KR20050024421A - 티말파신을 사용한 종양 항원 발현의 상향 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 처리하지 않은 종양 세포의 것과 비교하여 TLP의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 티말파신(thymalfasin)을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 항원 발현을 상향조절(up-regulating)하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 처리하지 않은 종양 세포의 것과 비교하여 TLP의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 티말파신을 세포에 투여하여 타겟 종양세포를 전-처리(pre-treating)하는 것을 포함하는, 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 생체내 및 생체외 진단방법들에 모두 적용가능하고, 생체내 면역치료 방법들에도 적용가능하다.

Description

티말파신을 사용한 종양 항원 발현의 상향 조절 방법{METHOD OF UP-REGULATING TUMOR ANTIGEN EXPRESSION USING THYMALFASIN}

본 출원은 2002년 6월 28일에 출원된 가출원 60/391,969의 혜택을 주장한다.

본 발명은 암 진단 및 암 치료 분야에 관한 것이고, 또한, 암의 진단 및 치료에서 티말파신(thymalfasin, 티모신 알파-1 (thymosin α-1))의 용도에 관한 것이다.

항암 백신, 면역-영상 및 약물전달 기술의 개발은, 종양 세포막에서 나타나고 MHC-1 분자에 의해 적합하게 표현되는 특이적 분자 타겟(예를 들어 종양 항원, tumor antigen)의 확인에 모두 의존한다. 항원의 확인은 종양 면역치료 및 특히 암 백신 개발에서 중심적인 문제를 남겼다. 다양한 종양-특이적 항원이 확인되었지만, 이러한 항원의 발현 수준 및/또는 MHC-1 분자에 의한 일정하지 않은 표현 때문에, 암세포의 존재를 검출하고 파괴할 수 있는 충분한 특이성 및 민감도를 갖는 면역 치료 및 면역-기초 진단 방법을 개발하는 것이 어려웠다. 종양 항원 검출에 대한 증가된 민감도는 더욱 공격적으로 전이상태를 치료하게 할 뿐만 아니라, 질병의 초기 단계에서의 진단 및 더욱 적은 수의 종양 세포를 가진 초기단계에서의 치료를 가능케 한다.

이미, 우리는 종양 특이적 항원인, TLP가 인간 및 실험적 종양에서 발현되고 보존된 서열을 갖는다는 것을 밝혔다. 이것은, TLP가 면역 진단방법 및 면역 치료방법에서 타겟 항원으로서 좋은 후보자로서 사용할 수 있게 하지만, TLP의 발현수준은 종양 분자 타겟 대부분에서와 같이 이러한 목적을 위한 이상적인 것보다는 낮은 수준이다.

티모신 알파-1, 즉 티말파신은 순환에서 정상적으로 발견되는 28-아미노산 펩티드이다. 티말파신은 IL-2, T 세포 IL-2 수용체, IFNα 및 IFNγ의 가슴샘 세포 성장, 분화 및 생성을 자극한다. Baxevanis, 1990; Bepler, 1994; Serrate, 1987; Stzein, 1989. 티모신 알파 1은 MHC 클래스 I 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다. Giuliani, 2000. 티말파신은 만성 B형 및 C형 간염, 후천성 면역결핍증(AIDS), 백신화에 대한 감소된 반응 및 암을 포함하는 다수의 질병에서 이의 치료적 가능성이 평가되었다. Andreone, 1996; Garaci, 1998, 2000; Gravenstein, 1986; Mutchnick, 1999; Sherman, 1998.

티말파신이 생체외 또는 생체내에서 대장암 세포에서의 TLP의 발현을 상향조절할 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 증가된 TLP 발현은, 예를 들어 방사능-면역 유도 외과수술 또는 면역-신티그래픽(immuno-scintigraphic) 기술과 같은 향상된 암세포 타겟팅에 기초한 향상된 진단 및 치료 방법의 다양화를 가능케 한다.

진전된 암, 특히 전이단계의 암의 보다 공격적이고 철저한 치료 뿐만 아니라 암의 초기 검출 및 치료를 가능케 하는, 티말파신과 같은 비독성 처리로 종양 항원의 발현을 증가시킬 수 있는 능력은 치료 및 진단목적 모두에 매우 유용하다.

도면의 간단한 설명

도 1 : TLP는 직장 암 세포주 DHD-K12의 세포막상에 발현된다.

도 2 : 직장 암 세포주 WiDr의 세포표면상에서의 TLP 발현은 티말파신의 처리에 의해 증가된다.

도 3 : 복수(ascite)로부터의 종양 세포상의 TLP 발현은 티말파신으로 동물을 처리함으로써 증가된다.

TLP 항원의 발현은 티말파신으로 상향 조절될 수 있다. 증가된 발현은 특정 CD8 개체군의 유발로부터의 더욱 효과적인 CTL 반응에 이를 수 있다. 부가적으로, 이러한 증가된 발현은 방사능-면역 유도 외과수술 또는 면역-신티그래픽 기술에서 세포들이 더욱 우수하게 타겟되고 검출되도록 할 수 있다. 또한, 인간 항원을 자연적으로 발현하는 실험 종양은 전-임상 모델의 개발에서 매우 유용하다. 본원 발명의 방법으로 종양 항원 발현을 향상시키는 것은 진단 및 면역 치료 방법에 증가된 민감도를 부여하는데, 이는 더욱 초기의 암의 진단 및 치료를 가능케 하고, 전이된 암을 포함하는 진전된 암의 더욱 공격적이고 철저한 치료를 가능케한다.

티말파신 펩티드의 TLP 발현-향상의 양은 통상적인 투여량-적정 실험에 의해 측정할 수 있다. TLP의 상향 조절은, 2㎍/㎏체중 내지 6㎎/㎏체중의 티말파신으로, 바람직하게는 20㎍/㎏ 내지 200㎍/㎏의 티말파신으로 투여함으로써 생체내에서 달성될 수 있다. 티말파신은 16㎎/복용량/1일 으로 인간에 투여되는 때에 안전한 것으로 알려졌고, 6㎎/kg/1일의 복용량으로 랫트에서 투여되는 때에 안전한 것으로 알려졌다.

티말파신은 예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내 또는 직접 종양 주위 영역으로 주사 또는 주입과 같은 당업계에서 공지된 다양한 수단으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 티말파신 펩티드는, 주사용 물, 생리학적 농도의 염수 또는 이와 유사한 물질과 같은 약리학적으로 허용되는 액체 담체에서 존재할 수 있다. 피하로 주사된 티말파신의 혈장 반감기는 약 2시간 정도일 뿐이다. Rost, et al., 1998. 그러나, 폴리머를 티말파신 펩티드에 콘쥬게이션시키면 펩티드의 혈장 반감기를 실질적으로 증가시킨다. Rasi, et al. (발간되지 않은 관찰). 콘쥬게이트된 티말파신의 경우에 대하여 적용할 때, 상기 투여량은 조성물에 존재하는 티말파신 펩티드만을 반영하고 여기에 콘쥬게이트된 폴리머의 중량은 반영하지 않는다.

티말파신 펩티드의 분리, 특성분석 및 사용은 예를 들어, U.S. Patent No. 4,079,127, U.S. Patent No. 4,353,821, U.S. Patent No. 4,148,788 및 U.S. Patent No. 4,116,951에 설명되어 있다. 본 발명은 자연적으로 발생되는 티말파신 뿐만 아니라 자연 발생 티말파신의 아미노산 서열, 이와 실질적으로 유사한 아미노산 서열 또는 이들의 생략된 서열을 갖는 합성 티말파신 및 재조합 티말파신 및, 예를 들어, 티말파신과 실질적으로 동일한 활성을 갖고 실질적으로 동일한 방식으로 기능하는 티말파신과 충분한 아미노산 상동성을 갖는 티말파신 펩티드와 같은, 티말파신의 것과 실질적으로 유사한 생물활성도를 보유하는 치환된, 결실된, 연장된, 대체된 또는 다른 방식으로 변형된 서열을 갖는 이들의 생물학적 활성 유사체를 포함하는 티말파신 펩티드에 적용된다.

실시예 1 (생체외)

WiDr(인간), IA-XsSBR(랫트) 및 DHD-K12(랫트) 직장암 세포주를 티말파신으로 5 - 100㎍/㎖에서 6 - 48시간 동안 처리하였다. TLP의 9 아미노산 펩티드 에피토프(CSH-275)에 대하여 생성된 TLP 항혈청을 사용하여, TLP 항원 발현을 플로우 사이토메트리(flow cytometry, FC)로 측정하였고, 항원의 위치는 동일초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning miscroscopy, CLSM)으로 측정하였다.

TLP는 모든 3가지의 직장 세포주에서, (투과화 시킨 후에 CLSM 및 FC에 의해) 세포의 30 - 55% 범위로 세포질에서, (FC에 의해)세포의 10 - 20%의 범위로 세포막에서 자연적으로 발현되었다. 도 1. 티말파신은 테스트된 모든 세포주에서 이러한 항원의 발현을 향상시킬 수 있다. 도 2. 향상의 수준 및 세포질과 비교한 막에서의 위치화는 투여량 및 처리 타이밍에 따라 변화하고, 세포의 90%의 발현수준에까지 이를 수 있다.

실시예 2 (생체내)

BD-IX 랫트는 동일계 DHD-K12 세포로 i.p. 주사하고, 티말파신으로 i.p. 또는 s.c. 처리하였다. TLP 발현 및 위치화는 복강 또는 종양조직 양쪽으로부터 얻은 종양 세포에 대하여 상기한 바와 같은 방법으로 측정하였다.

티말파신으로 처리한 동물로부터의 종양세포는 생체외에서 보여지는 것과 유사한 TLP 발현의 향상을 입증한다. 도 3.

참조(Reference)

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Baxevanis, C.N., et al., "Enhancement of human T lymphocyte function by prothymosin alpha: increased production of interleukin-2 and expression of interleukin-2 receptors in normal human peripheral blood T lymphocytes," Immunopharmacol. Immunotoxicol. 12 (4): 595-617 (1990).

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Giuliani, C., G. Napolitano, A. Mastino, S. Da Vincenzo, C. D'Agostini, S. Grelli, I. Bucci, D.S. Singer, L. D. Kohn, F. Monaco, E. Garaci & C. Favalli, "Thymosin-α1 regulates MHC class I expression in FRTL-5 cells at transcriptional1 level," Eur. J. Immunol. 30: 778-86 (2000).

Gravenstein S., Ershelr W. B., Drumaskin S., Schwab R.,Weksler M. E., "Anti-influenza antibody response: augmentation in elderly "non-respoders" by thymosin alpha 1,"Gerontologist 26: 150A (1986).

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Serrate S., Schulof R., Leondaridis L., Goldstein A. L., Sztein; M. B. , "Modulation of human natural killer cell cytotoxic activity, lymphokine production, and interleukin 2 receptor expression by thymic hormones", J. Immunol. 139: 2338-2343 (1987).

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Claims (10)

1. 처리하지 않은 종양 세포의 것과 비교하여 TLP의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 티말파신(thymalfasin)을 종양 세포에 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 항원 발현을 상향 조절(up-regulating)하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 투여는 생체내에서(in vivo) 환자에게 투여하는, 종양 세포 항원 발현을 상향 조절하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 티말파신을 2㎍/㎏체중 내지 6㎎/㎏체중의 투여량으로 투여하는 종양 세포 항원 발현을 상향 조절하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 티말파신은 20㎍/㎏체중 내지 200㎍/㎏체중의 투여량으로 투여하는 종양 세포 항원 발현을 상향 조절하는 방법.
5. 처리하지 않은 종양 세포의 것과 비교하여 TLP의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 티말파신을 세포에 투여하여 타겟 종양세포를 전-처리(pre-treating)하는 것을 포함하는, 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 투여는 생체내에서 환자에 대한 투여인, 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 티말파신은 2㎍/㎏체중 내지 6㎎/㎏체중의 투여량으로 투여하는 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 티말파신은 20㎍/㎏체중 내지 200㎍/㎏체중의 투여량으로 투여하는 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 투여는 생체외(in vitro)에서 세포에 대한 투여인, 종양 세포 항원 발현을 상향 조절하는 방법.
10. 제5항에 있어서, 상기 투여는 생체외에서 세포에 대한 투여인, 면역진단 또는 면역치료 방법의 민감도를 증가시키는 방법.