KR20050034749A - 세포 표본에서 암을 진단하고 혈관형성 활성을 모니터하기위한 ａｃ133의 정량적 ｒｔ-ｐｃｒ - Google Patents

Abstract

본 발명은 마커로서 AC133을 확인하기 위해 정량적 RT-PCR의 사용을 포함한다. AC133은 혈관형성에서 중요한 세포인 내피 전구세포(EPC)상에서 우세하다. 따라서, 본 발명은 피검체에서 EPC의 양을 확인하고, 예를 들어 손상된 조직 및 암의 발생 및 진행에서 혈관형성을 진단하고 모니터하는데 적용된다.

Description

세포 표본에서 암을 진단하고 혈관형성 활성을 모니터하기 위한 ＡＣ133의 정량적 ＲＴ-ＰＣＲ{Quantitative RT-PCR to AC133 to diagnose cancer and monitor angiogenic activity in a cell sample}

본 발명은 2002년 8월 28일자로 출원된 계류중인 미국 가특허원 제60/406,535호 및 2003년 7월 11일자로 출원된 미국 특허원 제10/618,102호에 대한 우선권을 주장하고 있다. 이들 문헌의 전문은 권리에 대한 포기없이 구체적으로 본원에서 인용된다.

1. 발명의 분야

본 발명은 암 생물학 및 핵산 생화학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 혈관형성 활성의 지표인 특정 유전자 산물을 증폭시키고 정량함으로써 암을 진단하고 혈관형성 활성을 모니터하는 신규한 방법을 제공한다.

2. 관련 기술의 설명

암 및 기타 암 이외의 질환에서 40개가 넘는 표적 항혈관형성 제제가 제I상, 제II상 및 제III상 임상시험에 도입되어졌다. 세포독성 제제는 또한 항혈관형성 활성이 있다. 다수의 선도적인 항혈관형성 제제가 동물 모델에서는 주목할만한 성과를 거두었음에도 불구하고 이의 임상 결과는 실망스러웠다[참조문헌: Mundhenke et al., 2001]. 최근에서야 무작위적으로 실시된 제III상 연구가, 전이 직장결장암 환자에서 5-FU, 류코보린, 이리노테칸(IFL)에 항VEGF 항체인 베바세주마브를 가하면 IFL 단독만을 사용한 환자에 비해 종양 반응 속도, 종양 진행 시간 및 전체 생존자 면에서 개선된다는 것을 최초로 밝혀내었다[참조문헌: Hurvitz et al., 2003]. 따라서, 규정된 대용법을 이용하여 항혈관형성 표적 반응을 모니터하고 유효성을 확인하는 것이 임상적으로 가장 중요할 것이다[참조문헌: Mundhenke et al., 2001; Folkman et al., 2001]. 현재 사용되고 있는 다수의 기술들은 비실용적이고 조직을 손상시키며 비경제적이다.

가장 널리 사용되는 혈관형성 대용법인 미세혈관 밀도 분석(Microvessel density assay; MVD)은 종양내에 분포되어 있는 CD34+ 내피세포의 밀도를 산출하여 정량한다[참조문헌: Byrne and Bundred, 2000]. 그러나 MVD는 종양 조직내 미세혈관을 직접 평가해야하기 때문에 임상에 사용하기에는 여러가지 실용적 및 이론적 한계가 있다. 따라서, MVD는 침습적이며 연속 측정하는데는 적합하지 못하다. 또한 미세혈관 밀도는 정착된 종양 덩어리의 중심에서 보다 주변에서 훨씬 더 높기 때문에 종양 혈관형성은 매우 불균일하다. 또한, MVD는 혈관형성 사이토카인의 전신적 효과, 및 보다 중요하게는 내피 전구세포를 간과한다.

혈관형성은 종양의 혈관 공용(cooption) 뿐만 아니라 활성 혈관형성 부위로 골수 유래된 내피 전구세포(EPC)의 이동 및 활성화, 점차 인지되는 생후 혈관형성의 주요 특징 및 MVD 분석이 평가하지 못하는 특징을 통해서도 일어난다[참조문헌: Asahara et al., 1999]. 따라서, EPC는 실행가능한 혈관형성 대용으로서, 모노클로날 항체를 이용하는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 기술을 사용하여 정량할 수 있다.

그러나, FACS 과정은 제한이 많다. 예를 들어, EPC가 저농도로 발견되고 또한 분리하는 동안에 수율이 낮아지기 때문에, FACS 분석은 분석당 50 내지 100㎖의 혈액이 필요하다. 연속적으로 측정할 필요가 있는 경우에 이 방법은 상당히 부담스러울 수 있다. 분리 과정 동안에 EPC가 종종 아폽토시스(apoptosis)을 당하여, 회수율이 더욱 낮아지는 것으로 여겨지고 있기 때문에, FACS는 가변성이 크며 수율 및 EPC의 생존률이 불량할 수 있다. 또한, FACS 과정은 불편하며 고가의 FACS 분류기와 기기를 작동시키는 숙련된 기술자를 필요로 한다.

따라서, 임상적으로 사용하기 위해서는 다음의 조건을 충족하는 항혈관형성 대용 마커가 요구된다: (1) 비-침습적이며, 입수가 용이하고, 재현가능해야 한다; (2) 연속 측정에 적합해야하며 경제적이어야 한다; (3) 가장 중요하게는, 내재하는 종양 혈관형성 활성을 반영할 수 있어야 한다[참조문헌: Byrne and Bundred, 2000].

발명의 요약

본 발명은 혈관형성을 활성화시키는 암 또는 염증 상태에 기인한 내재하는 혈관형성 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계; (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계; (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 RNA상에서 정량적 PCR을 실시하는 단계; 및 (d) 암 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물의 양과 암이 없는 피검체의 세포중 증폭 산물의 양을 비교하는 단계를 포함하여, 피검체에서 암을 진단하는 방법을 제공하는데, 이때 암 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물의 양이 암이 없는 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물의 양보다 증가하면 피검체에 암이 있다는 것을 나타낸다. 정량적 PCR은 반-정량 또는 완전 정량법일 수 있다. 이 방법을 사용하면 암의 기본적인 혈관형성 활성을 알 수 있다.

특정 양태에서, 본 방법은 직장결장암, 방광암, 난소암, 고환암, 유방암, 피부암, 폐암, 췌장암, 위암, 식도암, 뇌암, 백혈병, 간암, 자궁내막암, 전립선암 및 머리와 목의 암을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는 암을 진단하는데 사용할 수 있다. 다른 특정 양태에서, 암은 비-상피세포암이다. 보다 특별한 양태에서, 비-상피세포암으로는 골 육종, 연조직 육종 또는 위장관 기질종양이 있다.

본 발명의 한가지 양태에서, 세포는 단핵이다. 다른 구체적인 양태에서, 세포는 이전에 암이 있는 것으로 진단받은 사람 환자로부터 분리시킨다. 다른 양태에서, 표본은 말초 순환계로부터 채취한 혈액이다.

본 발명의 다른 구체적인 양태에서, 정방향 프라이머는 DNA 서열 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'(서열 번호 1)로 구성되어 있다. 본 발명의 또다른 구체적인 양태에서, 역방향 프라이머는 DNA 서열 5'- tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'(서열 번호 2)로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 양태에서, AC133 증폭 산물의 증가는 종양 부하를 추가로 예측한다. 본 발명의 다른 양태에서, AC133 증폭 산물의 증가는 종양 재발을 추가로 예측한다. 본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명은 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물량의 증가를 토대로 하여 치료를 결정함을 포함한다.

본 발명의 특정 양태에서, 본 방법은 피검체의 암을 치료함을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 또다른 구체적인 양태는 방사능치료법, 면역치료법, 화학치료법, 호르몬치료법 또는 유전자치료법을 이용하여 피검체를 치료하는 것이다 또한 본 방법은 방사능치료법, 면역치료법, 화학치료법, 호르몬치료법 또는 유전자치료법을 포함한 암 치료법의 혈관형성 효과를 모니터함을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계; (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계; 및 (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 실시하는 단계를 포함하여, 표본에서 내피 전구세포를 정량하는 방법을 포함하는데, 이때 표본의 세포중 AC133 증폭 산물의 양을 표준 곡선과 비교하면 표본중 내피 전구세포의 총량을 추정할 수 있다. 구체적인 양태에서, 표준 곡선은 공지된 양의 골수 유래 내피 전구세포를 연속적으로 희석시켜 유도한다. 본 발명의 구체적인 양태에서, 측정 정확도는 99%이다. 본 발명의 또다른 양태에서, 검출 한계는 100만개 세포당 1개의 내피 전구세포이다.

또한 본 발명은 (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계; (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계; (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 RNA상에서 정량적 PCR^TM을 실시하는 단계; 및 (d) 피검체 세포중 혈관형성 활성의 지표인 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물의 양을 평가하는 단계를 포함하여, 피검체의 세포중 혈관형성 활성을 모니터하는 방법을 제공한다. 본 발명의 구체적인 양태에서, 표본은 말초 순환계로부터 채취한 혈액이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 순환하는 내피세포의 양을 평가함을 포함한다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 또한 표본중 VEGF 수준을 평가함을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 피검체의 혈관형성 프로필을 발달시킴을 포함한다.

본 발명의 구체적인 양태에서, 본 발명은 혈관 손상, 자가면역 질환, 심근경색 또는 패혈증의 유무를 검출하는데 사용한다. 본 발명의 다른 양태에서는, 항혈관형성 치료제를 환자에게 미리 투여하고 항혈관형성 치료제의 효능을 평가함을 포함한다.

청구항을 포함한 본 발명의 전문에서, "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단수형 접미사는 "하나 이상"을 의미한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 후술하는 상세한 설명에서 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시적인 것으므로, 당분야의 숙련가라면 본 발명의 상세한 설명으로부터 본 발명의 요지 및 범주내에서 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것을 익히 알 것이다.

하기의 도면은 본 발명의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함시킨 것이다. 본 발명은 본원에서 제시한 구체적인 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 하기 도면을 참고로 하여 보다 잘 이해될 것이다.

도 1은 AC133의 PCR^TM이다. 단핵세포는 피콜-팍(Ficoll-Paque; Pharmacia Biotech) 과정에 의해 말초혈로부터 분리되었다. RNA는 트리졸(Trizol) 시약(Gibco Life Technologies)을 사용하여 추출하고 이의 농도를 측정하였다. AC133 유전자 전사체의 증폭은 제조자 지시사항에 따라 RT-PCR 키트(Invitrogene, San Diego, CA)를 사용하여 실시하였다. 스크리닝을 통해, 실험에 사용되는 PCR^TM 프라이머 서열은 정방향 프라이머 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'(서열 번호 1) 및 역방향 프라이머 5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'(서열 번호 2)이였다. 예상된 PCR^TM 산물은 서열이 확인된 670bp이였다. 프라이머는 진뱅크(GeneBank) ID가 AF027208인 AC133 유전자 서열을 기본으로 하여 디자인하였다. β-액틴에 대한 정량적 PCR^TM을 추가 대조군으로서 실시하였다. 환자 1 및 2는 전이 질환이 있었으며 환자 3은 3주전에 Duke C 암을 절제하였다.

도 2에서 VEGF 및 bFGF 수준은 정상 대조군에 비해 암환자에서 유의하게 증가하였다.

도 3은 AC133(CD133) 마커를 발현하는 CD34+ 세포의 생존률을 나타낸 것이다.

도 4에서 RT-PCR은 환자 표본중 AC133의 상승된 수준을 나타낸다. 내인성 참조(GAPDPH)에 대해 표준화되고 눈금측정기에 대해 상대적인 표적의 양은 △△C_t 방법에 의해 정의한다.

도 5는 정량적 PCR(Q-RT-PCR)의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다. CRC 환자 표본에서, 활동 또는 비활동 질환 상태를 구별하는 추정된 CD133 역치는 0.017로 나타나며, 이때 곡선 아래 영역(AUC)은 81%이다. 표본 크기(n=50).

암은 많이 연구된 질환의 선두로 올라섰기 때문에, 암을 검출하고/하거나 진단하고 항혈관형성 치료제의 유효성을 모니터하기 위해 실용적이고 비-침습적이며 경제적인 방법을 개발할 필요가 증가되고 있다. 전이성 결장직장암이 있는 환자에서 항혈관형성 치료법의 이용이 입증된 바 있다. 또한 다수의 빈번한 측정이 실시되어야 하는 경우에 특정 방법의 비용과 침습도를 고려한다면, 항혈관형성 치료법을 연속적으로 실시할 필요가 증가되고 있다. 미세혈관 밀도 분석(MVD)과 같이 혈관형성 활성을 모니터하는데 유용한 방법은 종양 조직내 미세혈관을 직접 평가해야하기 때문에 임상에 사용하기에는 여러가지 실용적 및 이론적 한계가 있다.

혈관형성은 종양의 혈관 공용 뿐만 아니라 활성 혈관형성 부위로 골수 유래된 내피 전구세포(EPC)의 이동 및 활성화, 및 MVD 분석이 평가하지 못하는 특징을 통해 일어난다. 따라서, EPC는 실행가능한 혈관형성 대용으로서, AC133에 대한 모노클로날 항체를 이용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 정량될 수 있다. 그러나, FACS 과정은 제한이 많다. 예를 들어, EPC가 저농도로 발견되고 또한 분리 과정 동안 수율이 낮아지기 때문에, FACS 분석은 분석당 50 내지 100㎖의 혈액이 필요하다. 연속적으로 측정할 필요가 있는 경우에 이 방법은 상당히 부담스러울 수 있다. 분리 과정 동안에 EPC가 종종 아폽토시스를 당하여 회수율이 더욱 낮아지는 것으로 여겨지고 있기 때문에, FACS는 가변성이 크며 수율 및 EPC의 생존률이 불량할 수 있다. 또한, FACS 분류는 매우 불편하며 비용이 많이 든다.

따라서, 현재의 혈관형성 활성을 모니터하기 위한 각 방법들은 상당한 한계를 갖는다.

A. 본 발명

본 발명은, 사람의 말초혈중 EPC를 검출하고 정량하기 위해 1단계의 매우 민감하지만 특이적이며 정량적인 방법을 제공한다. AC133은 EPC에 대해 매우 특이적이며 기능이 정의되지 않은 당단백질이며, 피검체의 말초혈 표본중 0.1 내지 0.5%로 존재한다. AC133이 EPC에 대해 매우 특이적이기 때문에, 세포 표본중 AC133 유전자 산물을 특이적으로 증폭시키는 RT-PCR을 사용하여 표본중 EPC의 수를 추정할 수 있다. 이러한 EPC의 추정량은, 공지된 양의 EPC의 시그날 강도를 측정하여 개발한 표준 곡선을 이용하여 유도할 수 있다.

상기한 바와 같이, 혈관형성 부위로 EPC가 이동하는 것은 혈관형성 활성의 특징이다. 따라서, EPC를 정량하는 본 방법은 혈관형성 활성을 모니터한다. 더욱이 암의 혈관형성 부위로 EPC가 이동된다는 것을 고려한다면, 본 발명은, 이러한 이동이 일어나는 암, 예를 들면 직장결장암, 방광암, 난소암, 고환암, 유방암, 피부암, 폐암, 췌장암, 위암, 식도암, 뇌암, 백혈병, 간암, 자궁내막암, 전립선암 및 머리와 목의 암 등의 혈관형성을 검출하고 암을 진단하는 것을 또한 용이하게 한다.

본 방법은 각 분석당 단지 5 내지 10㎖의 혈액이 필요하기 때문에 연속 측정에 적합하고 재현성이 높으며 실용적이고 비-침습적이다. 이 분석의 민감도는 U-937 세포주 중 AC133+ EPC, 또는 사람 단핵 말초혈중 말초 증강된 이동된 줄기/전구세포를 연속 희석시켜 평가한다. 이 과정의 검출 한계는 100만개의 PMNC당 1개의 EPC이다.

B. AC133, EPC 및 혈관형성

AC133은 기능이 알려져있지 않은, 구조적으로 신규한 5-막관통(transmembrane) 당단백질이다[참조문헌: Yin et al., 1997]. 이는 골수 유래의 내피 전구세포("EPC") 표면에서 선택적으로 발현된다[참조문헌: Reyes et al., 2002; Schmeisser et al., 2000; Hariharan et al., 1999]. AC133의 DNA 서열은 진뱅크 ID가 AF027208(서열 번호 3)로 찾을 수 있다.

EPC는 생후 혈관형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다[참조문헌: Gill et al., 2001]. 새로운 증거들은 혈관형성에서 중요한 사건중 하나가 혈관형성 부위로의 EPC의 이동 및 활성화임을 제시하고 있다[참조문헌: Reyes et al., 2001; Gill et al., 2001]. 예를 들어 외과 수술 동안의 물리적 파괴 또는 화상에 의해 유도된 혈관 외상은, EPC를 손상된 혈관 조직 부위로 모집하여 혈관 치유를 가속화시킴을 포함하는 연속적인 사건을 일으킨다[참조문헌: Gill et al., 2001]. 또한 EPC는 암 혈관형성에서도 중요한 역할을 한다. 따라서, EPC 모집 및 증식을 평가하면, 상기한 다양한 손상 및 질환을 진단하는데 있어 중요한 정보를 얻을 수 있다. 단지 암의 혈관형성 활성을 확인하는 것 외에도, 또한 본 발명은 암의 진단, 초기 또는 전이 암의 배경 또는 혈관형성 잠재성의 확인, 종양 부하의 평가, 종양 재발 예측, 화학치료 성공여부 평가 및 완화 측정에 사용할 수 있다.

C. 세포 표본의 수득

본 발명은 사람 피검체로부터 세포 표본을 수득하는 것을 일부 포함하는 방법을 기술하고 있다. 본 발명의 한가지 구체적인 양태는, 사람 피검체로부터 말초혈 표본을 수집함을 포함한다. 이는 혈액의 정맥내 추출 또는 말초 순환계의 일부를 포함한 다른 정맥으로부터 기타 이용가능한 수단에 의해 실시될 수 있다.

일단 세포 표본을 수집하면 표본을 처리하여 세포를 분리시켜야 한다. 본 발명의 한가지 양태는 단핵 세포의 분리를 기술하고 있다. 혈액으로부터 단핵 세포를 분리시키는 한가지 방법은 피콜-팍(Ficoll-Paque; Pharmacia Biotech) 과정이다. 피콜-팍은 말초혈로부터 높은 수율로 세포를 분리시키는데 사용되는 멸균 배지이다. 말초혈로부터 세포를 분리시키는 다른 방법에는 초원심분리 및 여과가 포함된다. 또한 백혈구연층(buffy coat)의 단층 세포를 수집하는 방법도 사용할 수 있다.

D. 세포 표본으로부터 RNA 전사체의 분리 및 정량화

일단 세포를 함유한 표본을 수득하면, 세포로부터 RNA를 추출한다. 총 세포 RNA를 분리시키는 다수의 방법이 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조문헌: Chomczynski and Sacchi (1987)]. 이를 실시하기 위한 특별한 방법은 트리졸 시약(Gibco Life Technologies)을 사용하여 총 세포 RNA를 추출하는 것이다. 트리졸 과정은 블렌더내에서 세포를 균질화한 후, 페놀계 트리졸 시약으로 추출함을 포함한다. 그런 다음, RNA를 이소프로필 알콜로 침전시키고 에탄올로 세척한 다음, RNAse-부존재 수(水) 또는 0.5% SDS에 재용해시킨다.

E. 역전사

역전사는 mRNA를 DNA로 전환시키는 과정이다. 이를 요약하면, 폴리-dT 프라이머를 메신저 RNA의 폴리-A 꼬리에 어닐링시킨다. 이는 역전사효소(RT)에 의해 연장되는 유리 3' 말단을 제공한다. 효소는 주형으로써 mRNA를 사용하여 5'→3'으로 합성을 실시한다. 중간 산물인 하이브리드 RNA-DNA 분자가 생성된다. 이 반응의 말기에, 효소는 완전한, 즉 mRNA를 대체하는 상보적인 DNA의 합성을 위한 주형으로서, 역전사체의 마지막 염기 몇개를 사용함으로써 그 자체에 다시 루프를 형성시킨다. 이로써 "헤어핀" 구조가 생성된다. 그런 다음 원래의 mRNA를 알칼리로 처리하여 분해시킴으로써 일본쇄 DNA를 생성된다. 헤어핀은 다음 단계, 즉 일본쇄 DNA를 이본쇄 DNA인 cDNA로 전환시키는 DNA 폴리머라제 I의 사용을 위한 천연 프라이머를 제공한다. 헤어핀은 S1 뉴클레아제에 의해 제거된다.

RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법은 익히 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다[참조문헌: Sambrook et al. (1989)]. 역전사를 위한 또 다른 방법은 열안정성, RNA-의존적 DNA 폴리머라제를 사용하는데 이는 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.

F. 증폭 방법

1. 프라이머

일반적으로 핵산 증폭 방법은 증폭 과정을 촉진시키는 프라이머의 사용에 의존한다. 본원에서 정의되는 바와 같이, 용어 프라이머는 주형에 의존적인 과정에서 초기 핵산의 합성을 개시할 수 있는 어떠한 핵산도 포함한다. 전형적으로, 프라이머는 길이가 10개 내지 25개 염기쌍인 올리고뉴클레오타이드이지만 보다 긴 서열을 사용할 수도 있다. 프라이머는 일본쇄형이 바람직하지만, 이본쇄형 또는 일본쇄형 모두 제공될 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태는 증폭 반응에 사용하기 위한 프라이머를 기술하고 있다.

다수의 프라이머는 진뱅크 ID가 AF027208인 AC133 유전자 산물에 대한 상보성을 기본으로하여 만든다. 본 발명에 기술된 구체적인 프라이머는 최적의 결과를 위해 다수의 프라이머를 스크리닝하여 선택한 것이다. 그러나, 본 발명은 여러가지 적합한 프라이머를 사용하여 실시할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성은 표준 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조문헌: Itakura and Riggs (1980)]. 또한 각각이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제4,659,774호, 제4,816,571호, 제5,141,813호, 제5,264,566호, 제4,959,463호, 제5,428,148호, 제5,554,744호, 제5, 574,146호 및 제5,602,244호는 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 기술하고 있다. 또한, 프라이머는 알맞은 가격으로 시판되고 있다.

길이가 13개 내지 100개, 바람직하게는 17개 내지 100개 뉴클레오타이드, 또는 본 발명의 몇몇 양태에서는 길이가 1 내지 2킬로염기 또는 그이상인 프로브 또는 프라이머를 사용하여 안정하고 선택적인 이중나선 분자를 형성시킬 수 있다. 일반적으로, 수득한 하이브리드 분자의 안정성 및/또는 선택성을 증가시키는데는 길이가 20개 염기 이상인 연속적인 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 분자가 바람직하다. 일반적으,로, 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 또는 경우에 따라 보다 긴 하나 이상의 상보적인 서열을 갖는 하이브리드화용 핵산 분자를 디자인하는 것이 더 좋다. 이러한 단편은, 예를 들어 화학적 방법에 의해 단편을 직접 합성하거나 재조합 생산용 재조합 벡터에 선택된 서열을 도입하여 용이하게 제조할 수 있다.

2. 하이브리드화

따라서, 상보적인 DNA 및/또는 RNA 서열과 함께 이중나선 분자를 선택적으로 형성하거나 표본으로부터 DNA 또는 RNA를 증폭하기 위한 프라이머를 제공하는 능력 때문에 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 프라이머로서)을 사용할 수 있다. 계획된 적용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브 또는 프라이머의 다양한 선택도를 수득하기 위해 다양한 하이브리드화 조건을 사용하는 것이 바람직하다.

높은 선택성이 필요한 적용의 경우, 전형적으로는 비교적 높은 엄격한 조건을 사용하여 하이브리드를 형성하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.10M NaCl을 제공할 수 있다. 이러한 높은 엄격한 조건은 프로브 또는 프라이머와 주형 또는 표적 쇄간에 미스매치가 거의 생기지 않도록 하며, 특이적인 유전자를 분리하거나 특이적인 mRNA 전사체를 검출하기에 특히 적합하다. 일반적으로 부가하는 포름아미드의 양을 증가시키면 보다 엄격한 조건이 부여되는 것으로 알려져 있다.

중간 정도의 엄격한 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M NaCl에 의해 제공되고, 낮은 엄격한 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염에 의해 제공될 수 있다. 하이브리드화 조건은 목적하는 결과에 따라 용이하게 조작할 수 있다. 다른 양태에서, 하이브리드화는, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂ 및 1.0mM 디티오트레이톨의 조건하에 성취될 수 있다. 사용되는 다른 하이브리드화 조건에는 약 40℃ 내지 약 72℃의 온도에서 약 10mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50mM KCl 및 1.5mM MgCl₂가 포함할 수 있다.

3. 표지

특정 양태에서는, 하이브리드화를 측정하기 위해 표지와 같은 적절한 수단과 함께 본 발명의 정의된 서열의 핵산을 사용하는 것이 유리하다. 검출가능한 형광 리간드, 방사능 리간드, 효소 및 또는 기타 리간드(예: 아비딘/바이오틴)와 같은 광범위한 적절한 지시인자가 당분야에 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 방사능 또는 환경에 바람직하지 않은 기타 시약 대신에 형광 표지 또는 효소 태그(예: 우레아제, 알칼리 포스파타제 또는 퍼옥시다제)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 효소 태그의 경우, 육안으로 볼 수 있거나 분광광도계로 검출할 수 있는 검출 수단을 제공하고, 상보적 핵산 함유 표본과의 특이적인 하이브리드화를 확인하는데 사용할 수 있는 비색계 지시인자 기질이 공지되어 있다.

4. PCR^TM

일반적으로, 본원에서 기술한 프로브 또는 프라이머가 PCR^TM에서와 같은 용액 하이브리드화에서 뿐만 아니라 고상을 사용하는 양태에서도 시약으로써 유용하다는 것을 예상할 수 있다. 고상을 수반하는 양태에서, 시험 DNA(또는 RNA)는 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정시키거나 흡착시킨다. 그런 다음, 목적하는 조건하에 이러한 고정된 일본쇄 핵산을 선택된 프로브와 하이브리드화시킨다. 선택된 조건은 특정한 환경(예: G+C 함량, 표적 핵산 유형, 핵산 공급원, 하이브리드화 프로브의 크기 등)에 좌우된다. 목적하는 특정 적용에 대해서 최적인 하이브리드화 조건은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 하이브리드화 분자를 세척하여 비특이적으로 결합한 프로브 분자를 제거한 다음, 결합된 표지의 양을 측정함으로써 하이브리드화를 검출하고/하거나 정량한다. 대표적인 고상 하이브리드화 방법은 미국 특허 제5,843,663호, 제5,900,481호 및 제5,919,626호에 기술되어 있다. 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 다른 하이브리드화 방법은 미국 특허 제5,849,481호, 제5,849,486호 및 제5,851,772호에 기술되어 있다. 명세서의 본 부분에서 확인되는 상기한 문헌 및 다른 문헌들의 관련 부분은 본원에서 참조문헌으로 인용된다.

다수의 주형 의존적 방법을 이용하여 소정의 세표 표본중 AC133 유전자 산물을 증폭시킬 수 있다. 가장 널리 공지된 한가지 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,302호 및 제4,800,159호 및 문헌[참조문헌: Innis et al., 1990]에 상세히 기술되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR^TM으로 지칭)이다. 이를 요약하면, PCR에서 마커 서열의 마주하는 상보적인 서열에 있는 영역에 대해 상보적인 2개의 프라이머 서열을 제조한다. DNA 폴리머라제(예: 택(Taq) 폴리머라제)와 함께 과량의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트를 반응 혼합물에 가한다. 마커 서열이 표본중에 존재하면, 프라이머는 마커에 결합하고, 폴리머라제는 뉴클레오타이드상에 부가시켜 프라이머가 마커 서열을 따라 연장되도록 한다. 반응 혼합물의 온도를 높히고 낮춤으로써 연장된 프라이머가 마커로부터 분리되어 반응 산물을 형성하고, 과량의 프라이머는 마커 및 반응 산물에 결합할 것이고, 당해 과정이 반복된다.

역전사효소(RT) PCR 증폭 과정은 mRNA 주형을 증폭시키는 PCR의 변형법이다. 따라서, AC133 유전자 산물을 증폭시키는 바람직한 방법은 제조자의 지시사항에 따라 RT-PCR 키트(Invitrogene)를 사용한다. 이 기술은 플루오젠(fluorogen) 하이브리드화 프로브 또는 dsDNA-특이적 형광 염료를 사용하여, 겔 전기영동에 의한 정제 또는 분리없이 증폭하는 동안에 PCR 산물을 실시간 검출한다. 이 방법의 프로브의 민감도는, 중요 반응물이 한계에 도달하기 전 증폭 대수기 동안 PCR 산물을 측정할 수 있게 한다. 이 방법은 PCR 산물의 분리를 필요로 하지 않는다.

5. 정량적 PCR

(i) 정량적 PCR의 유형

본 발명은 표본중 AC133+ 세포의 수를 계산하기 위해 정량적 PCR, 보다 상세하게는 정량적 RT-PCR에 의존한다. 이 방법은 부분 정량법이거나 완전 정량법일 수 있다.

경쟁 정량적 PCR^TM 및 실시간 정량적 PCR^TM 두 방법은 모두 표준 DNA 연속 희석물을 증폭시켜 작성한 표준 곡선과 비교함으로써 표본중 표적 유전자 농도를 추정한다. 그러나, 두 방법에서 이러한 표준 곡선이 생성되는 방법은 실질적으로 다르다. 경쟁적 QPCR에서는 공지된 농도의 내부 경쟁 DNA를 연속 희석한 표준 샘플 및 미지(주위) 표본 모두에 가한다. 이를 함께 증폭시킨 후, 표준 희석물 및 미지 표본 모두에 대해서 내부 경쟁자와 표적 PCR^TM 산물의 비율을 계산하고, 표준 희석물의 초기 표적 DNA 농도에 대한 경쟁자-표적 PCR^TM 산물의 비를 도시화하여 표준 곡선을 작성한다. 경쟁자 및 표적 DNA가 동일한 증폭 효율을 갖는다고 가정하면, 상기한 표준 곡선으로부터 주위 표본중 표적 DNA의 농도를 외삽할 수 있다.

실시간 QPCR에서는, 표적 DNA의 표준 희석물 및 미지량의 표적 DNA를 함유한 샘플 모두에서 증폭 산물의 축적을 연속적으로 측정한다. 표준 곡선은, 특이적인 역치 농도의 산물을 생성하는데 필요한 PCR^TM 주기(C_t)의 수와 표준 표본중 초기 주형의 농도를 상관시켜 작성한다. 시험 표본에서, 동일한 C_t 후 표적 PCR^TM 산물 축적을 측정하여, 표준 곡선으로부터 표적 DNA 농도를 내삽할 수 있다. 실시간 QPCR로 통상의 분석 동안에 표준 DNA의 보다 신속하고 용이한 측정이 가능하지만, 주위 표본중 표적을 정량화하는데는 경쟁적 QPCR이 보다 중요한 대안이 된다. 표적 DNA와 함께 공지된 양의 경쟁 DNA를 증폭시키는 것은, 표준 희석물에는 부재하는 것이 명백한 다량의 배경 DNA와 억제 기질의 존재로 인한 표본간 증폭 효율 차이를 보정하기 위한 직관적인 방법이다.

다른 유형의 QPCR은 응용 정량적 PCR^TM이다. "상대 정량적 PCR"로도 지칭되는 이 방법은 특정 핵산의 상대적인 농도를 측정한다. 본 발명에서, RT-PCR은 환자로부터 분리한 mRNA 종서 실시한다. 특정 mRNA 종의 농도가 다양함을 측정함으로써 특정 mRNA 종을 암호화하는 유전자가 차별적으로 발현한다는 것을 보여준다.

(ii) 이론적인 고려

PCR^TM에서, 증폭된 표적 DNA 분자수는 몇몇 시약이 한계에 도달할 때까지 반응 주기마다 대략 2배씩 증가한다. 이후, 증폭 속도는 주기간 증폭된 표적이 더 이상 증가하지 않을 때까지 점차적으로 감소한다. 주기 횟수를 X축에 놓고 증폭된 표적 DNA 농도의 로그값을 Y축에 두어 그래프를 도시하면, 도시한 점들을 연결시킴으로써 특징적인 형태의 곡선이 형성된다. 첫번째 주기 시작시 선의 기울기는 양수이고 일정하다. 이는 곡선의 선형부라 한다. 시약이 한계에 도달하면 선의 기울기는 감소하고 최종적으로는 0이 된다. 이 지점에서 증폭된 표준 DNA의 농도는 몇몇 고정값에 대해 점근선이 된다. 이는 곡선의 고평부라 한다.

PCR^TM 증폭의 선형부에서 표적 DNA의 농도는 반응 시작전 표적의 출발 농도에 정비례한다. 동일수의 주기가 완결되고 이의 선형 범위내에 있는 PCR^TM 반응에서 표적 DNA의 증폭 산물의 농도를 측정함으로써 원래의 DNA 혼합물중 특이적인 표적 서열의 상대 농도를 측정할 수 있다. DNA 혼합물이 상이한 조직 또는 세포로부터 분리한 RNA로부터 합성한 cDNA인 경우, 각각의 조직 또는 세포에 대해 표적 서열이 유도되는 특이적 mRNA의 상대량을 측정할 수 있다. PCR^TM 산물의 농도와 상대 mRNA 양간의 이러한 정비례는 PCR^TM 반응의 선형 범위내에서만 적용된다.

곡선의 고평부의 표적 DNA의 최종 농도는 반응 혼합물중 시약의 이용성에 의해 결정되며 표적 DNA의 원래 농도와는 상관없다. 따라서, RNA 수집군에서 RT-PCR에 의해 mRNA 종류의 상대량을 측정하기 전에 충족해야할 첫번째 조건은, PCR^TM 반응이 곡선의 선형부에 있는 경우에 증폭된 PCR^TM 산물의 농도를 표본추출해야 한다는 것이다.

특정한 mRNA 종류의 상대량을 성공적으로 측정하기 위한 정량적 RT-PCR 실험에서 충족해야할 두번째 조건은 증폭가능한 cDNA의 상대 농도를 몇몇 독립적 표준에 대해 표준화시켜야 한다는 것이다. RT-PCR 실험의 목적은 표본중 모든 mRNA 종류의 평균량에 대해 특정한 mRNA 종류의 양을 측정하는 것이다. 하기하는 실험에서는 다른 mRNA의 상대량을 비교하기 위한 내부 표준 및 외부 표준으로써 β-액틴, 아스파라긴 신세타제 및 리포코틴 II에 대한 mRNA를 사용한다.

경쟁적 PCR^TM에 대한 대부분의 프로토콜은 대략 표적만큼 풍부한 내부 PCR^TM 표준물을 사용한다. 이러한 전략은 선형기 동안에 PCR 증폭 산물을 표본추출하면 효과적이다. 반응이 고평기에 도달할 때 산물을 표본추출하는 경우, 보다 덜 풍부한 산물이 비교적 과량으로 나타난다. 예를 들어, 상이한 발현에 대해 DNA 표본을 조사하는 경우, 다수의 상이한 RNA 표본에서 상대량을 비교하면, 실제보다 RNA 상대량이 적게 나타나서 차이가 발생하는 왜곡이 일어날 것이다. 내부 표준이 표적보다 훨씬 많은 경우에 이러한 왜곡이 중요한 문제가 되지 않는다. 내부 표준이 표적보다 훨씬 많은 경우, RNA 표본간 직접적인 비교가 가능하다.

상기한 논의는 임상적으로 유도된 물질에 대한 RT-PCR 분석의 이론적 고려를 기술한 것이다. 임상 표본의 본래의 문제는, 표준화 문제를 발생시키는 이들의 양적 가변성, 및 바람직하게는 표적보다 크기가 큰 신뢰할 수 있는 내부 대조군을 함께 증폭시킬 필요가 있는 질적 가변성에 있다. 내부 표준을 암호화하는 mRNA의 양이 표적을 암호화하는 mRNA 보다 대략 5 내지 100배 많으며 표적 cDNA 단편보다 큰 증폭가능한 cDNA 단편인 내부 표준과 함께 상대적인 정량적 RT-PCR로써 RT-PCR을 실시하면 이러한 문제 모두를 극복할 수 있다. 이러한 분석으로는 각각의 mRNA 종류의 절대량이 아닌 상대량을 측정한다.

외부 표준 프로토콜을 사용하는 보다 통상의 상대적인 정량적 RT-PCR 분석을 사용하여 다른 연구를 실시할 수도 있다. 이러한 분석은 증폭 곡선의 선형부에 있는 PCR^TM 산물을 표본추출한다. 표본추출하기에 최적인 PCR^TM 주기의 수는 각 표적 cDNA 단편에 대해 실험적으로 결정해야 한다. 또한, 다양한 조직 표본으로부터 분리한 각각의 RNA 집단의 역전사효소 산물은 증폭가능한 동일 농도의 cDNA에 대해 주의깊게 표준화시켜야 한다. 이 분석은 mRNA 절대량을 측정하기 때문에 이러한 고려가 매우 중요하다. mRNA 절대량은 표준화된 표본중에서만 상이한 유전자 발현의 측정치로 사용할 수 있다. 증폭 곡선의 선형 범위의 실험적인 결정 및 cDNA 제제의 표준화는 지루하고 시간이 많이 드는 과정이지만, RT-PCR 분석 결과는 내부 표본을 사용하는 상대적인 정량적 RT-PCR 분석으로부터 유래된 결과보다 우수할 수 있다.

이러한 잇점의 한가지 이유는 내부 표준/경쟁자 없이도 증폭 곡선의 선형 범위내에서 모든 시약이 단일 PCR^TM 산물로 전환되어 분석의 민감도를 증가시킬 수 있기 때문이다. 다른 이유는 단지 1개의 PCR 산물이 나타나는 전기영동겔 또는 보다 덜 복잡하여 잡음이 적고 해석이 보다 용이한 다른 표시 방법에 의해 PCR 산물을 나타낼 수 있기 때문이다.

6. 다른 증폭 방법

소정의 주형 표본중에 존재하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는데는 다수의 다른 주형 의존적 방법을 이용할 수 있다. 가장 널리 공지된 증폭 방법중 하나는, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호, 및 다음 문헌[참조문헌: Innis et al. (1988)]에 기술되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR^TM으로 지칭)이다.

또 다른 증폭 방법은 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 유럽 특허원 제320 308호에 기술된 리가제 연쇄 반응("LCR")이다. 미국 특허 제4,883,750호는 표적 서열에 프로브쌍을 결합시키는 LCR과 유사한 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,912,481호에 기술되어 있는 PCR^TM 및 올리고뉴클레오타이드 리가제 분석(OLA)을 기본으로 하는 방법을 사용할 수도 있다.

본 발명의 실시에 사용할 수 있는 표적 핵산 서열의 또다른 증폭 방법은, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,843,650호, 제5,846,709호, 제5,846,783호, 제5,849,546호, 제5,849, 497호, 제5,849,547호, 제5,858,652호, 제5,866,366호, 제5,916,776호, 제5,922,574호, 제5,928,905호, 제5,928,906호, 제5,932,451호, 제5,935,825호, 제5,939,291호 및 제5,942,391호, 영국 특허원 제2 202 328호, 및 PCT 특허원 제PCT/US89/01025호에 기술되어 있다.

본 발명에서 증폭 방법으로써 PCT 특허원 제PCT/US87/00880호에 기술되어 있는 큐베타 리플리카제(Qbeta Replicase)를 사용할 수도 있다. 이 방법에서, 표적 서열에 상보적인 영역을 갖는 RNA의 반복 서열을 RNA 폴리머라제의 존재하에 표본에 가한다. 폴리머라제가 반복 서열을 복제한 다음, 이를 검출할 수 있다.

제한 부위의 한 쇄에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 포함한 표적 분자를 증식시키는데 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하는 등온 증폭 방법도 본 발명에서 핵산을 증폭시키는데 유용하다[참조문헌: Walker et al., 1992]. 미국 특허 제5,916,779호에 기술되어 있는 쇄 대체 증폭법(SDA)은 다회전의 쇄 대체 및 합성, 즉 닉 해독(nick translation)을 수반하는 핵산의 등온 증폭을 실시하는 또다른 방법이다.

다른 핵산 증폭 과정에는, 핵산 서열에 근거한 증폭(NASBA) 및 3SR[참조문헌: Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315]을 포함하여 전사를 기본으로 하는 증폭 시스템(TAS)이 포함된다. 유럽 특허원 제329 822호는 본 발명에 따라 사용할 수 있는, 환식으로 합성된 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 수반하는 핵산 증폭 방법을 기술하고 있다.

전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 PCT 특허원 제WO 89/06700호는 표적 일본쇄("ssDNA")에 프로모터 영역/프라이머 서열을 하이브리드화한 다음, 서열의 다수의 RNA 복사체를 전사시키는 것을 기본으로 하는 핵산 서열 증폭 계획을 기술하고 있다. 이 계획은 반복되지 않는데, 즉 생성된 RNA 전사체로부터 새로운 주형이 생성되지 않는다. 다른 증폭 방법에는 "레이스(race)" 및 "일방향 PCR^TM"[참조문헌: Frohman, 1994 ; Ohara et al., 1989]이 포함된다.

G. 분리 방법

일반적으로 시약(예: 주형 또는 과량의 프라이머) 또는 기타 증폭 산물로부터 한단계 또는 두단계로 증폭 산물을 분리시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 증폭 산물은 표준 방법을 사용하여 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리시킬 수 있다. 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조문헌: Sambrook et al. (1989)]. 핵산으로 작업하는 경우, 변성 PAGE가 바람직하다.

또한 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 여러 종류의 크로마토그래피가 있다; 흡착, 분배, 이온-교환 및 분자체, 및 칼럼, 종이, 박층 및 가스 크로마토그래피 등을 사용하기 위해 특화된 기술[참조문헌: Freifelder, 1982].

분리된 증폭 산물은 추가 조작을 위해 겔로부터 잘라내어 용출시킬 수 있다. 저융점 아가로스 겔을 사용하면, 겔을 가열하고 핵산을 추출함으로써 분리된 밴드를 제거할 수 있다.

이러한 분리 기술을 임상 세트에 적용하여 다수의 표본을 처리할 수 있다. 그러나, PCR^TM 산물의 분리 및 검출을 위한 신규한 수단은 임상학자가 한번에 수백 또는 수천개의 표본을 조사할 수 있도록 한다. 이러한 기술에는 FMAT(fluorometric microvolume assay technique; 형광측정 미세용적 분석 기술), 화학발광법, 서열 검출 시스템(Applied Biosystems) 및 질량 분광분석법이 포함된다.

다음은 핵산에 용이하게 적용되는 몇가지 분리 기술의 예이다.

1. 겔 전기영동

한가지 양태에서 증폭 산물은 표준 방법을 사용하여 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리시킨다[참조문헌: Sambrook et al., 1989].

2. 크로마토그래피 기술

또한 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 여러 종류의 크로마토그래피가 있다; 흡착, 분배, 이온-교환, 분자체, 및 칼럼, 종이, 박층 및 가스 크로마토그래피를 포함한 것을 사용하기 위해 특화된 기술[참조문헌: Freifelder, 1982]. 또한, 예를 들어 바이오틴 표지 또는 항원 표지로 표지된 cDNA 산물은 각각 아비딘 또는 항체를 포함한 비드를 사용하여 포획할 수 있다.

3. 마이크로유체(microfludic) 기술

마이크로유체 기술에는 미세모세관(ACLARA BioSciences Inc.) 또는 LabChip^TM "액체 집적회로"(Caliper Technologies Inc.)와 같은 플래폼상에서의 분리가 포함된다. 이러한 마이크로유체 플랫폼은 마이크로리터의 용적이 필요한 다른 분리 기술과 달리 단지 나노리터 용적의 표본만이 필요하다. 미세유체 장치를 사용하면 유전자 분석에 수반되는 과정중 몇몇을 소형화시킬 수 있다. 예를 들어 본원에서 참조문헌으로 인용된 공개 PCT 특허원 제WO 94/05414호(Northrup and White)는 표본으로부터 핵산을 수집하고 증폭시키기 위해 통합된 마이크로-PCR^TM 장치를 언급하고 있다. 본원에서 참조문헌으로 인용된 미국 특허 제5,304,487호(Wilding et al.) 및 미국 특허 제5,296,375호(Kricka et al.)는 세포를 포함한 표본을 수집하고 분석하기 위한 장치를 기술하고 있다. 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,856,174호는 핵산 분석에 수반되는 여러가지 절차 및 분석적 작동을 결합시킨 장치를 기술하고 있다.

4. 모세관 전기영동

몇몇 양태에서는 증폭된 유전자를 분석하기 위해 추가 수단 또는 대안을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 양태에서는, 분석을 위해 미세모세관 배열을 사용하는 것이 고려된다.

미세모세관 배열 전기영동은 특정한 분리 매질로 충전되거나 충전되지 않은 채널 또는 얇은 모세관의 사용을 수반한다. 모세관을 통한 표본의 전기영동은 표본에 대해 크기를 기본으로하는 분리 특성을 제공한다. 크기에 따른 핵산의 분리에 미세모세관 전기영동을 사용하는 것은, 예를 들어 다음 문헌에 언급되어 있다[참조문헌: Woolley and Mathies (1994)]. 미세모세관 배열 전기영동은 일반적으로 크기를 기본으로 하는 서열분석, PCR^TM 산물 분석 및 제한 단편 크기 분리를 위한 신속한 방법을 제공한다. 이러한 모세관은 용적에 대한 표면적 비가 높아서 모세관에 따른 실질적인 열의 차이없이 모세관에 보다 높은 전기장을 적용할 수 있도록 하며 결과적으로 보다 신속한 분리를 가능하게 한다. 또한 공초점 영상화 방법과 합하는 경우, 이 방법은 방사능 서열분석 방법의 민감도와 대적할만한 아토몰 범위의 민감도를 제공한다. 미세모세관 전기영동 장치를 포함한 마이크로유체 장치의 미세가공은, 예를 들어 다음 문헌에 상세하게 논의되어 있다[참조문헌: Jacobsen et al. (1994); Harrison et al. (1993); Manz et al. (1992); and U. S. Patent 5,904,824]. 전형적으로 이러한 방법은 실리카, 실리콘 또는 기타 결정성 기질 또는 칩상에 마이크로 크기의 체널을 포토리소그래피적(photolithographic)으로 에칭함을 포함하며, 본 발명에 사용하기 위해 용이하게 수정할 수 있다. 몇몇 양태에서, 모세관 배열은 본원에서 기술한 사출성형 기술을 사용하여, 장치의 몸체 제작에서 기술한 것과 동일한 중합체성 물질로부터 제작할 수 있다.

츠다 등은 원통형 모세 유리관의 대안으로 직사각형 모세관을 기술하고 있다[참조문헌: Tsuda et al. (1990)]. 이러한 시스템의 몇몇 잇점은, 높이 대 폭의 비가 커서 효율적인 열 발산이 가능하고 표면 대 용적 비가 높으며 광학 칼럼상 검출 양식에 대한 검출 민감도가 높다는 점이다. 이러한 평평한 분리 채널은 2차원 분리를 실시할 수 있는 능력을 지니는데, 한가지 힘은 분리 채널을 통해 적용되고 표본 영역은 다수의 채널 배열 검출기를 사용하여 검출한다.

다수의 모세관 전기영동법에서 모세관, 예를 들어 에칭되거나 평면 기판으로 잘리거나 성형된 채널 또는 융합 실리카 모세관은 적절한 분리/체 매트릭스로 충전시킨다. 전형적으로, 미세모세관 배열에서는 당분야에 공지된 여러가지 체 매트릭스를 사용할 수 있다. 이러한 매트릭스의 예에는 하이드록시에틸 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 등이 포함된다. 일반적으로 완충액을 전개시키고 조건을 진행시키는 특별한 겔 매트릭스를 선택하여, 핵산 단편의 크기, 요구되는 해상도 및 본래 또는 비변성 핵산 분자의 존재와 같은 특정한 적용의 분리 특성을 최대화한다. 예를 들어 전개 완충액은 표본중 핵산을 변성시키는 변성제, 카오트로픽(chaotropic) 제제(예: 우레아) 등을 포함할 수 있다.

H. 핵산 검출

본 발명에 따르면, 핵산 증폭 산물을 검출하고 정량할 수 있다. 특정 적용에서, 가시적인 수단에 의해 검출을 실시할 수 있다. 전형적인 가시화 방법에는 에티디움 브로마이드로 겔을 염색하는 것 및 UV광 아래 밴드를 가시화하는 것이 포함된다. 또한, 증폭 산물을 방사능측정 또는 형광측정 표지된 뉴클레오타이드로 완전히 표지하는 경우, 분리된 증폭 산물을 혼입된 방사능표지의 방사능 섬광계수법 또는 형광검출법에 적용하거나 전기 및/또는 열 충격 시그날을 이용할 수 있다[참조문헌: Affymax technology; Bellus, 1994].

한가지 양태에서, 증폭 산물을 분리한 후, 표지된 핵산 프로브를 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브는 발색단과 접합시키는 것이 바람직하지만 이를 방사능으로 표지시킬 수도 있다. 다른 양태에서, 프로브는 항체 또는 바이오틴과 같은 결합 파트너, 또는 검출가능한 잔기를 갖는 다른 결합 파트너와 접합시킨다.

전통적인 방법에서는 서던(Southern) 블롯팅 및 표지된 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출을 실시한다. 서던 블롯팅에 수반되는 기술은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다[참조문헌: Sambrook et al., 1989)]. 이의 한가지 예는, 본원에서 참조문헌으로 인용되며 자동 전기영동 및 핵산 이전을 위한 장치 및 방법을 기술하고 있는 미국 특허 제5,279,721호에 기술되어 있다. 장치는 겔의 외형적 조작없이 전기영동 및 블롯팅을 가능하게 하며 본 발명에 따른 방법을 실시하는데 이상적으로 적합하다.

본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 다른 핵산 검출 방법은, 각각 본원에서 참조문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,840,873호, 제5,843,640호, 제5,843,651호, 제5,846,708호, 제5,846,717호, 제5,846,726호, 제5,846,729호, 제5,849,487호, 제5,853,990호, 제5,853,992호, 제5, 853,993호, 제5,856,092호, 제5,861,244호, 제5,863,732호, 제5,863,753호, 제5,866,331호, 제5,905,024호, 제5,910,407호, 제5,912,124호, 제5,912,145호, 제5, 919,630호, 제5,925,517호, 제5,928,862호, 제5,928,869호, 제5,929,227호, 제5,932,413호 및 제5,935,791호에 기술되어 있다.

1.질량 분광법

핵산 검출에서의 최근의 혁신은 질량 분광분석법이다. 질량 분광분석법은 분자를 진공중에 이온화시켜 휘발에 의해 분자가 날아가게 함으로써 개별적인 분자의 중량을 측정하는 수단을 제공한다. 혼합된 전기장 및 자기장의 영향하에, 이온은 이들의 개별적인 질량(m) 및 전하(z)에 좌우되는 궤도를 따른다. 저분자량 분자의 경우, 질량 분광분석법은 모분자 이온의 질량을 측정함으로써 유기 분자를 분석하고 특성규명하는 통상의 물리적-유기적 레퍼토리의 일부이다. 또한, 이들 모분자 이온을 다른 입자(예: 아르곤 원자)와 충돌시켜 배열함으로써 소위 충돌 유도 해리(collision induced dissociation; CID)에 의해 분자 이온이 단편화되어 제2 분자를 형성하게 된다. 단편화 패턴/경로는 매우 빈번하게 상세한 구조 정보의 도출을 가능하게 한다. 당분야에 공지된 다른 질량 분광분석법의 적용은 다음 문헌에 요약되어 있다[참조문헌: Methods in McCloskey (1990)].

높은 검출 민감도, 정확한 질량 측정, MS/MS 배열과 결합한 CID에 의한 상세한 구조적 정보 및 속도뿐만 아니라 컴퓨터로의 온라인 데이타 전송을 제공하는 질량 분광분석법의 명백한 분석 잇점으로 인해, 핵산의 구조적 분석을 위해 질량 분광분석법을 사용하는 것이 고려될 수 있다. 이 분야를 요약한 문헌에는 다음이 포함된다[참조문헌: Schram (1990); and Crain (1990)]. 핵산에 질량 분광분석법을 적용하는데 있어 가장 큰 장애는 이들 매우 극성인 생물중합체를 휘발시키는 것이 어렵다는 점이다. 따라서, "서열분석"은, 모분자 이온의 질량을 측정하고 이를 통해 이미 공지된 서열을 확인하거나 또는 특히 이온화 및 휘발화의 경우 급속한 원자 포격(FAB 질량 분광분석법) 또는 플라즈마 탈착(PD 질량 분석분석법)을 이용하는 MS/MS 배열에서 CID를 통해 제2 이온(단편 이온)을 생성시킴으로써 공지된 서열을 확인함으로써 저분자량의 합성 올리고뉴클레오타이드로 한정된다. 예를 들어, 올리고데옥시뉴클레오타이드의 화학적 합성을 위한 보호된 이량체 블록의 분석에 FAB를 적용하는 것이 기술되어 있다[참조문헌: Koster et al., 1987].

2가지의 이온화/탈착 기술에는 전기분무법/이온분무법(ES) 및 매트릭스 보조 레이저 탈착법/이온화법(MALDI)이 있다. ES 질량 분광분석법은 펜 등[참조문헌: Fenn et al. (1989); WO 90/14148]에 의해 도입되었는데 이의 적용은 다음 문헌에 요약되어 있다[참조문헌: Smith et al., 1990; Ardrey, 1992]. 질량 분석기와 같이, 4극자가 가장 빈번하게 사용된다. 질량 계산에 모두 사용할 수 있는 다중 이온 피크의 존재로 인해 펨토몰량의 표본에서 분자량을 측정하는 것이 매우 정확하다.

이와 달리 MALDI 질량 분광분석법은 질량 분석기로써 TOF 배열을 사용하는 경우에 특히 적합할 수 있다. MALDI-TOF 질량 분광분석법은 힐렌캄프 등[참조문헌: Hillenkamp et al. (1990)]에 의해 도입되었다. 대부분의 경우 상기 기술로는 다중 분자 이온 피크가 생성되지 않기 때문에, 원칙적으로 질량 스펙트럼은 ES 질량 분광분석법보다 간단한 것 같다. 분자량이 410,000달톤 이하인 DNA 분자는 탈착시키고 휘발시킬 수 있다[참조문헌: Williams et al., 1989]. 보다 최근에, UV-레이저 대신에 상기 기술에서 적외선 레이저(IR)를 사용하면 합성 DNA, 플라스미드 DNA의 제한 효소 단편 및 크기가 2180개 뉴클레오타이드 이하인 RNA 전사체와 같이 보다 큰 핵산의 질량 스펙트럼을 얻을 수 있는 것으로 나타났다[참조문헌: Berkenkamp et al., 1998]. 또한 버켄캄프 등[참조문헌: Berkenkamp et al., 1998]은 MALDI-TOF IR을 사용하는 한정된 표본 정제에 의해 DNA 및 RNA 샘플을 분석하는 방법을 기술하고 있다.

일본 특허 제59-131909호에서는 전기영동, 액체 크로마토그래피 또는 고속 겔 여과에 의해 분리된 핵산 단편을 검출하는 기기를 기술하고 있다. 질량 분광분석 검출은 S, Br, I 또는 Ag, Au, Pt, Os, Hg와 같이 일반적으로 DNA에 존재하지 않는 핵산 원자를 혼입시켜 실시한다.

2. 에너지 전달

핵산을 검출하는 또다른 알려진 방법은 에너지 전달을 수반한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브를 형광 표지와 함께 하이브리드화하여 이를 표지하는 것은 당분야에 공지되어 있으며, 프로브 하이브리드화를 쉽게 검출하는 비방사능의 민감한 방법이다. 보다 최근에는 프로브 하이브리드화를 검출하기 위해 형광 강도를 직접 검출하는 것보다 형광 에너지 전달(FET) 과정을 이용하는 검출 방법이 개발되었다. FET는 한개의 수용체의 흡수 스펙트럼이 다른 공여체의 발산 스펙트럼과 겹치고 2개의 염료가 근접한 경우에 공여체 형광단과, 형광단이거나 형광단이 아닐 수 있는 수용체 염료 사이에서 발생한다. 이러한 특성을 지닌 염료는 공여체/수용체 염료쌍 또는 에너지 전달 염료쌍이라 한다. 공여체 형광단의 여기상태 에너지는 공명 쌍극자 유도된 쌍극자 상호작용에 의해 이웃하는 수용체에 전달된다. 이에 의해 공여체 형광이 소멸된다. 몇몇 경우에서, 수용체도 형광단인 경우, 이의 형광 강도는 향상될 수 있다. 에너지 전달 효율은 공여체와 수용체간의 거리에 크게 좌우되면 이러한 관계를 예측하는 식이 개발되어 있다[참조문헌: Forster, 1948]. 에너지 전달 효율이 50%인 수용체와 공여체 염료간 거리를 포스터(Forster) 거리(R_O)라 한다. 예를 들어, 전하 전달 및 충돌 소멸을 포함한 형광 소멸의 다른 기전도 공지되어 있다.

소멸을 일으키는 인접한 2개의 염료간의 상호작용에 의존하는 에너지 전달 및 다른 기전은 핵산 서열을 검출 또는 확인하기 위한 매력적인 수단이 되며, 그렇기 때문에 이러한 분석은 균일한 형식으로 수행될 수 있다. 일반적으로 불균일한 분석은 유리 표지로부터 하이브리드화 표지를 분리시키기 위한 추가 단계가 필요하기 때문에, 단일 형광단 표지의 형광을 검출하는데 의존하는 통상의 프로브 하이브리드화 분석보다 균일한 분석 형식이 간단하다. FET 하이브리드화 분석에 대한 몇몇 형식은 문헌에서 검토할 수 있다[참조문헌: Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992)].

핵산 증폭을 검출하기 위한 에너지 전달 또는 형광 소멸의 다른 기전을 이용하는 균일한 방법도 기술되어 있다. 히구치(Higuchi)는 이본쇄 DNA에 결합함으로써 형광이 증가하는 에티디움 브로마이드를 모니터함으로써 실시간 DNA 증폭을 검출하는 방법을 기술하고 있다. 그러나, 에티디움 브로마이드가 표적에 비특이적이며 배경 증폭 산물 또한 검출되므로 이러한 방법의 민감도는 제한적이다. 리 등[참조문헌: Lee et al. (1993)]은 PCR^TM 동안에 표적 증폭 특이적 방법에서 이중 표지된 검출 프로브가 잘려지는 실시간 검출 방법을 기술하고 있다. 검출 프로브는 증폭 프라이머의 하부스트림에 하이브리드화되므로, 택 폴리머라제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 검출 프로브를 분해함으로써 2개의 형광 염료를 분리시켜 에너지 전달쌍을 형성한다. 프로브가 잘려져서 형광 강도는 증가한다. PCT 특허원 제96/2114호는 효소 매개된 핵산 절단이 형광을 증가시키는 연속 형광측정 분석을 기술하고 있다. 형광 에너지 전달은, 표적에 하이브리드화하여 소멸되는 단일 형광 표지를 이용하는 방법의 측면에서만 상기 방법에서 사용이 제안되었다.

증폭 프라이머의 하이브리드화 부위의 표적 서열 하부스트림에 하이브리드화하는 검출 프로브 또는 시그날 프라이머를 핵산 증폭 검출에 사용하는 것이 기술되어 있다[참조문헌: 미국 특허 제5,547,861호]. 시그날 프라이머는 폴리머라제에 의해 유사한 방식으로 연장되어 증폭 프라이머를 연장시킨다. 증폭 프라이머의 연장은 표적 증폭 의존적인 방식으로 시그날 프라이머의 연장 산물을 대체하여, 표적 증폭의 표시로써 검출될 수 있는 이본쇄 제2 증폭 산물을 생성한다. 시그날 프라이머로부터 생성된 제2 증폭 산물은 다양한 표지 및 리포터 그룹, 잘려져서 특징적인 크기의 단편을 생성하는 시그날 프라이머중의 제한 부위, 포획 그룹, 삼중 나선과 같은 구조직 특징 및 이본쇄 DNA 결합 단백질에 대한 인지 부위에 의해 검출될 수 있다.

당분야에 공지되어 있는 다수의 공여체/수용체 염료쌍을 본 발명에 사용할 수 있다. 여기에는, 예를 들어 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)/테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), FITC/텍사스 레드(Texas Red^TM; Molecular Probes), FITC/N-하이드록시석신이미딜-1-피렌부티레이트(PYB), FITC/에오신 이소티오시아네이트(EITC), N-하이드록시식신이미딜 1-피렌설포네이트(PYS)/FITC, FITC/로다민 X, FITC/테트라메틸로다민(TAMRA) 등이 포함된다. 특정 공여체/수용체 형광단쌍을 선택하는 것은 중요하지 않다. 에너지 전달 소멸 기전의 경우, 공여체 형광단의 발산 파장이 수용체의 여기 파장과 겹치기만 하면 되는데, 즉 충분한 에너지 전달, 전하 전달 또는 형광 소멸이 가능하도록 2개의 염료간의 스펙트럼이 충분히 겹쳐야만 한다. P-(디메틸 아미노페닐아조)벤조산(DABCYL)은 플루오레신 또는 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌(EDANS)과 같은 인접한 형광단으로부터 형광을 효과적으로 소멸시키는 비-형광 수용체 염료이다. 소멸이 발생하는 기전에 상관없이 본 발명의 핵산 검출기에서 형광을 소멸시키는 어떠한 염료쌍도 본 발명에 사용하기에 적합하다. 말단 표지 및 내부 표지 방법 모두 당분야에 공지되어 있으며, 핵산 검출기에서 각각의 부위에 공여체 및 수용체 염료를 연결시키는데 통상 사용할 수 있다.

I. 키트

또한 본 발명은 본원에서 기술한 방법을 실시하기 위한 키트를 포함한다. 제한되지 않는 실시예에서, 프라이머, 역전사용 효소, 증폭용 효소 및 추가 제제를 키트에 포함시킬 수 있다. 따라서, 키트는 적합한 용기내에 이러한 시약을 하나 이상 포함한다. 또한 키트는 RNA 분리, 증폭 산물의 정제, 표지 등을 위한 시약을 포함할 수 있다.

키트의 성분은 수용성 매질에 포장하거나 동결건조형으로 포장할 수 있다. 키트의 적합한 용기는, 성분을 넣을 수 있으며 바람직하게는 적절하게 분배할 수 있는 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기를 일반적으로 포함한다. 키트중에 하나 이상의 성분이 있는 경우, 또한 키트는 추가 성분을 따로 넣을 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가 용기를 일반적으로 포함한다. 그러나, 성분의 다양한 혼합물을 바이알에 포함시킬 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 시판을 위해 밀폐되어 있는 시약 용기를 포함시키기 위한 수단을 일반적으로 포함한다. 이러한 용기는 목적하는 바이알을 보유하는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기일 수 있다.

J. 실시예

하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함시킨 것이다. 당분야의 숙련가라면, 실시예에서 설명되는 기술이 본 발명을 잘 실시하기 위해 본 발명자들이 개발한 기술을 대표하며, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 형식을 구성하는 것으로 간주할 수 있음을 익히 알 것이다. 그러나, 당분야의 숙련가라면 본 발명의 문맥에서 기술되어 있는 특정 양태내에서 여러가지 변화가 가능하며, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 수득할 수 있음을 알 것이다.

실시예 1

재료 및 방법

AC133의 정량적 PCR^TM

1 x 10⁶의 사람 말초 단핵 세포로부터 mRNA를 제조하고 올리고 dT를 사용하여 추출하였다. AC133에 대해 특이적인 다수의 3' 및 5' 프라이머는 AC133의 공개된 cDNA에 대한 유전자 은행 서열을 기본으로 하여 디자인하였다[참조문헌: Yin et al., 1997]. 선별을 통해 매우 특이적인 3' 및 5' 프라이머를 선택하였다. AC133에 대한 모든 PCR^TM은, 30개의 증폭 주기와 내부 대조군으로서 β-액틴을 사용하여 표준 프로토콜하에 실시하였다. 분석의 민감도는 U-937 세포주중 사람 탯줄 내피세포 또는 사람 단핵 말초혈중 정제된 CD34+ 세포를 연속 희석시켜 평가하였다. 본 과정의 검출 한계는 1 x 10⁶ PMNC당 1개의 EPC이며 특이도는 90% 이상이였다.

CEC 및 EPC의 측정

말초혈중 세포수는, CD45(조혈세포 배제), AC133 및 CD34와 반응하는 모노클로날 항체 패널을 사용하여 3색 유동 혈구계산기에 의해 측정하였다. 적절한 분석 게이트를 사용하여 EPC 수를 측정하였다[참조문헌: Boyer et al., 2000]. 참조 형광 비드를 사용하여 절대적인 세포수를 계산하였다. 말초혈 표본당 100,000개 이상의 세포가 수득되면, CEC 측정 게이트중 적절한 수의 결과(>100, 통상 3 내지 400)를 수집하여 분석 정보를 입수하였다. 과정의 민감도 및 특이도는 U-937 세포주 또는 사람 사이토카인-이동된 CD34+가 풍부한 MNC 제제를 연속 희석시켜 평가할 수 있었다. 이 과정의 검출 한계는 0.1세포/㎕이고 특이도는 90% 이상이였다[참조문헌: Boyer et al., 2000].

실시예 2

결과

AC133 발현을 분석하기 위해 CRC가 있는 3명의 환자뿐만 아니라 2명의 건강한 지원자에서 RT-PCR을 실시하였다. 대조군은 1 x 10⁶MNC중 CD34+가 풍부한, 골수 이식을 위해 준비한 말초 단핵 전구세포/줄기세포이였다. 환자 1 및 2 모두는 전이성 질환이 있으며, 환자 3은 대략 4주전에 종양을 절제하였고 낮은 ACC13 및 혈장 VEGF 수준을 나타낸다는 것이 흥미로왔다(도 1). 데이타는 종양 부하의 감소(수술)가 감소된 말초혈 EPC와 연관있음을 보여주었다.

혈청 VEGF 및 기타 혈관형성 사이토카인

사이토카인 및 VEGF는, VEGF 및 기타 사이토카인(R&D, Minneapolis, MN)용으로 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 사람 피검체의 혈장에서 측정하였다[참조문헌: Shi et al., 2001; Shi et al., 2000].

ELISA 분석은 3명의 CRC 환자 및 2명의 건강한 정상 지원자의 혈장 표본중 VEGF 및 염기성 FGF에 대해 실시하였다. 데이타(도 2)는 혈장 VEGF 및 FGF가 정상 지원자보다 유의하게 증가되었음을 보여주었다. VEGF 수준은 3명의 환자 모두에서 AC133 시그날과 포지티브하게 상관있는 것으로 나타났다(도 1). 또한 환자 1 및 2는 전이 질환이 있는 CRC 환자이고, Duke C 결장암을 절제한 환자 3에 비해 높은 AC133 및 혈장 VEGF 수준을 나타내었다. 문헌에 기술되어 있는 방법을 사용하여 또다른 가설에 대해 산화질소와 같은 다른 혈장 혈관형성 사이토카인을 조사할 수 있었다[참조문헌: Shi et al., 2001; Shi et al., 2000].

실시예 3

AC133의 RT-PCR 및 정량적 PCR ^TM (Q-RT-PCR) 분석

연구 집단

58명의 CRC 환자가 본 연구에 참여하였다. 잠재적으로 활동중인 상처, 염증, 감염, 수술한지 4주 이내, 최근의 심장 발작, 졸중 또는 사지 허혈이 있는 환자는 적합하지 않았다. 모든 환자는 30cc의 말초혈을 수집하기전 동의서에 서명을 해야할 필요가 있다.

CEP 양성 대조군 세포

건강한 지원자의 사이토카인-이동된 CD34+ PBMNC를 본 실험에 사용하였다. CD34+이 풍부한 동결된 말초혈 단핵 세포 제제는 37℃ 수욕에서 해동시켰다. 적혈구 세포는 RBC 용혈제로 용혈시켰다. 그런 다음, PBMNC 세포는, 파이코에리트린(PE; 적색 형광) 표지된 항-CD34 항체(Becton Dickinson, San Jose, CA)에 대해 친화성이 높은 1.5㎕의 FITC-표지된 비중화 MoAbs와 20분 동안 항온처리하고 세포를 PBS로 세척하였다. 다수의 양성 세포는 면역글로불린 G 이소형 대조군(FITC; Immunotech, Marceille, France)와 비교하고 쿨터 엘리트 유동 혈구계산기(COULTER, Hialeah, FL)를 사용하여 측정하였다. 생존성이 없는 세포는 프로피디움 요오다이드로 염색시켜 7AAD(생존성 마커)로 확인하였다. 총 10,000개 이상의 결과를 수득하였다. CD34+ 세포는 총 PBMNC의 0.56%에 존재하였다. CD34+, 7AAD(-) 집단은 96.1%였다.

RT-PCR

RT-PCR은 대조군으로서 β-액틴을 사용하여 환자에서 실시하였다. 증폭된 670bp의 산물의 서열을 확인하면 AC133은 정상 대조군에는 존재하지 않고 환자에만 존재하는 것으로 나타났다. 도 3은 몇몇 환자 표본중 상승된 AC133 수준을 보여준다. 이러한 결과는 다른 환자 표본을 사용한 추가 연구에서도 확인되었다.

PCR^TM은 l x 택맨(TaqMan) 완충액, 5.5nM MgC1₂, 200μM dATP, dCTP, dGTP 및 400μM dUTP, 300nM의 각각의 프라이머, 100nM 프로브, 0.5단위의 앰프이레이즈 우라실(AmpErase Uracril) N 글리코실라제(UNG), 1.25단위의 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold) 및 10㎕의 cDNA를 포함한 총 50㎕의 용적중에서 실시하였다. β-액틴 및 AC133 증폭은 각 표본에서 이중으로 실시하였다. 열 주기 조건에는 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 실시한 후, 95℃에서 15분 및 60℃에서 1분의 40주기가 포함된다. RT-PCRT에 사용되는 모든 시약은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems; Foster City, CA)로부터 구입하였다. 사용되는 프라이머는 다음과 같다:

AC133: 왼쪽: AGCCTTCATCCACAGATGCT(서열 번호 5)

오른쪽: TTTTGGATTCATATGCCTTCTG(서열 번호 6)

GAPDH: 왼쪽: CTTCACCACCATGGAGAAGGC(서열 번호 7)

오른쪽: GGCATGGACTGTGGTCATGAG(서열 번호 8)

데이타 해석

내인성 참조(GAPDH)에 대해 표준화시키고 양성 대조군에 상대적인 표적의 양은 C_t 방법에 의해 결정한다. 공식은 다음과 같다.

표적의 양=2^-△△C _t

상기식에서,

^-△△C_t={[C_t(AC133 표본)-C_t(GAPDH 표본)]-[C_t(AC133 측정치)-C_t(GAPDH 측정치)]}이다.

AC133의 실시간 QRT-PCR(CD133)

AC133 프라이머를 사용하여 실시간 정량적-RT-PCR을 실시하여 CEP를 정량하였다. 분석은 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 택맨 방법을 기본으로 하여 실시하였다. 이 기술은, 형광 방출을 통해 PCR^TM 산물이 검출될 수 있는 순환 시점을 알 수 있도록 하였다(C_t 값은 표적 mRNA의 출발량과 상관있다). 프라이머는 다음과 같다:

AC133: 왼쪽: CATGTTTGGAGGATCTTGCTAGC(서열 번호 9)

오른쪽: TTCCCGCACAGCCCC(서열 번호 10)

프로브: ATGGCCCTCGTACTCGGCTCCC(서열 번호 11)

GAPDH: 왼쪽: CTTCACCACCATGGAGAAGGC(서열 번호 12)

오른쪽: GGCATGGACTGTGGTCATGAG(서열 번호 13)

프로브: CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT(서열 번호 14)

동의서에 대해 알려준 후 말초혈 표본을 수집하고 분석이 끝날때까지 결과는 알리지 않는다. 수술한지 4주 이내, 활동중인 관절염, 외상 및/또는 염증이 있는 환자는 본 연구에서 배제시켰다. 분석은, GAPDH를 내부 대조군으로 사용하는 것을 제외하고는 문헌에 기술되어 있는 방법을 기본으로 하였다[참조문헌: Marchetti et al. (2002)]. 모든 표본은 양성 대조군으로서 사이토카인-이동된 말초 줄기세포로부터의 AC133+ 세포를 사용하여 이중으로 실험을 실시하였다. CD133 mRNA는 활동중인 CRC 환자의 말초혈에서만 검출되고 건강한 지원자에서는 검출되지 않았다(n=10).

AC133의 실시간 Q-RT-PCR은 활동중인 CRC가 있는 환자 또는 CRC가 없는 환자에서 실시하였다(n=44). AC133 마커의 추정 중간값은 임상적 질환이 없는 환자(0.0017; 범위: 0.0-9.51)에 비해 임상적 질환이 있는 환자에서 유의하게 높았다(4.2; 범위: 0.017-106.9); p 값 < 0.001 (Mann-Whitney 시험). 3개의 ACC 중간값(0.01, 0.05 및 0.1)을 컷-오프점으로 사용하여 활동 또는 비활동 방사선사진 질환 상태를 구별하는 95% 신뢰 구간(CI) 및 교차비(OR)를 추정하는 경우, 3개의 모든 점은 8.2 내지 14.6 범위의 통계학적으로 유의한 OR을 나타내었다(표 1).

CEA가 증가하지만 CRC 증거가 없는 3명의 환자에서 AC133이 상승한다는 것이 흥미롭다. 또한 상승된 CEA가 반영하는 상태인 재발된 CRC가 있는 환자에서도 CEP가 상승하였다. 한 환자는 갑상선암으로 인해 CEA가 증가하였다. 간 전이암을 절제한 병력이 있는 2명의 고위험 환자는 AC133이 9까지 상승하였다. 활동 또는 비활동 질환 상태를 구별하는 추정된 AC133 컷오프점은 0.017로 나타났으며, 이때 AUC는 81%였다. 본 연구는 AC133의 실시간 Q RT-PCR이 기본적인 종양 혈관형성의 결과로써 종양 상태와 상관있으며 종양 혈관형성의 대용 마커로서 사용할 수 있음을 보여준다.

결과	CD133 컷오프점(동일하거나 이보다 큼)
임상적 활동 CRC	0.01	0.05	0.1
없음(N=31)	14(45.2)	9(29)	9(29)
있음(N=13)	12(92.3)	11(84.6)	10(76.9)
교차비(95% CI)	14.6(1.7-126.2)	13.4(2.5-73.2)	8.2(1.8-36.7)
P값	0.004	0.001	0.005

본원에서 기술하고 청구하는 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 견지에서 과도한 실험없이도 실시되고 실행될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되어 있지만 본 발명의 개념, 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 기술한 조성물, 방법, 방법의 단계 또는 연속 단계에 변형을 적용할 수 있음을 알 것이다. 보다 구체적으로는, 동일하거나 유사한 결과를 수득하면서 본원의 시약 대신에 화학적 및 생리적으로 모두 연관된 특정 시약을 사용할 수 있음이 명백할 것이다. 당분야의 숙련가에게 명백한 이러한 유사한 대체 및 변형 모두는 추가된 청구항에서 한정되는 바와 같이 본 발명의 요지, 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.

K. 참조문헌

본원에서 상기한 바에 대한 예시적인 과정 또는 이를 보충하는 다른 설명을 제공하는 하기의 문헌들은 본원에서 참조문헌으로 인용된다:

미국 특허 제4,659,774호

미국 특허 제4,683,195호

미국 특허 제4,683,202호

미국 특허 제4,800,159호

미국 특허 제4,816,571호

미국 특허 제4,883,750호

미국 특허 제4,959,463호

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<110> Board of Regents, The University of Texas System <120> Quantitative RT-PCR to AC133 to diagnose cancer and monitor angiogenic activity in a cell sample <130> UTFC:755KR <150> US 60/406,535 <151> 2002-08-28 <150> US 10/618,102 <151> 2003-07-11 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 1 tgtacgaatt cgacagctac ttggctcaga c 31 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 2 tctagctcga gcatgatctt tatgataacc 30 <210> 3 <211> 3794 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (38)..(2635) <400> 3 ccaagttcta cctcatgttt ggaggatctt gctagct atg gcc ctc gta ctc ggc 55 Met Ala Leu Val Leu Gly 1 5 tcc ctg ttg ctg ctg ggg ctg tgc ggg aac tcc ttt tca gga ggg cag 103 Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Gly Asn Ser Phe Ser Gly Gly Gln 10 15 20 cct tca tcc aca gat gct cct aag gct tgg aat tat gaa ttg cct gca 151 Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp Asn Tyr Glu Leu Pro Ala 25 30 35 aca aat tat gag acc caa gac tcc cat aaa gct gga ccc att ggc att 199 Thr Asn Tyr Glu Thr Gln Asp Ser His Lys Ala Gly Pro Ile Gly Ile 40 45 50 ctc ttt gaa cta gtg cat atc ttt ctc tat gtg gta cag ccg cgt gat 247 Leu Phe Glu Leu Val His Ile Phe Leu Tyr Val Val Gln Pro Arg Asp 55 60 65 70 ttc cca gaa gat act ttg aga aaa ttc tta cag aag gca tat gaa tcc 295 Phe Pro Glu Asp Thr Leu Arg Lys Phe Leu Gln Lys Ala Tyr Glu Ser 75 80 85 aaa att gat tat gac aag cca gaa act gta atc tta ggt cta aag att 343 Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Thr Val Ile Leu Gly Leu Lys Ile 90 95 100 gtc tac tat gaa gca ggg att att cta tgc tgt gtc ctg ggg ctg ctg 391 Val Tyr Tyr Glu Ala Gly Ile Ile Leu Cys Cys Val Leu Gly Leu Leu 105 110 115 ttt att att ctg atg cct ctg gtg ggg tat ttc ttt tgt atg tgt cgt 439 Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr Phe Phe Cys Met Cys Arg 120 125 130 tgc tgt aac aaa tgt ggt gga gaa atg cac cag cga cag aag gaa aat 487 Cys Cys Asn Lys Cys Gly Gly Glu Met His Gln Arg Gln Lys Glu Asn 135 140 145 150 ggg ccc ttc ctg agg aaa tgc ttt gca atc tcc ctg ttg gtg att tgt 535 Gly Pro Phe Leu Arg Lys Cys Phe Ala Ile Ser Leu Leu Val Ile Cys 155 160 165 ata ata ata agc att ggc atc ttc tat ggt ttt gtg gca aat cac cag 583 Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly Phe Val Ala Asn His Gln 170 175 180 gta aga acc cgg atc aaa agg agt cgg aaa ctg gca gat agc aat ttc 631 Val Arg Thr Arg Ile Lys Arg Ser Arg Lys Leu Ala Asp Ser Asn Phe 185 190 195 aag gac ttg cga act ctc ttg aat gaa act cca gag caa atc aaa tat 679 Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Asn Glu Thr Pro Glu Gln Ile Lys Tyr 200 205 210 ata ttg gcc cag tac aac act acc aag gac aag gcg ttc aca gat ctg 727 Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Asp Lys Ala Phe Thr Asp Leu 215 220 225 230 aac agt atc aat tca gtg cta gga ggc gga att ctt gac cga ctg aga 775 Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly Ile Leu Asp Arg Leu Arg 235 240 245 ccc aac atc atc cct gtt ctt gat gag att aag tcc atg gca aca gcg 823 Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile Lys Ser Met Ala Thr Ala 250 255 260 atc aag gag acc aaa gag gcg ttg gag aac atg aac agc acc ttg aag 871 Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn Met Asn Ser Thr Leu Lys 265 270 275 agc ttg cac caa caa agt aca cag ctt agc agc agt ctg acc agc gtg 919 Ser Leu His Gln Gln Ser Thr Gln Leu Ser Ser Ser Leu Thr Ser Val 280 285 290 aaa act agc ctg cgg tca tct ctc aat gac cct ctg tgc ttg gtg cat 967 Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ser Leu Asn Asp Pro Leu Cys Leu Val His 295 300 305 310 cca tca agt gaa acc tgc aac agc atc aga ttg tct cta agc cag ctg 1015 Pro Ser Ser Glu Thr Cys Asn Ser Ile Arg Leu Ser Leu Ser Gln Leu 315 320 325 aat agc aac cct gaa ctg agg cag ctt cca ccc gtg gat gca gaa ctt 1063 Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro Pro Val Asp Ala Glu Leu 330 335 340 gac aac gtt aat aac gtt ctt agg aca gat ttg gat ggc ctg gtc caa 1111 Asp Asn Val Asn Asn Val Leu Arg Thr Asp Leu Asp Gly Leu Val Gln 345 350 355 cag ggc tat caa tcc ctt aat gat ata cct gac aga gta caa cgc caa 1159 Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro Asp Arg Val Gln Arg Gln 360 365 370 acc acg act gtc gta gca ggt atc aaa agg gtc ttg aat tcc att ggt 1207 Thr Thr Thr Val Val Ala Gly Ile Lys Arg Val Leu Asn Ser Ile Gly 375 380 385 390 tca gat atc gac aat gta act cag cgt ctt cct att cag gat ata ctc 1255 Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu Pro Ile Gln Asp Ile Leu 395 400 405 tca gca ttc tct gtt tat gtt aat aac act gaa agt tac atc cac aga 1303 Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr Glu Ser Tyr Ile His Arg 410 415 420 aat tta cct aca ttg gaa gag tat gat tca tac tgg tgg ctg ggt ggc 1351 Asn Leu Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Asp Ser Tyr Trp Trp Leu Gly Gly 425 430 435 ctg gtc atc tgc tct ctg ctg acc ctc atc gtg att ttt tac tac ctg 1399 Leu Val Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Ile Val Ile Phe Tyr Tyr Leu 440 445 450 ggc tta ctg tgt ggc gtg tgc ggc tat gac agg cat gcc acc ccg acc 1447 Gly Leu Leu Cys Gly Val Cys Gly Tyr Asp Arg His Ala Thr Pro Thr 455 460 465 470 acc cga ggc tgt gtc tcc aac acc gga ggc gtc ttc ctc atg gtt gga 1495 Thr Arg Gly Cys Val Ser Asn Thr Gly Gly Val Phe Leu Met Val Gly 475 480 485 gtt gga tta agt ttc ctc ttt tgc tgg ata ttg atg atc att gtg gtt 1543 Val Gly Leu Ser Phe Leu Phe Cys Trp Ile Leu Met Ile Ile Val Val 490 495 500 ctt acc ttt gtc ttt ggt gca aat gtg gaa aaa ctg atc tgt gaa cct 1591 Leu Thr Phe Val Phe Gly Ala Asn Val Glu Lys Leu Ile Cys Glu Pro 505 510 515 tac acg agc aag gaa tta ttc cgg gtt ttg gat aca ccc tac tta cta 1639 Tyr Thr Ser Lys Glu Leu Phe Arg Val Leu Asp Thr Pro Tyr Leu Leu 520 525 530 aat gaa gac tgg gaa tac tat ctc tct ggg aag cta ttt aat aaa tca 1687 Asn Glu Asp Trp Glu Tyr Tyr Leu Ser Gly Lys Leu Phe Asn Lys Ser 535 540 545 550 aaa atg aag ctc act ttt gaa caa gtt tac agt gac tgc aaa aaa aat 1735 Lys Met Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Ser Asp Cys Lys Lys Asn 555 560 565 aga ggc act tac ggc act ctt cac ctg cag aac agc ttc aat atc agt 1783 Arg Gly Thr Tyr Gly Thr Leu His Leu Gln Asn Ser Phe Asn Ile Ser 570 575 580 gaa cat ctc aac att aat gag cat act gga agc ata agc agt gaa ttg 1831 Glu His Leu Asn Ile Asn Glu His Thr Gly Ser Ile Ser Ser Glu Leu 585 590 595 gaa agt ctg aag gta aat ctt aat atc ttt ctg ttg ggt gca gca gga 1879 Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe Leu Leu Gly Ala Ala Gly 600 605 610 aga aaa aac ctt cag gat ttt gct gct tgt gga ata gac aga atg aat 1927 Arg Lys Asn Leu Gln Asp Phe Ala Ala Cys Gly Ile Asp Arg Met Asn 615 620 625 630 tat gac agc tac ttg gct cag act ggt aaa tcc ccc gca gga gtg aat 1975 Tyr Asp Ser Tyr Leu Ala Gln Thr Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Asn 635 640 645 ctt tta tca ttt gca tat gat cta gaa gca aaa gca aac agt ttg ccc 2023 Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Asp Leu Glu Ala Lys Ala Asn Ser Leu Pro 650 655 660 cca gga aat ttg agg aac tcc ctg aaa aga gat gca caa act att aaa 2071 Pro Gly Asn Leu Arg Asn Ser Leu Lys Arg Asp Ala Gln Thr Ile Lys 665 670 675 aca att cac cag caa cga gtc ctt cct ata gaa caa tca ctg agc act 2119 Thr Ile His Gln Gln Arg Val Leu Pro Ile Glu Gln Ser Leu Ser Thr 680 685 690 cta tac caa agc gtc aag ata ctt caa cgc aca ggg aat gga ttg ttg 2167 Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Gln Arg Thr Gly Asn Gly Leu Leu 695 700 705 710 gag aga gta act agg att cta gct tct ctg gat ttt gct cag aac ttc 2215 Glu Arg Val Thr Arg Ile Leu Ala Ser Leu Asp Phe Ala Gln Asn Phe 715 720 725 atc aca aac aat act tcc tct gtt att att gag gaa act aag aag tat 2263 Ile Thr Asn Asn Thr Ser Ser Val Ile Ile Glu Glu Thr Lys Lys Tyr 730 735 740 ggg aga aca ata ata gga tat ttt gaa cat tat ctg cag tgg atc gag 2311 Gly Arg Thr Ile Ile Gly Tyr Phe Glu His Tyr Leu Gln Trp Ile Glu 745 750 755 ttc tct atc agt gag aaa gtg gca tcg tgc aaa cct gtg gcc acc gct 2359 Phe Ser Ile Ser Glu Lys Val Ala Ser Cys Lys Pro Val Ala Thr Ala 760 765 770 cta gat act gct gtt gat gtc ttt ctg tgt agc tac att atc gac ccc 2407 Leu Asp Thr Ala Val Asp Val Phe Leu Cys Ser Tyr Ile Ile Asp Pro 775 780 785 790 ttg aat ttg ttt tgg ttt ggc ata gga aaa gct act gta ttt tta ctt 2455 Leu Asn Leu Phe Trp Phe Gly Ile Gly Lys Ala Thr Val Phe Leu Leu 795 800 805 ccg gct cta att ttt gcg gta aaa ctg gct aag tac tat cgt cga atg 2503 Pro Ala Leu Ile Phe Ala Val Lys Leu Ala Lys Tyr Tyr Arg Arg Met 810 815 820 gat tcg gag gac gtg tac gat gat gtt gaa act ata ccc atg aaa aat 2551 Asp Ser Glu Asp Val Tyr Asp Asp Val Glu Thr Ile Pro Met Lys Asn 825 830 835 atg gaa aat ggt aat aat ggt tat cat aaa gat cat gta tat ggt att 2599 Met Glu Asn Gly Asn Asn Gly Tyr His Lys Asp His Val Tyr Gly Ile 840 845 850 cac aat cct gtt atg aca agc cca tca caa cat tga tagctgatgt 2645 His Asn Pro Val Met Thr Ser Pro Ser Gln His 855 860 865 tgaaactgct tgagcatcag gatactcaaa gtggaaagga tcacagattt ttggtagttt 2705 ctgggtctac aaggactttc caaatccagg agcaacgcca gtggcaacgt agtgactcag 2765 gcgggcacca aggcaacggc accattggtc tctgggtagt gctttaagaa tgaacacaat 2825 cacgttatag tccatggtcc atcactattc aaggatgact ccctcccttc ctgtctattt 2885 ttgtttttta cttttttaca ctgagtttct atttagacac tacaacatat ggggtgtttg 2945 ttcccattgg atgcatttct atcaaaactc tatcaaatgt gatggctaga ttctaacata 3005 ttgccatgtg tggagtgtgc tgaacacaca ccagtttaca ggaaagatgc attttgtgta 3065 cagtaaacgg tgtatatacc ttttgttacc acagagtttt ttaaacaaat gagtattata 3125 ggactttctt ctaaatgagc taaataagtc accattgact tcttggtgct gttgaaaata 3185 atccattttc actaaaagtg tgtgaaacct acagcatatt cttcacgcag agattttcat 3245 ctattatact ttatcaaaga ttggccatgt tccacttgga aatggcatgc aaaagccatc 3305 atagagaaac ctgcgtaact ccatctgaca aattcaaaag agagagagag atcttgagag 3365 agaaatgctg ttcgttcaaa agtggagttg ttttaacaga tgccaattac ggtgtacagt 3425 ttaacagagt tttctgttgc attaggataa acattaattg gagtgcagct aacatgagta 3485 tcatcagact agtatcaagt gttctaaaat gaaatatgag aagatcctgt cacaattctt 3545 agatctggtg tccagcatgg atgaaacctt tgagtttggt ccctaaattt gcatgaaagc 3605 acaaggtaaa tattcatttg cttcaggagt ttcatgttgg atctgtcatt atcaaaagtg 3665 atcagcaatg aagaactggt cggacaaaat ttaacgttga tgtaatggaa ttccagatgt 3725 aggcattccc cccaggtctt ttcatgtgca gattgcagtt ctgattcatt tgaataaaaa 3785 ggaacttgg 3794 <210> 4 <211> 865 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Leu Val Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Gly Asn 1 5 10 15 Ser Phe Ser Gly Gly Gln Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp 20 25 30 Asn Tyr Glu Leu Pro Ala Thr Asn Tyr Glu Thr Gln Asp Ser His Lys 35 40 45 Ala Gly Pro Ile Gly Ile Leu Phe Glu Leu Val His Ile Phe Leu Tyr 50 55 60 Val Val Gln Pro Arg Asp Phe Pro Glu Asp Thr Leu Arg Lys Phe Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ala Tyr Glu Ser Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Thr Val 85 90 95 Ile Leu Gly Leu Lys Ile Val Tyr Tyr Glu Ala Gly Ile Ile Leu Cys 100 105 110 Cys Val Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr 115 120 125 Phe Phe Cys Met Cys Arg Cys Cys Asn Lys Cys Gly Gly Glu Met His 130 135 140 Gln Arg Gln Lys Glu Asn Gly Pro Phe Leu Arg Lys Cys Phe Ala Ile 145 150 155 160 Ser Leu Leu Val Ile Cys Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly 165 170 175 Phe Val Ala Asn His Gln Val Arg Thr Arg Ile Lys Arg Ser Arg Lys 180 185 190 Leu Ala Asp Ser Asn Phe Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Asn Glu Thr 195 200 205 Pro Glu Gln Ile Lys Tyr Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Asp 210 215 220 Lys Ala Phe Thr Asp Leu Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ile Leu Asp Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile 245 250 255 Lys Ser Met Ala Thr Ala Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Met Asn Ser Thr Leu Lys Ser Leu His Gln Gln Ser Thr Gln Leu Ser 275 280 285 Ser Ser Leu Thr Ser Val Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ser Leu Asn Asp 290 295 300 Pro Leu Cys Leu Val His Pro Ser Ser Glu Thr Cys Asn Ser Ile Arg 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Gln Leu Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro 325 330 335 Pro Val Asp Ala Glu Leu Asp Asn Val Asn Asn Val Leu Arg Thr Asp 340 345 350 Leu Asp Gly Leu Val Gln Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro 355 360 365 Asp Arg Val Gln Arg Gln Thr Thr Thr Val Val Ala Gly Ile Lys Arg 370 375 380 Val Leu Asn Ser Ile Gly Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu 385 390 395 400 Pro Ile Gln Asp Ile Leu Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr 405 410 415 Glu Ser Tyr Ile His Arg Asn Leu Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Asp Ser 420 425 430 Tyr Trp Trp Leu Gly Gly Leu Val Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Ile 435 440 445 Val Ile Phe Tyr Tyr Leu Gly Leu Leu Cys Gly Val Cys Gly Tyr Asp 450 455 460 Arg His Ala Thr Pro Thr Thr Arg Gly Cys Val Ser Asn Thr Gly Gly 465 470 475 480 Val Phe Leu Met Val Gly Val Gly Leu Ser Phe Leu Phe Cys Trp Ile 485 490 495 Leu Met Ile Ile Val Val Leu Thr Phe Val Phe Gly Ala Asn Val Glu 500 505 510 Lys Leu Ile Cys Glu Pro Tyr Thr Ser Lys Glu Leu Phe Arg Val Leu 515 520 525 Asp Thr Pro Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Trp Glu Tyr Tyr Leu Ser Gly 530 535 540 Lys Leu Phe Asn Lys Ser Lys Met Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr 545 550 555 560 Ser Asp Cys Lys Lys Asn Arg Gly Thr Tyr Gly Thr Leu His Leu Gln 565 570 575 Asn Ser Phe Asn Ile Ser Glu His Leu Asn Ile Asn Glu His Thr Gly 580 585 590 Ser Ile Ser Ser Glu Leu Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe 595 600 605 Leu Leu Gly Ala Ala Gly Arg Lys Asn Leu Gln Asp Phe Ala Ala Cys 610 615 620 Gly Ile Asp Arg Met Asn Tyr Asp Ser Tyr Leu Ala Gln Thr Gly Lys 625 630 635 640 Ser Pro Ala Gly Val Asn Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Asp Leu Glu Ala 645 650 655 Lys Ala Asn Ser Leu Pro Pro Gly Asn Leu Arg Asn Ser Leu Lys Arg 660 665 670 Asp Ala Gln Thr Ile Lys Thr Ile His Gln Gln Arg Val Leu Pro Ile 675 680 685 Glu Gln Ser Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Gln Arg 690 695 700 Thr Gly Asn Gly Leu Leu Glu Arg Val Thr Arg Ile Leu Ala Ser Leu 705 710 715 720 Asp Phe Ala Gln Asn Phe Ile Thr Asn Asn Thr Ser Ser Val Ile Ile 725 730 735 Glu Glu Thr Lys Lys Tyr Gly Arg Thr Ile Ile Gly Tyr Phe Glu His 740 745 750 Tyr Leu Gln Trp Ile Glu Phe Ser Ile Ser Glu Lys Val Ala Ser Cys 755 760 765 Lys Pro Val Ala Thr Ala Leu Asp Thr Ala Val Asp Val Phe Leu Cys 770 775 780 Ser Tyr Ile Ile Asp Pro Leu Asn Leu Phe Trp Phe Gly Ile Gly Lys 785 790 795 800 Ala Thr Val Phe Leu Leu Pro Ala Leu Ile Phe Ala Val Lys Leu Ala 805 810 815 Lys Tyr Tyr Arg Arg Met Asp Ser Glu Asp Val Tyr Asp Asp Val Glu 820 825 830 Thr Ile Pro Met Lys Asn Met Glu Asn Gly Asn Asn Gly Tyr His Lys 835 840 845 Asp His Val Tyr Gly Ile His Asn Pro Val Met Thr Ser Pro Ser Gln 850 855 860 His 865 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 5 agccttcatc cacagatgct 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 6 ttttggattc atatgccttc tg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 7 cttcaccacc atggagaagg c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 8 ggcatggact gtggtcatga g 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 9 catgtttgga ggatcttgct agc 23 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 10 ttcccgcaca gcccc 15 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 11 atggccctcg tactcggctc cc 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 12 cttcaccacc atggagaagg c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 13 ggcatggact gtggtcatga g 21 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 14 cctggccaag gtcatccatg acaacttt 28

Claims (27)

1. (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계;

   (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계;

   (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 상기한 RNA상에서 정량적 PCR^TM을 실시하는 단계; 및

   (d) AC133 증폭 산물의 양과 비(非)-암세포중 증폭 산물의 양을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 상기 피검체의 세포중 AC133 증폭 산물의 양이 비-암세포중 AC133 증폭 산물의 양보다 증가하면 피검체에 암이 있음을 나타내는, 사람 피검체에서 암을 진단하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 암이 직장결장암, 방광암, 난소암, 고환암, 유방암, 피부암, 폐암, 췌장암, 위암, 식도암, 뇌암, 백혈병, 간암, 자궁내막암, 전립선암, 및 머리와 목의 암인 방법.
3. 제1항에 있어서, 암이 비-상피세포암인 방법.
4. 제3항에 있어서, 비-상피세포암이 골 육종, 연조직 육종 또는 위장관 기질종양인 방법.
5. 제1항에 있어서, 세포가 단핵 세포인 방법.
6. 제1항에 있어서, 세포가 암이 있는 것으로 이전에 진단받은 사람 피검체로부터 분리되는 방법.
7. 제1항에 있어서, 표본이 말초 순환계의 혈액인 방법.
8. 제1항에 있어서, 정방향 프라이머가 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'(서열 번호 1)의 DNA 서열로 구성되는 방법.
9. 제1항에 있어서, 역방향 프라이머가 5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'(서열 번호 2)의 DNA 서열로 구성되는 방법.
10. 제1항에 있어서, AC133 증폭 산물의 증가가 추가로 종양 부하를 예보하는 방법.
11. 제1항에 있어서, AC133 증폭 산물의 증가가 추가로 종양 재발을 예보하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 피검체 세포에서의 AC133 증폭 산물량의 증가를 토대로 하여 치료를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 피검체의 암을 치료함을 추가로 포함하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 피검체를 방사능치료법, 면역치료법, 화학치료법, 호르몬치료법 또는 유전자치료법으로 치료하는 방법.
15. (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계;

    (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계; 및

    (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 실시하는 단계를 포함하며, 이때 표본의 세포중 AC133 증폭 산물의 양을 표준 곡선과 비교하여 표본중 내피 전구세포의 총량을 추정하는, 표본 중의 내피 전구세포를 정량하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 골수 유래의 내피 전구세포의 공지된 양을 연속 희석시켜 표준 곡선을 유도하는 방법.
17. 제15항에 있어서, 방법의 정확도가 99%인 방법.
18. 제15항에 있어서, 검출 한계가 100만개 세포당 1개의 내피 전구세포인 방법.
19. (a) 피검체의 세포를 포함한 표본을 수득하는 단계;

    (b) 표본의 세포로부터 RNA 전사체를 수득하는 단계;

    (c) AC133 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 정량적 PCR^TM을 실시하는 단계; 및

    (d) AC133 증폭 산물의 양을 평가하는 단계를 포함하며, 이때 피검체 세포중 AC133 증폭 산물의 양이 피검체 세포의 혈관형성 활성의 지표인, 피검체의 세포중 혈관형성 활성을 모니터하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 표본이 말초 순환계의 혈액인 방법.
21. 제20항에 있어서, 순환 내피세포의 양을 평가함을 추가로 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 표본중 VEGF 수준을 평가함을 추가로 포함하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 피검체의 혈관형성 프로필을 발달시킴을 추가로 포함하는 방법.
24. 제19항에 있어서, 혈관 손상, 자가면역 질환, 심근경색 또는 패혈증의 유무를 검출하는데 사용되는 방법.
25. 제19항에 있어서, 피검체가 이전에 항혈관형성 치료를 받았고, 평가가 항혈관형성 치료의 효능의 평가를 포함하는 방법.
26. 제19항에 있어서, 정방향 프라이머가 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'(서열 번호 1)의 DNA 서열로 구성되는 방법.
27. 제19항에 있어서, 역방향 프라이머가 5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'(서열 번호 2)의 DNA 서열로 구성되는 방법.