KR20050008237A - 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 그제조용 조성물, 그로부터 제조된 커버슬립을 구비한슬라이드 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 슬라이드 구조체는, 지지층, 상기 지지층의 상면 중앙부에 안착되는 조직 절편 및 상기 조직 절편의 외부 노출면을 완전히 감싸도록 형성되며, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 액상 커버 슬립을 포함하여 구비된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 광학해상도가 개선되어 조직 절편에 대한 미세 관찰 및 미세 영역에 대한 정밀한 선택이 가능하며, 조직 절편이 무수(non-aquous) 상태를 유지함으로써 외부와 차단되어 조직 절편 내 거대분자물질의 파괴 또는 변성 문제를 원천적으로 해결하였다.

Description

조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 그 제조용 조성물, 그로부터 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법{Liquid cover slip for protection of tissue section on slide from macromolecule-degradation and for improvement of optical resolution, composit for producing of the same, structure of slide having the same and method for manufacturing the same}

본 발명은 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미세 절제 장치의 광학현미경으로 관찰되며 레이저빔에 의해 절제되는 슬라이드 기판 상부에 탑재된 조직 절편의 광학해상도를 증진시킴과 동시에 조직 절편 내의 DNA, RNA, 단백질 등의 거대분자물질(macromolecule)의 파괴를 방지하여 물질 보존성을 향상시키는 기능을 갖는 액상 커버 슬립, 이를 제조하기 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 광학현미경으로 생물 조직의 특정 조직 절편을 관찰하기 위해서는 사전에 여러 단계를 거쳐 관찰용 슬라이드가 제작되고 있다. 구체적으로 살펴보면, 인간을 포함한 동물, 식물 및 미생물 등의 생체원으로부터 필요한 조직의 일부를 채취한 후, 조직절편을 고정시키는 단계(fixing), 조직 절편 내에 남아 있는 수분을 제거하는 탈수단계(dehydration), 상기 탈수과정에서 조직 절편 내부로 침투한 알코올을 자일렌(xylene)으로 대체시키는 투명화단계(clearing), 파라핀용액이 조직 내에 포함되도록 하여 파라핀 블록형태로 제조되는 포매단계(embedding)를 각각 거친다. 이후, 파라핀 블록을 소정 두께로 절편하는 박절단계(section)를 진행하고, 박편상태로 절편된 조직 절편을 슬라이드 상부에 탑재시킨 후, 광학현미경 관찰을 위해 소정의 염료를 이용하여 세포내 구성요소에 대한 염색을 행하는 염색단계(staining)로 진행된다.

한편, 동결조직 절편기(crymicrotome)를 이용하여 박편의 조직 절편을 제조하는 경우에는 상기 조직 절편을 파라핀블록 상태로 제조하는 포매단계를 거치지 않고도 신속하게 현미경 관찰을 위한 조직 절편을 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 실시예에서 채택되는 조직 절편은 파라핀블록 상태로 준비될 수도 있음은 물론, 동결조직 절편기를 이용하여 제조된 동결절편 상태로 준비된 후 이용될 수 있다.

그러나, 이러한 통상적인 조직 절편의 제작과정은 형태학적인 보존성(preservation)은 양호하나 조직 내부의 거대분자물질(macromolecule)이 상기 조직 절편의 제작과정 중, 고정과정이나 파라핀(paraffin) 포매 과정 중에 손상되는 단점이 있다. 한편, 동결조직 절편기를 이용하여 동결절편을 제작하는 경우에는 조직의 고정이나 파라핀 포매 과정이 없어도 되므로 조직 내 거대분자물질들이 잘 보존되는 장점이 있기는 하나 형태학적 보존상태가 불량한 것이 단점이다. 한편, 동결절편제작 방법은 거대분자물질의 보존성이 양호한 점은 있으나, 절제 조직을 새로이 확보해야하는 단점이 있으며, 통상적인 조직제작 방법으로 제작된 파라핀 블록은 이미 각 병원이 많이 확보되어 있어 샘플 확보가 아주 용이하다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 이상에서 살펴본 조직 절편을 준비하는 각 방법이 갖는 장단점을 충분히 고려하여 미세 절제 기술에 이용할 조직 절편의 제작 방법 중 어느 것으로 할 것인가를 결정하여야 한다.

광학현미경으로 관찰되는 조직 절편 내의 특정세포나 특정부위만을 선택적으로 절제하여 채취한 후, 이들 세포로부터 추출한 DNA, RNA 또는 단백질을 대상으로 유전적 변화나 후속 연구를 시행하고 있는 미세 절제 기술 분야에서는 (1)광학현미경을 통한 조직 절편에 대한 정밀한 관찰은 당연히 전제되어야 하며, (2)조직 절편 내의 특정 영역에 대한 선택이 정밀하게 진행되어야 하고, (3)상기 선택된 영역에 대해서 용이하게 절제가 이루어져야 할 것이며, (4)절제된 조직 절편의 수거가 용이하게 이루어져야 하고, (5)미세 절제가 진행되는 동안 절제된 조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지하여 이들 세포로부터 추출한 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 진행하는 후속 연구에 장애가 없어야 함은 자명하다.

그런데, 종래에는 슬라이드 상부에 탑재된 조직 절편에 대해 염색단계까지 완결되면, 조직절편 자체와 유사한 굴절율(refractive index)을 보이는 봉입제(mounting media)를 슬라이드 상부면에 적하시킨 후, 커버글래스(cover glass)를 덮어주어 조직절편에서 일어날 수 있는 빛의 산란 현상을 막아줌으로써 광학해상도(optical resolution)를 개선시킨 후, 광학현미경 등의 관찰도구를 이용하여 조직절편을 관찰하고 있다. 그러나, 단순한 광학적 관찰 목적 이외에도, 슬라이드 상부에 탑재된 시료의 특정부위를 현미경 시야에서 레이저빔을 이용하여 미세 절제하기 위해서는 슬라이드 상부 면에 커버글래스를 탑재시키는 종래의 방법으로는 원하는 세포를 레이저로 절제한다는 것이 불가능하기 때문에 지금까지 커버글래스나 봉입제에 의한 처리없이 염색 후 건조된 조직 절편을 현미경으로 관찰하면서 미세 절제를 행하여왔다. 그러므로 광학해상도가 전혀 보상 또는 개선되지 않은 상태에서 미세 절제를 하여왔기 때문에 전암 병변과 같은 미세 변화가 있는 병변을 현미경 시야에서 충분한 정도로 구분 또는 식별이 이루어질 수 없는 기술적 한계를 초래하고 있다.

이하에서, 기존에 개발된 미세 절제 장비를 이용하여 미세 절제를 진행하는 과정에서 발생될 수 있는 문제 요인을 구체적으로 살펴보기 위해 종래의 미세 절제 장비의 원리를 개략적으로 설명하기로 한다.

레이저를 이용한 미세 절제 장비는 절제방식에 따라 크게 두가지 종류로 구분할 수 있다. 그중 하나는 레이저의 열을 이용하는 방식이며, 다른 하나는 레이저를 나이프(knife)로 이용하는 방식이다.

레이저의 열을 이용하는 방법은 미국의 A사의 미세 절제 장비에서 구현되고 있는 방식으로서, 유리판 슬라이드 위에 염색된 조직 절편을 탑재시킨 후, 조직 절편 상부를 투명한 열가소성 필름(thermoplastic film)으로 덮는다. 이어서, 광학 현미경으로 조직 절편을 관찰하면서 원하는 세포 영역 상부에서 레이저빔을 발사하면, 열가소성 필름의 아래 면이 살짝 녹으면서 점성력을 갖게 되어, 그 하부에 배치된 조직 절편의 선택된 세포 영역과 결착된다. 이후, 열가소성 필름을 들어올리면, 레이저빔이 조사된 영역 부위의 열가소성 필름 하부면에 원하는 세포만을 선택적으로 수거하게 된다.

레이저빔을 자르는 도구로서, 나이프(knife)로 이용하는 방식은, 독일의 P사, L사 및 M사의 미세 절제 장비에 공통적으로 채택되고 있는 방식으로, 상기 P사 및 L사의 장비에서는 337 나노미터(㎚)의 파장을 갖는 UV 레이저빔을 사용하고 있으며, 상기 M사의 장비에서는 350 나노미터(㎚)의 파장을 갖는 UV 레이저빔을 사용하고 있으며, 이들 모두의 장비들은 레이저의 광분해(photolysis) 원리를 이용하여 얇은 막이나 조직절편을 정교하게 절제하고 있다.

상기 P사의 미세 절제 장비는 유리 슬라이드 위에 박막의 폴리에틸렌 나프탈레이트(이하, 'PEN'이라 약칭하기도 함)막을 편편하게 펴서 가장자리를 따라 접착제로 붙인다. 이후, 박막의 PEN 막 중앙 상부에 조직 절편을 탑재하고 조직 절편에 대한 염색을 행한다. 이어서, 조직 절편에 대한 현미경 관찰을 통해서 원하는 세포나 세포집단의 영역을 폐곡선으로 선택한 후, 선택된 영역에 대해 폐곡선을 따라가면서 초점이 정교하게 조절된 레이저빔을 조사한다. 레이저빔이 조사된 물질층, 즉 조직 절편을 비롯한 PEN 막 등에서 광분해가 일어나면서 정교하게 절제가 이루어진다. 절제를 위한 레이저빔의 제1단계 조사가 종결되면, 레이저 절제시의 초점과 다른 심도로 초점 심도를 조절한 후, 절제된 영역을 잔존영역으로부터 이탈시키기 위한 제2단계의 레이저빔이 조사된다. 상기 제2단계 레이저빔의 조사는 상기 제1단계 레이저빔의 조사시의 초점 심도와는 달리, 레이저빔의 초점이 절제 영역에 형성되지 않도록 초점 심도를 조절한 후 절제된 영역에 대해 이루어지도록 한다. 상기 제2단계로 조사된 레이저빔은 초점이 이탈된 상태로 조사되기 때문에 절제 영역에서는 더 이상의 광분해가 일어나지는 않으나 레이저빔이 갖는 광자흐름(photon flow)에 의해서 절제된 영역에 대해 일정한 장력(catapulting power)이 미치게 된다. 따라서, 레이저빔의 장력에 의해 절제된 영역이 잔존 영역과 분리되어 상방향으로 이탈되면, 그 상부에서 미네랄 오일(mineral oil)로 코팅되어 있는 수거튜브(collection tube)에 부착시킴으로써 절제 영역에 대한 수거가 이루어진다. 그러나, 이 방법은 광분해되는 초점을 맞춘(focusing) 부위와 장력효과(catapulting effect)를 위해 조절된 초점을 흐리게(defocusing)한 부위 간의 거리가 너무나 가깝기 때문에 제2단계 레이저빔 조사시 부분이나마 절제 영역에서 광분해가 일어날 수 있는 단점이 있다.

상기 P사 미세 절제 장비가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 L사의 미세 절제 장치에서는 장력 효과에 의해 절제된 조직 절편을 상방향으로 이탈시키기 위한 레이저빔의 제2단계 조사시 부분적인 광분해의 문제를 해결하기 위해 레이저를 이용한 조직 절편의 선택부위를 절제한 후, 절제된 영역이 자연 낙하하도록 하며, 수거용 튜브를 슬라이드 하부에 배치시키는 방법을 채택하였다. 그러나, 절제된 영역의 자연낙하 방식에 의한 수거 방법은 장비에 발생된 미세 정전기로 인하여 수거율이 저하되는 문제점을 안고 있다.

상기 M사의 장비는 상기 L사의 장비와 유사한 원리가 채택되어 사용되고 있지만, 미세 절제된 절제 영역에 대한 수거 과정이 자연낙하 방식 대신에 상부에서 접착성 캡(cap)으로 찍어내는 방식을 택하고 있으나, 이 방법은 수거 단계를 수행하기 위한 별도의 작업과정이 필요하며, 수거된 조직 절편을 회수하여 이용하는 것에 번거로움이 수반될 수 있는 단점이 있다.

미세 절제 장비 및 이를 이용한 관찰, 절제, 수거 등의 방법과 관련한 선행자료로는 미국특허출원번호, 09/043,093호, 국제출원공개번호 WO 99/39176호, 국제출원공개번호 WO 00/34757호, 미국특허번호 6,010,888호 등을 통해 더욱 상세하게확인할 수 있다.

그러나, 전술한 종래의 모든 미세 절제 장비들은 미세 절제 과정에서 커버글래스를 덮을 수 없는 한계로 인하여 광학해상도의 개선이 이루어질 수 없으므로, 절제 영역에 대한 미세한 관찰 및 선정이 용이하지 않은 문제가 내재되어 있는 기술적 한계에 노출되고 있음은 관련업계에서는 자명하게 이해되고 있다.

전술한 종래의 문제점에 기초하여 본 발명은, 1)현미경 관찰시 조직절편의 광학해상도를 충분한 정도로 향상시키고, 2)절제용 레이저빔에 의해 쉽게 절제가 이루어지게 하며, 3)절제 이후에는, 쉽게 제거될 수 있어서 절제된 조직 절편으로부터 RNA, DNA 및 단백질 추출 과정에 아무런 영향을 미치지 않아야 하며, 4)조직 절편의 거대분자물질(macromolecule)의 변성을 억제할 수 있어야 하며, 5)그 사용 및 취급이 간편하여야 하는 등의 여러 기술적 과제를 동시에 달성하고자 함에 있으며, 이러한 기술적 과제를 달성하기 위하여 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립, 이를 위한 조성물, 이를 이용하여 제조된 슬라이드 구조체 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 내지 도 3은 광학해상도의 차이를 설명하기 위한 비교예와 본 발명에 따른 실시예의 비교 사진들이다.

도 4 및 도 5는 조직 절편 내에 포함된 RNA 파괴 정도를 시간 변화에 따라 관찰한 비교예와 본 발명에 따른 실시예의 크로마토그래피의 실험결과 사진들이다.

도 6은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드의 파장대별 흡수 대역도이다.

도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 실시예에 관한 단면도들이다.

도 9는 상기 도 8에서 도시되고 설명된 슬라이드 구조체에 대한 미세 절제 및 수거를 설명하기 위한 단면도이다.

도 10은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체를 제조하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립은, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone) 중합체를 주성분으로 하여 제조되는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 커버슬립 내부에 UV 흡수 증진효과를 발휘할 수 있는 미량의 콩코레드(Congo Red)가 첨가되어 균일하게 분산된 상태로 제조되면 바람직하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조용 조성물은, 알코올; 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및 UV 흡수 증강제로서, 콩코 레드(Congo Red);를 포함하여 조성되어, 알코올을 용매로 하여 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하고, 미량의 콩고 레드가 포함된 용질이 용해되어 있는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 알코올 용매는 에탄올(ethanol) 또는 이소프로판올(isopropanol)을 이용하면 바람직하다. 특히, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고 레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 함유되어 있으면 더욱 바람직하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 슬라이드 구조체는, 지지층; 상기 지지층의 상면 중앙부에 안착되는 조직 절편; 및 상기 조직 절편의 외부 노출면을 완전히 감싸도록 형성되며, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립;을 포함하여 구비된 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 지지층은, 고분자필름층으로 구비되면 바람직하다. 한편, 상기 고분자필름층 하부면에 면하여 층간접착부재에 의해 부착된 슬라이드 기판을 더 구비하면 바람직하다. 또한, 층간접착부재에 의해 상기 고분자필름층 하부면에 부착된 슬라이드 기판은, 상기 고분자필름층 상부에 안착된 조직절편이 점유하는 영역을 포함하는 평면영역의 직하방으로 소정의 개구부인 윈도우가 구비되어 있는 윈도우형 슬라이드 기판인 경우에는 더욱 바람직하다. 상기 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 조성물을 이용하여 형성하면 바람직하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 슬라이드 구조체를 제조하는 방법은, (a)윈도우 슬라이드 기판 상부면의 가장자리에 층간점착성부재를 이용하여 고분자필름층을 부착시키는 단계; (b)윈도우리드가 결합된 상태의 윈도우 슬라이드 기판 상부면에 부착된 고분자필름층의 중앙 소정부 상면에 미리 준비된 조직 절편, 바람직하게는 동결절편을 안착시키는 단계; (c)상기 윈도우리드를 슬라이드 기판으로부터 제거하고, 슬라이드 판 상부에 안착된 조직 절편의 내부 구성물질에 대한 선택적으로 염색하는 단계; 및 (d)조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 이용하여 상기 조직 절편의 외부 노출면을 모두 감싸는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성시키는 단계;를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 (a)단계의 윈도우형 슬라이드 기판은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 기능성 엔지니어링 플라스틱의 일종인 폴리에테르이미드(Polyetherimide)와 정전기방지제가 미량 첨가된 물질로 제조된 것을 이용하면 바람직하다. 한편, 상기 (a)단계의 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 이용하면 바람직하다.

상기 (d)단계의 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물은, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올 용매; 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및 UV 레이저빔 흡수 증강제인, 콩고레드;를 포함하여 조성된 것을 이용하면 바람직하다. 이때, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 포함된 것을 이용하면 더욱바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 설명하고, 발명에 대한 이해를 돕기 위해 필요한 경우에는 첨부도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것이다.

본 발명에서 사용된 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 다양한 분자량을 갖는 고분자 중합체 물질로서, 인체에 무해하며, 물과 알코올 양쪽 모두에 용해되는 성질을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 조직 절편을 감싸는 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성하기 위해서 무수(non-aqueous) 상태의 알코올 용매를 이용하여 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다. 통상 조직 절편의 내부 구성물질들은 외기 또는 수분에 대해 쉽게 손상을 받기 때문에 알코올 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 에탄올 또는 이소프로판올이 더욱 바람직하다.

그런데, 슬라이드 구조체를 제조하는 과정에서 종래에 사용되던 봉입제 및 커버글래스를 대신하여 본 발명에 따른 폴리비닐 피롤리돈을 주성분으로 하는 슬라이드 조직 절편을 보호하기 위한 코팅층은 조직 절편이 외부 영향으로부터 보호되는 보호막 기능을 수행함은 물론, 상기 코팅층에 의해 외부에 노출된 조직 절편이 감싸여지게 되면 조직 절편에 불규칙한 표면형태(morphology)에 대한 개선이 이루어지므로, 광학 현미경 관찰시 빛의 난반사나 산란현상을 방지할 수 있으며, 폴리비닐 피롤리돈 자체의 굴절율(refractive index, 1.43)이 조직절편의 굴절율과 대차없음으로 인해, 광학 현미경 관찰시 높은 해상도를 보장하는 기능을 갖는다.

본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용된 코팅제 조성물의 구체적인 실시예는, 에탄올을 용매로 하여, 에탄올 용매 기준 중량 대비 10중량%의 분자량이 40,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체와 UV 레이저빔 흡수 증강제로서 알코올 용매 기준 중량 대비 0.002 중량%가 함유된 콩고 레드를 포함하여 조성하여 슬라이드 구조체를 제조한 후, 광학해상도의 개선내용과 조직 절편 내의 내부 구성물질의 보존성을 확인하기 위한 실험을 행하여 그 결과를 살펴보았다.

이러한 본 발명의 광학 해상도의 개선 효과에 대해서는 구체적인 실험자료를 통해 충분히 확인할 수 있었는 바, 하기 도 1 내지 도 3을 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 1 내지 도 3은 광학해상도의 차이를 설명하기 위한 비교예와 본 발명에따른 실시예의 비교 사진들이다. 도 1 내지 도 3에서 관찰하고 있는 조직 절편은, 임상환자의 대장암, 간암 및 위암 관찰을 위해 각각 채취된 후 동결절편으로 준비된 조직 절편에 관하여 광학현미경으로 관찰한 확대된 영상이미지들이다.

도 1 내지 도 3을 참조하면, 각 도면에서 중앙화살표를 기준으로 우측의 사진은 본 발명에 따른 조직 절편 보호층을 코팅한 상태에서 광학현미경을 이용하여 조직 절편을 관찰한 실시예의 사진들을 나타낸 것이며, 이에 대비되는 중앙화살표 좌측의 각 사진은 본 발명에 따른 실시예에 대응되는 비교예의 사진들이다.

먼저, 슬라이드 상부에 탑재시킨 조직 절편에 대한 소정의 염색 과정을 거친 후, 외기에 노출된 상태를 유지하고 있는 조직 절편에 대해 광학현미경으로 관찰하여 비교예 사진을 확보하였으며, 이후 본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 코팅한 후, 각각의 조직 절편에 대해서 광학현미경으로 다시 관찰하여 실시예 사진을 확보하였다.

상기 도 1 내지 도 3에 나타나 있는 좌측의 비교예와 실시예의 사진을 대조해보면 광학해상도의 개선정도를 직관적으로 확인할 수 있다. 즉, 비교예의 사진들(도 1의 1A, 도 2의 2A 및 도 3의 3A)에서는 염색된 조직 절편의 표면이 평평하게 유지되지 않음으로써 빛의 산란현상이 발행하여 관찰 대상의 세포들이 검은 색으로 보여 각 세포들간의 식별이 어려운 상태임을 확인할 수 있다. 그러나, 실시예의 사진들에서는 암세포와 염증세포를 확연하게 구분된 모습(도 1의 1B)을 확인할 수 있으며, 암세포들이 선구조물을 형성하고 모습(도 2의 2B)을 명확하게 확인할 수 있으며, 미만성으로 퍼져있는 모습(도 3의 3B)까지도 분명하게 구분할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립이 슬라이드 상의 조직 절편에 대한 광학해상도를 증진시키는 기능층으로 작용하고 있음을 알 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립의 또 다른 중요한 기능은 조직 절편 내의 거대분자물질의 보존성을 갖는 점이라 할 수 있으며, 특히 동결절편의 경우에는 그 효과가 배가될 수 있어 바람직하다. 즉, 고정액에 고정된 이후 파라핀에 포매되어 있는 조직은 이미 조직 속에 거대분자물질이 파괴된 상태이거나 일부 변성된 상태에 있기 때문에 거대분자물질의 보존성은 그 의미가 약하게 취급될 수 있다. 이와 달리, 동결절편 내에는 거대분자물질이 잘 보존되어 있을 뿐만 아니라 이들을 파괴시킬 수 있는 각종 파괴성 효소들, 예컨대 알엔에이즈(RNase), 디엔에이즈(DNase) 및 프로테이즈(Protease) 등까지도 보존되어 있으므로, 동결절편의 취급시 조심해서 다루지 않게 되면, 거대분자물질 들이 이들 파괴성 효소에 의하여 파괴될 수 있는 한계가 있다. 한편, 이들 파괴성 효소들은 물이라는 기질이 있을 때에만 작용한다는 점에서 동결절편에 대한 취급과정, 예컨대 다단계로 진행되는 염색과정을 무수(non-aqueous)상태에서 진행한다면, 최소한 전술한 문제를 해결할 수 있으나, 염색이 완료된 동결절편이 광학현미경의 관찰 및 레이저빔을 이용한 절제가 이루어지는 동안 외기에 노출된 상태를 유지하게 되면, 외기 내에 포함된 미량의 수증기 성분에 의해서 전술한 바와 같은 거대분자물질의 파괴를 막을 방법이 없게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 감싸게 되면 동결절편의 무수 상태가 유지시키면서, 외부에 노출이 이루어지지 않도록 격리함으로써조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지할 수 있는 기능이 발현되는 것이다.

즉, 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 하는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 조직 절편, 특히 동결절편을 감싸는 경우에는 동결절편 내외부를 무수 상태로 유지시키면서 외부와 차단을 시키기 때문에 조직 절편 내의 거대분자물질의 보존성을 향상시키는 기능층으로 작용하고 있음을 알 수 있다. 특히, 이러한 본 발명에 따른 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성 향상 효과는 가장 파괴가 쉽게 일어나는 것으로 알려져 있는 RNA를 대상으로 진행한 구체적인 실험을 통해 간단하고도 충분하게 확인할 수 있는 바, 하기 도 4 및 도 5를 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

도 4 및 도 5는 조직 절편 내에 포함된 RNA 파괴 정도를 시간 변화에 따라 관찰한 크로마토그래피의 실험결과의 비교예와 실시예의 사진들로서, 도 4는 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 형성하지 않은 상태의 조직 절편에 대한 관찰실험결과를 나타낸 사진이며, 도 5는 본 발명에 따른 조직 절편보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로 보호되는 조직 절편에 관한 관찰실험결과를 나타낸 사진이다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 슬라이드 상에 위치시킨 후 염색과정을 진행시킨 후, 별도의 외부 코팅층을 형성하지 않은 상태에서 실온에 방치해둔 동결절편에서 시간별로 추출한 리보소말 RNA의 28S밴드(4A) 및 18S밴드(4B)로 이루어진 두쌍의 밴드중 특히 상부의 28S밴드(4A)가 시간의 경과에 따라 현저하게 약하게 표시되고 있음을 알 수 있다. 즉, RNA의 28S밴드(4A)가 초기 관찰된 밴드(0시간)에비해, 시간 경과에 따라 현저한 정도로 약화되고 있음을 확인할 수 있다. 이는 외부에 노출된 동결절편 내부에 포함되어 있던 RNA가 외기에 포함되어 있던 수분 등에 의해 손쉽게 파괴되기 때문이다.

이와 달리, 도 5를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립으로 조직 절편을 코팅한 경우에는 RNA 밴드인 28S밴드(5A) 및 18S밴드(5B) 모두가 24시간이 경과한 후에도 초기 관찰된 밴드(0시간)와 동일한 정도의 밴드를 유지하고 있음 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 경우 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 향상됨을 알 수 있다. 이러한 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 향상된다면, 슬라이드를 제작한 이후, 일정한 기간을 경과하면서, 중장기적으로 슬라이드 내의 조직 절편에 대한 관찰 및 미세 절제가 이루어지는 연구의 경우에는 특히 바람직한 효과를 발휘할 수 있음은 자명하다.

한편, 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 UV 레이저빔의 에너지 흡수력이 약하여, UV 레이저빔을 이용하여 절제 작업을 진행하기 위해서는 고에너지의 UV 레이저빔이 필요하게 되므로, 이를 보상하기 위하여 UV 레이저빔의 에너지 흡수력을 증진시키는 첨가제를 첨가함으로써, 절제 작업의 효율성을 증진시킬 수 있다. 이를 위해서 미량의 콩고 레드를 폴리비닐 피롤리돈 중합체에 균일하게 분산된 형태로 존재하게 하면 바람직한 효과를 달성할 수 있다.

따라서, UV 흡수력 증강제로 사용되는 미량의 콩고 레드 및 주성분인 폴리비닐 피롤리돈을 알코올 용매에 용해시켜 준비된 액상 상태의 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 조직 절편이 탑재된 슬라이드 상부층에 기존에 잘 알려져 있는 다양한 방법, 코팅제를 슬라이드 일측부에 적하시킨 후 경사를 주어 흘러내리면서 코팅층을 형성하게 하거나, 코팅제를 조직 절편의 직상부면에 적하시킨 후, 일정한 회전력을 주어 원심력에 의한 코팅층을 형성하거나, 분사방식으로 슬라이드 상부면에 코팅제를 분사시키는 방법으로 코팅층을 형성하게 할 수 있다. 한편, 이러한 코팅층 형성을 위해서는 수작업으로 진행할 수도 있지만, 자동화된 시스템을 이용하여 안정적이며, 대량적으로 간이하게 진행할 수도 있다.

이상과 같은 방법으로 슬라이드 상부면에 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 도포된 이후, 실온에서 방치하면 휘발성을 갖는 알코올 용매의 대부분이 제거되면 콩고 레드가 균일하게 분산되어 있는 폴리비닐 피롤리돈 중합체층이 고상화된 코팅층으로 변화되어 장기간 슬라이드 내의 조직 절편이 보존됨으로써, 조직 절편 내의 거대분자물질의 파괴를 방지하는 보호층으로 기능함은 물론, 355㎚ 파장을 갖는 UV 레이저빔을 이용하여 조직 절편을 절제할 경우, UV 파장대에서 에너지 흡수력이 상대적으로 양호한 콩고 레드와 같은 UV 흡수 증강제를 포함하고 있기 때문에 콩고 레드를 첨가하지 않은 경우에 비하여 상대적으로 작은 에너지로서도 본 발명에 따른 액상 커버슬립이 용이하게 절제될 수 있는 장점을 발휘할 수 있다.

도 6은 본 발명에 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드의 파장대별 흡수대역도이다.

도 6에 도시된 바에 따르면, 그래프의 가로축은 파장대역을 나타내고 있으며, 그래프의 세로축은 흡수도를 나타내고 있는 바, 소정 파장에서 상대적인 흡수도를 확인 할 수 있다. 도 6에 도시된 그래프 상에는 두 개의 피크가 형성되어 있음을 확인할 수 있으며, 미세절제 장비에서 통상적으로 사용되는 350 나노미터(㎚) 주변의 파장 대역에서 두 번째 강도에 해당하는 피크(60)가 형성되어 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 따른 액상 커버 슬립 내에 첨가되는 콩고 레드가 액상 커버슬립에 첨가되는 경우에는 미세 절제용 UV 레이저빔의 흡수도가 증강되어, 낮은 에너지 상태에서도 절제 작업이 원활하게 수행될 수 있는 역할이 가능해짐을 알 수 있다.

본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용되는 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 다양한 분자량을 갖는 상태로 존재할 수 있으나, 전술한 바와 같이, 10,000 내지 360,000의 범위의 분자량을 갖는 경우에 본 발명이 목적하는 바를 최고의 효과로 달성할 수 있다. 이러한 분자량에의 수치한정 범위를 초과하는 경우, 즉 분자량이 10,000 미만인 경우에는 폴리비닐 피롤리돈의 용매인 알코올 성분이 휘발된 이후 건조과정을 거치면서 갈라지는 현상(cracking)이 발생되어 바람직하지 못하며, 분자량이 360,000을 초과하는 경우에는 UV 레이저빔에 의해 절제 과정이 원활하게 진행되지 않는 문제점이 있으므로, 특히 UV 레이저빔을 미세 절제 장치에 사용되는 슬라이드의 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립으로서의 적합성은 열악하다 할 것이다.

본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 제조하기 위해 사용되는 코팅제 조성물 성분은, 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체 및 콩고 레드로 조성되며, 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되는 것이 바람직하며, 상기 콩고 레드는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 함유되어 있으면 더욱 바람직하다.

만일, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체의 사용함량이 5 중량% 미만인 경우에는, 점도가 낮게 형성되어 조직 절편 상부에 적하시 너무 쉽게 흘러내려 너무 얇게 커버 슬립이 형성되거나, 경우에 따라서는 커버 슬립을 형성하지 않는 영역까지도 존재할 수 있어, 조직 절편의 표현 형태를 충분하게 개선시키지 못하여 바람직하지 못하며, 그 사용함량이 15중량%를 초과하는 경우에는, 점도가 너무 높게 형성되어 커버 슬립의 두께가 필요 이상으로 두껍게 형성됨으로써 절제시 고에너지의 레이저빔을 이용하여야 하므로 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명의 목적을 충분히 달성하기 위해서라면 상기 수치한정 범위 내에서 상기 폴리비닐 피롤리돈의 함량이 조절되어야 바람직하다.

또한, 상기 콩고 레드의 사용함량이 0.0025중량% 미만인 경우에는, UV 흡수 효과가 발현되지 않기 때문에 고에너지 레이저빔이 필요하게 되고, 그 사용함량이 0.025중량%를 초과하는 경우에는, 콩고 레드 자체가 갖는 붉은 색깔이 조직 절편에 과도하게 발현되어 조직 절편에 대한 형태학적 관찰에 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명의 목적을 충분히 달성하기 위해서라면 상기 수치한정 범위 내에서 상기 콩고 레드의 사용 함량이 조절되어야 바람직하다.

본 발명에 따른 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된슬라이드 구조체의 다양한 실시예 대해 하기 도 7 및 도 8을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다.

도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 일실시예에 관한 단면도들이다.

도 7은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체의 일실시예의 단면도이다.

도 7에 도시된 바에 따르면, 지지층으로 기능하는 평판구조를 갖는 슬라이드 기판(70) 상부에 층간접착부재(미도시)에 의해 부착된 고분자필름층(72)을 구비하도록 하였으며, 그 상부에 조직 절편(74)과 액상 커버 슬립(76)이 적층된 슬라이드 구조체가 구성되어 있다.

도 7에 도시된 슬라이드 구조체는 광학현미경을 이용한 단순 관찰용으로만 사용되는 경우에는 본 발명에 따른 액상 커버 슬립(76)으로 인한 개선된 광학해상도로 인하여 조직 절편 내의 미세 구조에 대한 상세하고 정밀한 관찰이 가능함은 물론, 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성 향상으로 인해 후속 연구에도 신뢰성이 보장된 연구가 수행될 수 있다.

한편, 상기 도 7에 도시된 슬라이드 구조체를 상하 역위시키지 않은 상태로 미세 절제 장치의 절제 스테이지에 탑재시킨 후, 하방으로부터 레이저빔을 조사하고, 상방으로 절제된 조직 절편을 수거하는 방식을 이용하는 경우에도, 광학적 관찰을 위한 개선된 해상도로 인하여 절제 영역의 효율적이고 신뢰성이 있는 선택 및 절제된 조직 절편 내의 거대분자물질에 대한 보존성이 개선됨으로 인하여, 조직 절편으로부터 추출한 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 하는 후속 연구에서도 연구의 효율성과 신뢰성을 향상시킬 수 있는 장점을 제공한다.

도 8은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체의 다른 실시예의 단면도이다.

도 8에 도시된 바에 따르면, 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80) 가장자리 상부면에 층간접착부재(미도시)에 고분자필름층(82)를 부착되어 있으며, 상기 고분자필름층(82)의 중앙 상부면에 조직 절편(84)이 안착되어 있고, 상기 조직절편을 완전하게 감싸는 액상 커버 슬립(86)이 적층된 상태로 슬라이드 구조체가 구성되어 있다. 상기 액상 커버 슬립(86)이 조직 절편(84)을 견고하게 밀착시킴과 동시에 그 외부를 완전히 감싸고 있고, 조직 절편과 유사한 굴절율을 가지고 있으며 또한 공기와 접촉하는 계면이 평평하게 형성되어 있음으로서, 광학현미경을 이용한 관찰시 난반사나 산란 등을 방지함과 아울러, 조직 절편 표면 형태를 개선시킴으로써, 미세 영역에 대한 관찰시 충분한 광학해상도를 보여줄 수 있다.

또한, 액상 커버 슬립(86)에 의해 조직 절편(84) 내의 거대분자물질, 예컨대 DNA, RNA 및 각종 단백질 등이 시간 경과에 따라 손상 또는 손실되는 것을 방지하며, 절제된 조직 절편 또는 이들로부터 추출되는 DNA, RNA 및 단백질을 대상으로 하는 후속 연구의 신뢰성을 확보할 수 있다.

한편, 슬라이드 기판(80)은 조직 절편(84)이 안착된 고분자필름층(82)의 하부 소정면은 외기에 직접 노출시키는 윈도우를 구비하고 있다. 슬라이드 기판(80)의 윈도우는 조직 절편(84), 특히 동결절편을 고분자필름층(82)에 탑재시킬 때, 고분자필름층(82)이 극저온 상태의 동결절편과 접하면서 대류 및 전도로 인한 저온 동조화현상이 발생되어, 고분자필름층(82)에 동결절편이 부착성이 저하되는 것을 방지하기 위해 슬라이드 기판(80)의 윈도우에 윈도우리드(88)가 결합된 상태에서 동결절편의 탑재를 시도하는 것이 바람직하다. 슬라이드 기판(80)에 윈도우리드(88)가 탈 부착시키는 방향을 화살표(8A)로 표시하였다.

한편, 도 7 및 도 8에서 도시되고 있는 슬라이드 구조체의 두께는 실제와는 현격한 차이를 보이고 있으며, 수직구조 상에서 설명의 용이함을 위해 각 층의 두께가 다소 과장되게 표현되고 있음을 충분히 이해하여야 하며, 실제 축척 등을 고려하여 도시하고 있는 것이 아님은 자명하다 할 것이다. 고분자필름층(72, 82)는 1 내지 2 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되며, 조직 절편(74, 84)는 2 내지 6 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되며, 본 발명에 따른 액상 커버 슬립(76, 86)은 8 내지 22 마이크로미터(㎛)의 두께로 형성되는 것이 일반적이다. 특히, 슬라이드기판(70, 80)의 실제 두께에 비하면, 육안으로 고분자필름층, 조직 절편 및 액상 커버 슬립의 두께는 표시하기 어려울 정도의 미세한 두께를 갖는다는 것은 상술하지 않아도 당업계에서는 자명하게 이해되고 있는 사실이다.

도 9는 상기 도 8에서 도시되고 설명된 슬라이드 구조체에 대한 미세 절제 및 수거를 설명하기 위한 단면도이다.

도 9에 도시된 바에 따르면, 도 8의 슬라이드 구조체의 상하 방향을 역위시킨 상태로 미세 절제 장치의 슬라이드 스테이지부(90)에 탑채시킨 상태에서, 조직 절편(84)을 관찰수단으로 화살표(9A)의 방향으로 관찰하여, 절제 영역(미도시)을선택한 후, 상기 역위된 상태로 탑채된 슬라이드 구조체의 직상부로부터 화살표 (9B)의 방향으로 조사되는 레이저빔에 의해 선택된 영역내의 고분자필름층(82), 조직 절편(84) 및 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(86)이 모두 절제된 미세 절편 영역에 대해 작용하는 중력의 영향에 의해 화살표(9C)의 방향으로 그 직하부에 배치된 수거함(92)에 수거되는 것을 알 수 있다. 한편, 미세 절제 장치는 전원에 의해 구동되며, 슬라이드 구조체를 이루는 각 층상구조가 박층으로 형성되어 있으며, 조사되는 레이저빔 자체도 일정한 에너지를 갖고 있는 점 등의 이유로 윈도우 슬라이드 기판(80)에 미세한 정전기가 발생할 수 있으며, 이로 인하여 절제된 미세 절제 영역에 미치는 중력요인보다도 더 큰 정전기력이 발생하는 경우에는 수거함(92) 내부로 수거가 올바르게 이루어지지 않을 확률이 상당하다. 따라서, 절제된 미세 영역이 단순 중력 요인에 의해 낙하되어 수거되는 방법에만 의존하는 것은 바람직하지 않고, 절제 영역으로 선택된 조직 절편에 대해 레이저빔을 이용한 절제 작업이 완료되면서, 조사되고 있는 레이저빔이 갖고 있는 장력에 의하여 조직 절편의 잔존 영역으로부터 절제된 영역의 분리를 촉진시킴과 동시에 윈도우 슬라이드 기판의 재질 요소에 정전기 방지제를 포함시켜 제조함으로써, 슬라이드 구조체 내부에 발생되는 미세한 정전기력을 제거함으로써, 이로 인한 수거율 저하의 문제를 해결하였다.

한편, 도 9에 도시된 바와 같은 역위된 상태가 아닌, 즉 도 8에 도시되어 있는 상태 그대로를 미세 절제 장치의 슬라이드 스테이지부에 탑재시킨 후, 상기와 같은 단계에 의해서도 조직 절편 관찰, 레이저빔에 의한 절제 및 절제된 조직 절편의 수거 작업이 진행될 수도 있다.

상기 도 7 내지 도 9에 의해 설명한 슬라이드 구조체의 각 구성부재 중 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(76 및 86)은 전술한 바에 따라 제조된 것을 사용하면 바람직하며, 고분자필름층(72 및 82)은 폴리에틸렌 나프탈레이트 중합체 물질을 이용하여 제조된 것을 사용하면 바람직하다. 한편, 슬라이드 기판(70 및 80)은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 폴리에테르이미드와 정전기방지제가 첨가된 물질을 이용하여 제조된 것이면 바람직하며, 특히 낙하식 수거방식의 미세 절제 방법을 이용할 수 있는 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80)의 경우에는 정전기 방지제가 첨가됨으로써 수거율 개선에 큰 효과를 보일 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제시되는 슬라이드 구조체를 제조하는 방법에 대해서 하기 도 10를 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 이때, 슬라이드 구조체에 대한 도면 부호는 도 9에 도시된 구조를 참조하여 설명하기로 한다.

도 10은 본 발명에 따른 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립이 구비된 슬라이드 구조체를 제조하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.

먼저, 윈도우를 구비한 슬라이드 기판(80) 상부면의 가장자리에 점착성부재(미도시)를 이용하여 고분자필름층(82)을 부착시킨다(S100). 이때, 슬라이드 기판(80)의 윈도우에 결합되는 윈도우리드(88)는 윈도우 슬라이드 기판(80)에 미리 결합된 상태에서 고분자필름층(82)을 부착시킬 수 있음은 물론, 먼저 고분자필름층(82)을 슬라이드 기판(80) 상부면에 부착시킨 이후에 윈도우리드(88)를 결합시킬 수도 있다. 한편, 슬라이드 기판(80)은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 폴리에테르이미드와 정전기방지제가 첨가된 물질로 제조된 것을 이용하고, 상기 윈도우리드는 고기능성 엔지니어링 플라스틱, 폴레에테르이미드 또는 폴리아릴레이트(Polyarylate, 통상적으로는 '아델(ardel)'이라고 불림)을 이용하여 제조되면 바람직하다. 특히, 슬라이드 기판(80)에 정전기 방지제를 첨가하여 제조함으로써, 도 9에서 설명한 바와 같이 정전기력에 의해 미세 절제된 조직 절편의 수거율이 저하되는 문제점을 해결할 수 있으므로 특히 바람직하다.

이어서, 윈도우리드(88)가 결합된 상태의 슬라이드 기판(80) 상부면에 부착된 고분자필름층(82)의 중앙 소정부 상면에 미리 준비된 조직 절편(84)을 안착시킨다(S102). 이때, 고분자필름층(82)은 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 이용하면 바람직하다. 한편, 고분자필름층(82)의 열용량이 매우 작기 때문에, 조직 절편(84)으로 극저온상태의 동결절편을 사용하는 경우에는 동결절편을 고분자필름층(82)에 접촉시 급속한 열전달에 의해 저온동조화 현상이 진행되어, 동결절편(84)의 온도와 고분자필름층(82)이 열평형을 이루어져, 양 물질간의 접촉이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 이러한 문제점을 윈도우리드(88)가 해결하고 있는 바, 상기 윈도우리드(88)가 고분자필름층(82)에 밀착되면서 얇은 공기층(미도시)을 개재시키면서 열평형에 대한 일정한 완충역할을 함과 동시에 고분자필름층(82)의 노출된 다른 이면을 차단시키으로서, 고분자필름층(82)이 급속하게 저온 동조화되는 것을 억제하는 기능을 발휘하게 된다. 따라서, 고분자필름층(82)의 온도와 동결절편(84) 간의 온도가 일정 정도로 격차를 유지함으로써, 동결절편(84)이 고분자필름층(82)에 용이하게 부착고정될 수 있도록 한다.

후속단계로, 상기 윈도우리드(88)를 슬라이드 기판(80)으로부터 제거하고, 슬라이드 기판(80) 상부에 안착된 조직 절편(84)에 대해 염색을 행한다(S104). 이러한 염색과정은 종래의 알려져 있는 다양한 염료를 이용하여 다양한 방법으로 진행할 수 있으며, 당업자에게는 자명한 단계이므로, 구체적인 설명은 약하기로 한다.

마지막으로, 분자량이 10,000 내지 360,000인, 바람직하게는 40,000인 폴리비닐 피롤리돈을 주성분으로 제조된 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물을 상기 조직 절편의 외부 노출면을 모두 감싸도록 도포하여 코팅층(86)을 형성시킨다(S106). 이로써 본 발명에 따른 일 실시예로서의 슬라이드 구조체의 제조 과정은 마무리된다. 이때, 상기 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립(86)을 제조하기 위한 조성물은, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올 용매와, 분자량이 40,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 알코올 용매 기준 중량 대비 5 내지 15중량%, 바람직하게는 10중량%가 함유되도록 하며, UV 레이저빔 흡수증강제로서 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%, 바람직하게는 0.02중량%의 콩고 레드를 포함하여 조성된 것을 이용하면 바람직하다.

한편, 전술한 단계에 따라 제조된 슬라이드 구조체는 광학기기에 의한 단순 관찰 또는 광학기기가 탑재된 미세 절제 장치를 이용한 관찰/절제영역선택(S108), 절제/수거작업(S110)이 연속적으로 진행될 수 있으며, 상기 절제된 조직 절편을 수거하여 후속 연구의 샘플원으로 이용하는 단계(S112)로 더 진행할 수도 있음은 자명하다. 이때, 도 7에 도시된 바에 따르는 슬라이드 구조체의 상하 구조 그대로 광학기기 등의 슬라이드 스테이지부(미도시)에 탑재될 수도 있음은 물론, 그 상하방향이 역위된 상태로 탑재되어, 관찰, 절제 작업이 진행될 수도 있다. 또한, 상기 절제/수거작업(S110)은 이용된 슬라이드 구조체 및 절제수단인 레이저빔이 조사되는 방향 등을 고려하여, 레이저빔이 조사되는 방향과 동일한 방향으로 수거되거나, 그 반대방향으로 수거될 수도 있으며, 중력을 이용한 수거 방법은 물론, 중력과 반대방향의 외력을 제공하여 별도의 수거장치 등을 이용하여 수거할 수 있음은 자명하다.

이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 당업자에게 본 발명을 상세히 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다.

본 발명에 따른 액상 커버 슬립, 그 제조용 조성물, 그 조성물을 이용하여 제조된 커버슬립을 구비한 슬라이드 구조체 및 그 구조체 제조방법에 따르면, 다음과 같은 구체적인 장점을 확인할 수 있다.

첫째, 광학해상도가 개선되어 조직 절편에 대한 미세 관찰 및 미세 영역에 대한 정밀한 선택이 가능해졌다.

둘째, 조직 절편 내에 포함되어 있는 거대분자물질들이 외기 노출이나 수분에 의해 손상될 수 있는 문제를 원천적으로 해결하였으며, 이러한 보호 기능은 동결절편을 이용하는 경우에 특히 바람직한 효과를 나타내고 있다. 따라서, 조직 절편 내의 각종 거대분자물질이 잘 보존됨으로써 후속 연구의 신뢰성을 확보할 수 있게 되었다. 특히, 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물은 무수 상태(non-aqueous)로 제조되므로, 조직 절편 내에 있을 수 있는 엔도지니어스 알엔에이즈(endogeneous RNase) 등의 활성화를 방지할 수 있어 바람직하다.

셋째, 미세 절제 장치와 연계된 작업 수행시 간이한 수거절차와 증대된 수거율을 보장할 수 있다.

넷째, 액상 커버 슬립을 제조하기 위한 조성물은 평소에는 액상이지만, 조직 절편 상부에 도포시 상온에 알코올 용매가 쉽게 증발하면서 빠른 시간 내에 고형화되면서 박막형태를 유지하며, 사용된 용매가 휘발성 알코올 용매이므로 인체에 무해하며, 수용성이어서 조직 절편 내의 내부 구성물질(macromolecule) 추출과정이 용이하게 이루어질 수 있으므로 그 사용과 취급이 용이하다.

마지막으로, 본 발명에 따르는 경우 조직 절편 내의 거대분자물질 보존성의 향상 및 광학 관찰시 증진된 해상력에 의해 정밀하게 관찰된 확대된 영상이미지를 제3자에게 전송한 후, 원격지에 있는 자로부터 충분하고도 신뢰성 있는 의견을 접수받아, 미세 절제를 진행할 수 있는 기초적인 기술적 베이스를 마련할 수 있어 바람직하다.

Claims (17)

1. 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone) 중합체를 주성분으로 하여 제조되는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 코팅층 내부에 콩고레드(Congo red)가 첨가되어 균일하게 분산된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립.
3. 알코올 용매;

   분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및

   콩고레드(Congo red);를 포함하여 조성된 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 알코올 용매는 에탄올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고 레드(Congo red)는 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025중량%가 포함되도록 조성되어 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립 제조를 위한 조성물.
6. 지지층;

   상기 지지층의 상면 중앙부에 안착되는 조직 절편; 및

   상기 조직 절편의 외부 노출면을 완전히 감싸도록 형성되며, 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체를 주성분으로 제조된 액상 커버 슬립;을 포함하여 구비된 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체.
7. 제6항에 있어서, 상기 지지층은, 판상구조의 고분자필름층으로 구비되는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체.
8. 제7항에 있어서, 상기 슬라이드 구조체는, 상기 고분자필름층 하부면에 면하여 층간 접착부재에 의해 부착된 슬라이드 기판이 더 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체.
9. 제8항에 있어서, 상기 슬라이드 기판은, 상기 고분자필름층 상부에 안착된 조직절편이 점유하는 영역을 포함하는 평면영역의 직하방으로 소정의 개구부인 윈도우가 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체.
10. 제7항 내지 제9항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체.
11. (a)윈도우를 구비한 슬라이드 기판 상부면 가장자리에 점착성부재를 이용하여 판상구조를 갖는 고분자필름층을 부착시키는 단계;

    (b)윈도우리드가 결합된 상태의 슬라이드 기판 상부면에 부착된 고분자필름층의 중앙 소정부 상면에 미리 준비된 조직 절편을 안착시키는 단계;

    (c)상기 윈도우리드를 슬라이드 기판으로부터 제거하고, 슬라이드 기판 상부에 안착된 조직 절편을 염색하는 단계; 및

    (d)상기 조직 절편의 외부 노출면을 모두 감싸는 액상 커버 슬립을 형성시키는 단계;를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 (a)단계의 슬라이드 기판은, 카보네이트 물질을 주성분으로 하고, 폴리에테르이미드(Polyetherimide)와 정전기방지제가 미량 첨가된 물질로 제조된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 (a)단계의 고분자필름층은, 폴리에틸렌 나프탈레이트(Polyethylene Naphthalate) 중합체 물질을 주성분으로 하여 제조된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 (d)단계의 액상 커버 슬립은, 알코올 용매; 분자량이 10,000 내지 360,000인 폴리비닐 피롤리돈 중합체; 및 콩고 레드(Congo red);를 포함하여 조성된 조성물을 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 알코올 용매는 에탄올 또는 이소프로판올을 이용하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 폴리비닐 피롤리돈 중합체는 알코올 용매의 기준 중량 대비 5 내지 15중량%가 포함되어 있으며, 상기 콩고 레드(Congo red)가 알코올 용매의 기준 중량 대비 0.0025 내지 0.025 중량%가 포함된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 (b)단계에서 사용된 조직 절편은 동결절편인 것을 특징으로 하는 슬라이드 조직 절편 보호 및 해상력 증진용 액상 커버 슬립을 구비한 슬라이드 구조체 제조 방법.