KR20050028705A - 태그 서열에 혼성화하는 검출 프로브를 이용하는 표적핵산의 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; (b) 얻어진 증폭 산물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 혼성화하는 단계; (c) 상기 혼성화 반응물을 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브의 마이크로어레이 상에서 혼성화하는 단계; 및 (d) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 표적 핵산의 검출방법을 제공한다.
Description
본 발명은 표적 핵산을 증폭하고 이를 효율적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
핵산 증폭 방법은 특정한 표적 서열을 신속하게 검출할 수 있도록 하는데 있어서 강력한 기술이다. 당업계에 알려진 핵산 증폭 방법의 예에는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR : 미국특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호), 가닥 치환 증폭(SDA: 미국특허 제5,270,184호), 핵산서열기초증폭(nucleic acid sequence based amplification)(NASBA: 미국특허 제5,130,238호), 전사기초증폭(D.Kwoh 등, 1989. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177), 자가-유지 서열 복제(self-sustained sequence replication)(3SR: J. Guatelli 등, 1990. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) 및 Qβ 레플리카제 시스템(P.Lizardi 등, 1988. BioTechnology 6, 1197-1202)이 포함된다.
이렇게 증폭된 핵산을 마이크로어레이 상에서 확인 또는 정량하는 방법의 예에는 직접 표지법 및 샌드위치 분석법 등이 포함된다. 직접 표지법 중 직접적인 염료 주입법(direct dye incorporation method)은 PCR 반응물 중에 형광과 같은 표지로 표지된 단량체, 즉 형광 표지된 dNTP를 포함시킴으로써, PCR 산물을 직접적으로 표지한다. 상기 PCR 산물을 마이크로어레이상의 포획 프로브와 혼성화시킨 다음, 상기 표지로부터 발생하는 신호를 판독함으로써 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 방법이다. 이 방법은 별도의 표지 반응을 수행하지 않고, PCR을 통하여 표지할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 표지 효율이 높지 않고, PCR에 의하여 얻어지는 PCR 산물과 그로부터 얻어지는 신호와의 사이에 정량적인 상관관계를 얻기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 다중 PCR을 통하여 표적 핵산을 증폭시키는 경우, 사용되는 염료의 양도 증가함으로써 소비되는 비용이 증가하게 된다. 또 다른 직접적 표지법은 터미널 트란스퍼라제(terminal transferase)와 같은 효소를 이용하여 증폭된 산물의 말단에 염료를 표지하는 것이다. 그러나, 이러한 방법들은 효소 반응을 별도로 수행하여야 하고, 효소 활성을 일정하게 유지하기가 어렵기 때문에 데이터의 재현성이 낮다는 단점이 있다. 스택킹(stacking)을 이용한 분석법은 마이크로어레이에 고정화된 포획 프로브와 함께 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 표지된 검출 프로브(detection probe)를 이용한다(C. Mirkin, 미국특허 제6,582,921호). 즉, 표적 핵산을 증폭하고, 증폭된 표적 핵산을 마이크로어레이에 고정화되어 있는 포획 프로브와 검출 프로브와 혼성화시킨다. 이러한 혼성화 과정을 도 1에 도식적으로 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 표적 핵산(9)은 마이크로어레이(6)에 고정화된 포획 프로브(7)와 검출 프로브(8)에 혼성화된다. 다음으로, 상기 검출 프로브로부터 신호를 측정함으로써 검출 프로브와 표적 핵산의 혼성화 정도를 측정한다. 그 결과로부터, 표적 핵산의 존재 유무 또는 그 양을 정량적으로 측정할 수 있다. 그러나, 이 방법은 표적 핵산 내에 있는 특정한 서열에 상보적인 검출 프로브를 설계하여야 하고, 상기 검출 프로브는 특정한 서열을 갖는 표적 핵산에만 적용가능하고, 상기 특정한 서열에서 변이가 발생한 경우에는 오류가 발생할 수 있다는 단점이 있다. 그외에 프라이머의 말단에 바이오틴(biotin)과 같은 특정 분자에 친화성이 높은 분자를 결합시키고, 형광 표지된 스트렙타비딘(streptavidine)과 같은 상기 특정 분자를 이용하여 형광과 같은 신호를 나타나게 하는 방법(Affymetrix, 미국특허 제6,203,989호) 등이 알려져 있으나, 과정이 복잡하고 반응의 재현성 등에 있어 고도의 숙련된 기술이 요구되는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 증폭 과정 중에 염료(dye)와 같은 표지 물질을 별도로 결합시키지 않음으로써, 다중 PCR에서와 같이 복수개의 표적 핵산이 증폭되는 경우에도 간편에게 이용될 수 있는 표적 핵산을 검출하는 방법을 연구하던 중 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 하나 이상의 표적 핵산에 공통적으로 이용될 수 있는 검출 프로브를 이용함으로써, 표적 핵산을 간단하고 효율적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 있어서, "표적 핵산"이라는 용어는 증폭되어질 핵산 서열을 의미한다. 상기 표적 핵산은 또한 마이크로어레이 상에 고정된 포획 프로브가 결합하는 서열을 포함하는 핵산서열을 의미하기도 한다. "태그 서열"이라는 용어는 증폭용 프라이머의 5′쪽에 포함되어지는 임의의 서열로서, 증폭된 표적 핵산에 포함되어지는 서열을 말한다. "검출 프로브"라는 용어는 표적 핵산의 특정한 서열에 혼성화할 수 있어 표적 핵산의 검출을 목적으로 사용되는 프로브를 말한다. 본 발명의 방법과 관련되는 경우에는, 상기 태그 서열에 혼성화하는 서열을 갖는 핵산으로서, 증폭된 표적 핵산에 포함되어 있는 태크 서열과 혼성화되었을 때 상기 표적 핵산의 존재 유무 또는 그 양을 정량적으로 검출할 수 있도록 한다. 상기 검출 프로브는 표지되어 있을 수 있다. "프라이머"라는 용어는 핵산의 증폭 반응에서 표적 핵산에 혼성화하고, 핵산의 연장 반응이 일어나는 시발체로서 작용하는 핵산을 말한다. 본 발명의 방법에 사용되는 프라이머는 5′쪽에 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열의 하류에는 표적 핵산에 혼성화하는 서열을 포함하는 의미이다. 본 발명의 방법에서 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머 세트에 포함된 하나의 프라이머에는 상기 태그 서열이 포함되고 다른 프라이머에는 상기 태그 서열이 포함되지 않을 수 있다. 또한, 포워드와 리버스 프라이머 모두에 상기 태그 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 핵산이 다중 PCR과 같이 복수개의 프라이머 세트를 포함하는 반응 혼합물을 이용하여 PCR을 하는 경우에는, 각 프라이머 세트의 포워드와 리버스 프라이머 중 어느 하나 이상이 태그 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 "다중 PCR"이라는 용어는, 복수개의 프라이머 세트를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 하나의 튜브에서 PCR을 수행하여, 복수개의 표적 핵산을 하나의 튜브에서 증폭하는 것을 말한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;
(b) 얻어진 증폭 산물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 혼성화하는 단계;
(c) 상기 혼성화 반응물을 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브의 마이크로어레이 상에서 혼성화하는 단계; 및
(d) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계.
본 발명에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 포함한 프라이머를 이용하여 증폭하는 방법이면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 바람직하기로는, PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것이다. (b) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 예에 한정되는 것은 아니며, 신호를 발생 시킬 수 있는 물질이고, 검출 프로브와 태그 서열간의 혼성화를 방해하지 않는 물질이면 어느 것이나 포함된다. (d) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것일 수 있다. 그러한, 신호는 형광, 방사선과 같은 빛의 형태이거나 효소 활성으로부터 파생되는 간접적인 신호일 수도 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;
(b) 얻어진 증폭 산물을 마이크로어레이 상에 고정화된 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브와 혼성화하는 단계;
(c) 상기 혼성화 반응물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 혼성화하는 단계; 및
(d) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계.
본 발명에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 포함한 프라이머를 이용하여 증폭하는 방법이면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 바람직하기로는, PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것이다. (c) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 예에 한정되는 것은 아니며, 신호를 발생 시킬 수 있는 물질이고, 검출 프로브와 태그 서열간의 혼성화를 방해하지 않는 물질이면 어느 것이나 포함된다. (d) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것일 수 있다. 그러한, 신호는 형광, 방사선과 같은 빛의 형태이거나 효소 활성으로부터 파생되는 간접적인 신호일 수도 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;
(b) 얻어진 증폭 산물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 마이크로어레이 상에 고정된 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
(c) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 표적 핵산의 검출방법.
본 발명에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 포함한 프라이머를 이용하여 증폭하는 방법이면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 바람직하기로는, PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것이다. (b) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 예에 한정되는 것은 아니며, 신호를 발생 시킬 수 있는 물질이고, 검출 프로브와 태그 서열간의 혼성화를 방해하지 않는 물질이면 어느 것이나 포함된다. (c) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것일 수 있다. 그러한, 신호는 형광, 방사선과 같은 빛의 형태이거나 효소 활성으로부터 파생되는 간접적인 신호일 수도 있다.
본 발명의 방법에 사용되어지는 프라이머, 태그 서열, 검출 프로브 및 포획 프로브의 길이는 특별하게 한정되는 것은 아니며, 혼성화 조건과 검출하고자하는 목적 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 10∼200 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 10∼100 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 15∼50 뉴클레오티드를 갖는 것이다.
본 발명의 방법을 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다. 도 2는 태그 서열을 포함하는 증폭용 프라이머를 사용하여 표적 핵산을 증폭하는 과정을 나타내는 것이다. 그 결과 증폭된 표적 핵산에는 한쪽 또는 양쪽 말단에 태그 서열을 포함하게 된다. 도 3은 표적핵산과 마이크로어레이(6)에 고정화된 포획 프로브(7)와 검출 프로브(8)가 혼성화되어 있는 상태를 나타내는 도면이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 검출 프로브(8)는 표적 핵산(9)의 태그 서열 부분에 결합하기 때문에 태그 서열을 포함하는 것이면 표적 핵산의 서열 정보에 상관 없이 혼성화할 수 있다는 장점이 있다. 이는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 검출 프로브를 사용하기 때문에, 그러한 검출 프로브를 특별히 설계하여야 하고, 특정한 서열을 갖는 표적 핵산에만 결합하기 때문에 적용에 한계가 있는 스택킹(stacking)을 이용한 분석법과는 현저한 차이가 있는 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예1
본 실시예에서는 먼저 태그 서열을 5′말단 쪽에 포함하는 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 표적 즉, MODY 1 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하고, 농도를 측정하였다. 상기 PCR 산물을 상기 태그 서열에 상보적인 표지된 검출 프로브(detection probe)와 혼성화시켰다. 다음으로, 상기 혼성화 반응물을 상기 표적 핵산에 대하여 상보적인 서열을 가진 포획 프로브가 고정화되어 있는 포획 프로브의 마이크로어레이 상에서 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 끝난 후, 세척하고 스캔하여 혼성화의 정도를 측정함으로써 표적 핵산을 검출하였다. 이하 본 실시예의 실험과정을 구체적으로 설명한다.
(1) 태그 서열을 포함하는 프라이머를 이용한 PCR을 통한 MODY 1 유전자의 증폭
먼저, MODY 1 유전자의 7개의 엑손을 표적으로 표적으로 하는 프라이머 세트를 설계하였다(표 1 참조)(Bioneer, 대전, 한국). 상기 프라이머 세트에 포함되는 각 프라이머는 5′쪽에 태그 서열 1과 2(서열번호 1 및 2)를 포함한다. 상기 프라이머 세트를 2개의 군으로 나누어 정상인의 게놈을 주형으로 하여 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분 동안 초기 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 64℃에서 15초 및 72℃에서 40초를 7회 반복하고, 8회로부터 29회까지는 어닐링 온도와 연장 온도를 72℃로 통합하여 3분 동안 반응시켰다. 마지막으로, 30회에서는 72℃에서 3분 동안 최종 연장(final extention) 반응을 시켰다.
표 1. 프라이머 세트 군
| 표적 및 산물의 크기 | 프라이머 |
| Exon 2-534bp | 서열번호 5 |
| 서열번호 6 | |
| Exon 3-324bp | 서열번호 7 |
| 서열번호 8 | |
| Exon 4-338bp | 서열번호 9 |
| 서열번호 10 | |
| Exon 7-459bp | 서열번호 11 |
| 서열번호 12 | |
| Exon 8-506bp | 서열번호 13 |
| 서열번호 14 | |
| Exon 9-359bp | 서열번호 15 |
| 서열번호 16 | |
| Exon 10-417bp | 서열번호 17 |
| 서열번호 18 |
(2) PCR 증폭 산물과 검출 프로브를 먼저 혼성화시킨 다음, 얻어진 혼성화 산물과 포획 프로브와의 혼성화
얻어진 PCR 산물을 정제 한 다음, 상기 정제된 PCR 산물, 검출 프로브 1(서열번호 3) 및 검출 프로브 2(서열번호 4)를 혼성화 버퍼와 혼합하였다. 상기 검출 프로브 1과 2는 서열번호 3과 4에 나타낸 바와 같이, 5′말단에 Cy3가 부착되어 있는 것이다. 이때 PCR 산물 및 각 검출 프로브의 최종 농도는 100 nM이 되게 조절하였다.
다음으로, 상기 PCR 산물과 검출 프로브의 혼성화 반응물을 상기 PCR 산물에 상보적인 포획 프로브가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에서 혼성화시켰다. 마이크로어레이 상에서 검색될 수 있는 MODY1 유전자에서 발견된 돌연변이의 종류 및 이들 각 돌연변이를 검출할 수 있는 포획 프로브는 표 2에 나타내었다. 상기 마이크로어레이 상에서 각 프로브는 각각 3개의 스팟(triplet spot)을 갖도록 배열하였다. 마이크로어레이 상에서의 혼성화 반응은 42℃에서 16시간 동안 6 x SSPET 버퍼 중에서 수행하였다. 마이크로어레이 상에서 혼성화 반응이 완료된 다음, 6 x SSPET와 3 x SSPET 버퍼 용액을 이용하여 각 5분 동안 세척하였다. 이상과 같은 마이크로어레이 상에서의 혼성화 결과를 Axon 4000B LASER 스캐너를 이용하여 스캐닝하고, 이미지 작업을 진행하였다.
그 결과, 얻어진 이미지는 4a에 나타내었다. 도 4a에서, 마이크로어레이 상의 포획 프로프의 배열은 표 3과 같았다.
표 2. MODY1 유전자의 돌연변이 및 그를 검출할 수 있는 포획 프로브
| 엑손 위치 | 돌연변이 명칭 | 특징 | 포획 프로브 |
| 2 | D69A | GAC -> GCC | MO1E02-01wp (서열번호 19 : 표준형) |
| MO1E02-01mp (서열번호 20 : 변이형) | |||
| 2 | F75fsdelT | TTC -> TC | MO1E02-02wp (서열번호 21 : 표준형) |
| MO1E02-02mp (서열번호 22 : 변이형) | |||
| 3 | K99delAA | GAC aaG -> GAC G | MO1E03-01wp (서열번호 23 : 표준형) |
| MO1E03-01mp (서열번호 24 : 변이형) | |||
| 3 | G115S | GGC -> AGC | MO1E03-02wp (서열번호 25 : 표준형) |
| MO1E03-02mp (서열번호 26 : 변이형) | |||
| 4 | V121I | GTC -> ATC | MO1E04-01wp (서열번호 27 : 표준형) |
| MO1E04-01mp (서열번호 28 : 변이형) | |||
| 4 | R127W | CGG -> TGG | MO1E04-02wp (서열번호 29 : 표준형) |
| MO1E04-02mp (서열번호 30 : 변이형) | |||
| 4 | R154X | CGA ->TGA | MO1E04-03wp (서열번호 31 : 표준형) |
| MO1E04-03mp (서열번호 32 : 변이형) | |||
| 4 | R154Q | CGA -> CAA | MO1E04-04wp (서열번호 33 : 표준형) |
| MO1E04-04mp (서열번호 34 : 변이형) | |||
| 7 | V255M | GTG -> ATG | MO1E07-01wp (서열번호 35 : 표준형) |
| MO1E07-01mp (서열번호 36 : 변이형) | |||
| 7 | Q268X | CAG -> TAG | MO1E07-02wp (서열번호 37 : 표준형) |
| MO1E07-02mp (서열번호 38 : 변이형) | |||
| 7 | E276Q | GAG -> CAG | MO1E07-03wp (서열번호 39 : 표준형) |
| MO1E07-03mp (서열번호 40 : 변이형) | |||
| 8 | R324H | CGC -> CAC | MO1E08-01wp (서열번호 41 : 표준형) |
| MO1E08-01mp (서열번호 42 : 변이형) | |||
| 9 | V393I | GTC -> ATC | MO1E09-01wp (서열번호 43 : 표준형) |
| MO1E09-01mp (서열번호 44 : 변이형) | |||
| 10 | I454V | ATC -> GTC | MO1E10-01wp (서열번호 45 : 표준형) |
| MO1E10-01mp (서열번호 46 : 변이형) |
표 3. 마이크로어레이 상의 포획 프로브의 배열 형태
| 1열 | 2열 | 3열 | 4열 | 5열 | 6열 | 7열 | 8열 | |
| 1행 | MO1E02-01wp | MO1E02-01mp | MO1E02-02wp | MO1E02-02mp | MO1E03-01wp | MO1E03-01mp | MO1E03-02wp | MO1E03-02mp |
| 2행 | MO1E04-01wp | MO1E04-01mp | MO1E04-02wp | MO1E04-02mp | MO1E04-03wp | MO1E04-03mp | MO1E04-04wp | MO1E04-04mp |
| 3행 | MO1E07-01wp | MO1E07-01mp | MO1E07-02wp | MO1E07-02mp | MO1E07-03wp | MO1E07-03mp | MO1E08-01wp | MO1E08-01mp |
| 4행 | MO1E09-01wp | MO1E09-01mp | MO1E10-01wp | MO1E10-01mp |
(3) PCR 증폭 산물과 포획 프로브를 먼저 혼성화시킨 다음, 얻어진 혼성화 산물과 검출 프로브와의 혼성화
PCT 증폭산물을 마이크로어레이 상의 포획 프로브와 먼저 혼성화시킨 다음, 얻어진 혼성화 산물을 검출 프로브와 혼성화시킨 다음 스캐너를 이용하여 스캐닝하였다.
마이크로어레이 상에서의 혼성화 반응은 42℃에서 16시간 동안 6 x SSPET 버퍼 중에서 수행하였다. 마이크로어레이 상에서 혼성화 반응이 완료된 다음, 6 x SSPET와 3 x SSPET 버퍼 용액을 이용하여 각 5분 동안 세척하였다. 다음으로, 혼성화 버퍼 용액에 용해된 검출 프로브(최종 농도 20nM)를 1시간 동안 상온에서 2차 혼성화시킨 다음, 상기와 같이 세척하였다. 이상과 같은 마이크로어레이 상에서의 혼성화 결과를 Axon 4000B LASER 스캐너를 이용하여 스캐닝하고, 이미지 작업을 진행하였다.
그 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에서, 마이크로어레이 상의 포획 프로브의 배열을 다음 표 3과 동일하다.
(4) 직접 표지법에 의한 표적 산물의 PCR 증폭 및 증폭 산물의 혼성화
본 발명의 검출방법을 종래의 검출방법과 비교하기 위하여, 종래의 직접 표지법에 의한 PCR을 통하여 표적 산물을 증폭하고, 증폭 산물을 마이크로어레이 상의 포획 프로브와 혼성화하여 증폭 산물을 검출하였다.
먼저, 직접 표지법에 의한 PCR에 사용된 직접 표지 시약(direct labeling reagent)의 조성은 다음과 같다: 물(dH2O), 27.9㎕; 10x버퍼, 5㎕; dNTP(dA, dG, dC = 200μM, dT = 40μM), 0.5㎕; 주형 DNA (200ng/㎕), 1㎕; Taq 폴리머라제 (3U), 0.6㎕; 프라이머(200nM), 14㎕; cy3-dUTP (20μM), 1㎕. 또한, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성시키고, 95℃에서 30초(변성), 63℃에서 15초(어닐링) 및 72℃에서 3분(연장)을 40회, 72℃에서 3분 동안 최종 연장하고 4℃에서 보관하였다.
그 결과를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에서, 마이크로어레이 상의 포획 프로브의 배열을 표 4와 동일하다.
표 4. 마이크로어레이 상의 포획 프로브의 배열 형태
| 1열 | 2열 | 3열 | 4열 | 5열 | 6열 | 7열 | 8열 | |
| 1행 | + | - | MO1E02-01wp | MO1E02-01mp | MO1E02-02wp | MO1E02-02mp | MO1E03-01wp | MO1E03-01mp |
| 2행 | MO1E03-02wp | MO1E03-02mp | MO1E04-01wp | MO1E04-01mp | MO1E04-02wp | MO1E04-02mp | MO1E04-03wp | MO1E04-03mp |
| 3행 | MO1E04-04wp | MO1E04-04mp | MO1E07-01wp | MO1E07-01mp | MO1E07-02wp | MO1E07-02mp | MO1E07-03wp | MO1E07-03mp |
| 4행 | MO1E08-01wp | MO1E08-01mp | MO1E09-01wp | MO1E09-01mp | MO1E10-01wp | MO1E10-01mp |
도 4a, 4b 및 4c에 나타낸 바와 같이, 종래 직접 표지 PCR에 의하여 증폭된 표적 핵산을 혼성화시킨 마이크로어레이의 배경(background) 형광강도는 평균 150이었으나(도 4c 참조), 본 발명의 방법에 따른 검출 방법에 의하는 경우 각각 106 및 60으로서 배경 형광강도가 현저히 감소하였음을 알 수 있다(도 4a 및 4b 참조). 특히, 본 발명의 방법 중 PCR 증폭 산물을 마이크로에레이에 고정화된 포획 프로브와 먼저 혼성화시킨 다음, 얻어진 혼성화 산물과 검출 프로브를 혼성화시킨 다음 검출하는 방법의 경우, 종래 직접 표지법에 비하여 배경 형광강도가 40% 수준에 불과하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써, 배경 형광강도가 낮게 측정되어 노이즈에 대한 신호(signal to noise)의 비율을 높일 수 있는 효과를 얻을 수 있었다.
얻어진 상기 이미지 데이터를 이용하여 특정 유전자 변이를 검출하기 위한 포획 프로브 스팟의 형관신호를 분석하였다. 표준형을 검출하기 위한 포획 프로브 스팟의 형광신호(wp)의 로그 값을 x 축으로 하고, 표준형을 검출하기 위한 포획 프로브 스팟의 형광신호에 대한 돌연변이형을 검출하기 위한 포획 프로브 스팟의 형광신호의 비율(wm/wp)의 로그 값을 y 축에 표시하여, 그래프 분석을 하였다. 그 분석 결과의 일 예로서, 엑손 10의 I454V 돌연변이와 그 표준형을 검출하기 위한 포획 프로브, 즉 MO1E10-01mp 및 MO1E10-01wp 스팟의 형광신호 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서, 원(●)으로 표시된 데이터는 상기 (4)에 따라 직접 표지법에 의하여 증폭된 표적에 대한 형광 강도를 분석한 것이고, 삼각형(▲)으로 표시된 데이터는 상기 (2)에 따라 분석된 증폭된 표적에 대한 형광 강도를 분석한 것이고, 역삼각형(▼)으로 표시된 데이트는 상기 (3)에 따라 분석된 증폭된 표적에 대한 형광 강도를 분석한 것이고, 다이아몬드(◆)는 PCR 콘트론에 대한 결과이다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 (2)와 (3)에 따라 분석된 증폭된 표적에 대한 형광 강도는 상기 (4)의 종래의 직접 표지법에 따라 분석된 증폭된 표적에 대한 형광 강도와 거의 유사하였다. 특히, 상기 (3)에 따라 분석된 증폭된 표적에 대한 형광강도가 종래의 방법로부터 얻은 결과와 거의 일치하였다.
이상과 같이, 본 발명의 방법에 의한 표적 핵산의 검출 방법은 종래의 직접 표지법에 의한 표적 핵산 검출 방법과 비교하여 형광 강도의 관점에서 거의 유사한 결과를 얻을 수 있었다(도 5 참조). 또한, 배경 신호의 관점에서 종래의 직접 표지법에 의한 표적 핵산 검출 방법과 비교하여 아주 우수한 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 의하면, 다중 PCR에 의하여 증폭된 복수 개의 표적 핵산에 대하여도 동일한 검출 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 표적 핵산의 종류가 증가함에 따라 소요되는 비용 상승율이 상대적으로 낮으며, 별도의 표지 반응을 수행하지 않는다는 점에서 간단하게 수행할 수 있다는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 방법을 이용함으로써 얻어지는 경제적인 효과는 상업적으로 얻을 수 있는 형광 염료의 소모량이 종래의 직접 표지 PCR 방법으로 시료를 준비하는 과정에서 소비되는 형광 염료와 비교하여 2% 정도에 불과하며, 직접 표지 과정에서 오는 PCR 반응의 지연 또는 중단과 같은 부작용을 피할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종래의 샌드위치 분석법의 일부으로서 표적 핵산이 검출 프로브와 포획 프로브와 혼성화된 상태를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 방법에 사용되는 태그를 포함하는 증폭 프라이머에 의하여 표적 핵산이 증폭되는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따른 표적 핵산의 검출과정의 일부로서 표적 핵산이 검출 프로브와 포획 프로브와 혼성화된 상태를 나타내는 것이다.
도 4a 및 4b는 PCR에 의하여 직접 표지된 표적 핵산을 검출하기 위하여 사용된 마이크로어레이의 포획 프로브 배열 및 그를 이용한 표적 핵산 검출 결과를 나타내는 것이다.
도 4c 및 4d는 본 발명의 방법에 따라 표적 핵산을 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO. LTD
<120> A method for detecting a target nucleic acid by using a detection
probe capable of hybridizing with a tag sequence
<130> PN050238
<160> 46
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tag sequence 1
<400> 1
tgttctcttg tcttg 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tag sequence 2
<400> 2
atcggtttgt ttgtc 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> detection probe 1 coupled with Cy3 dye at the 5' terminal
<400> 3
caagacaaga gaaca 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> detection probe 2 coupled with Cy3 at 5' terminal
<400> 4
gacaaacaaa ccgat 15
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
agcggaggcc aggttttgca ccggctccca ccccagaagg t 41
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
aggcccgcca ctctgcaaaa ccatgagccc aagtgtgccc attt 44
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
agcggaggcc aggttttgca cccgggatga agagatgaga gcactg 46
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
aggcccgcca ctctgcaaaa ggggcctgcc actgagtcat aaag 44
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
agcggaggcc aggttttgca agacaccccc accccctact cca 43
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
aggcccgcca ctctgcaaaa gctgcaaact gggccatgtg aaac 44
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
agcggaggcc aggttttgca ccctgcaggt cctcctccca cag 43
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
aggcccgcca ctctgcaaaa actgcgcccg gccatattgt ctc 43
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
agcggaggcc aggttttgca atgctggcgt accctggttg ttgag 45
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
aggcccgcca ctctgcaaaa caaagcggca cagtggggaa gc 42
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
agcggaggcc aggttttgca ggcgtcccaa ggcctgaggt ct 42
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
aggcccgcca ctctgcaaaa caatcttgcc ctttattccc taccc 45
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
agcggaggcc aggttttgca ggcagggtgg gaggggagaa c 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
aggcccgcca ctctgcaaaa gcgtcagggt gcagtgggat gt 42
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 19
ctgtgacggc tgca 14
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 20
ctgtgccggc tgca 14
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 21
tgcaagggct tcttccggag g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 22
tgcaagggct tcccggagga g 21
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 23
tcctcttgtc tttgtccac 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 24
cactggttcc tcgtctttg 19
<210> 25
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 25
cgggctggca tga 13
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 26
cgggctagca tga 13
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 27
ctggacggct gtg 13
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 28
tctggatggc tgt 13
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 29
atccggtccc gct 13
<210> 30
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 30
atccagtccc gct 13
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 31
ggtacctgtc gggacagga 19
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 32
gtacctgtca ggacagga 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 33
cggtacctgt cgggacagg 19
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 34
ggtacctgtt gggacagg 18
<210> 35
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 35
gacacccggc tca 13
<210> 36
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 36
tggacatccg gct 13
<210> 37
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 37
ctcctggaag ggca 14
<210> 38
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 38
agctcctaga aggg 14
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 39
aggcatactc attgtca 17
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 40
aggcatactg attgtca 17
<210> 41
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 41
ccaaagcggc cac 13
<210> 42
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 42
ccaaagtggc cac 13
<210> 43
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 43
acgatgacgt tggt 14
<210> 44
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 44
acgatgatgt tggt 14
<210> 45
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for wild type
<400> 45
tgggggatgg cag 13
<210> 46
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for mutant type
<400> 46
gggggacggc aga 13
Claims (15)
- (a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;(b) 얻어진 증폭 산물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 혼성화하는 단계;(c) 상기 혼성화 반응물을 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브의 마이크로어레이 상에서 혼성화하는 단계; 및(d) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 표적 핵산의 검출방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (d) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;(b) 얻어진 증폭 산물을 마이크로어레이 상에 고정화된 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브와 혼성화하는 단계;(c) 상기 혼성화 반응물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 혼성화하는 단계; 및(d) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 표적 핵산의 검출방법.
- 제6항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, (c) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, (d) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 핵산 시료로부터 하나 이상의 프라이머의 5′말단 쪽에 태그 서열을 포함하고 3′말단 쪽에 표적 결합 서열을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계;(b) 얻어진 증폭 산물을 상기 태그 서열에 특이적으로 결합하고 표지가 되어 있는 검출 프로브와 마이크로어레이 상에 고정된 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합하나 태그 서열에는 결합하지 않는 포획 프로브와 혼성화시키는 단계; 및(c) 상기 혼성화 결과를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 표적 핵산의 검출방법.
- 제11항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 PCR 또는 SDA를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭은 다중 PCR을 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, (b) 단계에서 상기 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 수용체 및 리간드로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, (c) 단계에서 혼성화 결과의 측정은 상기 검출 프로브의 표지로부터 발생하는 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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