KR20050052402A - 인테그린 길항물질의 초고속 대량 탐색방법 및 그에 의한신규 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 칩을 이용하여 인테그린의 길항물질을 탐색하는 방법 및 그에 의해 탐색된 유용한 펩타이드에 관한 발명이다. 사용된 단백질 칩은 특정한 기질(substrate)에 신물질인 캘릭스아렌(calixarene) 유도체를 코팅(coating)한 것으로 단백질이 균일하고 높은 활성도(activity)를 유지할 수 있으며 이 위에 인테그린 수용체 단백질을 고밀도 배열하여 리간드의 결합을 특이적으로 억제할 수 있는 물질들(단백질, 펩타이드, 저분자 화합물 등)을 탐색할 수 있다. 사용된 인테그린은 인테그린 αVβ3과 인테그린 αIIbβ3이며, 펩타이드 라이브러리를 이용하여 탐색된 새로운 길항 펩타이드는 결합력이 탁월하다.

Description

인테그린 길항물질의 초고속 대량 탐색방법 및 그에 의한 신규 펩타이드{High-Throughput Screening Method for integrin antagonist and new peptide screened therefrom}
본 발명은 고감도 단백질 칩을 이용하여 적은 양의 단백질만을 결합시킨 후 일어나는 단백질 상호작용을 이용한 신약 후보물질 스크리닝방법 및 그 방법에 의해 탐색된 유용한 펩타이드에 관한 발명이다.
Post-genome 연구의 중요한 분야의 하나가 단백질체 기능(functional proteomics) 연구분야이며, 이러한 단백질체 기능연구는 앞으로 단백질 발현 패턴분석, 질병 진단을 위한 바이오마커 분석, 새로운 바이오마커 및 신약 타깃의 발굴, 그리고 신약후보물질의 탐색 등 신약개발의 핵심적 기술로 널리 응용될 전망이다. 그러나 단백질 기능연구의 촉진을 위해서는 새로운 기술적 돌파구를 마련할 수 있는 기술혁신이 이루어져야 하며, 이러한 분야가 고감도 고밀도 단백질 칩 (highly sensitive protein microarray chip) 기술이라고 할 수 있다. 단백질 칩 기술은 단백질, 항체, 펩타이드, 리간드 등의 생체분자를 이용하여 소형화 및 집적화된 칩 표면에서의 반응으로 대량 및 동시분석을 위한 기술로서 최근 인간게놈지도의 발표로 단백질의 상호작용 및 기능 분석의 중요성이 대두되면서 DNA chip과 더불어 활발히 개발되고 있다.
인테그린 수용체는 세포 부착 및 이동, 분화, 증식 등과 같은 세포의 중요한 생리작용을 조절하는 세포표면수용체이다. 인테그린은 alpha와 beta subunit가 비 공유 결합으로 이루어진 heterodimer로 작용하며, alpha와 beta subunit가 쌍을 이루어 22가지의 인테그린 family를 구성하고 있다. 이들의 리간드 특이성이 각 인테그린 종류에 따라 다르며, 한 종류의 인테그린이 여러 가지 리간드를 동시에 결합할 수 있다. 리간드의 종류로는 주로 extracellular matrix proteins(vitronectin, fibronectin, collagen, laminin, vWF, fibrinogen 등)으로 매우 다양하다. 인테그린의 구조를 살펴보면, 긴 extracellular domain과 짧은 cytoplasmic domain으로 이루어져 있는데, extracellular domain은 리간드가 결합하는 부위를 가지고 있으며, Cytoplasmic domain은 세포질 내의 cytoskeleton과 연결이 되어 있어 인테그린이 활성화 되면 cytoskeleton rearrangement가 일어나 focal adhesion complex를 형성하면서 세포 부착 및 이동과정을 수행한다. 인테그린 αVβ3에 대한 길항물질은 예를 들어 뱀독에서 유래된 disintegrin family가 있다. Disintegrin은 약 30여가지가 알려져 있으며, 공통적인 인테그린 결합 부위인 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 가지고 있어 인테그린과 리간드의 결합을 억제하는 기능을 가지고 있다. 이들은 혈소판 표면에 존재하는 인테그린의 일종인 αIIbβ3 인테그린을 차단하여 리간드인 fibrinogen의 결합을 억제하여 혈소판 응집을 저해하는 작용을 한다. 이 같은 disintegrin의 특성 때문에 인테그린 αVβ3에 대한 길항물질로 작용하여 혈관신생(angiogenesis)을 억제한다.
인테그린 αVβ3에 대한 humanized mAb인 Vitaxin은 현재 고형암 치료목적으로 임상시험 1상에서 거의독성이 없이 성공적으로 완료되었고, 현재 임상시험 2상이 진행중이다. 특이할 만한 것은 임상시험을 실시한 12명의 암환자 중 한명은 암조직이 50%이상 줄어들었다는 것이다. EMD121974은 Merck사에서 개발한 내피세포의 인테그린 αVβ3를 차단하는 저분자 물질(cyclic RGD 펩타이드)로서 임상실험 1상이 진행중이다. 이 물질은 RGD서열을 가진 cyclic 펜타 펩타이드로서 동물실험을 통하여 사람의 악성 흑색종 등에서 혈관신생을 억제하여 암 성장을 저해하는 활성을 가지고 있다. Endostatin의 경우 지금까지 그 작용 기전이 밝혀지지 않았는데, 최근 recombinant human endostatin이 혈관 내피 세포의 alpha(5)- 와 alpha(v)-인테그린과 작용하여 내피세포의 이동과 같은 인테그린-의존적인 내피세포 기능을 억제한다고 밝혀졌다. 따라서, 이 같은 결과는 인테그린을 타깃으로 한 길항물질은 항암 치료를 목적으로 하는 혈관신생 억제제로서 개발을 가능케 한다는 것을 시사한다.
기존의 인테그린의 길항물질 탐색기술은 연구소 또는 병원 등에서 진단을 목적으로 상용화되어 널리 쓰이는 기술 중에 하나인 효소면역항체법(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)이다. 그러나 이 방법은 단백질 양이 많이 소요될 뿐만 아니라, 비특이적 반응이며 대량 탐색에 부적절하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 단백질 칩을 이용하여 인테그린에 반응하는 길항물질을 빠르게 대량 탐색하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 전술한 인테그린 길항물질 탐색방법을 이용하여 탐색된 유용한 신규 펩타이드를 제공하는 것이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 단백질 칩 상에 인테그린 αIIbβ3 및/또는 αVβ3을 부착하는 단계, 상기 인테그린이 부착된 단백질 칩에 형광물질이 부착된 리간드 단백질 및 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 풀을 반응시키는 단계, 상기 반응이 끝난 후 완충용액으로 세척하는 단계, 및 상기 세척 후 리간드 결합정도를 측정하는 단계를 포함하는 인테그린 길항물질의 초고속 탐색방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 전술한 리간드는 비트로넥틴(EMBO J. 1985 Oct; 4(10): 2519-24), 피브로넥틴(Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25; 12(14): 5853-68), 콜라겐(FEBS Lett. 1987 Dec 10; 225(1-2): 188-94), 라미닌(Lab Invest. 1989 Jun; 60(6): 772-82), 본 윌레브랜드 인자(Von Willebrand Factor; vWF; Biochemistry. 1986 Jun 3; 25(11): 3171-84) 및 피브리노겐(Thromb Haemost. 1979 Jun 30; 41(4): 662-70)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 리간드인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 전술한 탐색방법에 의해 탐색된 인테그린 길항작용을 갖는 유용한 신규 펩타이드인 서열번호 1의 HSDVHK, 서열번호 2의 HGDVHK, 서열번호3의 HHLLHK, 서열번호 4의 HGLVHK, 및 서열번호 5의 HGDLHK 펩타이드를 제공한다.
이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명에 있어 단백질 칩으로 ProteoChipTM(Proteogen, Inc., 서울, 한국)이 이용될 수 있다. ProteoChipTM은 아민화된(aminated) 글래스 슬라이드에 캘릭스아렌(calixarene) 유도체를 코팅(coating)한 것으로 캘릭스아렌 유도체는 bifunctional molecular linker로서 작용한다(Han M.H. et al.: ProteoChip, its fabrication method and detection of protein using ProteoChip, Korea patent application No. 2002-41770, 2002 및 Lee, Y.S. et al.: ProteoChip: a highly sensitive protein microarray proposed by a novel method of protein immobilization for application of protein-protein interaction studies, Proteomics 2003; 3: 2289-2304 참조). ProteoChipTM(Proteogen Inc.에서 구입)에 인테그린 수용체를 부착시켜 인테그린 단일층을 구성한 후, 형광물질로 표식된 리간드 단백질과 무작위 서열을 가지고 있는 펩타이드들을 혼합하여 리간드 결합을 방해하는 최적의 펩타이드를 초고속 대량 탐색 할 수 있는지를 실험하였다.
먼저, 칩위에 결합된 인테그린 수용체의 안정성을 조사하기 위하여 인테그린-리간드 간의 친화력을 확인한 결과 농도 의존적으로 리간드가 칩에 고정된 인테그린에 결합하는 것으로 보아 고정화된 인테그린 수용체의 안정성에는 전혀 문제가 없음을 확증하였다. 지금까지 인테그린 길항물질로 알려진 disintegrin 및 인테그린에 대한 단일 항체등을 이용하여 인테그린-리간드 결합을 억제할 수 있는지를 조사한 결과, 이들 단백질들이 모두 ProteoChipTM상에서 효과적으로 인테그린-리간드 결합을 경쟁적으로 억제하는 것을 확인하였다. 실제로 약 200만가지의 무작위 서열을 가지고 있는 펩타이드를 가지고 있는 펩타이드 라이브러리를 대상으로 인테그린-리간드 결합 억제 실험을 ProteoChipTM으로 대량 탐색을 시도하였는데, 그 결과 최적의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 탐색할 수 있었다. 이 같은 결과는 ProteoChipTM이 인테그린-리간드 결합을 방해하는 새로운 선도물질의 탐색을 가능케 하여 신약개발의 새로운 탐색기술로 사용할 수 있다는 것을 증명하는 것이다.
본 발명의 공정과 바람직한 비한정적인 실시예에 대해 도면을 참고로 하여 자세하게 설명하면 다음과 같다.
실시예 1: 단백질 칩 상에 인테그린 수용체의 고정화
단백질 칩으로 ProteoChipTM(Proteogen, Inc., 서울, 한국)을 사용하였으며, ProteoChipTM(Proteogen, Inc., 서울, 한국) 상에 마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)로 인테그린을 스팟팅하여 인테그린 수용체 마이크로어레이(microarray)를 구성하였다(Lee, Y.S. et al.: ProteoChip: a highly sensitive protein microarray proposed by a novel method of protein immobilization for application of protein-protein interaction studies, Proteomics 2003; 3: 2289-2304 참조). αIIbβ3 인테그린은 GRGDSPK-Sepharose 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 혈소판에서 분리 정제하였으며(Kang I.C. and Kim D.S., Analysis of potent glycoprotein IIb-IIIa antagonist from natural sources. J Biochem Mol Biol 1998; 31: 515-518 참조), αVβ3 인테그린은 Chemicon International, Inc.(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
10mM β-옥틸티오글루코피라노사이드(octylthioglucopyranoside), 1.0mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, 및 30% 글리세롤을 함유하는 인산-완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 희석된 인테그린(40μg/ml)을 스팟팅한 후 37℃에서 3시간 동안 보관하고, 그 후 결합하고 남은 인테그린을 0.5% 트윈 20을 함유한 인산-완충 생리식염수(0.5% PBST)로 세척하였다. 제조된 인테그린 마이크로어레이를 사용 시까지 4℃에서 보관하였다. 이렇게 제조된 인테그린 마이크로어레이(인테그린 부착 단백질 칩)을 인테그린 수용체의 길항물질 초고속 대량탐색에 사용하였다(도 1 참조).
실시예 2: 인테그린 마이크로어레이를 이용한 인테그린-리간드 결합 반응 실험
실시예 1에서 제조한 인테그린 부착 단백질 칩에 형광물질(Cy-5 또는 Cy-3; Amersham-Pharmacia Biotech, 미국)이 붙어있는 리간드 단백질(fibrinogen 또는 vitronectin; Chemicon International, Inc., 미국)을 1 ㎍/ml-1 fg/ml까지 마이크로어레이로 스팟팅 한 후 37℃ 습도가 75%이상인 오븐에서 1시간동안 반응을 시킨다. 0.5% PBST에 10분 정도 담구어 세척한 후 형광스캐너로 인테그린-리간드 반응결과를 관찰하였다.
농도에 따른 형광의 상대적 세기를 그래프로 도식하면 선형으로 나타남을 알 수 있다. 이것으로 한계측정 농도가 1 fg/ml까지임을 알 수 있다(도 2).
실시예 3: 인테그린 길항물질에 의한 인테그린 α IIb β 3 -fibrinogen 결합 억제 실험
실시예 1에서 제조한 인테그린 αIIbβ3-부착 단백질 칩에 형광물질(Cy-5)이 붙어있는 리간드 단백질(fibrinogen 100ng/ml)과 알려진 인테그린 길항물질로 disintegrin 종류인 echistatin 250㎍/ml, flavoridin 250㎍/ml, kistrin 250㎍/ml, salmosin 2.6ng/ml와 인테그린에 대한 단일클론 항체(mAb) 1.0mg/ml, 및 다양한 농도의 합성 RGD 펩타이드(echistatin, flavoridin, kistrin: Sigma-Aldrich, 미국; Salmosin: 유전자재조합 대장균에서 분리정제; 인테그린에 대한 단일클론 항체: Chemicon International, Inc., 미국; 합성 RGD 펩타이드: 한국생명공학연구원에서 합성)들을 혼합하여 마이크로 피펫 또는 마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)를 이용하여 칩 표면에 고정된 인테그린 수용체 위에 떨어뜨린 후, 37도 습도가 75%이상인 오븐에서 4-12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 3% BSA가 포함된 0.5% PBST으로 10분정도 세척하였다. 형광스캐너를 이용하여 리간드 결합정도를 상대적 형광의 세기로 분석함으로서 길항물질의 경쟁적 길항 능력을 측정하였다. 그 결과, 알려진 인테그린 길항물질 처리군들에서 상대적으로 현저히 낮은 형광 세기를 나타내는 것으로 보아 이 물질들이 인테그린 αIIbβ3-fibrinogen 결합 반응을 효과적으로 억제하는 것임을 증명하는 것이다(도 3).
도 3에서 실험에 사용한 RGE와 RGD는 자동화 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성한 것으로 이와 같은 펩타이드를 주문자의 요구에 따라 합성하여 주는 업체로부터 구입하여 실험을 하였다. 실험에 사용한 것은 염기가 6개인 것으로 중간에 염기서열인 RGE 또는 RGD을 가지고 있다. 일반적으로 인테그린 αIIbβ3는 염기서열인 RGD와는 결합을 하여 fibrinogen이 인테그린 αIIbβ3와 결합하는 것을 억제한다. 그러나 RGE는 인테그린 αIIbβ3와 결합을 하지 않으므로 이와 같은 억제 역할을 할 수 없다. 도 3은 이와 같은 내용을 실험한 결과이다. 즉 먼저 인테그린 αIIbβ3가 스팟되어 있는 칩에 RGD 또는 RGE을 농도별로 일정 농도의 형광이 붙어있는 fibrinogen과 혼합하여 억제 역할을 하는지를 실험한 결과이다. 결과는 형광스캐너로 측정하여 형광강도를 측정하게 된다. 원래는 빨강색 또는 파랑색 이와 같은 하나의 색으로 결과가 나오나 이 경우 형광강도를 쉽게 보기가 어려워 기기의 소프트웨어가 이것을 형광강도에 따라 색깔의 변화를 주게 되어 있다. 보통 가장 형광의 강도가 제일 높은 경우 흰색, 그리고 빨강, 주황, 노랑, 초록, 파랑 이런 순으로 형광강도를 표현하게 된다. 즉 결과를 보면 RGE(농도별)와 fibrinogen이 혼합된 경우 색깔이 흰색 또는 빨간색으로 RGE가 인테그린 αIIbβ3와 fibrinogen간의 상호작용을 억제하지 못 한다는 것을 알 수 있다. 그러나 RGD(농도별)와 일정농도 fibrinogen이 혼합된 경우 RGD의 농도가 증가함에 따라 흰색에서 노란색으로 변화가 된다. 즉 RGD가 fibrinogen이 인테그린에 결합하는 것을 저해하여 형광의 강도가 줄어드는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 인테그린 길항물질에 의한 인테그린 α V β 3 -vitronectin 결합 억제 실험
실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3-부착 단백질 칩에 형광물질(Cy-3)이 붙어있는 리간드 단백질(vitronectin 100 ng/ml))과 알려진 인테그린 길항물질로 로 disintegrin 종류인 echistatin 250㎍/ml, flavoridin 250㎍/ml, kistrin 250㎍/ml, salmosin 2.6ng/ml와 인테그린에 대한 단일클론 항체(mAb) 1.0mg/ml, 및 다양한 농도의 합성 RGD 펩타이드(echistatin, flavoridin, kistrin: Sigma-Aldrich, 미국; Salmosin: 유전자재조합 대장균에서 분리정제; 인테그린에 대한 단일클론 항체: Chemicon International, Inc., 미국; 합성 RGD 펩타이드: 한국생명공학연구원에서 합성)들을 혼합하여 마이크로 피펫 또는 마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)를 이용하여 칩 표면에 고정된 인테그린 수용체 위에 떨어뜨린 후, 37도 습도가 75%이상인 오븐에서 4-12시간 동안 반응시킨다. 반응 후 3% BSA가 포함된 0.5% PBST 용액으로 10분정도 세척하였다. 형광스캐너를 이용하여 리간드 결합정도를 상대적 형광의 세기로 분석함으로서 길항물질의 경쟁적 길항 능력을 측정하였다. 그 결과, 알려진 인테그린 길항물질 처리군들에서 상대적으로 현저히 낮은 형광 세기를 나타내는 것으로 보아 이 물질들이 αVβ3-vitronectin 결합 반응을 효과적으로 억제하는 것임을 증명하는 것이다(도 4).
도 4에 사용한 길항물질들은 이미 인테그린 αVβ3-vitronectin의 길항물질로 널리 알려진 물질들이다. 역시 이것도 길항물질와 형광을 붙인 vitrenectin을 혼합하여 인테그린 αVβ3와 vitronectin 상호작용을 억제하는지를 실험한 결과이다. control은 길항물질이 없이 형광 붙은 vitronectin 있는 경우이고 나머지들은 길항물질와 RGE 염기서열을 포함한 펩타이드을 가지고 실험을 한 결과이다. 이것도 도3의 설명과 같이 형광을 강도는 무지개 색깔로 표현이 된다. 즉 결과를 보면 control 즉 형광 붙은 victronectin만 있는 경우, 그리고 RGE가 포함된 펩타이드의 경우 형광의 색깔이 흰색과 빨간색으로 나타나고 있다. 즉 인테그린 αVβ3와 vitronectin이 상호작용을 한다는 것을 알 수 있다. 그러나 길항물질이 포함된 경우 길항물질이 인테그린 αVβ3와 vitronectin의 상호작용을 억제하여 인테그린 α Vβ3에 vitronectin이 결합하지 않아 형광이 제일 낮은 파란색으로 나타나고 있다.
실시예 5: 인테그린 마이크로어레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리로부터 인테그린 길항 펩타이드들의 초고속 대량 탐색
실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3-부착 단백질 칩에 형광물질(Cy-3)이 붙어있는 리간드 단백질(Fibrinogen 100ng/ml 및 vitronectin 100ng/ml)과 펩타이드 라이브러리의 114가지 펩타이드 pool을 혼합하여 마이크로 피펫 또는 마이크로어레이어(CM-1000; Proteogen, Inc., 서울, 한국)를 이용하여 칩 표면에 고정된 인테그린 수용체 위에 떨어뜨린 후, 37℃ 습도가 75%이상인 오븐에서 4-12시간 동안 반응시킨다. 반응 후 3% BSA가 포함된 0.5% PBST 용액으로 10분정도 세척하였다. 형광스캐너를 이용하여 리간드 결합정도를 상대적 형광의 세기로 분석함으로서 길항물질의 경쟁적 길항 능력을 측정하였다. 그 결과, 알려진 인테그린 길항물질인 RGD 펩타이드보다 상대적으로 현저히 낮은 형광 세기를 나타내는 펩타이드들을 관찰할 수 있었으며, 따라서 이 펩타이드들이 인테그린 αVβ3에 대한 결합력이 합성 RGD 펩타이드보다 훨씬 결합력이 강한 펩타이드들 임을 증명하는 것이다. 네모로 표시된 펩타이드 서열은 길항능력을 가진 펩타이드를 의미한다(도면 5 및 7). 이를 근거로 하여 αVβ3에 특이적으로 결합하여 길항작용을 하는 펩타이드 서열들을 결정할 수 있었으며, 이들에 대한 생물학적 활성 분석 결과는 후술하는 도 9, 10, 11, 12 및 13에 나타내었다. 각 펩타이드 서열은 인테그린 결합부위로 알려진 아미노산 서열(예; RGD, LDV 등)과는 전혀 다른 지금껏 보고되지 않은 새로운 아미노산 서열을 가지고 있다. 이 결과로 볼때, 본 발명의 인테그린 마이크로어레이는 길항 펩타이드를 탐색하는 도구로서 매우 유용함을 증명하는 것이며, 더 나아가 신약후보물질의 탐색기술로서 ProteoChipTM을 이용한 인테그린 마이크로어레이가 이용될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 6: 탐색 발굴된 인테그린 길항 펩타이드들의 아미노산 서열에 따른 인테그린 길항작용 분석
실시예 3-5의 competitive inhibition assay를 통하여 인테그린 αVβ3-특이 억제 활성을 보이는 새로운 펩타이드들을 발굴하였다(표 1 및 표 2 참조). 표 1은 인테그린 마이크로어레이를 이용하여 발굴된 길항 펩타이드 서열을 나타내는 표이다. 표 1의 결과를 기초로 살펴보면 헥사펩타이드의 1번 위치에 히스티딘 또는 루신 등을 포함하면 상대적으로 다른 것보다 저해정도가 가장 좋다는 것을 의미하고, 헥사펩타이드의 1번 위치에 글루타메이트 또는 글루타민이 있는 경우 어느 정도 저해를 하나 그 정도가 히스티딘, 루신, 또는 타이로신 보다는 상대적으로 약하다는 것을 의미한다. 아래 표 1에 인테그린 αVβ3-비트로넥틴 상호작용을 저해하는 헥사펩타이드 군내의 지정 위치 아미노산을 나타내었다. 아래의 표 1에서 주된 저해는 80%이상의 저해인 경우, 부수적인 저해는 50%이하의 저해인 경우를 나타내며, 이 결과는 세 번의 독자적인 실험을 통하여 얻은 것이다.
헥사펩타이드 내의아미노산 위치 인테그린칩상의 저해활성을 보이는 헥사펩타이드의 아미노산
서열 주된(major) 저해 부수적인(minor) 저해
1 H,L,Y E,Q,S,W
2 G,S,H L,Q,R,W
3 L,V E,F,N
4 I,H,L,R,W F,I
5 W,K,Y,I,V,H F,Q
6 A,F,M,R D,E,G,N
이러한 결과를 바탕으로 인테그린 αVβ3-특이 억제 활성을 보일 것으로 예상되는 12개의 펩타이드를 제조하고, 이를 이용하여 농도별로 인테그린 αVβ3-비트로넥틴 상호작용 억제 정도를 평가하였다. 즉, 아미노산 서열 차이에 의한 길항작용의 강도를 조사하였다. 아래의 표 2에 인테그린 αVβ3-비트로넥틴 상호작용의 저해하는 합성 펩타이드 및 그들의 저해농도를 나타내었다. 아래의 표 2에서 저해는 펩타이드없는 대조군에 대하여 길항활성을 갖는 최대 저해 농도의 1/2로 정량화하였고, ND는 활성이 검출되지 않은 것을 의미한다.
번호 펩타이드 IC50(pg/ml)
1 HGLLHK-NH2 ND
2 HSLLHK-NH2 ND
3 HHLLHK-NH2 3.4
4 HGDLHK-NH2 30.7
5 HSDLHK-NH2 ND
6 HHDLHK-NH2 ND
7 HGLVHK-NH2 2.43
8 HSLVHK-NH2 46
9 HHLVHK-NH2 313
10 HGDVHK-NH2 44.7
11 HSDVHK-NH2 1.74
12 HHDVHK-NH2 ND
인테그린 αVβ3-특이 억제 활성실험에서 HSDVHK와 HGDVHK는 기존에 길항물질로 알려진 GRGDSP와 비교 우위의 길항능력을 보였으나, HHDVHK는 길항능력이 거의 없는 것으로 관찰되었다. 이는 2, 3, 4번째 아미노산(헥사펩타이드의 두 번째 아미노산은 Gly, Ser, and His이고; 세 번째 아미노산은 Leu and Asp이고; 네 번째 아미노산이 Leu and Val임)들이 길항작용에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 길항 작용을 갖는 헵타펩타이드들 중에서도 HSDVHK가 가장 효과적이다. 또한, 이 결과는 아미노산 서열 특이적 길항작용을 ProteoChipTM을 이용한 인테그린 마이크로어레이로 정확하게 측정할 수 있음을 보여주는 증거이다. 따라서, 본 발명의 인테그린 마이크로어레이는 단백질-단백질 상호작용을 정확하고, 민감하게 분석할 수 있는 도구가 될 수 있다고 해석된다.
실시예 7: 인테그린 마이크로어레이를 이용하여 탐색한 길항 펩타이드의 생물학적 활성 분석
7-1) 인간 자궁혈관내피세포(HUVEC) 이동 실험
HUVE 세포를 10% 소태아 혈청(fetal calf serum)와 3ng/ml bFGF이 함유된 M199 배지에서 배양하였다. 이 세포를 이동 실험(migration assay)에 사용하기 위하여 16시간 동안 컨트롤 배지(0.1% BSA가 포함된 M199)에서 배양한 후 Boyden chamber 안에 삽입되어 있는 gelatin(40μM)으로 도포된 다공성 막의 위쪽 칸에 3X104개로 가하였다. 동시에 시료도 농도별로 같이 처리하였다. Chamber 아래 칸에는 chemoattractant인 bFGF를 넣어서 HUVE 세포가 아래 칸으로 이동할 수 있도록 유도하였다. 4시간 동안 37℃에서 배양한 후 막을 제거하고 고정한 다음 crystal violet으로 염색하고, 막을 통과하여 이동한 세포수를 현미경으로 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타나는 바와 같이 HSDVHK와 HGDVHK는 효과적으로 인간 자궁혈관내피세포(HUVEC)의 이동을 억제하였으나, HHDVHK는 영향이 거의 없었다. 이러한 결과로부터 인테그린 αVβ3-특이 억제 펩타이드들의 생물학적 활성을 확인할 수 있다.
7-2) 닭 융모막 혈관신생 억제 실험
① 실험 재료 및 시약 조제
수정란은 풀무원(주)에서 구입하며, Sample loading을 위한 Thermanox cover-slips는 Nunc사(미국)에서, 관찰시 필요한 10% Intralipose(fat emulsion)와 주사기는 녹십자사(한국)에서 각각 구입 하였다.
② 실험 단계(과정)
1일째(0일배): 수정란을 incubator에서 부화시킨다. 이때, incubator의 온도는 37-38℃로, 습도는 90% 이상 유지되도록 수시로 확인하였다.
3일째(2일배): 수정란의 뾰쪽한 끝부분에 칼로 흠을 내었다. 이후, 수평으로 뉘어놓고 5㎖ syringe로 구멍을 낸 다음 albumin을 2㎖ 정도 뽑아내었다. 수정란이 건조되지 않고 또 감염되지 않도록 구멍을 유리테잎으로 봉한 후 구멍이 아래로 향하도록 놓고 다시 incubator에 보관하였다.
4일째(3일배): 수정란의 air sac이 있는 쪽(주사기 구멍의 반대쪽)으로 직경 2-3㎝ 크기의 원형 window를 내고 수정란으로 확인된 것만 넓은 유리테잎으로 막고 다시 incubator 시켰다. 참고로, 원형 window를 내는 방법은 날카로운 칼로 수정란의 껍질 위에 원형으로 흠을 낸 뒤 핀셋으로 껍질을 뜯어내었다.
5일째(4.5일배): 이 시기가 되면 CAM이 생성되며, 그 직경이 2-5㎜ 정도된다. Sample을 적당한 용매(ddH2O, ethanol 등)에 녹인 다음 4등분된 Thermanox coverslip 위에 10㎕씩 떨어뜨리고 clean bench 안에서 말렸다. 여기서 Thermanox coverslip은 가위로 잘라 4등분하여 clean bench의 UV 아래에서 overnight 시킨 것이다. 수정란의 유리테잎을 칼로 뜯어내고 CAM을 찾아 확인한 후, 핀셋으로 sample이 처리된 Thermanox를 뒤집어 조심스럽게 올려놓고 다시 유리테잎으로 막았다. 이때 사용하는 가위, 칼, 핀셋 등은 70% ethanol로 소독하여 사용하고, 핀셋은 sample을 하나하나 loading할 때마다 소독하여 사용하였다.
7일째(6.5일배): 유리테잎을 칼로 뜯어내었다. Syringe로 Intralipose (fat emulsion)를 1㎖ 취하고, 기포를 제거한 뒤 CAM의 바로 아래부분에 주입하였다. 이때 흰색 바탕에 뚜렷한 혈관을 관찰할 수 있었다. Syringe로 Intralipose를 주입할 때는 혈관이 다치지 않도록 주의한다. 관찰이 끝난 수정란은 카메라로 근접촬영 하였다.
실험 결과, 도 9의 결과와 일치하게 HSDVHK와 HGDVHK는 효과적으로 닭 융모막 혈관 신생(CAM angiogenesis)을 억제하는 효과가 강약의 차이를 보이면서 관찰되었으나, HHDVHK는 영향이 거의 없었다. 결과를 종합하여 도 10에 나타내었다.
7-3) 피하 고형암의 성장 억제 실험
루이스 폐암 세포(Lewis lung carcinomas cell, 1X106개)를 C57BL/6 마우스의 등(dorsal) 중간부위에 피하주사하고, 종양의 부피가 100-200mm3가 되었을 때 무작위로 세 군으로 분리하였다. 두 군에는 하루에 한번 종양으로부터 떨어진 부위에 HGDVHK 또는 HSDVHK (100mg/마우스kg) PBS용액을 각각 피하주사하였고, 다른 한 군에는 대조군으로 PBS 용액을 주사하였다. 모든 그룹에 있어 종양의 크기를 매일 동일한 시간에 측정하였으며 실험은 대조군의 마우스가 죽었을 때 중단하였다.
실험 결과 루이스 폐암 세포를 실험 쥐에 주사하여 만든 고형암이 HSDVHK를 100mg/마우스kg의 투여량에서 고형암 성장이 크게 억제됨을 관찰하였다. 이 같은 결과는 HSDVHK의 항 신생혈관 형성 활성에 의하여 고형암의 성장을 억제한 결과라고 해석된다. 그 결과를 종합하여 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.
이상의 결과로 볼때, 본 발명에 따라 제조된 인테그린 마이크로어레이는 펩타이드 라이브러리를 통하여 인테그린과 특이적으로 결합하는 길항 펩타이드를 효과적으로 탐색할 수 있으며, 그 결과 지금까지 알려져 있지 않은 독특한 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 발굴할 수 있었다. 동시에 이러한 길항 펩타이드의 생물학적 활성을 in vitro 인간 자궁혈관내피세포 이동실험, in vivo 닭 융모막 혈관신생 억제 실험 및 피아 고형암 성장 억제 실험을 통하여 증명하였다.
이상과 같은 본 발명은 다음과 같은 효과를 갖는다.
첫째로, 신약 후보물질 스크리닝에 응용할 수 있다. 인테그린 길항물질의 초고속 대량 탐색(High-Throughput Screening)이 가능하기 때문에 질환과 관련된 다른 종류의 표지단백질들에 대한 길항단백질들의 초고속 대량 탐색이 가능할 것이므로 짧은 시간 안에 많은 신약 후보물질을 탐색할 수 있을 것이다.
둘째로, ProteoChipTM을 이용하여 제조한 인테그린 단백질 칩의 인테그린-리간드 반응은 측정 한계가 매우 낮아 고감도 측정이 가능하다. 기존의 인테그린-리간드 상호작용 연구방식은 ELISA방법이었는데, 이는 단백질의 양이 많이 소요되며, 비특이적 반응을 나타내는 단점이 있었다. 하지만, ProteoChipTM을 이용하여 사용되는 단백질의 양이 ELISA보다 1,000배이상 적은양을 사용하기 때문에 기존의 이용했던 것보다 많은 비용 면에서 절감효과가 가능하고 또한 그 결과도 기존의 것보다 고감도 측정이 가능하므로 훨씬 좋은 결과를 얻을 수 있다.
셋째로, 단백질-단백질 상호작용 연구에 사용할 수 있다. 인테그린 수용체를 한 예로서 인테그린-리간드 상호작용을 조사하였지만, 다른 많은 종류의 단백질에 대하여 반응하는 단백질-단백질 상호작용 연구도 가능하다.
넷째로, 응용성이 다양하다. 즉, 단백질-DNA, 단백질-Small molecules(Chemical compounds), 단백질-특정세포와의 상호작용 등의 연구가 가능할 것이다.
다섯째로, 본 발명은 탁월한 인테그린 αIIbβ3 및 인테그린 αVβ 3 저해활성을 갖는 신규 펩타이드를 제공하며, 이러한 본 발명의 펩타이드는 항암제로 사용될 수 있다.
도 1은 단백질 칩인 ProteoChipTM 상에 인테그린 수용체의 고정화 방법을 도식한 것이다.
도 2은 단백질 칩인 ProteoChipTM을 이용한 인테그린-리간드 결합 반응 실험 결과를 도식한 것이다.
도 3은 위와 같은 인테그린-리간드 결합 반응의 한 실시예로 인테그린 길항물질에 의한 인테그린 αIIbβ3-fibrinogen 결합 억제 실험을 수행한 결과이다. 실험에 사용한 RGE와 RGD는 자동화 펩타이드 합성장치를 이용하여 합성한 것으로 이와 같은 펩타이드를 주문자의 요구에 따라 합성하여 주는 업체로부터 구입을 하였다. 실험에 사용한 것은 염기가 6개인 것으로 중간에 염기서열인 RGE 또는 RGD을 가지고 있다. 일반적으로 인테그린 αIIbβ3는 염기서열인 RGD와는 결합을 하여 fibrinogen이 인테그린 αIIbβ3와 결합하는 것을 억제한다. 그러나 RGE는 인테그린 αIIbβ3와 결합을 하지 않으므로 이와 같은 억제 역할을 할 수 없다. 도 3은 이와 같은 내용을 실험한 결과이다.
도 4는 인테그린 길항물질에 의한 인테그린 αVβ3-vitronectin 결합 억제 실험 결과이다.
도 5 인테그린 αIIbβ3에 길항 작용을 가지는 펩타이드를 발굴하기 위한 실험이다. 형광의 강도는 무지개 색깔로 표현이 된다. 여기서 사용된 1A6와 같은 기호에서 첫 번째 숫자는 특정 아미노산이 조정된 위치를 두 번째 영문자는 아미노산을, 그리고 마지막 숫자는 펩타이드의 길이를 나타낸다. 예를 들어 2H6은 헥사펩타이드이고 2번 위치에 히스티딘이 있다는 것을 의미한다.
도 6은 도 5에서 실험한 결과, 즉 형광의 강도를 숫자로 계산하여 그래프로 그린 결과이다. 그래프에서 노란색 막대는 fibrinogen만 있는 경우의 형광 강도와 비교하여 형광강도가 약 30% 내지 약 50% 사이인 경우 그리고 빨간색 막대는 약 20% 미만인 경우를 나타낸다. 그래프 밑의 1 내지 19라는 숫자는 좌측 박스 안에 있는 염기들을 말하며, position 숫자는 염기가 고정된 위치이다. 예를 들어 position 1에 X축이 1인 것은 헥사펩타이드의 1번 위치에 알라닌이 있다는 것을 의미한다. 그리고 Y축은 형광의 강도로 색깔을 숫자로 표현한 것으로 최대 형광의 감도는 65535이다. 그래프가 짧을수록 저해하는 역할이 크다고 할 수 있다.
도 7은 도 5와 같은 방법을 사용하여 인테그린 αVβ3을 가지고 실험한 결과이다.
도 8은 도6과 같은 방법으로 사용하여 인테그린 αVβ3을 가지고 실험한 결과이다.
도 9는 인간 자궁 혈관내피세포(HUVE cell)의 이동에 미치는 인테그린 αVβ3 길항 펩타이드들의 영향을 분석한 결과이다. 각 길항 펩타이드들의 생물학적 특성 연구의 일환으로 in vitro 혈관 내피세포 이동 실험을 수행한 결과이다.
도 10은 계란 융모막 혈관 신생에 미치는 인테그린 αVβ3 길항 펩타이드들의 영향을 분석한 결과이다. 각 길항 펩타이드들의 생물학적 특성 연구의 일환으로 in vivo에서 혈관 신생 억제실험을 수행하였다. 도 10에서 A는 peptide 없이 bFGF만 처리한 positive control 군의 결과이고; B는 bFGF 없이 cell만 있는 negative control 군의 결과이고; C는 bFGF 존재 하에서 GRGDSP 펩타이드로 처리한 군의 결과이고; D는 bFGF 존재 하에서 HGDVHK 펩타이드로 처리한 군의 결과이고; E는 bFGF 존재 하에서 HSDVHK 펩타이드로 처리한 군의 결과이고; F는 bFGF 존재 하에서 HHDVHK 펩타이드로 처리한 군의 결과이다.
도 11은 루이스 폐암 세포를 투여한 C57BL/6 마우스를 이용한 피하 고형암 성장 억제 실험에서 인테그린 αVβ3 길항 펩타이드들이 미치는 영향을 평가한 실험결과 사진이다.
도 12는 루이스 폐암 세포를 투여한 C57BL/6 마우스를 이용한 피하 고형암 성장 억제 실험에서 인테그린 αVβ3 길항 펩타이드를 투여함에 따라 변화하는 종양의 크기를 나타낸 결과이다.
도 13는 루이스 폐암 세포를 투여한 C57BL/6 마우스를 이용한 피하 고형암 성장 억제 실험에서 인테그린 αVβ3 길항 펩타이드를 투여함에 따라 변화하는 종양의 무게를 나타낸 결과이다.
<110> Proteogen Co. <120> High-Throughput Screening Method for integrin antagonist <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin antagonistic peptide <400> 1 His Ser Asp Val His Lys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin antagonistic peptide <400> 2 His Gly Asp Val His Lys 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin antagonistic peptide <400> 3 His His Leu Leu His Lys 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin antagonistic peptide <400> 4 His Gly Leu Val His Lys 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin antagonistic peptide <400> 5 His Gly Asp Leu His Lys 1 5

Claims (4)

  1. a) 단백질 칩 상에 인테그린 αIIbβ3 및/또는 αVβ3을 부착하는 단계;
    b) 상기 인테그린이 부착된 단백질 칩에 형광물질이 부착된 리간드 단백질 및 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 풀을 반응시키는 단계;
    c) 상기 반응이 끝난 후 완충용액으로 세척하는 단계; 및
    d) 상기 세척 후 리간드 결합정도를 측정하는 단계를 포함하는 인테그린 길항물질의 초고속 탐색방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기의 리간드는 비트로넥틴, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 본 윌레브랜드 인자(Von Willebrand Factor; vWF) 및 피브리노겐으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 리간드인 것을 특징으로 하는 인테그린 길항물질의 초고속 탐색방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 탐색방법에 의하여 얻은 인테그린 αVβ3 길항작용을 갖는 서열번호 1의 HSDVHK, 서열번호 2의 HGDVHK, 서열번호 3의 HHLLHK, 서열번호 4의 HGLVHK, 또는 서열번호 5의 HGDLHK 펩타이드.
  4. 제3항의 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 암치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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