 1.9

대조구 0.6 0.8

상기 자료는 대조구에서는 기저 수준의 증식이 관찰되고, pCEnv 또는 pCGag/pol만으로 면역화된 군에서는 적당한 수준의 증식이 관찰됨을 나타낸다. 비록 IL-1α와의 동반 투여군에서는 pCEnv 또는 pCGag/pol 면역화의 경우 T 헬퍼 세포 증식이 전혀 증가하지 않았지만, pCEnv+TNF-β의 동반 투여군에서는 5 ㎍/㎖의 gp120 단백질 농도에서 촉진 지수 3.1로 T 헬퍼 세포 증식의 의미있는 증진을 보였다. 이와 유사하게, pCGag/pol+TNF-β의 동반 투여군에서는 5 ㎍/㎖의 Pr55 단백질 농도에서 촉진 지수 4.0 T 헬퍼 세포 증식의 유의한 증진을 보였다. pCEnv+TNF-α 및 pCGag/pol+TNF-α를 사용한 동반 투여에서는 촉진 지수가 각각 6.1 및 12.4 (각 단백질 농도 5 ㎍/㎖)로 높은 수준의 T 헬퍼 세포 증식이 관찰되었다.

- Th1 시토킨 동반 투여

Th1 시토킨인 IL-2, IL-15, 및 IL-18의 동반 투여 효과를 조사하였다. pCEnv+IL-18 및 pCGag/pol+IL-18의 동반 투여군은 촉진 지수 4.4 및 10.0을 각각 초래하였다(각각 5 ㎍/㎖의 단백질 농도에서). Th1 시토킨인 IL-2 및 IL-18를 유도하는 INF-γ와의 동반 투여를 수행하여 T 헬퍼 세포 증식 반응을 측정하는 실험에 있어서, 그 방법은 하기와 같다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 재조합 gp120 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대해 시험하였다. pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 Pr55 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대한 T 세포 증식 반응을 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다. 하기 자료를 얻었다.

gp120 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCEnv 2.2 1.3

pCEnv + IL-18 4.4 0.8

pCEnv + IL-12 7.8 3.8

대조구 0.5 0.2

p24 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCGag/pol 2.4 0.8

pCGag/pol + IL-18 10.0 2.1

pCGag/pol + IL-12 12.0 3.8

대조구 0.6 0.8

또한, pCEnv+IL-2 및 pCGag/pol+IL-2 동반 투여는 촉진 지수 6.0 및 12.0을 각각 초래하였다(각각 5 ㎍/㎖의 단백질 농도에서). 그러나, IL-15의 동반 투여는 T 헬퍼 세포 증식의 다소간의 증가를 초래하였다. IL-2 의존성 Th1 시토킨인 IL-2 및 IL-15의 동반 투여 효과에 따른 T 헬퍼 세포 증식 반응을 측정하기 위하여, 하기 방법을 사용하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 재조합 gp120 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대해 시험하였다. pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 Pr55 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대한 T 세포 증식 반응을 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다. 하기 자료를 얻었다.

gp120 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCEnv 2.2 1.3

pCEnv + IL-2 6.0 2.1

pCEnv + IL-15 2.3 2.0

대조구 0.5 0.2

p24 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCGag/pol 2.4 0.8

pCGag/pol + IL-2 12.0 2.5

pCGag/pol + IL-15 2.6 0.6

대조구 0.6 0.8

- Th2 시토킨 동반 투여

또한, 전-염증성 및 Th1 시토킨 동반 투여의 검증 외에, pCEnv 및 pCGag/pol과 Th2 시토킨인 IL-4, IL-5 및 IL-10과의 동반 투여의 효과도 조사하였다. IL-4 또는 IL-5와의 동반 투여군 모두는 pCEnv 또는 pCGag/pol만으로 면역화하는 것에 비해 T 헬퍼 세포 증식의 다소간의 증가를 보였다. Th2 시토킨인 IL-5 및 IL-10의 동반 투여 효과에 따른 T 헬퍼 세포 증식 반응을 측정하기 위하여, 하기 방법을 사용하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 재조합 gp120 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대해 시험하였다. pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고 Pr55 단백질 (최종 농도가 5 및 1 ㎍/㎖임)에 대한 T 세포 증식 반응을 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다. 하기 자료를 얻었다.

gp120 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCEnv 2.2 1.3

pCEnv + IL-4 3.8 2.9

pCEnv + IL-5 2.4 1.8

pCEnv + IL-10 4.5 2.3

대조구 0.5 0.2

p24 단백질

5 ㎍/㎖ 1 ㎍/㎖

pCGag/pol 2.4 0.8

pCGag/pol + IL-4 5.0 3.1

pCGag/pol + IL-5 3.1 2.1

pCGag/pol + IL-10 8.0 2.4

대조구 0.6 0.8

IL-10의 동반 수송은 (각 단백질 농도는 5 ㎍/㎖임) 촉진 지수가 각각 4.5 및 8.0이 되도록 T 헬퍼 세포 증식을 극적으로 증가시켰다.

- 세포독성 T 림프구의 생성

세포 면역의 증진을 관찰하기 위하여, 세포 독성 T 림프구 (CTL) 분석을 pCEnv 및 pCGag/pol로 면역화된 마우스의 비장 세포를 사용하여 수행하였다. 2개의 DNA로 면역화 (각각 50 ㎍)된 마우스를 2주 후에 분리하였다. 재접종한지 1주 후에 마우스를 희생시키고, 비장을 수확하고, 림프구를 단리하고, CTL 반응에 대해 시험하였다. 분석법은 특이적 및 비특이적 백시니아로 감염된 표적 또는 펩티드로 처리된 표적으로부터 크롬 방출을 측정하기 전에 이펙터 비장 세포의 시험관내 촉진의 존재 및 부재하에 수행하였다. 표적의 비용해도를 계산하기 위하여 비특이적 (vSC8 감염됨) 표적물의 용해도를 특이적 (vMN462 또는 vVK1 감염됨) 표적물의 용해도로부터 감하였다.

- 이펙터의 시험관내 촉진이 존재하는 CTL 반응

다양한 시토킨의 동반 투여에 따른 세포독성 T 림프구를 측정한 자료를 얻었다. 자료는 하기와 같다.

항원 특이적 CTL 반응

50:1 25:1 12.5:1

pCEnv 10% 4% 3%

pCEnv + IL-1α 14% 10% 6%

pCEnv + TNF-α 30% 23% 18%

pCEnv + TNF-β 20% 16% 13%

pCEnv + 1L-2 22% 16% 4%

pCEnv + 1L-15 46% 28% 10%

pCEnv + 1L-12 35% 24% 19%

pCEnv + 1L-18 22% 16% 13%

pCEnv + 1L-4 4% 4% 7%

pCEnv + 1L-5 13% 11% 9%

pCEnv + 1L-10 13% 8% 3%

대조구 3% 2.0% 3.5%

50:1 25:1 12.5:1

pCGag/pol 12% 11% 7%

pCGag/pol + IL-1α 16% 8% 1%

pCGag/pol + TNF-α 29% 20% 7%

pCGag/pol + TNF-β 12% 13% 3%

pCGag/pol + 1L-2 14% 11% 10%

pCGag/pol + 1L-15 30% 21% 7%

pCGag/pol + 1L-12 38% 24% 15%

pCGag/pol + 1L-18 19% 15% 4%

pCGag/pol + 1L-4 2% 2% 2%

pCGag/pol + 1L-5 0% 3% 2%

pCGag/pol + 1L-10 6% 6% 0%

대조구 3.3% 2.8% 4.5%

전-염증성 시토킨, 즉 IL-1α, TNF-α 및 TNF-β와의 동반 투여를 수행하여 세포 독성 T 림프구 반응을 측정하기 위하여 수행된 실험에서, pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vVK1) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vMN462) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

Th1 시토킨, 즉 IL-12 및 IL-18을 유도하는 IFN-γ와의 동반 투여를 수행하여 세포 독성 T 림프구 반응을 측정하기 위하여 수행된 실험에서, pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 쥐(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vVK1) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vMN462) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

IL-2 수용체 의존성 Th1 시토킨, 즉 IL-2 및 IL-15와의 동반 투여를 수행하여 세포 독성 T 림프구 반응을 측정하기 위하여 수행된 실험에서, pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vVK1) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vMN462) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

Th2 시토킨, 즉 IL-5 및 IL-10과의 동반 투여를 수행하여 세포 독성 T 림프구 반응을 측정하기 위하여 수행된 실험에서, pCGag/pol과 함께 제1 DNA를 동반 투여(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vVK1) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. pCEnv와 함께 제1 DNA를 면역화(각 50 ㎍씩)한지 2주 후에, 마우스(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 추가로 1주 후에, 비장을 면역화된 쥐로부터 수거하고, 그들의 림프구를 단리하고, 특이적(vMN462) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

- 전-염즘성 시토킨 동반 투여

pCEnv 또는 pCGag/pol 및 전-염증성 시토킨 IL-1α, TNF-α 및 TNF-β와의 동반 투여된 마우스에 대한 CTL 분석 결과로부터의 자료에 관해서, 대조구 동물에서는 특이적 사멸이 기저 수준으로 관찰된 반면, pCEnv만으로 면역화된 동물은 낮은 수준의 CTL 반응을 보였다. pCEnv+IL-1α 또는 pCGag/pol+TNF-β로의 동반 투여는 CTL 활성을 다소 증가시켰다. 반면에, pCEnv+TNF-α로 동반 투여한 후에, HIV-1 인벨롭을 발현하는 백시니아 (vMN462)로 감염된 표적의 특이적 사멸은 극적으로 증가되는 것이 관찰되었다. 50:1의 이펙터 대 표적(E:T)의 비에서 pCEnv+TNF-α로 동반 투여한 후에 표적 세포에서 30% 초과의 비용해도를 관찰하였다. 유사하게, pCGag/pol+TNF-α로 면역화된 마우스는 HIV-1 gag/pol을 발현하는 백시니아(vVK1)로 감염된 표적물의 항원 특이적 CTL 용해의 의미있는 증진을 초래하는 반면(E:T의 비가 50:1에서 20%의 용해도), pCGag/pol+IL-1α 또는 pCGag/pol+TNF-β로의 동반 투여는 CTL 반응을 조금 증가시켰다.

- Th1 시토킨 동반 투여

DNA 백신 작제물과 Th1 시토킨의 동반 수송의 효과를 조사하였다. pCEnv로 면역화된 마우스로부터의 CTL 분석 결과 및 Th1 시토킨인 IL-12 및 IL-18로 동반 투여된 마우스로부터의 결과에 있어서, IL-12의 동반 투여와 달리 IL-18의 동반 투여는 CTL 반응을 다소 증가시켰다. 또한, IL-2의 동반 투여도 CTL 반응을 다소 증가시켰다. 반면에, pCEnv+IL-15 면역화 후에는 46%의 비용해도로 CTL 반응의 더욱 극적인 증가가 관찰되었다. 유사하게, pCGag/pol+IL-15로 면역화된 쥐는 항원 특이적 CTL 용해도의 의미있는 증진(약 30%)을 초래하였다.

- Th2 시토킨 동반 투여

전-염증성 및 Th1 시토킨 동반 투여로부터의 효과 외에, Th2 시토킨인 IL-4, IL-5 및 IL-10의 동반 투여가 CTL 반응의 수준에 미치는 효과를 연구하였다. 이러한 시토킨을 사용한 동반 투여는 T 헬퍼 세포 증식 반응을 증가시킬지라도, pCEnv 또는 pCGag/pol 중 하나와 IL-4, IL-5 또는 IL-10의 동반 투여는 CTL 반응을 특이적으로 증가시키지 않았다.

- CTL 반응에서 MHC 클래스 I 제한의 결정

TNF-α 및 IL-15와의 동반 투여를 통한 CTL 반응의 증진이 CD8+ MHC 클래스 I 제한적 촉진에 기인한 것인지를 측정하기 위하여, balb/c 마우스에 있어서 MHC 클래스 I 제한 CTL에 대한 특이적 에피토프로 밝혀진 HIV-1 인벨롭 펩티드(RIHIGPGRAFYTTKN)를 사용하여 CTL 분석을 수행하였다. 마우스는 50 ㎍의 각 DNA 작제물로 2주 간격으로 2회 면역화되고, 그들의 비장을 두번째 면역화한지 1주일 후에 수확하엿다. CTL 분석을 인벨롭 특이적 펩티드를 사용하여 시험관내 촉진의 존재 하에 비장세포 상에서 수행하였다. 50:1의 E:T비에서 25% 및 32% 특이적 사멸로, IL-15 및 TNF-α을 사용한 동반 투여 (도 11A 내지 11E) 후에 CTL 반응의 의미있는 증진을 관찰하였다. 이러한 관찰은 컴플리먼트 용해에 의한 이펙터 세포 집단로부터 CD8+ T 세포를 제거한 후 CTL 활성을 측정하여 확인하였다. 마우스를 상기와 동일한 간격으로 각 플라스미드 50 ㎍을 2회 면역화하였다. 이펙터 세포의 하나의 군은 상기와 같이 처리하였고, 제2 군으로부터의 CD8+ T 세포는 제거하는 방식으로 CTL 분석을 수행하였다. 도 11F 내지 11O에 도시된 바와 같이, CD8+ T 세포의 제거는 IL-15 및 TNF-α를 동반 투여한 후 관찰된 항원 특이적 CTL 증진을 억제하였다. 이러한 결과는 세포 독성 활성의 증진이 항원 특이적이며, 클래스 I 제한적이고, CD8+ T 세포 의존적임을 나타낸다.

- CTL 직접 반응 (이펙터의 시험관 내 촉진 없이)

높고 일정한 수준의 CTL 반응이 2개의 동반 투여군으로부터(시험관내 촉진의 존재 하에) 관찰되었기 때문에, TNF-α 또는 IL-15로 동반 투여에 의해 유도된 직접적 CTL 반응의 수준을 관찰하였다. 크롬 방출 분석은 비장 세포를 단리한 날에 수행하였다. IL-12 동반 투여된 직접 CTL와는 달리, pCEnv 및 TNF-α 또는 IL-15 (도 12)로 동반 투여한 후 직접 CTL 활성의 유도는 관찰되지 않았다.

<토의>

임의의 면역화법의 총괄절 목적은 최소 수의 면역화를 사용하여 효능적이고 지속적인 병원체 특이적 면역 반응을 유도하는 것이다. 그러나, 이러한 방어의 관계는 병원체에 따라 변화되고, 그 결과의 개량점은 면역 반응을 구동시킴으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 높은 수준의 특이적 항체 반응은 헤파티스 B 바이러스의 감염으로부터 방어하는데 중요한 것으로 여겨지나, 임파종 코리오메닝기티스 바이러스 (LCMV) 감염으로부터의 방어는 주로 T 세포 매개 반응으로 매개된다. DNA 백신접종법의 고안은 각 표적 병원체에 대한 방어와 연관되도록 유도된 면역 반응의 방향을 설정하고 정도를 조절함으로써 개량될 수 있다.

새로운 면역화법으로, 핵산 면역화는 항원 특이적 체액 및 세포 면역 반응을 모두 다양한 동물 모델의 생체 내에서 유발할 수 있음이 입증되었다. 더 임상적으로 효과적인 백신은 면역 반응의 방향 및 정도를 조절하는 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 백신으로부터의 면역 반응의 특이적 유형 및 방향의 미세 조절 및 면역요법은 면역학적으로 중요한 분자, 예를 들어 시토킨 및 조촉진 분자애 대한 유전자의 동반 수송에 의해 성립될 수 있다.

시토킨은 면역망의 개시제 및 조절자로서 면역 반응 및 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. 면역계에서의 그들의 특이적 기능에 근거하여, 시토킨들은 전-염증성 시토킨, Th1 시토킨 및 Th2 시토킨으로 더욱 세분화될 수 있다. 전-염증성 시토킨인 IL-1, TNF-α 및 TNF-β는 상해 및 감염에 대한 숙주 반응의 개시제로서 중요한 역할을 한다. IL-1은 IL-2의 생산의 유도 및 세포 상에서 IL-2R의 상승 조절로 간접적으로 T 세포를 활성화한다. 또한, IL-1은 B 세포의 분화, 증식, 및 IgG의 합성을 유도함으로써 B 세포에 영향을 준다. IL-1은 IL-1α 및 IL-1β로 명명된 적어도 2개의 형태로 존재하고, 유사한 활성을 보인다. TNF-α 및 TNF-β는 동일한 세포 표면 수용체에 결합하는 유사 연관 단백질(약 30% 아미노산 상동성을 지님)이다. TNF-α는 활성화된 대식세포 및 단구적 호중구, 활성화된 림프구, 및 NK 세포에 의해 생성되는 반면, TNF-β는 림프구에 의해 생성된다. TNF-α 및 TNF-β는 또한 그람 음성 세균에 의해 감염되어 수반되는 패혈성 쇼크 및 류마티스성 관절염에 연루된다. 또한, TNF-α는 다른 전-염증성 시토킨의 합성을 조절하는데 중요한 역할을 담당하는 것으로 제안되었다.

Th1 시토킨은 면역 반응의 세포성 또는 T 세포 매개된 무기화와 연관되어 있다. IFN-γ, 즉 원형 Th1 유형의 시토킨은 Th1, CD8+ 및 NK 세포에 의해 생성되고, 항바이러스 효과, 및 MHC 클래스 I 및 II 항원의 상승 조절과 같은 면역 조절 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 신규한 시토킨 IFN-γ 유도 인자(IGIF) 또는 IL-18은 IFN-γ의 생성을 증진시키는 한편, 촉진된 PBMC에서 IL-10의 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, IL-18은 구조적으로 관련이 없는 시토킨 IL-12와 유사하게, 사람의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 배양물 중 천연 킬러(NK) 세포 활성을 증진시킨다. IL-12는 주로 외부 자극에 의해 활성화된 T 세포에 의해 생성되고, 항원 특이적 T 세포의 증식 및 다클론 확장에 중요하다. IL-2는 3개의 사슬, 즉 α, β 및 γc쇄로 구성된 수용체계와의 상호작용에 의해 T 세포를 활성화하는 데 중요한 작용을 한다. IL-15는 새롭게 발견된 IL-2의 상동체로서, IL-2와 유사한 T 세포 촉진 활성을 갖는 다형질발현 시토킨이다.

Th2 시토킨은 면역 반응의 체액성 또는 항체 매개의 무기화를 조절한다. IL-5는 B 세포를 항체 생성 플라즈마 세포로 분화시키는 것을 조절하는 이량체 시토킨이다. IL-5는 쥐 및 사람의 B 세포에 의해 항원 특이적 IgA 생산을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한, IL-5는 호산구의 성장 및 증식을 촉진한다. IL-10이 Th2 T 세포 클론에 의해 초기에 생성되는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 또한 B 세포 및 단세포에 의해 생성된다. 원형 Th2 유형의 시토킨인 IL-10은 미토겐 활성화된 단세포에 의해 IL-1α, IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 시토킨의 생산을 억제하며, TFN-γ의 대식세포 활성화 효과를 억제하는 것으로 나타났다. HIV-1 감염에서 IL-10의 가능한 역할은 보고되어 있고, IL-10 mRNA는 상승 조절되고, 비감염된 개체로부터의 PBMC와 비교하여 증가된 수준의 IL-10이 무증상의 HIV 양성인 개체로부터의 PBMC로부터 관찰되었다. 또한, IL-10은 사람의 대식 세포에서 시험관내 바이러스 복제를 감소시키는 것이 관찰되었다.

전-염증성 Th1 및 Th2 시토킨의 발현 카셋트는 DNA 백신에 의해 유도되는 면역 반응의 생체 내 조절자로서 그들의 기능을 분석하기 위해 개발되었다. 시토킨 유전자는 DNA 면역원 작제물과 함께 쥐의 근육내로 동반 수송되고, 유도된 면역 반응의 방향 및 정도에 있어서 그들의 효과를 분석하였다. 항체 반응에 있어서 극적인 증가는 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-18과 동반 투여하는 경우에 관찰되었다. TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-10 및 IL-18과의 동반 투여는 T 헬퍼 증식 반응의 극적인 증진을 초래하는 반면, IL-5 및 IL-15와의 동반 투여는 T 헬퍼 증식의 온화한 증가를 초래하엿다. 더욱이, 모든 동반 투여 배합물 중 TNF-α 및 IL-15 동반 투여만이 IL-12 동반 투여에서와 유사한 수준(30% 초과의 비용해도)의 CTL 증진을 초래하였다. TNF-β, IL-2 및 IL-18과의 동반 투여는 DNA 면역원으로만 면역화된 군에 대해 CTL 반응을 온화하게 증가시켰다. IL-12 또는 CD86의 동반 투여를 관찰한 결과, TNF-α와 IL-15의 동반 투여로부터 관찰된 CTL 반응의 증진은 MHC 분류 I 및 CD8+ T 세포에 의해 제한된다.

IL-18은 IL-12와 유사한 활성을 공유한 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 사람의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 배양액 중 IL-18은, 구조적으로 관련이 없는 시토킨 IL-12와 유사하게, 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 증진시킨다. 또한, IL-18은 IFN-γ의 생산을 증진시키는 반면, 콘카나발린 A (con A) 촉진된 PBMC에서 IL-10의 생산을 억제한다. IL-18은 IL-12 의존성 경로를 통하여 IFN을 유도하는 것이 관찰되었다. IL-12 동반 수송의 경우에 T 세포 매개의 반응의 유의한 증진 및 체액성 반응의 다소간 감소가 일어날지라도, IL-18 동반 수송과 유사한 효과는 관찰되지 않았다. IL-18 동반 투여를 사용한 경우 항체 역가의 유의한 증가가 관찰되었다. 또한, CTL의 극적인 증진을 유도하는 IL-12 동반 수송과는 달리, IL-18 동반 투여는 유사한 수준의 CTL 증진을 유도하지 않았다. IL-18의 면역 조절 특성은 IL-10과 유사한 것으로 보인다.

생체 내에서의 IL-12 및 IL-18의 동반 투여의 분별적 효과 외에, IL-2 및 IL-5의 동반 투여도 면역 반응의 상이한 방향 및 정도를 초래하였다. IL-2 및 IL-15는 IL-2 수용체의 γ쇄를 공유하며 T 세포 촉진의 시그날링을 포함하는 유사한 생활성을 갖는 것으로 보고되어 있다. IL-2 동반 투여는 항체 및 T 헬퍼 세포 증식 반응을 극적으로 증가시키는 반면, IL-15 동반 투여는 의미있는 CTL 반응의 증진을 초래한다. 이러한 차이점은 IL-15의 특성에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, IL-15는 류마티스 관절염에서 활액 T 세포의 활성화를 통해 유의한 TNF-α 생산을 유도하는 것으로 보고되어 있다. 반면에, IL-2는 현저히 낮은 수준의 TNF-α를 유도한다. 이 생체내 자료는 시그날링이 2개의 분자가 관여함으로써 상이하게 활성화됨을 암시한다.

Th2 시토킨은 T 세포 매개된 반응에 영향을 주지않고, Th2 유형의 면역 반응을 증진시키는데 사용될 수 있다. IL-4, IL-5 및 IL-10은 효능있는 Th2 시토킨인 것으로 보고되어 있다. IL-4, IL-5 및 IL-10 동반 수송으로 인한 항체 반응 수준의 현저한 증가 및 T 헬퍼 증식은 현저히 증가된다. 반면에, CTL 반응 수준의 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Th2 유형의 반응이 IL-4, IL-5 또는 IL-10 동반 투여로 엔지니어링될 수 있음을 입증하였다.

다기능 면역 조절자로서의 TNF-α 및 IL-15의 기능에 대한 극적인 관찰을 하였다.

DNA 면역화로부터 숙주의 면역 반응을 유도하는데 있어서 면역학적으로 중요한 다양한 시토킨의 기능을 조사하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 면역 반응의 특정 무기화의 유도는 시토킨 유전자의 동반 투여법을 사용하여 엔지니어링될 수 있다. 이 시토킨 유전자 보조제 망은 특이적 면역 반응을 유도하여 백신접종 프로그램을 질병에 대해 다양하게 변화되는 방어와 더욱 밀접하게 연관되도록 조절하는 새로운 수준의 조절 하에 놓이게 된다. 백신 및 면역 요법의 이러한 미세 조절은 기존에 달성할 수 없었다. 그 결과, 면역 반응의 정도 및 방향의 조절은 다양한 백신법에서 잇점을 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 매개 반응이 탁월하지만 체액성 반응이 더 이상 필요하지 않거나 유해하기까지한 경우, IL-12 유전자는 특정 DNA 면역원과 동반 수송되는 면역 조절자로서 선택될 수 있다. 반면에, 표적의 세포외 세균에 대한 백신을 제작하기 위하여, 예를 들어 IL-4, IL-5 또는 IL-10 유전자가 동반 투여될 수 있다. 더욱이, CD4+ T 헬퍼 세포 및 항체가 방어에 중요한 역할을 담당하는 경우에, GM-CSF 및 IL-2가 동반 수송될 수 있다. 마지막으로 모든 면역 반응의 3가지 무기화가 중요한 경우에, TNF-α가 동반 투여되어 항체, T 헬퍼 세포, 및 CTL 반응의 배합된 증진을 일으킬 수 있다.

<실시예 6>

*PCR 반응을 사용하여, BL1으로 명명되고 도 14에 도시된 삽입물을 클로닝하고, 도 15에 도시된 적절한 제한 효소를 사용하여 PCR3 진핵세포 발현 벡터 및 벡터 pBBKan으로 라이게이션하였다. BL1 작제물을 상이한 HIV-1 항원과 동반 투여하고, 마우스에서 면역촉진 효과를 측정하였다. 그 결과는 도 16 및 17A, 17B, 17C 및 17D에 나타나 있고, 이는 HIV-1 항원과 함께 동반 면역화되는 경우에 BL1 중의 DNA가 면역 반응을 증진시킴을 나타낸다. 상이하게 관찰된 효과는 비장 크기의 증가, 및 항체 및 CTL 반응의 증가이다.

피코르나바이러스과 (Picornavirus)	속(屬)	리노바이러스: (의학) 감기의 약 50%와 관련됨
		에테로바이러스: (의학) 폴리오바이러스, 콕스삭키에바이러스, 에코바이러스, 및 감염 A 바이러스 등의 사람 엔테로바이러스
		아프토바이러스: (수의학) 발 및 구강 질병 바이러스임
	표적 항원	VP1, VP2, VP3, VP4, VPG
칼시바이러스과 (Calcivirus)	속	바이러스의 노르워크군 (Norwalk Group): (의학) 이들 바이러스는 전염성 위장염의 주요한 원인 매개물이다.
토가바이러스과 (Togavirus)	속	알파바이러스: (의학 및 수의학) 예를 들면 세닐리스 바이러스, 로스리버 바이러스, 이스턴 및 웨스턴 말뇌염 등이 있음
		레오바이러스: (의학) 루벨라 바이러스
플라리비리듀과 (Flariviridue)		예: (의학) 뎅그열, 황열, 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염 및 진드기 발생 뇌염 바이러스
간염 C 바이러스 (Hepatitis C virus)		(의학) 이들 바이러스는 아직 과로 정해지지 않았으나 토가바이러스 또는 플라비바아러스과 중 하나인 것으로 생각된다. 가장 유사한 것은 토가바이러스과이다.
코로나바이러스과 (Coronavirus)		(의학 및 수의학) 감염성 기관지염 바이러스 (가금), 돼지 전달가능한 위장 바이러스 (돼지), 돼지 혈구응집 뇌척수염 바이러스 (돼지), 고양이 감염성 복막염 바이러스 (고양이), 고양이 장 코로나바이러스 (고양이), 개 코로나바이러스 (개), 사람 호흡기 코로나바이러스는 약 40가지의 감기 EX. 224E, 0C43를 유발한다. 코로나바이러스는 비A, B, C 간염을 일으킬 수 있다.
	표적 항원	E1 - M 또는 매트릭스 단백질로 불리움
		E2 - S 또는 스파이크 단백질로 불리움
		E3 - HE 또는 헤마글루틴-엘터로오즈 당단백질 (모든 코로나바이러스에 있는 것은 아님)로도 불림
		N - 뉴클레오캡시드
랍도바이러스과 (Rhabdovirus)	속	베실리오바이러스
		리사바이러스: (의학 및 수의학) 광견병
	표적 항원	G 단백질
		N 단백질
필로비리듀과 (Filoviridue)		(의학) 마르버그 (Marburg)및 에볼라 바이러스 등의 출혈열 바이러스
파라믹소바이러스과 (Paramyxovirus)	속	파라믹소바이러스: (의학 및 수의학) 멈프스 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스 (닭에게 중요한 병원체)
		모르빌리바이러스: (의학 및 수의학) 홍역, 개디스템퍼
		뉴민바이러스: (의학 및 수의학) 호흡기 합포체 바이러스
오르토믹소바이러스과 (Orthomyxovirus)		(의학) 인플루엔자 바이러스
분가바이러스과 (Bungavirus)	속	분가바이러스: (의학) 캘리포니아 뇌염, LA 크로스
		플레보바이러스: (의학) 리프트계곡열
		한타바이러스 : 푸레말라는 헤마하긴 열 바이러스이다.
		나이어바이러스 (수의학) 나이로비 양 병
		이외에 많은 정해지지 않은 분가바이러스
아레나바이러스과 (Arenavirus)		(의학) LCM, 라사 열 바이러스

레오바이러스과 (Reovirus)	속	레오바이러스 : 가능성이 있는 사람 병원체
		로타바이러스 : 소아의 급성 위장염
		오르비바이러스 : (의학 및 수의학) 콜로라도 진드기 열, 레봄보 (사람) 말뇌증, 청설병
레트로바이러스과 (Retrovirus)	아과	온코리비리날 (Oncorivirinal): (수의학) (의학) 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII
		렌티비리날 (Lentivirinal): (의학 및 수의학) HIV, 고양이 면역결핍 바이러스, 말 감염증, 빈혈 바이러스
		스푸마비리날 (Spumavirinal)
파포바바이러스과 (Papovavirus)	아과	폴리오마바이러스: (의학) BKU 및 JCU 바이러스
	아과	파필로마바이러스: (의학) 암 또는 유두종의 악성 진행과 관련된 많은 바이러스 종류
아데노바이러스 (Adenovirus)		(의학)
		EX AD7, ARD., O.B. - 호흡기 질환 유발, 275와 같은 아데노바이러스는 장염을 유발한다.
파르보바이러스과 (Parvovirus)		(수의학)
		고양이 파르보바이러스: 고양이의 장염을 유발
		고양이 판로이코페니아바이러스
		개 파르보바이러스
		돼지 파르보바이러스
허피스바이러스과 (Herpesvirus)	아과	알파 허피스 비리듀
	속	심플렉스바이러스 (의학)
		HSVI, HSVII
		바리셀로바이러스: (의학-수의학) 가광견병 - 수두 대상포진
	아과	베타 허피스 비리듀
	속	시토메갈로바이러스 (의학)
		HCMV
		뮤로메갈로바이러스
	아과	감마 허피스 비리듀
	속	림포크립토바이러스 (의학)
		EBV - (부르키츠 림포)
		라디노바이러스
폭스바이러스과(Poxvirus)	아과	코르도폭스비리듀 (의학-수의학)
	속	바리올라 (천연두)백시니아 (우두)파라폭시바이러스-수의학오이폭스바이러스-수의학카프리폭스바이러스레포리폭스바이러스수이폭스바이러스
	아과	엔테모폭스비리듀
헤파드나바이러스과(Hepadnavirus)		간염 B 바이러스
비분류		간염 델타 바이러스
[표 2]세균성 병원체
병원성 그람 양성 콕시 (cocci)에는 뉴모코칼 (pneumococcal), 스태필로코칼 (staphylococcal), 및 스트렙토코칼 (streptococcal)이 포함되고, 병원체 그람 음성 콕시에는 메닝고코칼 (meningococcal), 및 고노코칼 (gonococcal)이 포함됨
병원성 장내 그람 음성 바실리 (bacilli)에는 엔테로박테리아 (enterobacteriaceae), 슈도모나스 (pseudomonas), 액시네토박테리아 (acinetobacteria) 및 에이케넬라 (eikenella), 멜리오이도시스 (melioidosis), 살모넬라 (samonella), 시겔로시스 (shigellosis), 헤모필러스 (hemophilus), 찬크로이드 (chancroid), 브루셀로스 (brucellosis), 투랄레미아 (tularemia), 에르시니아(yersinia) (파스테렐라(pasteurella)), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 (streptobacillus moniliformis) 및 스피릴륨 (spirillum), 리스테리아 모노시토겐 (listeria monocytogenes), 에리시펠로트릭스 류지오파티아 (erysipelothrix rhusiopathiae), 디프테리아 (diphtheria), 콜레라 (cholera), 안트락스 (anthrax), 도노바노시스 (donovanosis), 그래뉼로마 인기날 (granuloma inguinale) 및 바르토넬로시스 (bartonellosis)가 포함됨.
병원성 혐기성 세균에는 파상풍, 보툴리즘, 다른 클로스트리디아, 결핵균, 레프로시 (leprosy) 및 다른 미코박테리아 (mycobacteria)가 포함됨, 병원성 스피로헤탈 (sprirochetal) 질병에는 시필리스 (syphilis), 트레포네마토스 (treponematoses), 야스 (yaws), 핀타 (pinta) 및 엔데믹 시필리스 (endemic syphilis), 및 렙토스피로시스 (leptospirosis)가 포함됨. 병원성 세균 및 진균에 의한 감염에는 액티노마이코시스 (actinomycosis), 노카르디오시스 (nocardiosis), 크립토코코시스(cryptococcosis), 블라스토미코시스 (blastomycosis), 히스토플라즈모시스 (histoplasmosis) 및 코시디오도미코시스 (coccidiodomycosis), 캔디다시스 (candidasis), 아스퍼질로시스 (aspergillosis), 및 뮤코르미코시스 (mucormycosis), 스포로트리코시스 (sporotrichosis), 파라코시디오도미코시스 (paracoccidiodomycosis), 페트리엘리디오시스 (petriellidiosis), 토룰로소시스 (torulopsosis), 미세토마 (mycetoma) 및 크로모미코시스 (chromomycosis) 및 더마토피토시스 (dermatophytosis)가 포함됨.
리케치알 감염에는 리케치알(rickettsial) 및 리케치오스(rickettsioses)가 포함됨
미코플라즈마 및 클라미디알 감염에는 미코플라즈마 뉴모니에 (mycoplasma pneumoniaes), 림포그래뉼로마 베네륨 (lymphogranuloma venerum), 앵무새병 (psittacosis), 및 페리나탈 클라미디알 (perinatal chlamydial) 감염이 포함됨.
진핵 병원체
원생동물 및 기생충 및 감염물에는 아메바증 (amebiasis), 말라리아, 레슈마니아시스 (leishmaniasis), 트립파노소미아시스 (trypanosimiasis), 톡소플라즈모시스 (toxoplasmosis), 뉴모시스티스 (pneumocystis), 카리니 (carinii), 바베시오시스 (babesiosis), 기아르디아시스 (giardiasis), 트리키노시스 (trichinosis), 필라리아시스 (filariasis), 시스토소미아시스 (schistosomiasis), 선충, 흡충류(trematode) 또는 흡충(fluke), 및 조충류(조충) 감염이 포함됨

본 발명에 따라 조절 인자와 작동 가능하게 연결된, IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및(또는) BL-1를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개량된 백신을 제공할 수 있다.

도 1A 및 1B는 실시예 4로부터의 도면을 도시하고 있다. 도 1A에서, 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍을 측정 전에 근육내로 투여하였다. 면역화한지 14일 후에, 모든 면역화된 동물로부터 수확된 비장을 칭량하였다. 음성 대조구 동물을 면역화하였다. Gag/Pol만을, 그리고 IL-12만을 주입한 쥐로 부터 비장의 질량은 면역화되지 않은 대조구 쥐와 유사하였다 (약 100 ㎎). 그러나, Gag/Pol+IL-12 유전자를 주입한 쥐로부터의 비장 질량은 대조구 비장의 거의 3배였다. 대조적으로, Gag/Pol+GM-CSF 면역화된 쥐의 비장은 커지지 않았다. 도 1B에서, 백혈구를 준비하고, 각 비장으로부터 정제하였다. 각 비장의 질량 차이에 따라, Gag/Pol+IL-12 면역화된 비장으로부터의 세포수는 대조구 비장 유래의 수보다 3배를 초과하였다. Gag/Pol+GM-CSF 면역화된 쥐의 비장은 대조구 비장의 세포수에서 림프구의 수를 크게 증가시키지 않았다.

도 2에서, 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍를 측정하기 전에 근육내 투여하였다. 면역화한지 14일 후에, 비장을 수확하고, 사진화하였다. 비장의 시각적 크기는 질량에 직접 상응하였고, 여기서 면역원+IL-2 백신접종된 비장은 면역화되지 않은 대조구 비장보다 훨씬 컸다. 군락: (-) 면역화되지 않음; IL-12 면역화됨; 인벨롭+IL-12 면역화됨; Gag/Pol+IL-12 면역화됨.

도 3에서, IL-12의 각 사슬을 동반 투여하였다. 각 플라스미드 50 ㎍을 사용하였다. Gag/Pol뿐만 아니라, p35 및 p40 사슬 모두는 비장 확장에 요구되었다.

도 4에서, 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍을 측정하기 전에 근육내 투여하였다. 면역화된 쥐로부터의 항혈청을 수집하고, ELISA에 의해 HIV-1에 대한 특이적 항체 반응을 분석하였다. 28일 째에 수집된 시료의 ELISA의 결과를 도시하고 있다. 1:100 희석비에서, 인벨롭+GM-CSF로 면역화된 군으로부터의 혈청은 인벨롭만으로 면역화된 군보다 큰 HIV-1 gp120에 대한 항체 반응을 보였다. 반면에, 인벨롭+IL-12로 면역화된 군은 동일한 기간 동안 보다 적은 체액 반응을 보였다.

도 5에서, T 헬퍼 림프구의 활성화 및 증식은 항원 활성화된 B 세포의 확장을 통한 체액의 면역 반응, 및 CD8+세포독성 T 세포의 확장을 통한 세포 면역 반응 모두를 유도하는데 있어서 중요한 기능을 한다. 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍을 측정하기 전에 근육내로 투여하였다. 수확된 비장 세포를 T 세포 증식에 관해 시험하였다. 재조합 p55 단백질 20 ㎍/㎖을 각 웰에 플레이팅하여 T 세포의 증식을 촉진하였다. 렉틴 PHA 10 ㎍/㎖을 다클론성 촉진자 양성 대조구로서 사용하였다. 촉진 지수는 배지에서 세포로부터 측정된 수준으로 나누어진, 특정 단백질로 촉진된 세포로부터 검출되는 방사능 정도이다. PHA의 촉진 지수는 58.8이었다.

도 6에서, 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍을 측정하기 전에 근육내로 투여하였다. 시험관 내 촉진 없이 CTL 분석을 수확된 비장으로부터 제조된 세포를 사용하여 수행하였다. IL-12 유전자 카셋트만으로 면역화된 대조군은 백그라운드 레벨을 초과하는 표적 세포의 비용해도(specific lysis)를 초래하지 않았다. 또한, 이펙터:표적의 비가 50:1로 Gag/Pol만으로 면역화된 경우에 낮은 수준(3%)의 비용해도를 관찰하였다. 대조적으로, 50:1의 이펙터:표적의 비에서 Gag/Pol+IL-2를 동반 투여하는 경우에 62%의 비용해도를 관찰하였고, 12.5:1의 이펙터:표적의 비에서 9%로 판정되었다. Gag/Pol+GM-CSF 플라스미드로 면역화된 것은 검출가능한 CTL 활성을 보이지 않았다. 부적절한 항원-발현 백시니아로 제조된 표적에 대해 수행된 동일한 CTL 분석은 의미있는 CTL 반응을 초래하지 못했다.

도 7에서, 각 cDNA 발현 카셋트 50 ㎍을 측정하기 전에 근육내로 투여하였다. 시험관내 촉진없이 수행된 CTL 분석은 수확된 비장으로부터 준비된 세포를 사용하였다. 50:1의 이펙터:표적의 비에서 인벨롭만으로, 그리고 인벨롭+GM-CSF로 면역화된 군락은 4% 및 1%의 낮은 수준의 특이적 CTL을 각각 초래하였다. 한편, 인벨롭+IL-2를 사용한 경우에는 59%의 CTL 활성의 극적인 증진을 관찰하였다. 부적절한 항원-발현 백시니아로 제조된 표적에 대해 수행된 동일한 CTL 분석은 의미있는 CTL 반응을 초래하지 못했다.

도 8A, 8B 및 8C는 본 발명에 유용한 플라스미드를 도시하고 있다. 도 8A는 IL-12의 코딩 서열을 단일쇄 단백질로 함유하는 플라스미드를 도시하고 있다. 도 8B 및 8C는 2개의 각 서브유닛에 대한 2개의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드를 도시하고 있다.

도 9는 표 3을 도시하고 있다.

도 10에 도시된 바와 같이, 각 시토킨 유전자는 CMV 프로모터의 조절 하에 발현 플라스미드 내로 클로닝되고, 시험관 내에서 RD 세포내로 형질감염된다. 각 시토킨의 발현은 면역침전법 또는 시토킨 ELISA를 사용하여 확인하였다.

도 11A 내지 11O는 MHC 분류 I-제한적 CTL을 결정하는 실험으로부터의 결과를 도시하고 있다. 도 11A 내지 11E에 도시된 바와 같이, 제1 DNA를 pCEnv와 동반 투여 (각각 50 ㎍)한지 2주 후에, 쥐(군락 당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 1주일 후, 비장을 면역화된 쥐로부터 수집하고, 그들의 임파구를 단리하고, balb/c에서 MHC 분류 I-제한적인 것으로 보고된 인벨롭 특이적 펩티드(RIHIGPGRAFYTTKN)을 사용하여 제조된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 도 11F 내지 11O에 도시된 바와 같이, 제1 DNA를 pCGag/POL과 동반 투여 (각각 50 ㎍)한지 2주 후에, 쥐 (군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 1주일 후, 비장을 면역화된 쥐로부터 수집하고, 그의 림프구를 단리하고, CTL 반응에 대해 시험하였다. 컴플리먼트 용해에 의해 CD8+T 세포를 제거하여 CTL 분석을 수행하였다. 이펙터 세포를 CD8+T 세포의 존재 하에 (상단), 그리고 CD8+T 세포의 부재 하에 (하단) 제조하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

도 12는 직접 항원 특이적 CTL을 평가하는 실험으로부터의 결과를 도시하고 있다 (이펙터의 시험관내 촉진 없이). 제1 DNA를 pCEnv와 동반 투여 (각각 50 ㎍)한지 2주 후에, 쥐(군락당 4마리)를 동일한 투여량으로 재접종하였다. 1주일 후, 비장을 면역화된 쥐로부터 수집하고, 그의 림프구를 단리하고, 특이적(vMN462) 및 비특이적 백시니아(vSC8)로 감염된 표적 세포를 사용하여 CTL 반응에 대해 시험하였다. 이 실험은 유사한 결과로 2회 반복되었다.

도 13은 항체(Y축), T 헬퍼(X축), 및 세포독성 T 림프구 반응(Z축)에 대한 각 시토킨의 동반 투여 효과를 요약하여 도시하고 있다. 각 시토킨을 면역 반응의 3가지 방식에 대한 그들의 효과에 따라 3차원 상에서 플롯하였다.

도 14는 BL1의 뉴클레오티드 및 예견된 아미노산 서열을 도시하고 있다.

도 15는 BL1을 PCR3 진핵 발현 벡터 및 벡터 pBBKan으로 라이게이션한 것을 도시하고 있다.

도 16은 BL1의 동반 투여의 존재 및 부재 하에, HIV 항원 Nef에서 조절되는 항-HIV 항원 반응을 비교한 ELISA 분석 결과를 도시하고 있다.

도 17A, 17B, 17C 및 17D는 BL1의 동반 투여의 존재 및 부재 하에, HIV 항원 Gag/Pol에서 조절되는 항-HIV 항원 면역 반응을 비교하여 분석 결과를 도시하고 있다.

Claims

a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 면역원을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

이들 뉴클레오티드 서열이 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 플라스미드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하는 조성물로,

(a) 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제1 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

(b) 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제2 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 하나의 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 또는 제2 플라스미드가 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드가 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원, 암 관련 항원 또는 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원을 코딩하는 표적 단백질인 조성물.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 조성물.
제1항 또는 제3항의 조성물 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 병원체, 암 세포 또는 자가 면역질환 관련 세포에 대해 개체를 면역화시키기 위한 제약 조성물.
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 면역원을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는,

재조합 백신.
제10항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원, 암 관련 항원 및 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 백신.
제10항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 것인 재조합 백신.
제10항에 있어서, 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 백신.
제10항에 있어서, 상기 백신이 재조합 백시니아(vaccinia) 백신인 재조합 백신.
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 면역원을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는,

약독화된 생백신 병원체.
제15항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원, 암 관련 항원 및 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약독화된 생백신 병원체.
제15항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 약독화된 생백신 병원체.
제15항에 있어서, 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 약독화된 생백신 병원체.
제10항의 재조합 백신 또는 제15항의 약독화된 생백신 병원체 및 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 병원체, 암 세포 또는 자가 면역질환 관련 세포에 대해 개체를 면역화시키기 위한 제약 조성물.
제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하는 조성물로,

(a) 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제1 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

(b) 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제2 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 하나의 HIV-1 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
제20항에 있어서, 상기 제1 플라스미드 및(또는) 제2 플라스미드가 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된, IL-1, TNF-α, TNF-β, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, IL-18 및 BL-1(도 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질)으로 이루어진 군에서 선택되는 면역조절 단백질을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 HIV-1 항원을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

이들 뉴클레오티드 서열이 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 플라스미드를 포함하는 조성물.
제22항에 있어서, 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 조성물.
a) 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 IL-15을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및

b) 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나의 면역원을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

이들 뉴클레오티드 서열이 포유동물 세포 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 플라스미드를 포함하는 조성물.
제24항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원, 암 관련 항원 및 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제24항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 조성물.
제1 및 제2 플라스미드를 포함하는 조성물로,

(a) 포유동물 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제1 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 IL-15를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

(b) 포유동물 중에서 기능할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 제2 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 하나의 면역원을 코딩하는 조성물.
제27항에 있어서, 상기 면역원이 병원체 항원, 암 관련 항원 및 자가면역 질환 관련 세포와 연관된 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제27항에 있어서, 상기 면역원이 HIV-1 항원인 조성물.