KR100319828B1

KR100319828B1 - 혈관벽세포성장호르몬활성을저해하는새로운펩티드

Info

Publication number: KR100319828B1
Application number: KR1019980020207A
Authority: KR
Inventors: 채치범; 배동구; 고용송
Original assignee: 허일섭; 주)녹십자; 정명식; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1998-06-01
Publication date: 2002-05-13
Also published as: KR20000000541A

Abstract

본 발명은 신 혈관형성 유도물질인 혈관벽세포 성장호르몬(vascular endothelial growth factor, 이하 'VEGF'로 약칭함) 활성을 저해하는 새로운 펩티드 및 이를 항암제, 신 혈관형성과 관련된 질병의 치료제로 사용하는 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 신 혈관형성을 유도하고 암세포 등에 의해 분비되는 VEGF의 활성을 저해하는 새로운 펩티드 서열을 화학적으로 합성된 펩티드 라이브러리로부터 분리함으로, 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 항암제, 신 혈관형성과 관련된 질병의 치료제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈관벽세포 성장호르몬 활성을 저해하는 새로운 펩티드

본 발명은 신 혈관형성 유도물질인 혈관벽 세포 성장 호르몬(vascular endothelial growth factor, 이하 'VEGF'로 약칭함) 활성을 저해하는 새로운 펩티드 및 이를 항암제, 신 혈관형성과 관련된 질병의 치료제로 사용하는 용도에 관한것이다.

보다 상세하게는 화학적으로 합성된 펩티드 라이브러리(펩티드 무작위 서열 혼합물)로부터 분리된 1) 첫 번째, 네 번째, 여섯 번째 아미노산은 아르기닌이고; 2) 두 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘에서 선택되며; 3) 세 번째, 다섯 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신에서 선택된 여섯 개의 아미노산으로 구성된 서열을 포함하는 VEGF의 길항작용 펩티드에 관한 것으로서, 본 발명의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 효과적인 항암제, 신 혈관형성과 관련된 질병의 치료제 등으로 사용될 수 있다.

신 혈관형성(angiogenesis)이란 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 일컫는 용어로 정상적인 개체의 경우 상처가 치유될 때나 기관이 형성되는 과정에서 신 혈관형성이 유도되며, 이러한 신 혈관형성은 필요한 시기와 장소에서 정해진 기간만 활성을 가지며, 생체 내에서는 신 혈관형성 유도물질과 저해물질들간의 평형에 의해 세밀하게 조절되고 있다(Loitta, L. A. et al., Cell,64, 327 (1991)).

이러한 신 혈관형성의 정교한 조절기작의 실패가 당뇨성 실명증과 류마티스 관절염을 포함한 여러 가지 질병들의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Kohn, E. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 1307 (1995)). 또한 최근 보고에 의하면, 암세포의 성장과 전이에도 신 혈관형성 과정이 필수적이라는 사실이 밝혀졌다. 구체적으로 암세포로 형성된 종양이 직경 2 mm 이상의 크기로 성장을 하려면 산소와 영양분의 공급과 세포의 성장에 유해한 대사산물을 처리해 줄 수 있는 새로운혈관의 형성이 필수적인 것이고(Fidler, I. J. et al., Cell,79, 185 (1994)), 또한 암세포의 전이도 암세포나 정상적인 조직 세포에 의해 분비된 여러 가지 신 혈관형성 유도물질들에 의해 만들어진 새로운 모세혈관 망을 통해서 가속화 될 수 있다(Biood, C. H. et al., Biochim. Biophys. Acta.,1032, 89 (1990)).

암 치료에 있어 기존의 항암제나 치료법이 지닌 한계는 단일 종양 내에도 매우 다양한 암세포가 존재하며, 암세포는 정상 세포보다 빠른 돌연변이 속도와 성장 속도를 가지고 있어서 투여된 항암제들에 빠른 내성을 보인다는 것이다. 그러나 신 혈관형성 저해를 통한 암 치료방법은 암세포가 아닌 숙주의 정상 세포(혈관벽 세포)의 성장을 막기 때문에, 기존의 암치료법들이 갖는 한계의 원인이 된 암세포의 다양성과 항암제에 대한 암세포의 내성 형성 등의 문제점들을 극복할 수 있을 것으로 생각되며, 기존 암치료법 보다 신 혈관형성 저해를 통한 암 치료의 우수성은 여러 사람들의 동물시험 결과들이 뒷받침해 주고 있다(Burrows, F. J. et al., Pharmac. Ther.,64, 155 (1994)).

생체 내에서는 신 혈관형성 유도물질(angiogenic factor)과 억제물질(antiangiogenic factor)들이 공존하여 이들간의 평형에 의해 신 혈관형성이 정교하게 이루어지고 있으며, 현재까지 수십 종의 암세포와 연관된 신 혈관형성 관련 물질들이 알려져 있다. 그 중 VEGF은 강력한 신 혈관형성 유도 단백질의 하나로 저산소증(hypoxia)을 포함한 다양한 자극에 의해 발현이 유도되며, 이를 분비하는 인간 암세포들의 생체 내에서의 성장 및 전이에 필수적으로 요구된다는 것이 단일 항체를 이용한 실험을 통해 알려져 있다(Connolly, D. T. et al., J. Biol.Chem.264, 20017 (1989); Kim, K. J., et al., Nature362, 841 (1993)). VEGF은 혈관벽 세포에만 특이적으로 발현되는 수용체(KDR/Flk-1, Flt-1)를 통한 신호전달이 성장 호르몬으로서의 활성을 나타내는 데 필수적인 것으로 알려져 있다(Millauer, B. et al., Cell,72, 835 (1993), De Vries, C., et al., Science255, 989 (1992)). 이밖에도 VEGF이 신 혈관형성 과정에서 중심적인 역할을 할 것이라는 증거들이 계속 나오고 있다(Leung, D. W. et al., Science,246, 1306 (1989)).

따라서, VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하는 물질은 VEGF이 유도하는 신 혈관형성을 저해할 수 있을 뿐만 아니라, VEGF을 분비하는 암세포의 성장과 전이도 저해할 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 효과가 기대되는 VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하는 물질을 개발하기 위하여 연구한 결과, 화학적으로 합성된 펩티드 라이브러리(펩티드 무작위 서열 혼합물)로부터 분리된 1) 첫 번째, 네 번째, 여섯 번째 아미노산은 아르기닌이고; 2) 두 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘에서 선택되며; 3) 세 번째, 다섯 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신에서 선택된 여섯 개의 아미노산으로 구성된 서열을 포함하는 펩티드가, VEGF와 그 수용체간의 결합을 저해하여 VEGF의 활성을 저해하며, VEGF과 그 호르몬을 분비하는 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 저해한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신 혈관형성 및 암세포의 성장과 전이를 저해할 수 있는 VEGF 길항작용 펩티드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1a는 VEGF이¹²⁵I로 표지된 후에도 결합시간에 의존적으로 인간의 탯줄에서 유래한 혈관벽세포(human umbilical vein endothelial cell)에 결합함을 보여주는 것이고,

도 1b는 VEGF이¹²⁵I로 표지된 후에도 VEGF 농도에 의존적으로 인간의 탯줄에서 유래한 혈관벽세포에 결합함을 보여주는 것이고,

도 1c는 도 1b에서 얻은 결과를 스캐차드(Scatchard) 분석법을 통해 혈관벽 세포 표면에 두가지 종류의 수용체가 존재함을 확인한 것을 나타낸 것이고,

도 2는 펩티드 무작위 서열 혼합물을 이용하여 VEGF과 그 수용체간의 결합을 억제하는 펩티드를 찾기 위한 1차 검색의 결과이고,

도 3a는 1차 검색의 결과에 기초하여 합성한 첫 번째 2차 펩티드 라이브러리를 이용하여 VEGF의 활성 저해 정도를 조사한 결과이고,

도 3b는 첫 번째 2차 검색 결과에 기초하여 합성한 두 번째 2차 펩티드 라이브러리를 이용하여 VEGF의 활성 저해 정도를 조사한 결과이고,

도 4는 2차 검색에서 가장 효과적인 VEGF 저해활성을 보인 서열 혼합물을 C₁₈역상 칼럼으로 분리한 후, 다시 각각의 분리된 펩티드 혼합물이 VEGF과 그 수용체간의 결합을 어느 정도 저해하는지를 검색한 결과이고,

도 5는 본 발명에서 분리한 12가지 펩티드의 VEGF과 그 수용체간의 결합 저해능을 조사한 결과이고,

도 6은 본 발명의 펩티드 중 가장 활성이 우수한 3개의 펩티드들이 VEGF에 결합하는 정도가 과량의 VEGF에 의하여 저해되는 것을 보여주는 것이고,

도 7a은 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 펩티드가 VEGF이 유도하는 혈관벽 세포의 성장을 농도에 비례하게 저해하는 것을 나타낸 것이고,

도 7b는 과량의 펩티드를 처리하여 혈관벽 세포의 성장을 측정한 결과 세포의 성장저해가 펩티드의 직접적인 독성에 의해 일어난 것이 아니라는 것을 확인한 것이고,

도 8은 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 펩티드가 VEGF을 분비하는 인간 암세포가 유도하는 신 혈관형성을 저해하는 것을 나타낸 사진이고,

도 9는 본 발명의 펩티드가 인간 근육종 암세포의 성장에는 직접적인 영향을 미치지 않음을 보여주는 것이다.

본 발명은 1) 첫 번째, 네 번째, 여섯 번째 아미노산은 아르기닌이고; 2) 두 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘에서 선택되며; 3) 세 번째, 다섯 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신에서 선택된 여섯 개의 아미노산으로 구성된 서열을 포함하는 VEGF 길항작용 펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 VEGF 길항작용 펩티드를 항암제, 신 혈관형성 관련 질병치료제 등으로 사용하는 용도를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 VEGF 활성을 저해하는 새로운 펩티드를 분리하기 위하여, 우선 화학적으로 펩티드 무작위 서열 혼합물을 합성한다.

구체적으로 6개의 아미노산으로 연결된 펩티드를 합성하기 위해, 6개의 위치마다 18개의 아미노산이 각각 특정된 혼합물을 합성한다. 즉 특정된 위치에서 특정된 아미노산을 O라 표현하고 혼합물로 합성된 나머지 위치는 X로 표현하면, OX₂X₃X₄X₅X₆, X₁OX₃X₄X₅X₆등이 되어 총 108(6 × 18) 혼합물을 합성하였다.

상기 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 VEGF가 혈관벽 세포에 존재하는 자신의 수용체에 결합하는 활성을 가장 효과적으로 저해하는 펩티드 서열을 분리한다. 본 발명에서는 배양된 혈관벽 세포에 방사능 이온으로 표지된(labeled) VEGF 와 펩티드 무작위 서열 혼합물을 넣고 이들을 반응시키고 난 후, 결합하지 않은 VEGF는 제거하고 결합한 방사능의 양을 측정하여 혈관벽 세포에 존재하는 수용체에 결합한 VEGF의 양을 결정하였다. 그 결과 가장 최소의 농도로 VEGF가 자신의 수용체에 결합되는 활성을 저해한 펩티드 혼합물을 분리하였다.

상기와 같은 선별과정에 의하여 분리한 펩티드 혼합물은 각 위치마다 3-5개의 아미노산으로 특정되고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

1(N)	2	3	4	5	6
K	K	K	R	K	R
R	R	R	K	R	K
G	H	H	H	W	H
A	T	T			F
H	W	W			L

상기 1차 선별과정의 결과를 토대로 하여 하기 표 2에 나타난 바와 같이 카르복시 말단의 두 위치를 선택된 아미노산으로 고정시키고 펩티드 서열의 나머지 위치는 1차 선별과정에서 선택된 아미노산들이 동일 비율로 합성되게 하였다.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

1-N

K, R, G, A, H 의 혼합물K, R, H, T, W 의 혼합물K, R, W, G, S 의 혼합물R, K, H 의 혼합물

2

3

4

5

K

R

K

H

F

L

6-C

R

W

K

R

W

K

R

K

R

W

K

R

W

상기 표 2의 펩티드 혼합물로 다시 VEGF와 수용체의 결합을 저해하는 정도를 측정하고(도 3a 참조), 그 결과 분리된 펩티드의 서열을 결정한 결과 여섯 번째 위치에는 아르기닌과 히스티딘, 그리고 다섯 번째 위치에는 아르기닌과 라이신이 가장 효과적인 것으로 나타났다.

상기 두 번의 선별과정의 결과를 토대로 하여 하기 표 3에서와 같이 첫 번째, 네 번째, 그리고 여섯 번째 위치는 정해진 아미노산으로, 펩티드 서열의 나머지 세 위치는 상기 두 번의 선별과정에서 얻은 아미노산의 혼합물을 사용하여 펩티드 혼합물을 합성하였다.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

1-N

K

R

G

A

H

K

R

G

A

H

K

R

A

G

H

2

K, R, H, T, W 의 혼합물K, R, W, G, S 의 혼합물

3

4

R

K

H

5

K, R 의 혼합물

6-C

R

마찬가지로 VEGF의 활성을 가장 효과적으로 저해하는 펩티드를 분리한 결과, 첫 번째, 네 번째, 그리고 여섯 번째 위치 모두 아르기닌이 가장 효과적으로 VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하는 것으로 나타났다(도 3b 참조).

상기에서 분리된 펩티드 혼합물을 C₁₈역상 칼럼에서 다시 분리하여 VEGF와 수용체의 결합 저해능을 조사한 결과 첫 번째, 네 번째와 여섯 번째 위치에는 아르기닌이 가장 효과적이라는 사실을 확인하였으며, 두 번째 위치는 아르기닌, 라이신, 히스티딘이었으며, 세 번째 위치와 다섯 번째 위치는 아르기닌과 라이신임을 확인하였다(도 4 참조).

상기 아미노산으로 된 펩티드 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1(R)-N

R

2(K, R, H)

K

R

H

K

R

H

K

R

H

K

R

3(K, R)

K

R

K

R

4(R)

R

5(K, R)

K

R

H

6(R)-C

R

IC₅₀(㎛)

3.4

2.1

3.8

본 발명에서 분리한 상기 12개의 펩티드로 다시 한번 VEGF와 수용체의 결합 저해능을 조사한 결과, 서열 1의 펩티드(NH₂-Arg-Arg-Lys-Arg-Arg-Arg-CONH₂), 서열 2의 펩티드(NH₂-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg-CONH₂)그리고 서열 3의 펩티드(NH₂-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-CONH₂) 가 가장 강력한 VEGF 활성제해제임을 확인하였다.

상기한 펩티드가 VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하기 위해서는 여러 가지 가능한 기작이 있을 수 있으므로 구체적인 저해 메카니즘을 알아보기 위하여, 우선 검색된 펩티드들이 VEGF과 직접 결합하여 VEGF이 혈관벽 세포의 세포막 표면에 존재하는 수용체와의 결합을 저해하는지 확인하기 위하여, 펩티드와 혈관세포의 존재하에서 표지된 VEGF와 표지되지 않은 VEGF의 경쟁적 결합정도를 측정하였다. 그 결과 표지된 VEGF가 수용체에 결합하는 정도가 표지되지 않은 VEGF의 농도 및 첨가된 펩티드의 농도에 따라 감소하였으며 따라서 본 발명의 검색된 펩티드는 VEGF과 직접 결합한다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 펩티드가 VEGF에 의한 혈관벽 세포의 성장을 억제하는지 조사하기 위하여, 검색된 펩티드와 VEGF의 존재하에서 혈관벽 세포의 DNA 합성 정도를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 펩티드는 VEGF에 의해 유도되는 혈관벽 세포의 DNA 합성을 농도에 비례하여 저해하는 것으로 나타나, 결국 혈관벽 세포의 성장을 억제하는 활성이 있음을 확인하였다(도 7a 및 도 7b 참조).

또한 본 발명의 펩티드가 항-혈관형성 활성(anti-angiogenic activity)을 가지는지 조사하기 위하여, 달걀 CAM(chorioallantoic membrane)에 VEGF 와 본 발명 펩티드를 처리한 결과 VEGF에 의해 유도되는 신혈관 형성을 본 발명의 펩티드가 저해하는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 펩티드가 VEGF를 분비하는 암세포에 의해 유도되는 신혈관 형성을 억제하는지 조사하기 위하여 근육종 암세포에 의해 분비된 VEGF를 본 발명의 펩티드와 함께 달걀 CAM에 처리한 결과, 본 발명의 펩티드가 암세포에 의해 유도되는 신혈관 형성을 억제하는 것을 확인하였다(도 8 참조).

VEGF에 길항작용을 가지는 것으로 확인된 본 발명의 펩티드가 암세포의 성장을 직접적으로 억제하는지 알아보기 위하여, 인간 근육종 암세포를 배양하여 본 발명의 펩티드를 처리한 다음 일정시간후 세포의 생존률을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 펩티드가 직접적으로 암세포의 성장에 영향을 주는 것은 아님을 확인하였다(도 9 참조).

상기와 같은 여러 가지 실험을 통하여 본 발명의 펩티드는 암세포의 성장에는 직접적인 영향을 주는 것은 아니고, 암세포에 의해 유도되는 혈관형성을 특이적으로 저해하며 이는 본 발명의 펩티드가 암세포에 의해 분비되는 VEGF이 혈관벽 세포의 세포막 표면에 존재하는 수용체와 결합하는 것을 저해하는 것에 의한 결과라는 사실이 확인되었다.

따라서 본 발명의 펩티드는 VEGF가 그 수용체에 결합하는 것을 저해하는 효과가 우수하므로 효과적인 항암제 또는 당뇨성 실명증, 류마티스 관절염 등의 신 혈관형성과 관련된 질병의 치료제 등으로 사용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> ¹²⁵ I로 표지된 VEGF의 특성 규명

¹²⁵I로 표지된 VEGF을 실험에 사용하기 위해 먼저 이 표지된 단백질이 생체 내에 존재하는 단백질과 동일한 활성을 가지는지 조사하였다.

우선, 인간의 탯줄에서 유래한 혈관벽 세포(HUVE cell, Clonetics)를 배양 용기(gelatin-coated 100 mm dish, Falcon)에 넣고 혈관벽 세포용 배지(Medium 199 + 20% BCS, 5 ㎍/㎖ of heparin, 6 ㎍/㎖ of endothelial cell growth supplement, 5 ng/㎖ of basic Fibroblast Growth Factor)로 37℃ 동물세포용 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포가 가득 자라면 트립신/EDTA 용액을 처리하여 원심분리한 후 혈관벽 세포용 배지로 다시 섞은 다음 세포(5 × 10⁴cells/well, Clonetics)를 배양용기(24 well, Costar Co.)에 넣고 하루동안 키운 후¹²⁵I로 표지된 VEGF 0.2 ng이 들어 있는 배지(Medium 199/25 mM HEPES (pH 7.4)/ 0.1% bovine serum albumin)에 넣고 4 ℃에서 3시간동안 결합시키고 난 후, 결합하지 않은 표지된 VEGF을 제거하기 위해 위에서 사용한 배지와 0.1%의 알부민이 든 인산염 완충용액으로 각각 2번과 1번씩 씻어 주었다. 그 후, 혈관벽 세포에 존재하는 수용체에 결합한 표지된 VEGF의 양을 결정하기 위해 이 배양용기에 0.5 ㎖의 용해 용액(20 mM Tris-HCl (pH 7.4)/ 1% Triton X-100)을 상온에서 20분간 처리한 후 용해된 세포 혼합물을 γ-카운터(Counter)를 이용하여 결합한 방사능의 양을 측정하였다. 비특이적 결합(non-specific binding)은 표지된 VEGF과 표지되지 않은 VEGF의 몰비가 1 : 100이 되게 같이 배양하여 결정하였으며, 이것을 음의 대조군으로 사용하였다.

도 1a 및 도 1b에서 나타난 결과에 의하면 표지된 VEGF(1 ng/㎖)과 인간의 탯줄에서 유래한 혈관벽 세포(5 × 10⁴cells/well)의 세포막 표면에 존재하는 VEGF수용체간의 결합이 결합시간과 표지된 VEGF 농도에 의존적이었으므로 이는 둘간의 상호작용이 특이적이라는 것을 보여주는 것이다.

도 1b에서 얻은 결과를 스캐차드(Scatchard) 분석법을 통해 혈관벽 세포 표면에 두가지 종류의 수용체가 존재함을 확인하였다(도 1c). 이 두가지 수용체 중의 하나는 결합력(KD)이 3 pM이며, 한 세포당 약 2000개가 존재하며, 다른 하나는 결합력(KD)이 50 pM이며 한 세포당 약 6000개가 존재하는 것으로 나타났다. 이상의 결과가 기존의 여러 사람들에 의해 보고된 바와 일치함을 확인하였다(Myoken, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 5819 (1991); Bikfalvi, A. et al., J. Cell Physiol.149, 50 (1991)).

<실시예 2> 펩티드 무작위 서열 혼합물에서 VEGF 길항작용 펩티드 서열 검색

(단계 1) 펩티드 무작위 서열 혼합물의 제조

펩티드 무작위 서열 혼합물은 다음과 같이 합성하였다(Pinilla, C. et al., Bio Techniques 13:901-905, 1992).

6개의 아미노산으로 연결된 펩티드를 합성할 때 특정 위치를 이미 아는 아미노산으로 정하고 나머지 5개의 위치는 씨스틴과 트립토판을 제외한 18개의 아미노산의 혼합물로 연결하였다. 즉, 아는 아미노산으로 정해진 위치를 O라 표현하고 혼합물로 합성된 나머지 위치는 X로 표현하면, OX₂X₃X₄X₅X₆, X₁OX₃X₄X₅X₆등이 되어 6개의 위치마다 18개의 이미 아는 아미노산으로 정해진 혼합물을 만들었다. 따라서 총 108(6 × 18) 혼합물이 만들어졌다.

(단계 2) 1차 펩티드 서열 검색

펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 VEGF과 그 수용체가 결합하는 펩티드를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

인간 탯줄에서 유래한 혈관벽 세포(5 × 10⁴cells/well, Clonetics)를 배양용기(24 well Costar Co.)에 넣고 하루동안 키운 후¹²⁵I로 표지된 VEGF 0.2 ng과 여러 농도의 펩티드나 펩티드 서열 혼합물이 들어 있는 배지(Medium 199/25 mM HEPES(pH 7.4)/0.1% bovine serum albumin)에 넣고 4 ℃에서 3시간동안 결합시키고 난 후, 결합하지 않은 표지된 VEGF을 제거하기 위해 위에서 사용한 배지와 0.1%의 알부민이 든 인산염 완충용액으로 각각 2번과 1번씩 씻어 주었다. 그 후, 혈관벽 세포에 존재하는 수용체에 결합한 표지된 VEGF의 양을 결정하기 위해 이 배양용기에 0.5 ㎖의 용해 용액(20 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1% Triton X-100)을 상온에서 20분간 처리한 후 용해된 세포 혼합물을 γ-카운터를 이용하여 결합한 방사능의 양을 측정하였다.

도 2는 0.33 nM/펩티드 서열의 농도로 펩티드 무작위 서열 혼합물을 사용하여 실시한 1차 선별과정의 결과이다. 이 결과에 기초하여 상기 표 1에 표시된 바와 같이 각 위치마다 3-5개의 아미노산을 선택하였으며, 펩티드 서열의 모든 위치에서 라이신과 아르기닌이 혈관벽 세포 성장 호르몬의 활성에 대한 길항능이 가장 탁월한 것으로 나타났다.

(단계 3) 2차 펩티드 서열 검색

1차 선별과정의 결과를 토대로 하여 두 번의 2차 혼합물을 상기 표 2와 같이합성하여 혈관벽 세포 성장 호르몬과 그 수용체간의 결합을 저해하는 정도를 조사하여 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 첫 번째 2차 라이브러리의 합성을 위해 카르복시 말단의 두 위치를 선택된 아미노산으로 고정시키고 펩티드 서열의 나머지 위치는 2차 선별과정에서 선택된 아미노산들이 동일 비율로 합성되게 하였다. 이 첫 번째 2차 라이브러리에는 15개의 펩티드 혼합물이 있으며, 각 혼합물은 375가지의 펩티드 서열을 가진 혼합물로 구성되어 있다.

1차 검색과정과 동일한 방법으로 이 첫 번째 2차 라이브러리의 다양한 농도(0.01, 0.05, 0.1, 1 μM/sequence)에서 VEGF의 활성 저해 정도를 조사하였으며, 그 중 0.1 μM/서열의 결과를 도 3a에 나타내었다. VEGF의 활성을 가장 효과적으로 저해하는 펩티드의 서열은 여섯 번째 위치에는 아르기닌과 히스티딘, 그리고 다섯 번째 위치에는 아르기닌과 라이신이 가장 효과적인 것으로 나타났다.

상기 두 번의 선별과정의 결과를 토대로 하여 두 번째 2차 라이브러리를 만들기 위해, 아미노 말단에서부터 첫 번째, 네 번째, 그리고 여섯 번째 위치는 정해진 아미노산으로, 펩티드 서열의 나머지 세 위치는 상기 두 번의 선별과정에서 얻은 아미노산의 혼합물을 사용하였다(표 3 참조).

두 번째 2차 라이브러리도 역시 15개의 펩티드 혼합물을 가지고 있으며, 각 혼합물은 50가지의 펩티드 서열로 구성되어 있다. 각 혼합물의 활성을 여러 농도(0.1, 0.25, 1 μM/sequence)로 검색하였으며, 그중 0.25 μM/서열의 결과를 도 3b에 나타내었다.

그 결과 첫 번째, 네 번째, 그리고 여섯 번째 위치 모두 아르기닌이 가장 효과적으로 VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하는 것을 알 수 있었다.

(단계 4) 펩티드 서열의 분리

두 번째 2차 라이브러리에서 선별된 가장 효과적인 펩티드 혼합물을 C₁₈역상 칼럼에서 서로 다른 머무름 시간을 가지고 분리되는 6개의 혼합물로 다시 분리하였으며, 다시 이 여섯가지의 혼합물의 다양한 농도(0.5, 1, 2, 5, 10, 25 μM/peptide)에서 VEGF와 그 수용체간의 결합에 미치는 영향을 조사하였다(도 4).

그 결과 1번 혼합물이 가장 높은 활성을 보였으며, 이 혼합물이 UV₂₈₀에서 흡광도를 보이지 않아 트립토판이 포함되어 있지 않은 것을 확인하였고, 아미노산 조성 분석에서 아르기닌, 라이신과 히스티딘이 존재함을 확인하였다.

지금까지의 여러번의 검색결과 VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해할 수 있는 6개의 아미노산으로 구성된 펩티드에서 첫 번째, 네 번째와 여섯 번째 위치에는 아르기닌이 가장 효과적이라는 사실을 확인하였으며, 두 번째 위치(아르기닌, 라이신과 히스티딘), 세 번째 위치(라이신과 아르기닌) 그리고 다섯 번째 위치(아르기닌과 라이신)들은 2-3개의 아미노산들로 범위를 좁힐 수 있었다.

상기 세 위치가 고정된 아미노산들의 조합인 12개의 펩티드를 상기 표 4와 같이 합성하여, C₁₈역상 칼럼으로 각 펩티드를 순수 분리하였다.

(단계 5) 3차 펩티드 서열 검색

아미노산 조성 분석을 통해 각 펩티드의 서열의 간접적으로 확인하고, 농도를 결정하고 난 후, 이 12개의 펩티드들의 VEGF에 대한 길항작용을 다양한 농도(1, 4, 10, 20 μM/sequence)에서 검정하였다(도 5).

그 결과 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 3개의 펩티드들이 VEGF이 그 수용체에 결합하는 것을 가장 효과적으로 저해함을 확인하였고, 그 각각의 IC₅₀값은 2, 3.4와 3.8 μM/서열이었다.

<실시예 3> 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 검색된 펩티드들의 특성 연구

VEGF과 그 수용체간의 결합을 저해하기 위해서는 여러 가지 가능한 기작이 있을 수 있다. 예를들면, 직접 VEGF이나 그 수용체중 어느 하나와 결합하여 둘간의 상호작용을 막을 수 있다.

검색된 펩티드들이 VEGF과 직접 결합하여 VEGF이 혈관벽 세포의 세포막 표면에 존재하는 수용체와의 결합을 저해한다는 것을 증명하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 상기 실시예 2의 단계 5에서 검색하고 합성 정제한 여섯 개의 아미노산으로 구성된 각 펩티드를 20% 초산 용액에 녹인 후 공기 중에서 말리는 방법으로 96 웰 엘리자 용기에 고정(100 ng/well)시키고, 0.1%의 알부민이 든 인산염 완충액으로 상온에서 3분간 3회 처리하고 난 후, 앞서 사용한 인산염 완충용액에¹²⁵I로 표지된 VEGF(0.2 ng/well)을 넣어 고정된 펩티드와 37 ℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 결합되지 않은 표지된 VEGF을 앞서 사용한 인산염 완충 용액으로 상온에서 3분간 4회 씻어낸 다음 ν-카운터로 결합한 방사능의 양을 측정하였다. 비특이적 결합(non-specific binding)은 표지된 VEGF과 표지되지 않은 VEGF의 몰비, 혹은 고정된 펩티드와 결합용액에 넣어준 고정되지 않은 펩티드의 몰비가 1 : 100이 되게 같이 배양하여 결정하였으며, 이것을 음의 대조군으로 사용하였다.

그 결과 도 6에 나타난 것처럼, 표지된 VEGF은 고정된 펩티드와 직접 결합하였으며, 이 상호작용은 과량의 표지되지 않은 VEGF이나 용액상태의 펩티드를 결합용액에 첨가함으로서 완전히 제거됨을 알 수 있었다. VEGF과 각 펩티드간의 결합력(KD)은 IC₅₀값을 이용한 하기 식을 이용하여 구하였다(De Blasi, A. et al., Trends Pharmacol. Sci.,10, 227 (1989)).

KD = IC₅₀- [표지되지 않은 경쟁제] .

상기 식을 이용하여 결정된 결합력(KD)은 서열 1, 서열 2, 서열 3의 펩티드 에 대해서 각각 5, 2 그리고 22 μM 이었다. 이 결과에 의하면 펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 검색된 3가지 펩티드들은 모두 VEGF과 직접적으로 또 특이적으로 결합함을 알 수 있다.

<실시예 4> 3차 검색에 의한 펩티드들이 가지는 VEGF에 의한 혈관벽 세포 성장의 억제능력 검정

펩티드 무작위 서열 혼합물로부터 검색된 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 펩티드들이 인간의 탯줄에서 유래한 혈관벽 세포에서 VEGF이 유도하는 DNA 합성을 억제하는지를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

젤라틴이 고정된 배양용기(48 well, Nunc)에 혈관벽 세포(10⁴cells/well)를 넣어 37 ℃에서 하루간 배양한 다음 혈청이 들어있지 않은 배지(serum-free medium 199)로 3회 씻어준 뒤 VEGF(10 ng/㎖)과 다양한 농도의 검색된 펩티드가 들어있는 배양용액을 가한 후 37 ℃에서 배양하였다. 24시간 후 삼중수소로 표지된 티미딘([methyl-³H]thymidine, 0.5 μCi/well)을 가한 후 다시 하루간 배양하였다. 이를 0.1%의 알부민이 든 인산염 완충액으로 씻은 후 0.4N NaOH로 상온에서 20분간 세포를 용해시키고 2N NCl로 중화시킨 다음 DNA 합성에 이용된 방사능의 양을 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)로 측정하였다. 검색된 펩티드의 독성을 조사하기 위해 과량의 각 펩티드(100 μM)를 VEGF이 없는 상태에서 위와 동일한 과정으로 실험을 실시하였다.

그 결과 도 7a에서 알 수 있는 것처럼 검색된 펩티드는 모두 VEGF에 의해 유도되는 혈관벽 세포의 DNA 합성을 농도에 비례하게 저해하고 IC₅₀값은 10 ∼ 20μM이었다.

또한, 과량의 펩티드(100 μM)를 처리해 동일한 실험을 했을 때 혈관벽 세포의 성장에 영향이 없는 것을 확인함으로써 이런 DNA 합성 저해 현상이 혈관벽 세포에 대한 검색된 펩티드의 직접적인 독성에 의해 일어난 것이 아니라는 것도 알 수 있었다(도 7b).

이상의 실험결과에 의거하여 우리는 3가지의 검색된 펩티드가 VEGF에 의한 혈관벽 세포의 성장 유도를 특이적으로 저해하는 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 검색된 펩티드들의 VEGF이나 이를 분비하는 인간 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성 억제능력 검정

본 발명의 펩티드의 항-혈관형성 활성(anti-angiogenic activity)을 검정하기 위하여, 달걀 CAM(chorioallantoic membrane)을 이용해서 이들이 VEGF에 의해 유도되는 신혈관 형성을 억제하는지 여부를 조사하는 실험을 실시하였다.

유정란(풀무원)을 90%의 습도가 유지되는 37 ℃ 배양기에 넣고 배양시켰다. 3일 후에 2 ㎖ 정도의 알부민을 제거하고 4일 후에 달걀 껍질의 일부를 제거해 2 cm × 2 cm 정도의 창을 만들었다.

VEGF(10 ng)과 다양한 양의 펩티드나 다른 시료를 섞은 후에 3 ㎕를 1/4 조각의 더마녹스 커버슬립(Thermanox coverslip, Nunc)에 점적하여 말린 후 상기 9일배 달걀의 CAM에 얹었다.

이틀 후에 점적된 샘플로 이해 유도되는 혈관이 있는지 여부를 해부 현미경하에서 두 사람이 서로 무관하게 결정하였다. 실험은 각각의 샘플당 10여개의 달걀을 이용해 3회 이상 반복 실시하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료	양성 반응 달걀 수/총 달걀 수	양성 반응(%)	P^a
물	3/28	10.8(1.4)^b
VEGF(10 ng)	9/27	33.6(3.8)	0.004
VEGF + RRKRRR(1 ㎍)	4/26	15.6(5.1)	0.245
VEGF + RKKRKR (1 ㎍)	4/26	15.6(4.5)	0.271
VEGF + RRRRRR (1 ㎍)	4/26	15.6(5.1)	0.245
VEGF + KKKKKK (1 ㎍)	8/25	32.6(12.2)	0.038
VEGF + 프로타민(50 ㎍)	5/26	18.8(4.1)	0.128

신 혈관형성을 확인할 수 있는 이 생체 모델 실험에서 VEGF은 신 혈관형성을 유도하는 전형적인 "수레바퀴(spokewheel)" 구조를 보여주었다. 이러한 신 혈관형성은 검색된 펩티드(1 ㎍/egg)나 항-혈관형성 인자(anti-angiogenic factor)로 알려진 프로타민(protamine, 50 ㎍/egg)을 VEGF과 동시에 처리하였을 때 완전히 저해되었다. 하지만, 본 발명에서 검색된 펩티드와 비슷한 성질을 가지고 있지만 검색에서 선택되지 않은 대조군 펩티드(KKKKKK)는 검색된 펩티드가 가지는 항-혈관형성 활성을 보이지 않았다.

상기 실험과 도 7b의 결과를 종합하면, 검색된 펩티드는 혈관벽 세포의 성장에는 직접적인 영향을 주지 않고, 넣어준 VEGF이 혈관벽 세포에 존재하는 그 수용체와 결합하는 것을 막음으로써 VEGF이 유도하는 신 혈관형성을 억제함을 알 수 있다.

검색된 펩티드가 VEGF을 분비하는 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 억제함을 달걀 CAM을 이용한 동일한 실험을 통해 확인하였다. 앞서 행한 실험과 같은 방법으로 수정란을 구입해 알부민을 제거하고 창을 만들었다. 10⁵개의 인간 근육종 암세포(HT1080, human fibrosarcoma)와 7.5 ㎍의 Type I 콜라젠(Rat tail, Beckton Dickinson, USA)을 5 ㎕의 부피에 섞어 이를 1/4 조각의 더마녹스 커버슬립에 점적해 상온에서 콜라젠 스폰지를 만들었다. 이 콜라젠 스폰지를 10일 배의 달걀 CAM 위에 얹은 후 3일간 38 ℃에서 배양하여 암세포에 의해 유도되는 혈관을 상기와 같은 방법으로 확인하고 사진을 찍었다(표 6 및 도 8 참조).

시료	양성 반응 달걀 수/총 달걀 수	양성 반응(%)	P^a
세포 없슴	5/27	18.5(2.1)
암세포만	18/24	76.0(8.5)	0.011
암세포 + RRKRRR (0.1 ㎍)	8/22	36.0(8.5)	0.160
암세포 + RKKRKR (0.1 ㎍)	10/23	43.0(9.9)	0.141
암세포 + RRRRRR (0.1 ㎍)	10/24	41.0(7.1)	0.098
암세포 + KKKKKK (0.1 ㎍)	14/22	59.0(1.4)	0.002

그 결과 VEGF을 분비하는 인간 근육종 암세포도 달걀 CAM에서 배양하였을 때 전형적인 "수레바퀴(spokewheel)" 구조를 보였으며(10⁵cells/egg, 76%), 검색된 펩티드(100 ng/egg, 36 ∼ 43%)를 암세포와 동시에 처리하였을 때 신 혈관형성이 저해되었다. 하지만, 위에서 사용한 대조군 펩티드는 암세포와 동시에 처리하였을 때 통계적으로 유의미한 정도의 저해활성을 보이지 않았다(100 ng/well, 59%).

<실시예 6> 검색된 펩티드가 인간 근육종 암세포의 성장에 미치는 직접적 영향 검정

VEGF의 길항작용 펩티드들이 인간 근육종 암세포의 성장에 직접적인 영향이 있는지 여부를 다음과 같은 실험을 통해 알아보았다. 인간 근육종 암세포(5 × 10³cells/well)를 배양용기(96 well, Nunc)에 넣고 하루간 배양한 후 여러 농도의 검색된 펩티드가 들어 있는 배지(DMEM)를 가하여 배양하였다. 3일 후에 살아 있는 세포의 수를 20 ㎕ 테트라졸리움 염색약(Cell Titer 96 Non-Radioactive Proliferation assay kit, Promega)을 가하여 37 ℃에서 4시간 배양한 후, 살아 있는 세포에 의해 생성된 포마잔 양을 0.2 ㎖의 용해 용액을 넣어 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 용해된 포마잔에 의한 흡광도는 살아 이는 세포 수에 비례한다.

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이 검색된 펩티드 모두는 10^-4M의 농도에서도 인간 근육종 암세포의 성장에 영향을 주지 않았다.

본 실험과 상기 실시예 5에서 관찰된 결과들은 검색된 펩티드가 인간 근육종 암세포의 성장에는 직접적인 영향을 주지 않지만 인간 근육종 암세포에 의해 유도되는 혈관형성을 특이적으로 저해함을 보여주고 있으며, 이는 검색된 펩티드가 인간 근육종 암세포에 의해 분비되는 VEGF이 혈관벽 세포의 세포막 표면에 존재하는 수용체와 결합하는 것을 저해함으로써 인간 근육종 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 억제하고 있음을 보여주고 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 펩티드는 VEGF과 혈관벽 세포에 존재하는 그 수용체간의 결합을 저해하고, VEGF의 활성을 저해하며, VEGF과 그 호르몬을 분비하는 암세포에 의해 유도되는 신 혈관형성을 저해한다. 따라서 본 발명의 펩티드는 당뇨성 실명증과 류마티스 관절염을 포함한 신 혈관형성과 관련된 질병의치료제, 항암제로 유용하게 이용될 수 있고, 또한 본 발명의 펩티드를 이용한 암 치료방법은 암세포가 아닌 숙주의 정상 세포(혈관벽 세포)의 성장을 막기 때문에, 기존의 암치료법들이 갖는 한계의 원인이 된 암세포의 다양성과 항암제에 대한 암세포의 내성 형성 등의 문제점들을 극복하는 탁월한 방법이 된다.

〔서열목록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 6

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

[서열 1]

〔서열목록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 6

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

[서열 2]

〔서열목록〕

서열번호 : 3

서열의 길이 : 6

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩티드

[서열 3]

Claims

1) 첫 번째, 네 번째, 여섯 번째 아미노산은 아르기닌이고; 2)두 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘에서 선택되며; 3) 세 번째, 다섯 번째 아미노산은 아르기닌, 라이신에서 선택된 여섯 개의 아미노산으로 구성된 서열을 포함하는 혈관벽세포 성장호르몬 활성억제 펩티드.

제 1항에 있어서, 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.

제 1항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.

제 1항에 있어서, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.