KR20050011016A - 가금 티푸스 원인균 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성이있는 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금용복합미생물제제

Info

Abstract

Description

Claims

KR20050011016A

Publication number: KR20050011016A
Application number: KR1020030049791A
Authority: KR
Inventors: 구동환; 복진덕; 한영숙; 박근수; 박승환
Original assignee: 주식회사 중앙바이오텍
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2003-07-21
Publication date: 2005-01-29
Also published as: KR100500397B1

본 발명은 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금용 복합미생물제제에 관한 것으로, 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성이 높은 축산 분뇨 또는 토양에서 분리한 신규한 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24 및 락토바실러스 플랜타륨(Lctobacillus plantarum) Hans 1-19 균주를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 복합미생물제제는 가금 티푸스 원인균에 대한 항균 활성이 높아 동물용 항생제 대체제로서 사용이 가능하며, 이를 사료에 0.2% 혼합 급여 시 산란계의 분변균총 중 살모넬라와 대장균 수를 줄여 이들에 의한 폐사를 줄일 수 있으며, 산란계의 산란율과 난각두께와 난황색도를 개선시키는 뛰어난 효과가 있다.

가금 티푸스 원인균 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성이 있는 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금용 복합미생물제제{Bacillus strain having antibiotic activity against Salmonella gallinarum inducing fowl typhoid and a mixed microbial agent comprising the strain}

본 발명은 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금용 복합미생물제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 축산 분뇨, 토양, 분변 등으로부터 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성을 갖는 미생물을 분리하고 이를 제제화하여 가금 티푸스 원인균의 생육을 억제 또는 사멸시킬 뿐만 아니라 가금의 산란율과 폐사율을 개선시키는 가금용 복합미생물제제에 관한 것이다.

1992년 8월 하순 우리나라에서 가금 티푸스가 김포군 소재 15만수 규모의 산란계 농장에서 발생되어 거의 전국적으로 확산되었으며, 무더운 여름철에는 그 피해가 매우 심각한 양상으로 나타나고, 또한 점차 해를 거듭할수록 이 병의 국내 오염이 증가함에 따라 다른 계절에서의 발생 빈도 역시 높아가는 추세에 있다. 병의 확산을 억제하기 위하여 백신이나 항균성 약제를 사용하였으나 방제가 매우 어려웠으며, 국내에서 발생하는 가금 티푸스 원인균은 병원성이 매우 강하여 한 번 발생한 농장은 거의 대부분의 경우 농장 내 닭이 모두 비워질 때까지 발병이 지속되어 각종 방역 수단을 동원한 사후 처리에도 불구하고 효과적으로 예방과 치료를 하는 데는 실패하였다.

현재, 양계, 젖소 등에 대한 항생제 사용이 금지되고 있으며, 호르몬제 역시 사용이 금지되고 있고, 미국 식품의약국(FDA)에서는 동물 성장 촉진용으로 페니실린이나 테라마이신 등의 항생제 사용을 금지하고 있는 실정이다. 또한 안전하고 위생적인 축산물에 대한 소비자의 욕구가 높아진데다 정부 또한 검사 강화 방침을 세워 농축가들 스스로가 유해 물질 잔류에 대한 불안으로 항생, 항균제를 사용하는 대신 생균제를 사용한 제품에 대한 선호도가 높아지고 있다. 주로, 락토바실러스속(Lactobacillus), 바실러스속(Bacillus), 클로스트리둠속(Clostridum), 효모 등의 유용균을 함유한 생균제가 부각되기 시작하였다.

살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum)에 의해 유발된 가금 티푸스의 방제 대책으로는 위생을 중점으로 하는 소독방법, 백신을 이용한 면역학적 방법 및 생균제 투여에 의한 살모넬라의 경쟁적 축출방법이 있다.

이 중 생균제를 이용한 살모넬라의 경쟁적 축출방법은 각종 유익한 생균 배양액을 갓 태어난 병아리에 투여함으로 이들 병아리의 장관 속을 유익한 세균총으로 유도함으로써 이후 자연 환경이나 사료로부터 감염되는 살모넬라의 장관 정착을 미리 방지한다.

이점에 착안하여 본 발명자는 축산 폐수, 토양, 분변 등으로부터 가금 티푸스 원인균에 항균활성을 가진 미생물을 분리하고 이를 제제화하여 상기 미생물제제를 산란계에 처리함으로써 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum)의 생육을 억제 또는 사멸시킬 뿐만 아니라, 산란율 및 폐사율을 개선시키는 복합미생물제제를 제공하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 축산 폐수, 토양, 분변 등으로부터 분리한 가금티푸스 원인균에 항균활성이 있는 균주를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 가금 티푸스를 예방 및 치료할 수 있고, 장내 미생물의 균총을 개선시키며, 산란계의 산란율 및 폐사율을 개선시키고, 난각두께 및 난황색도를 개선시키는 생균 또는 대사 물질을 함유하는 복합미생물제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가금 티푸스의 예방 및 치료에 효과가 있는 복합미생물제제를 유효성분으로 함유하는 가금 사료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 축산 분뇨 또는 토양 등에서 곡물 흡착 건조 능력이 뛰어나고 내 산성, 내 담즙성, 내 열성이 높고 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 뛰어난 균주를 분리 동정한 후, 상기에서 얻은 균주를 포함하는 복합미생물제제를 제조하고 이를 사료에 첨가하여 산란계에 급여시킨 다음 가금 티푸스에 대한 방어효과, 산란계의 산란율과 폐사율에 미치는 영향 및 산란계의 난각두께 및 난황색도에 미치는 영향을 조사함으로써 달성되었다.

이하 본 발명을 구체적으로 상세하게 설명한다.

도 1은 축산 분뇨 또는 토양에서 분리한 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu 88 균주를 나타낸 사진도이다.

도 2는 축산 분뇨 또는 토양에서 분리한 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 본 발명바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu 24 균주를 나타낸 사진도이다.

도 3은 축산 분뇨 또는 토양에서 분리한 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 본 발명락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)Hans 1-19 균주를 나타낸 사진도이다.

도 4는 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu 88 균주의 페이퍼 디스크법에 따른 살모넬라 갈라나륨 균에 대한 항균활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu 88 균주와 살모넬라 갈리나륨(Salmonell gallinarum)균을 혼합배양한 후 항균활성을 나타낸 사진도이다.

도 6은 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu 88 균주의 배양액과 살모넬라 갈라나륨 균을 혼합하여 평판배지에 도말한 결과를 나타낸 사진도이다.

도 7은 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤 Gu 88 균주의 야생형 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성 효과를 나타낸 결과이다.

도 8은 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤 Gu 88균주와 살모넬라 갈리나륨을 혼합배양한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu 24 균주와 살모넬라 갈리나륨을 혼합배양한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명 복합미생물제제의 제조공정을 도시한 것이다.

도 11은 본 발명 복합미생물제제를 산란계에 급여 시 산란율에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명 복합미생물제제를 산란계에 급여 시 폐사율에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 13은 본 발명 복합미생물제제를 산란계에 급여 시 분변세균에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 14는 본 발명 복합미생물제제를 산란계에 급여 시 난각두께(난황고) 및 난황색도에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 축산 분뇨 또는 토양 등에서 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 세균의 분리·동정 단계; 상기로부터 분리한 균주를 포함하는 복합미생물제제의 제조단계; 상기 복합미생물제제의 가금 티푸스에 대한 방어효과, 산란계의 산란율 및 폐사율, 산란계의 난각두께 및 난황색도에 대한 영향 조사단계로 구성된다.

본 발명의 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 높은 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 KCTC 10498BP 균주는 그람 염색에 양성을 띠고, 포자를 형성하며 열, 산 및 담즙에 대한 내성을 가지며, 운동성이 있으며, 본 발명 복합미생물제제에는 6~10 Log cfu/g 이 함유되고, 바람직하게는 6 Log cfu/g 으로 함유됨을 특징으로 한다.

본 발명의 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 높은 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24 KCTC 10496BP 균주는 열, 산 및 담즙에 내성이 좋으며, 유용한 효소를 많이 생성하며, 상품화된 대표적인 항균 활성 물질은 바시트라신(Bacitracin)이 있고, 본 발명 복합미생물제제에는 7~10 Log cfu/g이 함유되고, 바람직하게는 7 Log cfu/g 이 함유됨을 특징으로 한다.

본 발명의 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) Hans 1-19 KCTC 10497BP 균주는 항균활성이 높고 본 발명 복합미생물제제에는 7~10 Log cfu/g 이 함유되고, 바람직하게는 7 Log cfu/g 이 함유되며, 다른 유산균과는 달리 산업 현장에서 배양하기 쉬우며, 내산성과 내담즙성, 내열성이 뛰어나 장내에 생존해 들어가는 균수가 많으며, 장내 사료 이용성이 높고, 산 생성력이 뛰어나 장내 병원균의 성장을 억제하여 장내 균총 정상화에 기여하는 특징이 있다.

본 발명의 복합미생물제제에 포함되는 싸카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae) CYC-809 KCTC 8910P 균주는 한국생명공학연구소내 미생물기탁센타에서 분양받은 균주이며 본 발명 복합미생물제제에 7~10 Logcfu/g이 함유되고, 바람직하게는 7 Log cfu/g 이 함유되며, 본 발명 균주의 성장을 돕기 위하여 제제에 첨가하며, 이 균은 장내에서 유해 산소를 이용해 CO₂를 생성하여 장내 환경을 혐기 조건으로 조성하는데 기여하며 이러한 작용에 의해서 유산균의 성장을 돕는 특징이 있다. 장내에서 사멸된 싸카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae)는 다당류의 상태로 효모 세포벽에 있던 만난 올리고당이 용출되어 유해균과 결합하여 체외로 배설시키는 작용을 하며, 또한 풍부한 아미노산과 비타민, 미네랄 및 미지 성장 인자를 가지고 있다.

본 발명의 실시예에서 사용된 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨 균은 본 발명자가 야생에서 분리하여 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 복합미생물제제는 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 KCTC 10498BP, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24 KCTC 10496BP, 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) Hans 1-19 KCTC 10497BP 및 싸카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae) CYC-809 KCTC 8910P 균주 각각을 단독 배양하여 상기 균주 배양액을 부형제 곡물에 혼합하여 일정 온도에서 숙성시킨 후 열풍 건조기에서 수분 함량 12% 이하로 건조시킨 후 각각 메쉬 입도에 맞게 분쇄하여 20 kg 단위로 포장함을 특징으로 한다.

본 발명 복합미생물제제는 양계용 사료에 0.2%의 양으로 첨가되며, 사료의 종류나 형태에 상관없이 사용될 수 있다.

본 발명 복합미생물제제를 유효성분으로 함유하는 사료에 있어서, 복합미생물제제는 미생물의 생균체 혹은 생균체 건조분말 혹은 그것의 배양산물 혹은 대사산물 중 어느 하나를 포함함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 본 발명 미생물 균주의 선별

본 발명 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum)에 대해 항균활성을 갖는 균주를 분리하기 위해, 축산 분뇨 또는 토양에서 바실러스(Bacillus spp.)종들을 비롯한 유산균을 분리하고 항균활성을 측정하기 위하여 -78℃에 보관하면서 필요 시 3번 계대배양하여 사용하였다. 3번 계대배양한 균을 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 원심분리한 다음 그 상등액을 여과 멸균한 후 0.5 mL을 4.5 mL의 멸균 TSB배지에 첨가(10%)하여 살모넬라 갈리나륨을 약 1x10⁵cfu/mL 접종하여 37℃에서 18시간 배양했을 때 살모넬라 갈리나륨이 성장하지 못하는 균을 선발하였다. 선발된 균주를 그람 염색, 형태 관찰, 포자형성 유무, 운동성 시험 및 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 및 API 50 CHL kit와 API 50 CHL database V4.0을 이용하여 동정하였다. 또한, 불명확한 균은 16S rRNA의 염기서열을 분석방법을 병행하였다.

그 결과, 가장 강력한 항균 활성을 나타내는 균주는 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa)(도 1)과 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)(도 2)과 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum)임을 확인하였다. 상기 균주들 중 페니바실러스 폴리마이샤는 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88로 명명하고 2003년 7월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10498BP를 부여받았다. 또한, 바실러스 서브틸러스는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24로 명명하고 2003년 7월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10496BP를 부여받았다. 락토바실러스 플랜타륨 균주는 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) Hans 1-19로 명명하고 2003년 7월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10497BP를 부여받았다.

상기 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주의 특성과 기질 이용성을 표 1과 2에 나타내었다.

구분	특징
포자형성	형성함
운동성	있음
그람염색	양성
배양특징	배양 시 배양액을 검화 시킴

기질	이용성	기질	이용성	기질	이용성
글리세롤	+	인노시톨	-	인눌린	+
에리스리톨	-	만니톨	-	멜레찌토즈	-
D-아라비노즈	-	솔비톨	-	D-라피노즈	+
L-아라비노즈	+	α-메틸-D-만노사이드	-	아미돈	+
리보오즈	+	α-메틸-D-글루코사이드	+	글리코겐	+
D-자일로스	+	N-아세틸 글루코사민	-	자일리톨	-
L-자일로스	-	아미그달린	+	β-겐티오바이오스	+
아도니톨	-	알부틴	+	D-튜라노오즈	+
β-메틸자일로사이드	+	에스툴린	+	D-라이조오즈	-
갈락토즈	+	살리신	+	D-타가토오즈	-
D-글루코즈	+	셀로바이오스	+	D-퓨코즈	-
D-플락토즈	+	말토즈	+	L-퓨토즈	-
D-만노즈	+	락토즈	+	D-아라비톨	-
L-소보즈	-	멜리바이오스	+	L-아라비톨	-
람노즈	-	싸카로스	+	글루코네이트	-
둘시톨	-	쓰레할로즈	+	2 세토 글루코네이트	-
둘시톨	-	쓰레할로즈	+	5 세토 글루코네이트	-

상기 표에서 +는 양성, -는 음성을 나타낸다(API 50 CHL kit를 이용함).

실시예 2: 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤( Paenibacillus polymyxa ) Gu88 균주의 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성 조사

상기 실시예 1에서 분리한 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주의 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성은 페이퍼 디스크법에 따라 조사하였다. 1x10⁵cfu/mL의 살모넬라 갈리나륨(Salmonell gallinarum)을 트립틱 쏘이 아가(TSA) 평판 배지에 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주의 배양 상등액을 여과 멸균하여 8 mm 페이퍼 디스크(paper disc)에 40 ㎕점적하였을 때 항균활성도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

비교예 1: 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤( Paenibacillus polymyxa ) Gu88 균주의 항균활성 조사(I)

살모넬라 갈리나륨(Salmonell gallinarum)균을 각각 10⁵cfu/mL 씩 함유하고 있는 2 mL의 트립틱 쏘이 브로스(TSB)배지가 들어있는 시험관에 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주의 배양 상등액을 0.3%와 0.5%씩 첨가하여 온도가 각각 25℃, 30℃, 37℃로 조절된 배양기에 넣어 24시간 배양한 다음 그 결과를 도 5에 나타내었다.

이때, A1은 시험액 0.3%를 첨가(25℃), A2는 시험액 0.5% 첨가(25℃), B1는 시험액 0.3% 첨가(30℃), B2는 시험액 0.5% 첨가(30℃), C1은 시험액 0.3% 첨가(37℃), C2는 시험액 0.5% 첨가(37℃), D는 시험액이 없이 살모넬라 갈리나륨(Salmonell gallinarum)균 10⁵cfu/mL만 들어있는 TSB 배지를 37℃에서 배양한 결과를 사진으로 나타낸 것이다.

비교예 2: 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤( Paenibacillus polymyxa ) Gu88 균주의 항균활성 조사(II)

본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주가 살모넬라 갈리나륨(Salmonell gallinarum)균을 사멸시키는 것인지(bacteriocidal)를 조사하기 위하여 균주 배양액 0.5%와 살모넬라균 1x10⁵cfu/mL을 혼합하여 2시간 배양한 후 시료를 채취하여 희석한 다음 평판배지에 도말하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 살모넬라균은 시험액과 접촉 시 생존력을 잃어 버려 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주는 살모넬라균을 사멸시키는 것을 알 수 있었다.

비교예 3: 본 발명 균주의 야생형 살모넬라균에 대한 항균활성 조사(III)

본 발명 페니바실러스 폴리마이샤 Gu88 균이 트립틱 쏘이 브로스(Tryptic Soy Broth)배지에서 야외에서 직접 분리한 살모넬라 갈리나륨 균을 억제할 수 있는지를 알아보기 위해 살모넬라균과 경합배양을 실시하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 균주는 살모넬라 갈리나륨을 완전히 사멸시키는 것으로 나타났다.

비교예 4: 본 발명 페니바실러스 폴리마이샤( Paenibacillus polymyxa ) Gu88균주와 바실러스 서브틸러스( Bacillus subtilis ) Gu24 균주의 살모넬라균에 대한 항균활성 조사

본 발명 페니바실러스 폴리마이샤 Gu88균과 바실러스 서브틸러스 Gu24 균주를 멸균된 사료 10%와 함께 살모넬라 갈리나륨균이 들어있는 삼각플라스크에서 혼합 배양한 결과, 도 8과 9에 나타난 바와 같이, 상기 두 균주 모두 살모넬라균을 15시간 이후에 완전히 사멸시키는 것으로 나타났다.

실시예 3 : 본 발명 균주의 독성시험

본 발명 페니바실러스 폴리마이샤 Gu88 균주를 ICR 마우스에서 간이독성검사를 실시하였다. 태어난 지 2주령 되는 ICR 마우스를 분양받아 사육케이지 당 4마리를 넣어 1주일 동안 안정을 취하였다. 사육 환경은 21℃±3℃, 상대 습도는 40∼60%이었으며, 케이지 내의 깔짚은 3일에 한번씩 갈아주었다. 실험균주의 접종량은 펠렛 사료에 균주 배양액 1.2 mL을 사료 60 g에 분주하여 사료 대비균 접종액이 0.2%가 되도록 하여 20분 가량 정치한 후 사료 급여 통에 넣어두었다. 독성 검사는 간접적인 방법으로 각각 개체에 대한 일당 증체량과 사료 효율과 사료 요구율을 대조구와 비교하였으며, 직접적인 방법으로 각각 개체의 적혈구와 백혈구 수를 측정하여 대조구와 비교하여 독성유무를 판단하였다. 표 3은 각 균주의 급여에 의한 ICR 마우스의 사양 효과를 나타낸 자료이며, 표 4는 각 균주의 급여에 의한 ICR 마우스의 혈액내의 적혈구 수와 백혈구 수를 나타낸 자료이다. 사양 성적이나 혈액 성상 등의 수치가 대조구와 차이가 없어 독성이 없는 것으로 나타났다.

사양 효과균 주	일당 증체량	사료 효율	사료 요구율
대조구	0.521	0.031	1.95
페니바실러스 폴리마이샤 Gu88	0.62	0.032	1.93
바실러스 서브틸러스 Gu24	0.62	0.031	1.95
락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19	0.63	0.032	1.93

(단위: g)

혈 구균 주	적혈구 수(1x10⁶/mL)	백혈구 수(1x10³/mL)
대조구	8.659±1.436	6.439±0.879
페니바실러스 폴리마이샤 Gu88	8.320±1.089	7.126±1.013
바실러스 서브틸러스 Gu24	7.245±1.096	6.665±1.045
락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19	8.888±0.653	7.773±1.675

실시예 5: 본 발명 균주를 포함한 복합미생물제제의 제조 공정 및 배지 성분 함량

가금 티푸스를 예방 및 치료하기 위한 복합미생물제제를 제조하기 위해, 상기 실시예 1에서 선발한 균주에 부용제 곡물을 혼합하여 건조시켜 제조하였다.

우선, 페니바실러스 폴리마이샤 Gu88 균주와 락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19 균주의 경우, 하기 표 5∼6의 배지 조성에 따라 균주 배양배지를 제조하여 121℃에서 30분간 멸균한 다음, 페니바실러스 폴리마이샤 Gu88 균주와 락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19 균주를 상기 액체배지에 2%으로 각각 접종하고, 각각 30℃와 37℃에서 배양하였다. 그 후, 상기 각 균주 배양액에 1 : 1 : 1의 비율로 혼합한 옥분, 말분 및 탈지강을 4 : 5의 비율로 첨가하고 53℃에서 24시간 동안 열풍 건조하여 최종 수분 함량이 12% 이하가 되도록 한 다음 메쉬 사이즈 32에서 분쇄하여 20 kg 단위로 포장하였다.

페니바실러스 폴리마이샤 Gu88 균의 배양 배지 조성

구성 요소	함량(g/liter)
무수포도당(Glucose)	10
대두분	15
LS 300	1

락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19 균의 배양 배지 조성

구성 요소	함량(g/liter)
당밀(Cane molasses)	50
Corn Steep Liquor(CSL)	50
pH	7.0

바실러스 서브틸리스 Gu24 균주의 경우, 고체배양 곡물(옥분, 말분, 탈지강을 1 : 1 : 1의 비율로 혼합함)을 121℃에서 30분간 멸균한 다음, 멸균 증류수에서 18시간 배양된 상기 균주(10%)의 배양액을 상기 멸균 곡물에 4 : 5의 비율로 혼합하고 37℃에서 48시간 동안 캐비넷 배양하였다. 그 후 상기 혼합액을 53℃에서 24시간 동안 열풍 건조하여 최종 수분 함량이 12% 이하가 되게 하고 이를 메쉬 사이즈 32에서 분쇄하여 20 kg 단위로 포장하였다.

상기로부터 얻은 균주 분말을 하기 표 7에 따라 첨가하여 복합미생물제제를 제조하였다. 도 10에 본 발명 복합미생물제제의 제조공정을 도시하였다.

구성 요소	함량(g/kg)
페니바실러스 폴리마이샤 Gu88	1x10¹⁰
락토바실러스 플랜타륨 Hans 1-19	1x10⁹
바실러스 서브틸리스 Gu24	1x10¹⁰
싸카로마이세스 세레비제	1x10¹⁰
옥분	333g
말분	333g
탈지강	333g

실시예 6: 본 발명 복합미생물제제의 가금 티푸스에 대한 방어효과

상기 실시예 5에서 제조한 복합미생물제제를 초생추 병아리에 급여함으로써가금 티푸스 공격 접종 시 방어효과를 조사하였다. 본 발명 복합미생물제제를 사료에 0.4% 첨가하여 자연 급여시킨 처리구와 사료에 아무것도 첨가하지 않은 대조구를 두어 가금 티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나륨 균을 10⁸cfu/마리 씩을 인위적으로 공격 접종하였을 때 실시예 1에서 선발된 균주의 방어효과를 수행하였다.

표 8에 나타난 바와 같이, 급여구는 36 마리중 10마리가 폐사하여 27.8%가 사멸한 반면 대조구인 비급여구는 22마리가 폐사하여 61%의 치사율을 보였다. 방어효과는 비급여구의 22마리 폐계 중 급여구에서 12마리가 보호되어 55%의 보호 효과를 보였다.

실시예 7: 본 발명 복합미생물제제의 산란계의 산란율에 대한 효과 조사

상기 실시예 5에서 제조한 본 발명 복합미생물제제의 산란계의 산란율에 미치는 효과를 조사하기 위해, 경기도 화성군 독정리에 소재한 7만수 산란계 농장인 삼주농장에서 실험대상으로 1만 수인 1개 동을 선택하여 본 실험을 수행하였다. 51주령(2002년 7월 9일)부터 53주령까지는 콘트롤 기간으로 잡았으며, 실제 실험기간은 54주령인 8월 16일부터 68주령인 11월 11일까지 약 3개월간 실시하였다. 실험기간동안 어떠한 항생제도 사용치 않았으며, 생균제 사용량은 사료 1톤당 2 kg을 혼합하여 최종 농도 0.2%로 조절하였다. 이 농장의 사육 환경은 다른 산란계 농장과 거의 같았다.

도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명 복합미생물제제를 급여 시 산란계의 산란율이 평균 5% 정도 개선되었다.

실시예 8 : 본 발명 복합미생물제제의 산란계의 폐사율에 대한 효과 조

상기 실시예 7에 따라 본 발명 복합미생물제제를 산란계에 급여한 후 산란계의 폐사율을 조사하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명 복합미생물제제를 급여 시 산란계의 폐사율은 감소하는 추세를 나타냈다.

실시예 9 : 본 발명 복합미생물제제의 분변세균에 대한 효과 조사

본 발명 복합미생물제제의 분변세균에 대한 효과를 조사하기 위해, 실시예 7에 따라 산란계의 분변세균 중 살모넬라 배양배지에서 생성되는 균수와 유산균 배양배지에서 생성되는 균수와 TSB배지에서 생성되는 균수를 측정하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 유산균 수와 TSB 배지에서 성장하는 총균수는 일정하게 유지되었지만 대장균 배지와 살모넬라 배지에서 형성되는 집락의 수는 급여 후 현저히 감소하였다.

실시예 10: 본 발명 복합미생물제제를 산란계 급여 시 난각두께와 난황색도에 미치는 영향 조사

본 발명 복합미생물제제를 산란계 급여 시 난황두께와 난황색도에 미치는 영향은 경기도 안성시 일죽면에 소재하는 일죽농장에서 조사하였다. 상기 농장은 총 12만수의 규모로 그중 3만수가 들어있는 무창 계사에 일일 사료 급여량 중 본 발명 복합미생물제제를 0.2% 급여하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명 복합미생물제제를 급여 시 난각두께와 난황색도가 현저하게 개선되었다.

상기 실시예 및 비교예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대해 항균활성이 있는 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 가금용 복합미생물제제에 관한 것으로, 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나륨에 대한 항균활성이 높은 축산 분뇨 또는 토양에서 분리한 신규한 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24 및 락토바실러스 플랜타륨(Lctobacillus plantarum) Hans 1-19 균주를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 복합미생물제제는 가금 티푸스 원인균에 대한 항균 활성이 높아 동물용 항생제 대체제로서 사용이 가능하며, 이를 사료에 0.2% 혼합 급여 시 산란계의 분변균총 중 살모넬와 대장균 균수를 줄여 이들에 의한 폐사를 줄일 수 있으며, 산란계의 산란율과 난각두께와 난황색도를 개선시키는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 축산방제산업상 매우 유익한 발명인 것이다.

미생물제제 비 급여구

가금 티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum)에 대해 항균활성을 가지는 대사산물을 생산하고, 그람 염색에 양성 반응을 나타내며, 포자를 형성하며, 운동성이 있으며 배양 시 배양액을 검(gum)화 시킴을 특징으로 하는 페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 KCTC 10498BP .
페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 KCTC 10498BP 균주를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 가금 티푸스의 예방 및 치료용 미생물제제.
페니바실러스 폴리마이샤(Paenibacillus polymyxa) Gu88 KCTC 10498BP 균주, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Gu24 KCTC 10496BP 균주, 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) Hans 1-19 KCTC 10497BP 균주 및 싸카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae) CYC-809 KCTC 8910P 균주를 각각 단독 배양하여 각각의 액체 배양액 1x10⁶∼1x10⁷cfu/g에 멸균한 곡물 부용제(옥분, 말분 및 탈지강을 1 : 1 : 1의 비율로 혼합함)을 첨가하여 상기 혼합물을 열풍 건조한 다음 수분 함량이 0∼12% 가 되게 하고 이를 메쉬 사이즈 32에서 분쇄하여 제조됨을 특징으로 하는 가금 티푸스의 예방 및 치료용 복합미생물제제.
제 3항에 있어서, 상기 균주의 생균체 혹은 그것의 배양산물 혹은 대사산물을 포함함을 특징으로 하는 가금 티푸스의 예방 및 치료용 복합미생물제제.
제3항 기재의 복합미생물제제를 함유함을 특징으로 하는 가금 사료용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 복합미생물제제는 총 무게당 0.2%의 함량으로 첨가됨을 특징으로 하는 가금 사료용 조성물.