JP4520642B2 - 非接触レーザーキャプチャ顕微解剖のための設計 - Google Patents
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Description
本出願は、「Non−Contact Laser Capture Microdissection」と題された、米国仮出願第60/111,662号(1998年12月10日出願)(この出願の開示は、本明細書中に参考として援用される)の一部継続出願であり、そして同出願の利益を主張する。
【0002】
本発明は、レーザーキャプチャ顕微解剖の新規な方法に関する。一般的に、レーザーキャプチャ顕微解剖(以下、LCMとしても知られている)は、可視化後に、スライドから試験片のサンプルを集めるプロセスに関する。このプロセスにおいて、活性化可能な表面は、選択された領域で、可視化された試験片の上に置かれ、この表面は、試験片を接着するために活性化され、そしてこの活性化可能な表面は、付着した試験片の選択された部分で取り除かれる。
【0003】
LCMの新規な方法のこの開示において、熱的に活性化可能なポリマー層についての物理的プロセスおよび設計が記載され、そして活性化におけるポリマーは、目的の顕微鏡視野内にある標的被験体を「手を伸ばしてつかむ」ために、顕著に延びる。冷却により、この活性化可能な層は収縮し(蓄積弾性応力に応じて冷却の間または冷却後のいずれかで)、それによって「キャプチャされた」顕微鏡標的を、最初のポリマー表面の近くに戻す。これらの物理的プロセスおよび特定の設計を用いて、「非接触LCM」は、スライド上に取り付けられた組織サンプルなどの試験片からの固定された分離距離(5〜20ミクロンのオーダー)で、活性化可能なコーティングを選択的に配置することによって行われ得る。試験片が、顕微解剖から選択された物質を有し(典型的には、透過またはエピ蛍光による顕微鏡内の可視化による)、そしてレーザー照射を用いて活性化可能なコーティングが活性化される場合、活性化可能なコーティングの膨張およびそれに続く収縮は、サンプル内の標的要素の正確なキャプチャおよび摘出を引き起こす。活性化は、表面を接着性にする(例えば、熱可塑性接着または光化学的接着)。代替の設計においては、活性化可能なコーティングの側面に曝された試験片は、活性化可能なコーティングを有する薄い表面層を有し得、支持基板と試験片に曝された薄い表面層との間に、表面下層を形成する。表面下層の外向きの拡張は、薄い表面層の、複合組織表面との接触をもたらす。この代替の設計においては、この表面層は、特定の標的に対する特異的親和性を分子的に示し得、試験片から顕微解剖のために選択された物質を標的とする特異性に加えて、結合特異性を提供する。
【0004】
(発明の背景)
顕微鏡視野における特定の被験体の顕微解剖は、複雑な視野から特定の要素を分離するために、長い間実施されてきた。これは、特定の細胞(例えば、幹細胞)あるいは細胞の塊(例えば、腎臓の糸球体)または細胞より小さい要素(例えば、中期染色体または染色体の特定のバンド)でさえ、次の生化学的分析のために所望され得る、複雑な生物学的サンプルにおいては、特に重要である。フローサイトメトリーおよび細胞選別は、単一の細胞懸濁液から特定の細胞の集団を分離するために、20年間以上使用されている。1976年に、Meier−Rugeらは、侵襲性の癌細胞の酵素活性の分析を行うために、組織試験片中の侵襲性の癌細胞の縁に沿って切り取るために使用された、パルスUV−レーザー顕微鏡について記載した。SchindlerおよびHolland(特許)は、走査レーザービームにより不必要な細胞を殺すか、または所望の領域を除く全ての領域を切り取るかのいずれかにより、細胞培養物から特定の生細胞を分離するために使用されるレーザー顕微鏡について記載した。Shibataら(Am.J Pathol.141:539,1992)は、複雑な組織切片の目的の特定の顕微鏡領域上に、単純なUV−吸収マスクを置き、そして他の全ての領域のDNAをUV照射により損傷させる、同様のプロセスを記載した。保護された領域の少量のDNAは、組織内の癌細胞における特定の変異を評価するために、抽出され、そしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅される。Whetsellら(Oncogene 7:2355,1992)は、複雑な病理試験片における純粋な細胞の集団の分離および続く分子分析のために適用される、種々の手動の顕微解剖技術を記載し、この技術は、以下:標的領域を針またはマイクロピペットの先端部を用いて屑にする工程、細胞懸濁液を作製するために液体を注入する工程、次いで懸濁した微小サンプルを、次のマクロ分子分析のためにこの先端部に引き戻す工程、を含む。Lance A.Liottaらによる、「Isolation of Cellular Material Under Microscopic Visualization」と題された米国特許出願第08/203,780号(1994年3月1日出願)において、試験片の可視化された物質をプローブの先端部に接着させ、次いでこの先端部を除去して、獲得したサンプルを分子分析のために溶液中に置くというアイデアが記載された。
【0005】
Lance A.Liottaらによる「Isolation of Cellular Material Under Microscopic Visualization」と題されれた米国特許出願第08/544,388号(1995年10月10日出願)において、純粋な癌細胞の集団において特異的に発現される遺伝子のcDNAライブラリーを構築するために、癌細胞を顕微解剖する概念が開示された。2つの特定の顕微解剖の概念が提案された:1)手動の「針」顕微解剖および2)組織細胞と接触して配置される活性化可能な結合層の、光(レーザー)ビームによる限局的な活性化。後者の概念は、レーザーキャプチャ顕微解剖と称される顕微解剖に発展している(Emmert Buckら、Science 274:998,1996およびBonnerら、Science 278:1481,1997)。この開示において、試験片の顕微鏡可視化は、抽出のための組織を選択することが行われた。その後、活性化可能なコーティングを含むフィルムが試験片の上に配置され、そしてこのフィルムは、この試験片と選択された物質で接着される状態になるように、レーザーにより活性化された。活性化されたフィルムが除去された場合、この試験片の接着した部分は、同様に除去されて所望の解剖をもたらす。
【0006】
この、最初のLCM概念において、LCMの特異性は、限局的な結合により与えられ、これは、活性化可能なフィルムの標的の領域が活性化された場合にのみ起こる。組織サンプル上に置かれたコーティングの他の全ての部分は、非結合であるとみなされた。実際には、組織の病理切片は、顕微鏡的な層の不規則な表面を示し、そして標的の組織部位に限局的にレーザー結合させるために使用される熱可塑性ポリマーは、組織表面にあるピーク、または下にある顕微鏡スライドと強く結合していない領域全体をピックアップし得る。この問題は、目的の移送が起こる領域を、選択的に切り取り得るかまたは打ち抜き得る、活性化可能なフィルムの発展を導き、それによって、レーザーにより活性化されない「移送フィルム」の広い領域から生じる、非特異的な汚染を、劇的に減少させた。
【0007】
2つの表面(ここで、フイルム基板と組織切片)の間の熱的に活性化された結合を作製するために使用される熱可塑性ポリマーを用いる先行技術において、結合の強度は、適用圧力、溶融ポリマーの流動性および活性化の時間に依存する。従って、組織との強力な結合(すなわち、顕微鏡ガラススライドに対する組織の結合の強さより強い結合)の必要性は、強力な接触圧力または長い活性化パルスを必要とするようである。Robert F.Bonnerらによる「PRECISION LASER CAPTURE MICRODISSECTION USING SHORT PULSE LENGTH」と題された米国仮特許出願番号第60/094,871号(1998年7月20日出願)において、最も小さいLCM顕微解剖(例えば、直径<10ミクロン)を作製するために、短いパルスが必要とされ、そしてその作製を可能にしたことが開示された。
【0008】
フィルムが最初に試験片と接触され、次いで活性化されること(Emmert−Buckら、およびBonnerらに記載されたように)あるいは、フィルムの活性化された領域は、最初は試験片(顕微鏡)から短い距離で離れており、そして活性化が起こった場合に試験片と接触するようになることのいずれかは、1995年のLiottaらの開示において固有のことである。しかし、最初の1995年のLiottaらの開示においては、フィルムのある部分は常に試験片と接触している。所望の顕微解剖においてより優れた精度を得るための、全ての活性化可能なコーティングの試験片からの意図的な間隔についての示唆は存在しないことに、注目することが重要である。いずれかの場合において、試験片の選択された部分は、フイルムに接着し、そしてフィルムと共にもぎ取られる。
【0009】
Lance A.Liottaらによる「Isolation of Cellular Material Under Microscopic Visualization」と題されたPCT出願第PCT/US96/16517号(1996年10月9日出願)において;レーザーキャプチャ顕微解剖を増強したものが記載された。種々のフィルムおよび活性化エネルギー源が記載された。
【0010】
1998年2月4日出願のLance A.Liottaらによる「ISOLATION OF CELLULAR MATERIAL UNDER MICROSCOPIC VISUALIZATION」と題された米国特許出願第09/364,927号(1997年2月7日出願)において、レーザーキャプチャ顕微解剖の基礎技術に関するさらなるパラメーターが記載された。この場合もまた、活性化可能なコーティングと試験片との間の分離を意図的に維持することの特定の長所は、詳細には記載されなかった。
【0011】
Seth R.Goldstein、Robert F.Bonnerらによる「MECHANICAL HANDLING SYSTEMS FOR LASER CAPTURE MICRODISSECTION」と題された仮特許出願第60/073,480号(1998年2月3日出願)において、レーザーキャプチャ顕微解剖についての、活性化可能なコーティングと試験片被験体との間の意図的な空間的な分離を有するアイデアが記載された。
【0012】
Seth R.Goldstein、Robert F.Bonnerらによる「CONVEX GEOMETRY ADHESIVE FILM SYSTEM FOR LASER CAPTURE MICRODISSECTION」と題された米国特許出願第08/883,821号において、レーザーキャプチャ顕微解剖のために有用なフィルムを保持するための、円柱状の表面の使用を開示した。この出願において、ロッド(典型的には、円錐形の端部を有する)は、試験片に接触した。従って、従来の活性化が起こり(典型的には、レーザーによる)、ロッド上のコーティングを活性化して、この試験片の選択された部分と接触させる。
【0013】
Seth R.Goldstein、Robert F.Bonnerらによる「Mechanical Handling Systems for Laser Capture Microdissection」と題された米国仮出願第60/073,480(1998年2月3日出願)において、本発明者らは、活性化される層と試験片表面との間に小さい空間的分離を有することの長所を、詳細に記載した。この開示は、本明細書全体に記載される場合、本出願において相互参照される。
【0014】
これに代わり、本発明者らは、レーザーパルスにより限局的に活性化された移送フィルムの体積の拡大を利用する物理的現象を開示し、これは、1)移送表面と組織との間の小さい分離を同時に広げ、そして2)移送表面に、非常に短いパルス(例えば、<<1m秒)においてさえも強力な結合を形成するために必要な、分子接触を生じさせるために十分な、接触力を作り出す。この物理的プロセスの使用は、活性化可能な層の独特の設計および特性、ならびに支持基板およびレーザーキャプチャ顕微解剖(LCM)の間の、サンプルからのこの分離を維持するために特異的に設計された特別の表面コーティングの両方を利用する、種々の開示された発明を導く。
【0015】
(発明の要旨)
選択的に活性化可能な表面が組織サンプルから距離をあけて維持され、そして活性化により組織サンプルに対して並べられる、微小並置のためのLCM装置およびプロセスが記載される。典型的な場合において、活性化可能な熱可塑性の層によるレーザー照射の吸収は、標的の方向を限定し、そして所望の微小並列をもたらす、容積拡大を引き起こす。活性化された体積の開示された微小拡大は、複雑なサンプル内の標的の要素との局所的な接触を引き起こし、そして以下のいずれかに対して十分な接触圧を生じる:1)この標的における全ての空間に流れ込み(例えば、その中の空気または液体を置換する)、そして強力な力学的結合を形成する、または、2)限局的な標的特異的な結合および親和力特異的な結合を作製するために、活性化された表面または調製された表面を、標的サンプルと密接に結合させる(例えば、移送フィルムの調製された表面と結合した特定の高親和性のリガンドと接触する特定の細胞表面レセプターを有する細胞)。
【0016】
選択的に活性化可能な層(例えば、その層は、レーザーパルスを特異的に吸着し、その下表面で標的と結合する)は、通常、最上層全体の上に接着した、非吸収性の支持基板を有する。この活性化可能な層の下表面は、典型的には試験片から5〜20ミクロン離れて維持される。この分離は、活性化可能な移送層が、試験片表面のピーク(例えば、組織表面の凹凸のピーク)と接触する部分がないことを、再現可能に保証するために十分大きくなければならず、従って、試験片の厚みの平坦さまたは均等性に依存する。
【0017】
好ましい実施形態においては、非接触LCMは、一連の標的要素の正確な位置への集中を可能にする(例えば、このサンプルにおけるこれらの要素の最初の(より大きい)分離にかかわらず、10um移動して、移送フィルム表面上の位置の特定の20umアレイ上に配置する)。これは、サンプルにおける個々の要素の、標的、結合および分離のプロセスが、選択された分離距離を変更することなく、任意の回数繰り返されうることを必要とする。この場合において、キャプチャされた物質は、活性化された層の最初の下表面と同一平面に引き戻されるか、またはキャプチャされた物質全体が、残されたサンプルの上表面を越えるのに十分近くに引き戻されるかのいずれかである。
【0018】
LCMの現在行われている形態において、本発明者らは、比較的低い温度(約100℃)で、組織の空間に流れ込み、そしてすぐに強力な結合を形成し得るような、低い融点を有しかつ融点を超える温度上昇に伴い急速に粘度が減少する熱可塑性ポリマーを、特に選択した。その最も頑強な形態において非接触LCMを達成するために、本発明者らはさらに、この熱可塑性ポリマーにおいて、溶解した場合に、可逆的な大きい体積増加を必要とした(これは、冷却される際に再凝固するように、回復し得る)。この様式において、限局的に溶解する場合、このポリマーは、その全体の厚みの大部分を顕微鏡試験片中の標的要素に向かって移送させられ、分離している隙間を埋め、そしてサンプル内の「液体間隙」を満たすため、または標的要素を囲むために、さらに拡がる。従って、埋められた厚みは、分離の空隙とサンプル試験片の厚みとの和にほぼ等しい。通常、このLCM熱可塑性ポリマーは、レーザーパルスの終了後、非常に急激に冷却されるので(試験片が載っている顕微鏡スライドの高い熱伝導率のため)、活性化された体積のこのポリマーは、伸展した状態で凝固する(すなわち、限局的に弾力的に変形する)。
【0019】
溶解の際の大きい相転移を有する強力な長鎖熱可塑性ポリマー(例えば、Dupont ELVAX 410または4310)を使用することにより、溶解した場合、活性化されたポリマーは大きい距離(100um厚の層に対して>20ミクロン)を移動し得、すぐに標的との強力な結合を形成し、そして顕微鏡スライドとのその結合(およびその本来の非標的サンプル要素)から分離されるようにこの標的要素の保持を保ち、次いで弾性圧力を放出して弾性的に縮む。この大きな動きおよび続く弾性的収縮を使用し、最初の移送表面から10um離れた10um厚の標的要素は、「基礎を築かれ」(隙間が埋められ)得、活性化されたポリマーによりその空隙を埋められ、そして強力に結合され、次いで、移送されない試験片のピーク(例えば、組織切片表面の凹凸)を越えるように、移送フィルム基板に向かって10umを超えて引き戻される。
【0020】
活性化されたポリマーは、溶融時間および加熱時間における、その厚みの変化またはその部分的な体積変化により予想される、その本来の厚みよりも大きい距離でさえも、届き得る(典型的には、フィルム厚の約20%)。これは、溶融した中核の円柱に拡がる、周囲のポリマーの溶融なしで加熱することにより達成され得る。この溶融した中核の円柱への拡がりは、中心の中核を効率的に圧搾してより遠くへ移動させる。同様に、迅速な溶融および拡がり、次いで、冷却および半径方向の温度勾配の動力学は、活性化されたポリマーの中心が、一連のパルスで標的試験片に向かって少しずつ進むのを可能にする(中心のピークおよび周囲の環状の減少領域を形成する)。さらに、熱可塑性ポリマーの上表面に対してより大きな力を適用することにより、このポリマーを、下表面の溶融と同時に上表面で気化させて気泡にし得る。この気泡の圧力は、活性化されたポリマーを、さらにより遠くの距離に進める(これは、溶融の体積変化よりさらに大きな、気化による体積変化である)。一般的に、このポリマーの急速な冷却は、拡がった泡を凝固させる。この大きな拡がりによる標的のキャプチャおよび分離の後に、第二の低いエネルギーパルスがこのポリマーを再溶融させ、そして気泡(部分的に減圧)を崩壊させる場合、大きな弾性的な反跳が達成される。
【0021】
あるいは、気泡または低温で気化可能な液体は、標的試験片と活性化されていないポリマー表面との間の大きな間隙を埋めるその能力を増大させるために、このポリマーフィルムの上の領域に配置され得る。このような全ての改良において、拡大のより大きな可逆性が好ましい。なぜならこれは、LCMがキャプチャした要素を、より完全に最初のポリマー表面と同一表面に引き戻すからである。例えば、活性化されたポリマー層の拡大が完全に可逆性であり、そして10umの厚みである場合、標的要素が、空隙の70%の部分が拡大するポリマーにより完全に満たされ、次いで本発明者らは、キャプチャされた要素が3umだけ活性化されていないポリマーフィルムから突き出ることを予測する。従って、この組織の表面のピークが+3umであり、最初の間隙が5um以上である場合、キャプチャされたサンプルは、このフィルムおよびその基板が、移送表面の最初の平均に戻された場合、組織表面接触との移送表面の分離が起こらないように、十分に引き戻される。隣接する活性化されていないポリマー表面は、先にキャプチャされた要素が、このサンプルの表面に接触するといういかなる心配もなく、さらなる要素を標的とするために使用され得る。このような手順は、複数の要素が、一連の工程で、移送フィルム上の並んでいる「パーキング位置(parking place)」の任意の禁止された配列に移送されることを可能にする。この集中機能は、次の分析(分子分析または光学分析のいずれか)が、向上した感受性および特異性、より早い反応速度、ならびに少量の試薬に関連した低いコストを必要とする場合は常に、非常に重要である。
【0022】
必要な空間的分離または間隙は、支持基板および活性化可能な表面の構造、選択的に活性化可能な表面のためのホルダーの構造、組織サンプルあるいは参照表面と接触させるホルダーの構造、または、さらに設計された空間的分離を維持するためのメカニズム(例えば、空気保持方法または片持ち梁式方法)により維持され得る。所望の空間的分離を確立するための方法が、開示される。
【0023】
選択的に活性化可能な表面が活性化される場合、それは拡大して組織サンプルと接触し、試験片を並べる。次いで、この選択的に活性化可能な表面は、組織サンプルに関して接着性になり得、組織サンプルに圧力を与え得、組織サンプルを走査し得、または調製された表面を、組織サンプルと局所顕微的に制御して接触させ得る。
【0024】
従って、この開示は、通常接触していないが、フィルム層の限局的な活性化により接触させられる、2つの表面の間の限局的に特異的な並列を作製する、先行技術においては知られていない方法を記載する。この限局的に特異的な活性化は、密接な接触がこの表面上の活性化された部位でのみ作製されるように、他の表面に対する1つの表面の移動を引き起こす。
【0025】
通常の場合において、局所的な結合の確立は、2つの表面が合わせられる場合に必要とされる。この局所的な結合は、多数の異なる形態であり得る:
1)ポリマーの標的サンプルの隙間への熱可塑的注入および強力な限局的な力学的結合への急速な固化、
2)拡大する表面が範囲(領域)を包み込むように、力学的または高い表面親和力により特定の範囲へ結合する(例えば、サンプルにおける特定の細胞に結合した、ポリスチレンラテックス微粒子抗体)、ポリマーの熱可塑的拡大、
3)ポリマー表面上の単層コーティングの細胞表面との密接な分子接触(単層の外側の表面上の特定のリガンドが、目的の細胞表面(例えば、このリガンドに対して特異的なレセプターを有する細胞)への高い親和性の強力な特異的結合を形成し得るように)を作製する、ポリマーの熱可塑的拡大(これは、先の顕微鏡標的決定に対する標的の、目に見えない分子組成物に基づく特異的な選択を付加する)、
4)強力かつ熱可塑性ポリマーに対して親和性の下にあるポリマー層と結合する、細胞の間へのポリマーの熱可塑的拡大(例えば、目的の細胞の周りにバスケットを形成する−生細胞全体または個々の染色体もしくは細胞小器官などの、最も小さい顕微鏡的に観察可能な被験体に対して特に有用である)、および
5)ポリマーの高い親和性の表面が、標的細胞における特定の高分子と結合するような、乾燥した組織切片の隙間への、ポリマーの熱可塑的注入(これは、ポリマーが、標的の試験片由来の特定の分子成分の精製手段を提供する、アフィニティーカラムとして作用することを可能にする)。
【0026】
これらの方法の可能性に固有のものは、熱可塑性ポリマーフィルムの限局的な活性化、および限局的な加熱を用いるその容積拡大が、ポリマー表面の、正確な用量依存性の距離での限局的な拡大を引き起こすことの発見である。次いで、この熱可塑性ポリマーは、標的サンプルとの分離を埋めるように拡大し得、これら2つの表面の限局的な接触をもたらす。この拡大は、以下により引き起こされ得る:
1)加熱と共作用の線形熱的拡大、およびサンプル組織(または標的)に直面する表面を除く全ての面において限局的に加熱されたポリマーの慣性拘束、
2)加熱により固体(例えば、結晶)から液体への相転移を起こすような、ポリマーの体積増加、および標的に直面する表面を除く全ての面において限局的に加熱されたポリマーの慣性拘束、および
3)限局的に液体になる(すなわち、低粘度の)標的の熱可塑性ポリマーに囲まれた気泡を加熱することにより引き起こされる、急速な圧力過渡、そしてそれによって、この増加した限局的圧力に限局的に反応する。
【0027】
本発明者らは、近赤外レーザーダイオードパルスによって局所的に融解した場合、ナフタロシアニンで染色された低融点のEVAフィルム(例えば、Elvax410、200W、および4310処方物)が、数十ミクロン弾性的に拡張することをなし得ることを発見した。この拡張された材料は、そのような距離でオリジナルから分離された新しい表面と接触され得、次いで、急速に冷却した際にこの新しい表面と強力な結合を形成し、同時に、弾性ポリマーに応力を作り出す。標的サンプルとその基質の付着を切断する際に、ポリマーの弾性応力が解放され、結合された標的がオリジナルのポリマー表面に向かって戻り得る。この機構を使用する場合、標的の表面を見つけ、分子レベルについてこの表面を適合させるために、このポリマー表面を動かすことが可能である。このパルスの間、2つの表面の非応力分子相互作用は、ポリマーの急速な冷却の前に(パルスが停止した後に)これらの特定の分子結合が形成され得るように、達成され得る。これによって、標的は、ポリマーフィルムに、およびそれを介してフィルムの下にある固体基板に物理的に結合され得る。
【0028】
以前のLCMとは異なり、これらの機構は、以下を可能にする:
1)前接触なしでの標的の局所的捕捉(これによって、以前のLCM法に通例の非特異的相互作用および部分的移動を避ける)、
2)複合体サンプル(同じ形態学および/または分子表面同一性を有する)の異なる領域の反復サンプリング、および移動フィルムの1つ以上の正確に特定された領域上への結合(例えば、複数の標的が、複合体(組織)サンプル(単数または複数)のオリジナルの間隔に関係なく、平坦なフィルム上に一緒に接近して配置され得る)、それによって、希薄な要素を移動表面の小さな規定された表面に効果的に濃縮すること[効果的な顕微鏡検査およびインサイチュラベリング、ならびにこのようにプールされたサンプルから非常に小さな体積への巨大分子の効果的な抽出を可能にする]、
3)特異的巨大分子標的による標的細胞による捕捉プロセスならびに同時の顕微鏡的イメージングによる形態学的同定におけるさらなる巨大分子特異性の可能性、ならびに
4)機械的リンカーの細胞表面への特異的結合による、湿ったサンプル表面および生きた細胞の捕捉を可能にすること(以前のLCM方法は、水の存在下で効果的に結合されなかった)。
【0029】
局所的加熱および冷却の間、熱可塑性ポリマーの再現可能な拡大および収縮という特別な性質を使用するために、活性化されていないポリマーと標的表面との間の正確な分離(例えば、複合体組織の5〜10um厚さの部分)を作製するための新規な方法を考え出すことが必要である。例えば、本発明者らは、焦点光ビーム(例えば、近IRレーザーダイオード)によって活性化されたポリマー表面を作製し、その結果、5〜20ミクロンのオーダーの正確な距離がこの表面を標的サンプルから分離するためのプロセスを記載する。これは、境界材料または正確なスペーサーによってなされ得、これは、これが押しつけられる組織、または生物学的調製表面と結合を形成しない。
【0030】
さらに、この方法は、境界ゾーンを組織表面と直接接触させながら、活性化され得るポリマー表面を組織表面から固定した距離(これは、通常、組織試験片の厚さよりも大きいが、ポリマー層の厚さよりもずっと小さい)に保持する圧力プレートを含む。以前に開示されたLCMの概念および材料を使用すると、このアセンブリは、目的の領域、顕微鏡によって同定され、レーザービームによって標的化される特異的な組織成分上に置かれ得る。レーザービームは、適用される場合、ポリマーを加熱し、それによってそのポリマーを拡張し、接触させ、結合させる(例えば、標的中の流体または空気の空間を含浸し、次いで、その場所で冷却し、標的に対して局所的に強力な結合を形成する)。
【0031】
本発明者らは、本発明者らがLCM(Dupont ELVAX 410エチレンビニルアセテート)に対して使用している標準的なEVAポリマーが、室温からその融点に局所的に加熱された場合、典型的に>10%拡張することを示した。従って、標的ポリマーフィルムが、局所的点において頂部から底部まで融解する場合、これは、台座としておよそ10%のフィルム厚さを拡張する。従って、局所的に溶解される場合、100ミクロンの厚さのフィルムが、10ミクロンより大きく拡張し、従って、フィルムが組織を見出すまでフィルムと組織との間のこの厚さの空気の隙間を探索し得る。フィルムが組織を見出した場合、これは、組織の空隙に拡張し、強力な局所的結合を形成する。
【0032】
本発明者らは、進行する実際の距離が、照射されたセグメントにおいて達せられるより高い温度に起因して、これらの値よりも2〜3倍大きくなり得ることを観察した。この拡張は、放射熱フローに起因すると考えられ、これによって、周りの固体ポリマーが融解したゾーンを半径方向に狭窄し、オリジナルのポリマー表面からさらにポリマーの台座を押し出す。一般に、ポリマーが冷却される場合、フィルムが組織(生物学的)試験片を急速に「剥ぐ(peel)」かまたは持ち上げるまで組織内で拡張し続け、これは、含浸されたゾーン(典型的には円柱状の台座)の境界において引き裂く。この点において、ポリマーおよび含浸された標的組織が、オリジナルのポリマー表面にパチンと戻る(snap back)。典型的には、はね返り(recoil)は、オリジナルの拡張の50%より大きい。従って、LCMに使用される本発明者の既存のEVAポリマーについて、本発明者は、均一な5ミクロンの空気の隙間を架橋するために、10ミクロン拡張するために100ミクロンの厚さのポリマー層を活性化し、次いで、それが強く結合する5ミクロンの厚さの組織のスライスを含浸し得る。組織からの分離の際に、組織ポリマー表面は、5ミクロンより大きく縮小し、その結果、この領域は、以前に述べた境界ゾーンを除いて何処にも接触を作製しないで、組織試験片の異なる領域上に再び置かれ得る。
【0033】
従って、異なる点の反復の移動は、(フィルムおよびその基質の適切な並進によって)なされ得、移動表面上の小さな中心ゾーンにおいて濃縮され得る(すなわち、組織部分内よりもずっと小さい標的−標的間隔に置く)。一旦、十分に均一な生物学的標的がこの移動表面上の蓄積されると、これは、抽出および分子分析のための微小容器上または微小容器内に置かれ得る。
【0034】
この置換プロセスの特異的改良は、熱可塑性フィルムの(円柱状)微小チャンバの開口頂部への環状シーリング(annular sealing)を含む。このシーリングは、移動組織(生物学的標的)をチャンバの中心においてまたは蓋を形成するポリマーの表面の内側に配置してチャンバをシールする様式で生じる。さらなる特異的な改良は、EVAフィルムの熱可塑性のシーリング性質を使用し、この緊密なシールを環状のレーザー源(または円で走査される点)によって、または環状に加熱された圧力プレートによってのいずれかで形成する。この後者のアプローチは、凹状の熱可塑性ポリマーがオリジナルで形成される基板が、100〜200ミクロンの厚さのMylar(ポリエステル)フィルムのように比較的薄い場合、より容易に理解される。
【0035】
特定の好ましい形状は、その室温の厚さが、活性化可能ポリマーについて所望の凹部の量だけ所望の熱可塑性接着ポリマーの厚さより大きくなるように、「非粘着性」ポリマーテープを製造することである。これは、EVAおよび「非粘着性」境界の異なる拡張によって、EVAが高温で平坦な表面を形成し、これが冷却時に所望の凹部を導くように、高温で基板上に鋳造することによるEVAの製造によって達成され得る。例えば、本発明者らは、中心チャネル4mmの厚さを形成するために、両端上に200ミクロンの厚さのストリップのポリアミド(3mmの幅)を有する200ミクロンの厚さのポリエステル(1cmの幅)の積層体を形成し得た。この構築物によって形成される間隔において、ホットElvax410(IR吸収色素を有する)の微細な連続的ビード(bead)(ロッド)が押し出される。次いで、押し出された材料は、平滑化ドラム(smooth drum)によって熱ロールされ、平坦な表面を形成する。冷却時に、押し出された材料は、ポリエステル(これは、このポリエステルに結合されたポリイミドの境界ストリップから20ミクロンだけ凹状である)上にELVAX410の4mmの幅の中心部分を有する1cmの幅のテープを残す。従って、本発明者らは、「非接触LCM」に対する正確に凹状にされたテープの製造のための単純なスキームを提案する。代替物が、堅い基板上の同じ種類の放出表面(ポリイミド)境界を形成し、次いで、中心領域をEVAで満たすことに注意すること。
【0036】
非接触LCMのさらなる改良は、移動が十分に規定された位置で周期的に配置され得るように、テープを周期的にマーキングするための以前に開示された設計を使用する。もともと、この概念は、少しの移動領域を抽出および分子分析容器にパンチ(punching)することが、移動領域の別々の光学的位置なしで実施され得るように、開発された。その本発明での使用において、「非接触LCM」テープは、周期的なインジケーターマーカーに対して固定された増分だけ並進され得る。LCM移動の各セットの間で、サンプルが集められ得る。プロセスの最後において、個々の標的の複数の移動のセット(これらは均一である)が、分子分析について1つのサンプルにプールされ得る。移動の各セット内の個々のLCM移動間のずっと小さな分離は、小さな領域内の各セット(上記例において、これは、0.5mm以内であり得るが、異なるセットは、2mmの中心の間隔にされ得る)についてのクラスターを作製する。分子抽出および分析に使用される微小チャンバは、微小移動セット間のテープ並進と正確に同じ周期的な繰り返し(上の例において2mm)を有する、ウェルの直線アレイ(個々の移動クラスターよりもわずかに大きい直径を有するか、または上の例においてd>0.5mm)として形成され得る。このスキームによって、多数のセットの移動が連続テープ上に集積され得、次いで連続的に移動され得、分子抽出および分析のために微小チャンバの直線アレイ上に(熱)シールされ得る。これは、流れ(current)LCMプロセスの効率を大きく増加し、分析がより手早く、より低試薬費用で、そしてより正確に実施され得るような小さな体積に分子分析システムの体積を減少するための手段を提供する。さらに、この設計またはその類似物は、分析の自動化および流れLCM移動キャップに渡るサンプルの追跡(特に、従来技術の微小容積の流体プロセッシングを組み込む場合)にかなりの利点を提供する。
【0037】
さらに、非接触は、活性化される位置を除いて、テープと試験片との間の接触がない、本発明者らが現在示している種々の手段によって、テープおよび圧力プレートによって達成され得る。例えば、テープが、圧力プレート/堅い基板と標的試験片表面との間の隙間よりも、正確に所望の非接触隙間だけ小さい均一な厚さであり得る。さらなる例として、試験片(例えば、5ミクロンの厚さ組織スライス)が配置されるガラススライドの頂部は、試験片がないその縁部近くの規定されたステージ表面に対して保持される。この後者の場合において、LCM移動フィルムについての圧力プレートまたは堅い基板は、ガラススライドの頂部の上に正確に72ミクロンで機械的に配置され、テープは、均一に60ミクロンの厚さであり、圧力プレートのより下の表面に対して保持される。ガラススライド上の組織部分は、(組織を切断するミクロトームを調節することによって)5ミクロンの厚さにされた。この場合、移動フィルムのより下の表面は、最も近い表面の組織試験片の7ミクロン上にある(移動フィルムが組織試験片と接触する活性化時のみおよび所望の標的点のみ)。圧力プレートが球形または楕円形である場合、レーザー活性化および分離(標準LCM段階)の後のテープの並進、以前に移動された領域が、さらに組織表面から除去され、そして濃縮を有する平坦フィルム非接触LCMに必要な「はね返り」が、もはや必要ないことに注意すること。これは、非接触LCMを実行する最も簡単なフィルムおよび手段であり、本発明者が現在試験している分離手段または代替のものが、市販であり正確に規定し維持するのが容易である場合、非接触LCMのこの変形は、最も広く使用されそうである。
【0038】
移動表面に付着されるスペーサーが、潜在的に製造するのが容易であり、そして本発明者らは、これを達成するためのいくつかの方法を議論するものの、非接触LCMは捕捉および濃縮に基礎的な方法である。これは、隙間に渡り、そのすぐ下(従来の意味での下)の標的を捕捉するのに十分な熱ポリマーの拡張に頼る。これは、引き続く分析に役立つ移動フィルム上の特定の位置への、希薄な対象物の濃縮、一連の標的の特異的移動および蓄積のような多くの利点を提供する−(例えば、マイクロリットル以下の体積を有する微小分析チャンバに配置することによる)。たとえ、移動フィルムの底部の表面が平坦であるか、または凸状であっても、所望の標的上の特定の隙間において移動フィルムを正確に配置し得る電気化学的/光学的システムを設計することが可能である。本発明者らは、一対のこのようなシステムを組み立て、その上に内在的にオフセット空間を有するそれらのフィルムの相対的な利点を評価している。
【0039】
Non−Contact Laser Capture Microdissectionと題され、1999年12月10日に出願された、上で参照された仮特許出願番号第60/111,662号の出願から、本発明者は、本明細書とともに含まれる図1Gおよび1Hに関して詳細にされた重要な発見をなした。詳細には、本発明者らは、試験片の選択された部分を顕微解剖した後に、活性化可能な材料上の材料の任意の台座を実質的に崩壊させ、実質的に除去することが可能であることを見出した。これは、顕微解剖捕捉および分離が完了下後に、励起照射の第2パルスを使用することによって達成され得る。この台座の収縮は、繰り返し可能であり、予測可能であることが分かっている。これは、試験片から収集され、選択された材料の部分の不注意な損失または汚染を妨げるという利点を有し、収集物質の隣接部分への類似の細胞の濃縮を可能にする。
【0040】
(特定の実施形態の説明)
図1を参照して、レーザー捕捉顕微解剖を、スライド14に載置された試験片Mの底部から来る視野経路を有する、いわゆるEPI顕微鏡に関して、概略的に示す。光源Lは、試験片Mを照射する。同時に、接眼レンズEが、試験片Mの下からの逆転した経路に沿った試験片を表示する。具体的に、試験片Mは、選択された部分M1で可視化される。この部分が選択されると、本開示にさらに記載されるように、レーザー捕捉顕微解剖が起こる。この解剖の一部として、レーザー源Zが、テープT上に含まれる活性化可能なコーティングに入射されることが必要である。
【0041】
従って、本開示は、先行技術において公知ではない、ポリマー表面が周辺材料から5〜20ミクロン以上のオーダーの正確な距離で溝が付けられるように、焦点が合わせられた光線(例えば、近IRレーザーダイオード)によって活性化されるポリマー表面を作製するための方法を記載する。この周辺材料は、それが押し付けられる組織または生物学的な調製表面と結合を形成しない(図2Dを参照のこと)。さらに、本方法は、圧力プレート(例えば、円柱状ロッドR−図6を参照のこと)を含み、このプレートは、活性化可能なポリマー表面18を組織表面から固定された距離で維持しながら、組織表面と直接接触する周辺ゾーンまたはリム16を配置する(このプレートは、通常、組織試験片の厚さよりも厚いが、ポリマー層よりも非常に薄い)。以前に開示されたLCM概念および材料を使用して、このアセンブリは、目的の領域、顕微鏡によって同定され、そしてレーザービーム(これは、ポリマーを加熱し、それを広げさせ、そして接触させ、そして結合させる(例えば、流体または空気空間を標的中に含浸させ、次いで、焦点に標的との強い結合を形成する場所を冷却する))によって標的化される特定の組織成分上に配置され得る。
【0042】
図1A〜1Eはすべて、一連の図で、活性化を示す。図1Aにおいて、レーザーからのパルスの間、活性化可能な材料Eの体積が徐々に増加する。5〜20ミクロンの範囲の一貫したギャップが存在するのが、サンプルMと活性化可能な材料Eの低面との間であることに、注意すべきである。
【0043】
図1Bを、参照して、活性化可能な材料Eの全体積が活性化されることが分る。これは、試験片Mの選択された部分M1に接触し、そしてこの場合、それと結合するための、下部部分7の拡張にを引き起こす。
【0044】
図1Cを参照して、拡張され、そして活性化された材料Eは、ここで冷却されることが分る。このことは、細長い部分が、弾性的に圧力が加えられるか、または引張られるということが生じる。読者は、いくつかの場合において、この引張りが、実際に、サンプルの選択された部分M1が、図1Dに示されるように、完全に分離されることを理解する。あるいは、図1Dを参照して、活性化可能な層Eが十分な距離引かれて、所望の顕微解剖および活性化可能な層Eの応力の緩和を引く起こし得る。いずれかの場合において、図1Dの構成が生じる。
【0045】
図1Eを参照して、サンプルに対する活性化可能な材料のEの相対的な移動が起こる。この場合、サンプルの、もともと分離され、選択された部分が、濃縮され得る。
【0046】
最後に、図1Fを参照して、2つのさらなる現象が示される。第一に、活性化可能な材料Eが、活性化された第1体積V1と共に示される。この体積において、拡張を補助する気泡Gが、示される。この気泡は、材料内に以前に置かれたかまたは溶解した気体、活性化可能な材料の揮発性成分、または活性化された体積V1内に、活性化の際に気体を発生する実質的に任意の成分であり得る。
【0047】
第二に、再び図1Fを参照して、内部体積V1の周囲のほぼ円柱状の体積V2を活性化することが、可能である。この円柱状体積V2は、体積V1に向かう成分を有する円柱状体積の拡張を作り出す一般的な効果を有する。このことは、活性化可能な材料Eを、チューブから絞り出される歯磨き粉と異ならない様式で、拡張させる。この後者の例とは異なり、活性化可能な材料が冷えると、有効に押出された体積の収縮が起こり得る。
【0048】
図2Fを参照して、室温からその融点まで焦点で加熱される場合、LCMにおいて本発明者らが使用したEVAポリマー(Dupont ELVAX 410&200W&4310エチレンビニルアセテート)は、典型的に、>10%まで膨張する。従って、標的ポリマーフィルムが、焦点において上部から底部まで、溶融される場合、フィルム厚さの10%より大きく、台座Pとして前方に膨張する。図2Fに示されるように、これは、スライド14上の試験片Mに向かって起こる。従って、100ミクロン厚のフィルムが、焦点で溶融される場合、10ミクロンより大きく膨張する。この膨張ポリマーは、従って、これが、組織を見出すまで、それと組織との間のこの厚さエアギャップを探る。膨張する支柱が、組織または台座Pを見出す場合、収縮点での支柱は、強い焦点結合を形成する組織の間隙空間へ膨張する。
【0049】
実際の移動距離は、これらの値より2〜3倍大きいことを、本発明者らは観測および発見した。この過剰な膨張は、照射されたセグメントにおいて達せられるより高い温度に一部起因し、そして周りの固体ポリマーが溶融ゾーンを放射状に収縮させる放射状の熱フローに起因すると考えられている。この溶融ゾーンの放射状の収縮は、ポリマー台座Pをもともとのポリマー表面からさらに遠くへ押す。
【0050】
一般に、ポリマーが冷却される場合、フィルムは、(生物学的な)試験片の組織から、急速に「剥がされる」か、または昇離させられるまで組織内で膨張し続ける。台座のこの上昇により、含浸されたゾーン(典型的に、円柱状台座)の境界で裂く。この点で、ポリマーおよび含浸された標的組織は、収縮された台座P’として、もとのポリマー表面に跳ね返る。
【0051】
上記の参照されるもとの仮出願が提出されて以来、台座pの退縮が、十分に完全ではないことが発見された。試験片を横たえる収集された試験片を例示する通常の配置が図1Gに示される。
【0052】
上記の参照された仮特許出願第60/111,662号の1998年12月10日の提出以来、発明者らは発見をした。発明者らは、LCMの間に作り出されるこの台座が、顕微解剖後に減縮され得ることを発見した。このペダルの減縮はレーザーエネルギーの第2のパルスの使用と共に起こる。具体的に、標的サンプルが分離された後(図1Gを参照のこと)、第2の低出力でかつ広く焦点合わせされたビームが、膨張されかつ活性化された材料Eに当てられる。図1Hに示されるように、台座Pの実質的に完全な退縮が起こる。この発見の重要性のいくつかの議論を順に示す。
【0053】
第1に、台座Pの端部上のテープから突き出した試験片M1の選択された部分を有することは、所望ではない。この種類の突出は、収集されたサンプルを外れるか、または試験片の他の非特異的な部分に接触させ、それを含むことに脆弱にする。第1の場合において、所望のサンプルが全体的に失われる。第2の場合において、非特異的な移動が試験片の品質を低下させる。
【0054】
第2に、台座Pの膨張および収縮において、気泡が存在しない膨張した台座Pの使用は、試験片M1の接着されかつ選択された部分の予想可能なかつ繰返し可能な膨張および収縮を生じさせることを本発明者らは明らかにした。
【0055】
第3に、この収縮は、試験片M1の選択された部分の分解をほとんど生じない。さらに、発明者らは、実質的に完全である収縮を見出した。
【0056】
第4に、第2のパルスは、第1のパルスと同じ出力および面積であり得る。しかし、発明者らは、図1Hに示されるように、より低出力のより長くまたはより広く分散したビームを好ましいと考える。
【0057】
発明者らは、台座Pの観測された収縮の原因について確信がない。活性化可能な材料の表面張力は、収縮の原因となり得る。交互に、活性化可能な材料は、冷却の際に、自然な均一な厚さを求め得る。代りに、第2の「アニーリングパルス」によって引き起こされる収縮は、標的の捕捉および/または分離の間にポリマーにおいて、引き起こされる応力の緩和に起因し得る。第2のパルスの前に分離工程が生じる場合、収縮のみが起こる。いずれの状況においても、観測された挙動は、非接触LCMにおいて非常に有用であることを本発明者らは発見した。
【0058】
台座Pを崩壊させるために放射の第2のパルスを使用することなく、発明者らは、反跳が、もとの伸張の50%を超えることを見出した。従って、LCMにおいて使用される発明者らの現存するEVAポリマーと共に、例えば、発明者らは、均一な5ミクロンの空気ギャップを横切るように、100ミクロン厚のポリマー層を活性化させて、10ミクロン伸ばし、次いで、それに強く結合する5ミクロン厚の組織スライスを含浸させる。組織からの分離の際に、組織ポリマー表面は、約7ミクロンに収縮し(図2Hを参照のこと)、その結果、この領域は、先に記載された境界ゾーンを除くどことも接触させられることなく、組織試験片(これは、2ミクロン以内で平らである)の異なる領域上に、再び配置され得る。
【0059】
従って、異なるスポットの反復移動が、(フィルムおよびその基板の適切な移動によって)なされ得、そして濃縮される(すなわち、組織切片内の標的対標的間隔よりもずっと狭い標的対標的間隔で配置される)。これは、全ての所望の蓄積された要素が移動表面上の小さな中心ゾーン内に濃縮されることを生じ得る。一旦十分な均一な生物学的な標的が、この移動表面上に蓄積されると、これは、抽出および分子分析のためにミクロ容器上か、またはその中に配置され得る。
【0060】
この配置プロセスの具体的な洗練には、図4に示されるような、熱可塑性フィルムの(円柱状)ミクロチャンバの開口頂部への環状密閉を含む。これは、フタを形成するポリマーの内面チャンバまたは中心に配置された生物学的な標的として移動された組織と共にチャンバを密封するような様式で起こり得る。
【0061】
さらなる特定の洗練は、EVAフィルムの熱可塑的な密封の性質を使用して、環状レーザー源(または円内で走査されたスポット)によって、または環状の加熱された圧力板によってのいずれかで、この密接したシールを形成する。溝を付けられた熱可塑性ポリマーがもともと形成された基板が200ミクロン厚未満のMylar(ポリエステル)フィルムのように比較的薄い場合、この後者のアプローチは、より容易に実現可能である。
【0062】
図2A〜2Hを参照して、特定の好ましい形状は、その室温での厚さが活性化可能なポリマーにおける所望の溝の量による所望の熱可塑性接着性ポリマーの厚さよりも大きいように、「非粘着性」ポリマーテープを製造するためである。これは、高温で基板上にキャスティングすることによるEVAの製造によって達成され得、その結果、EVAおよび「非粘着性」境界の差動的な膨張が、EVAに、冷却の際に所望の溝を導く平坦な表面を、高温で形成する。
【0063】
図2Aを参照して、基板20は、テープ様基板の一方の側面に2つのリッジ22を有する。基板20は、4mmの厚さである中心チャネル24を形成する両方の縁上の200ミクロンの厚さのストリップのポリアミド(3mm幅)からなるリッジ22を有する200ミクロンの厚さのポリエステル(1cm幅)からなる。中心チャネル24は、「U」形状の領域(図3Aを参考のこと)を規定し、そこへ熱ELVAX 410(IR吸収色素を有する)の微細で連続的なビードB(ロッド)が押出される(図3Bおよび3Cを参照のこと)。次いで、これは、滑らかなドラムによる熱ロール26によって、熱ローリングされ、平坦な表面を形成する(図2Bを参照のこと)。加熱されながら、活性化可能な表面18は、リッジ22と同一平面である(図2Bを参照のこと)。冷却時に、活性化可能ポリマーは収縮して凝固する(図2Cを参照のこと)。これは、ポリエステル上のELVAX 410の4mm幅中心切片を有する1cm幅のテープに導き、ポリエステルに結合されたポリアミドの境界ストリップから20ミクロンまで溝を付けられている。
【0064】
従って、発明者らは、「非接触LCM」のための正確溝付きテープの製造のための単純なスキームを提案する。
【0065】
代替は、同じ種類のリリース表面(ポリアミド)の境界を剛性の基板上に形成し、次いでEVAで中心領域を満たすことであることに注目のこと。
【0066】
図4を参照すると、非接触LCMのさらなる改善は、テープの周期的なマーキングのための、以前に記載された設計を使用し、その結果、移動が、よく規定された位置(例えば、位置28a〜28E)で周期的に配置され得る。本来は、この概念は、小さな移動領域を抽出物に打ち抜き、そして分子分析容器が移動領域の光学的位置を分離することなく、実施され得るように、開発された。
【0067】
この本用法において、「非接触LCM」テープは、その上の周期的指示器マーカー30に対して一定の増分で、LCM移動の各セットの間で並進され得る(図4を参照のこと)。図4に示すように、移動のセットは、個々の標的の複数の移動を示し、これらの標的は均一であり、そして分子分析のために1つのサンプルにプールされる。各セットの移動内での個々のLCM移動間のより小さな分離が、小さな領域(上記実施例においては、これは0.5mm以内であり得るが、一方で異なるセットは、中心が2mm間隔を空け得る)内での各セットについてのクラスターを作製することは、可能である。
【0068】
見られる図4の底部ストリップを参照すると、キャッピングテープストリップCは、間隔をあけた微小チャンバHを含むことが見られる。分子の抽出および分析のために使用される微小チャンバHは、ウェル(個々の移動クラスターよりわずかに大きな直径を有するか、または上記実施例においてはd>0.5mm)の直線状アレイとして、マイクロ移動セット間でのテープの並進と正確に同じ周期的繰り返し(上記実施例においては2mm)を有して、形成され得る。このスキームは、多数のセットの移動が連続したテープ上に蓄積され、次いで分子の抽出および分析のための微小チャンバの直線状アレイ上に、連続的に並進されて(熱)シールされることを、可能にする。このことは、現行のLCMプロセスの効率を大いに増加させ、そして分子分析システムの容量を、その分析がより迅速に、より低い試薬費用で、そしてより大きな正確さで実施され得るような小容量まで減少させる手段を提供する。さらに、この設計またはその類似物は、特に従来技術の微小容量のマイクロフルイディックスプロセッシングを組み込む場合に、分子の分析およびトラッキングの自動化のために、既存のLCM移動キャップに勝る有意な利点を与える。
【0069】
図5を参照すると、本発明の代替の実施形態が図示される。具体的には、基板20は、層を完全に横切って置かれる活性化可能ポリマー表面18を有する。活性化可能ポリマー表面18の頂部には、中心周期的開口32を有するコーティング表面31が配置される。このコーティングおよび開口は、試験片Mからの活性化可能ポリマー表面18の所望の凹部を形成する。
【0070】
図6を参照すると、本発明はまた、後続の表面が円柱状ロッドRの円錐状端部34をコーティングする場合に、活性化可能ポリマー表面18のスペーシングを含む。活性化可能ポリマー表面18の、試験片Mからの所望のスペーシングを実施する目的で、リム16が配置される。これは、円柱状ロッドRの遠位端の位置である。円柱状ロッドRの一端が試験片に対して保持されるので、所望されることは、リム16が試験片Mに接触することのみであることを、読者は理解する。円柱状ロッドRが、円錐状端部34を試験片Mに対して平行に配置するよう整列される角度を与えると仮定すれば、この試験片からの所望の空間的分離が生じる。レーザーキャプチャ微小解剖のための表面のこの実施形態に関するさらなる情報のために、読者の注意は、本明細書の名指しされた発明者の1人であるSeth R.Goldsteinらによる、CONVEX GEOMETRY ADHESIVE FILM SYSTEM FOR LASER CAPTURE MICRODISSECTIONの表題の、米国特許出願第08/883,821号に促される。
【0071】
図7A〜7Cは全て、活性化可能コーティングEを有する基板Sのための支持体のための、ホルダHを図示する。各場合において、基板Sは、ホルダ中のキャビティを通して適用される真空によって、ホルダHに保持される。各場合において、このキャビティの深さは、下にある試験片Mから間隔をあけてコーティングEを維持するような程度にされる。
【0072】
図7Aに注目すると、キャビティ40は直線である。基板Sは、ホルダHの下に延びるに十分な幅を有し、そしてこの基板の中心に活性化可能コーティングE(これは、通常はテープの形態である)を有する。キャビティ40の深さ、基板SおよびコーティングEは、真空Vが適用される場合に、活性化可能コーティングEがスライドG上の試験片Mから間隔を空けるようにされる。
【0073】
図7Bは、図7Aに類似しており、キャビティ41が丸い。図7Cは、試験片Mに粘着していない非常に薄いコーティングCが、基板Sおよび活性化可能コーティングEを試験片Mから間隔をあける点で、図7Bと異なり、この場合の活性化可能コーティングEは、基板Sの全幅に延びる。
【0074】
図8Aおよび8Bは、テープホルダHの実施例であり、これらは、テープストリップを受容し、そして保持するように、設計される。図7A〜7Cの場合と同様に、試験片Mからの間隔は、スライドまたは試験片のいずれかとの接触により、確立される。
【0075】
図8Aを参照すると、ホルダHは直線であり、テープ45の形態の基板Sが、活性化可能コーティングEでコーティングされている。テープ45は、真空VによってホルダHに保持され、ここでキャビティ48の深さ、基板S、活性化可能コーティングEの全てが、5〜20ミクロンの分離を保持するよう設計されている。
【0076】
図8Bは、アクチュエータAがホルダHの側部に配置されているので、図8Aとは異なる。アクチュエータAは、代表的に、精密なスペーシングデバイスである。これらは、スライドG上の試験片Mからの活性化可能コーティングEの精密なスペーシング、ならびに接着サンプルの活性化可能コーティングEへの分離の補助の両方を、可能にする。
【0077】
図9を参照すると、空気ベアリングPが、スライドGおよび試験片MからのホルダHの空間的分離を実施する。他の全ての局面において、この実施形態は、図8Bに類似する。
【0078】
図10A〜10Cは、全て、活性化可能コーティングがサンプルに関して片持ち状になっている場合を図示する。これらの図の各々が、いわゆるEPI経路(視野およびレーザーによる活性化の両方が、試験片Mの下から来、そしてこの試験片の下から、活性化可能なコーティングを局所的に見、そして活性化する)と共に使用されることを、読者は理解する。
【0079】
図10Aを参照すると、機械的スライド50(概略的に示す)が、直角梁51を支持する。テープ56は、リール52、54の間に逐次的に供給される。試験片Mを有するスライドGは、下に顕微鏡対物レンズOを有する。調節は、スライド50をスライドGおよび試験片Mの方におよびそれらから離れるように移動させることにより、達成される。
【0080】
図10Bは、リール52、54およびテープ56の支持体が、簡単な梁64の上にあることを除いて、図10Aに類似する。簡単な梁64は、旋回接続60および調節可能接続62を有する。調節可能接続62を調節することによって、テープ56の方へおよびそれから離れてのスペーシングが、スライドG上の試験片Mから生じる。
【0081】
図10Cを参照すると、片持ち梁吊下の好ましい方法が、ロッドの端部の凸状表面上に配置される活性化可能コーティングと共に使用される。
【0082】
円柱状ロッドRは、活性化可能コーティングEでコーティングされた円錐状表面70を有する。円柱状ロッドRは、ソケット72を設置し、このソケットが次に、シャフト74およびステッパモータ76に同心的に固定される。
【0083】
ステッパモータ76は、旋回点82上のロッカーアーム80に設置され、そしてここで、上端84および下端86において始動される。具体的には、活性化可能コーティングEの試験片MおよびスライドGからの空間的関係の荒い調節が、リードスクリューアクチュエータ90、および上端84におけるロッカーアーム80への板バネ接続によって、生じる。精密な調節は、アクチュエータ表面98におけるロッカーアーム80の下端86上のアクチュエータ96の、差動マイクロメータ94によって生じる。観察され得るように、ロッカーアームは、代表的に、顕微鏡ステージ100に設置される。
【0084】
操作において、図10Cの実施形態は、活性化可能コーティングEと試験片Mとの間に可能である1ミクロンの許容を有して、高度に所望されることを示した。
【0085】
図11は、試験片Mと活性化可能コーティングEとの間の空間的間隔を測定する方法を図示する。図11を参照すると、マーカーMが、活性化可能コーティングEの表面上のEPI対物レンズOを通して焦点を合わせられる。このようなマーカーは、プラス約1ミクロンまたはマイナス約1ミクロンを作製し得る。
【0086】
図12を参照すると、基板Sが2つのアクチュエータAの間に吊下され、これらのアクチュエータAが次に、間に試験片Mを有してスライドGに支持されることが見られる。多くの基板Sが活性化可能コーティングE(例えば、EVA)でコーティングされる場合には、このEVAはこのような切断の線に沿ったバリ(burrs)蓄積に蓄積される傾向があることが、見出された。図12に示す凸状の断面形状は、このようなバリを小さな間隙から処分する。
【0087】
2つの主要な限定が、本明細書中に記載する本発明を支配することが、理解される。第一に、活性化可能コーティングは、常に、間隙によって試験片から空間的に離れて維持する。第二に、活性化されると、活性化可能コーティングは、この間隙を架橋し、そして標的領域において試験片Mと少なくとも接触する。
【0088】
可撓性テープが、上に活性化可能ポリマーの層がコーティングされる「不活性基板」と共に使用される場合には、基板の凸状表面および活性化可能ポリマーの層が、このテープを凸状加圧プレートに適合させることによって達成され得ることが、理解される。
【0089】
全ての材料は、一般に、いくらかの狭い温度範囲にわたって、準直線的な膨張係数を有する。非接触キャプチャは、焦点膨張が、周囲の層の膨張よりずっと大きいことを要求する。本発明者らは、パルスの間および終了後に、集中的にポリマーを加熱するが、その熱は放射状に流れ続け、これによって周囲の材料がその熱に比例して膨張し、直線的な熱膨張を呈した。実際に、活性化されたポリマーに関連する相変化におけるより大きな容量変化(すなわち、溶融または溶融および蒸発/含まれる気泡の膨張)は、簡単な直線的な熱膨張と比較して非接触LCMを大いに容易にし、そしてより大きな膨張が高度に局在化されることを可能にする。
【0090】
加熱は、レーザービームのサイズおよび短いパルス長によって、局所的に集中され得るが、熱はパルスの終了後の放射状に流れ、従って局所的な活性化領域に完全には適合しないことに注目のこと。しかし、本発明者らは、ポリマーを溶融させるために十分な加熱が起こる容量を、制限し得る。非接触LCMの本発明者らの用法において、この相変化(またはその内部に作製されるより小さな蒸気泡)は、周囲の固体の「非活性化」ポリマーおよびその「不活性な」基板のより小さな直線的な膨張係数と比較して、大きな容量膨張に関連する。周囲の「溶融していない」構造は「剛性」であるので、膨張した溶融容量は、強制的に「間隙」を横切って流され、試験片中の所望の標的に接触し、そしてキャプチャする。
【0091】
活性化可能コーティングEが活性化の際に、試験片Mの可視領域に粘着することは、必要ではない。例えば、活性化可能コーティングは、試験片Mに対して常に粘着する表面を備え得る。さらに、このようなコーティングは、試験片に対する選択的なアタッチメントを有し得る。例えば、このコーティングは、活性化領域において、特定のタンパク質に優先的に付着し得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、試験片の視覚化を行う顕微鏡、試験片の上にある基板上の活性化可能コーティング、および活性化可能コーティングを活性化するためのレーザーを図示するレーザー捕捉顕微解剖の斜視図である。
【図1A】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Aは、サンプルの上の最初の活性化を示す。
【図1B】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Bは、完全な活性化および活性化された下部分とサンプルの材料との接触を示す。
【図1C】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Cは、応力下で収縮するポリマーを示す。
【図1D】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Dは、現在冷却された活性化可能材料に付着された組織サンプルの標的部分を示す。
【図1E】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Eは、濃縮を可能するためにサンプルに対する活性化可能コーティングの相対的運動を示す。
【図1F】 図1A〜1Fは、レーザーを用いることによる活性下の活性化可能コーティングのそれぞれの図である。
図1Fは、標的試験片を収集するための台座の押出しを示す。
【図1G】 図1Gは、試験片の一部を取り外すために収縮される気体バブルを図示しない試験片を有する台座(ここで、図1Fの試験片および台座に類似して示される)を示す。
【図1H】 図1Hは、広い低電力ビームで再溶解された図1Gの台座および試験片を示し、台座が実質的にオリジナルのテープの寸法に戻ることが可能となり、顕微解剖された試験片をさらにテープに向かって引っ込めて試験片の損失を避け、他の類似の試験片の近接収集を可能にする。
【図2A】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Aは、活性化可能コーティングを受容するためのテープ状基板上の間隔の離れた位置に配置された非粘着性境界を示す。
【図2B】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Bは、非粘着性境界間の基板上の溶融コーティングの配置を示す。
【図2C】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Cは、冷却のために、オプティカルフラットに配置された、図2Bの基板を示す。
【図2D】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Dは、基板上のコーティングが冷却された後の、図2Cの基板を示し、小さな分離が今やコーティングの底部からオプティカルフラットに存在することに注意のこと。
【図2E】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Eは、今や試験片の上に並列される図2Dの基板を示し、試験片に対する接触が非粘着性境界においてのみ生じ、試験片から凹状にされた活性化可能コーティングを示す。
【図2F】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Fは、図1に示されるようなレーザーによる活性化可能コーティングの活性化を示す図2Eの基板および試験片を示し、より詳細には、試験片の選択された領域と接触するためにカラムを形成するための活性化可能コーティングの膨潤を示す。
【図2G】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Gは、試験片から取り除かれた図2Fの基板を示し、試験片の選択された部分が付着されて、カラムが縮み、収縮される。
【図2H】 図2A〜Hは、一連の図の側部立面である。
図2Hは、試験片から図2Fの収集部位にすぐ隣接した部位に選択された類似の組織を有する異なる試験片に配置された基板を示す。
【図3A】 図3Aは、非粘着性境界間に活性化可能コーティングを配置する前の、いずれかの側面で積層された非粘着性境界を有するテープ状基板を示す。
【図3B】 図3Bは、非粘着性境界間で図3Aの基板に配置された活性化可能コーティングが引き続いて、形成される材料のビードを示す。
【図3C】 図3Cは、2つの非粘着性境界間のビードを示す図3Bの基板の側部立面断面である。
【図3D】 図3Dは、凹状のコーティングを形成するための、図3Cのビードの概略的な熱ローリングを示す。
【図4】 図4は、本発明のテープ上に収集された試験片部分をプロセシングするための微小チャンバの一連のカプセル化を含むシーリングアレイの側面に沿った、図3A〜3Dで生成されるテープに類似したテープを示す。
【図5】 図5は、本発明のレーザー捕捉微小解剖を実行するための環状非粘着性境界を有するテープの3次元的図である。
【図6】 図6は、試験片からロッド上の活性化可能コーティングを一定の間隔に置くための遠位リムを有するロッド状部材を示し、ここで、試験片の部分の収集が起こる。
【図7A】 図7A〜Cは、組織試験片から活性化可能表面の空間的分離を行う活性化可能表面ホルダーの実施形態である。
図7Aは、組織サンプルに対して参照表面上に静置し、活性化可能表面を組織サンプルから間隔を空けて離れた距離に保持するための真空作動ホルダーを示す。
【図7B】 図7A〜Cは、組織試験片から活性化可能表面の空間的分離を行う活性化可能表面ホルダーの実施形態である。
図7Bは、ホルダーの内側表面が丸くされた、図7に類似の真空ホルダーを示す。
【図7C】 図7A〜Cは、組織試験片から活性化可能表面の空間的分離を行う活性化可能表面ホルダーの実施形態である。
図7Cは、スライド表面と接触した非接着コーティングを除いて、活性化表面がホルダー内の材料全てを占める、図7Bに類似の真空ホルダーを示す。
【図8A】 図8Aおよび8Bは、テープホルダーが、スライドまたはスライドに対する参照表面と接触する実施形態の図である。
図8Aは、活性化可能表面が、ホルダー内に制限され、ホルダーからの組織サンプルからのその分離を確立して示す。
【図8B】 図8Aおよび8Bは、テープホルダーが、スライドまたはスライドに対する参照表面と接触する実施形態の図である。
図8Bは、組織サンプルからの選択された材料の分離を行うためのアクチュエーターを有するホルダーを示す。
【図9】 図9は、ホルダーとスライドとの間の接触が生じないように、ホルダーがエアベアリングによってスライドに対して吊るされた、図8Bに類似の実施形態を示す。
【図10A】 図10A〜10Cは、組織サンプルを有するテープまたはテープホルダーのいずれとも接触しない実施形態である。
図10Aは、テープホルダーが、テープホルダーに関して片持ち梁のようにされる場合を示す。
【図10B】 図10A〜10Cは、組織サンプルを有するテープまたはテープホルダーのいずれとも接触しない実施形態である。
図10Bは、テープが組織サンプルに関して単純な梁上で旋回し、サンプルの観測が、サンプル中へのスライドを通るいわゆるEPI経路に沿って生じる場合を示す。
【図10C】 図10A〜10Cは、組織サンプルを有するテープまたはテープホルダーのいずれとも接触しない実施形態である。
図10Cは、本発明を使用する凸状表面装置の側部立面である。
【図11】 図11は、テープの低い表面上の基準マークを使用し、組織サンプルとテープの間の距離の測定を行う。
【図12】 図12は、切断されたテープ側面におけるいわゆるいが(bur)の危険に曝す要件なしに、組織サンプルとテープの間の必要とされる間隔を確立するためのアクチュエーターおよびエアベアリングを示す。
Claims (40)
- 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
選択的活性化可能な層を提供する工程であって、活性化の際に、該選択的活性化可能な層が、該選択的活性化可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた、第1間隔を超える容量膨張の末端を有する該容量膨張を引き起こす、工程;
該試験片に曝される該選択的活性化可能な層上に、調製された表面を配置する工程であって、該調製された表面が、該試験片の少なくとも1つの成分と親和性特異的結合を有する、工程;
該第1間隔より小さな、限られた分離において、該試験片の上にある該選択的活性化可能な層を配置する、工程;および
該容量膨張の末端において、該試験片の部分を局所的に接触するために、少なくとも該第1間隔まで容量膨張を引き起こすために、該選択的活性化可能な層を選択的に活性化し、該調製された表面を該試験片へ接触させ、そして活性化可能な層上の、該調製された表面によって定義される特異的表面親和性を有する、該標的された試験片の成分と親和性特異的結合を形成する、工程、を包含する、プロセス。 - 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
支持基板を提供する工程;および
前記選択的活性化可能な層を、該支持基板に接着する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
該試験片を可視化する工程;および
該試験片の可視化された部分内の所望される標的の上にある、前記選択的活性化可能な層を選択的に活性化する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、ここで、前記選択的に活性化する工程が、以下:
該試験片の標的された部分と、機械的な結合を形成する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
該試験片内の異なる標的要素の対応する接触およびキャプチャを引き起こすために、前記選択的活性化可能な層の異なる部分の選択的活性化を繰り返す工程、を包含する、プロセス。 - 請求項5に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
前記試験片に関して、前記選択的活性化可能な層を移動する工程であって、前記一連のキャプチャされた要素を、該試験片内のそのスペーシングと比較して、前記活性化された層上に集中する工程、
を包含する、プロセス。 - 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
レーザーで活性化された選択的活性化可能な層を提供する工程であって、該選択的活性化可能な層は、レーザー活性化の際に熱により発生する容量膨張を引き起こし、そして冷却の際に弾性的に収縮し、該容量膨張の末端が、該選択的活性可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた第1間隔を超える、工程;
該試験片に曝される該選択的活性化可能な層上に、調製された表面を配置する工程であって、該調製された表面が、該試験片の少なくとも1つの成分と親和性特異的結合を有する、工程;
該第1間隔より小さな分離において、該試験片の上に該選択的活性化可能な層を配置する、工程;および、
加熱するためにレーザーエネルギーを用いて該選択的活性化可能な層を選択的に活性化する工程であって、該活性化が、該容量膨張の該末端において、該試験片の部分と局所的に接触および結合するために、少なくとも該第1間隔まで容量膨張を引き起こし、該調製された表面を該試験片へ接触させ、そして活性化可能な層上の、該調製された表面によって定義される特異的表面親和性を有する、該標的された試験片の成分と親和性特異的結合を形成する、工程;
レーザー活性化を取り除く工程;および
容量膨張を冷却する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項7に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
前記容量膨張を冷却する工程であって、該工程が、該容量膨張の収縮を引き起こし、該試験片の残部から該試験片の標的された部分を分離させ、それによって該試験片の残部から該試験片の部分を顕微解剖する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項7に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
前記容量膨張を冷却する工程が、該試験片の部分への付着を維持し、一方で、前記活性化可能な層の該容量膨張を弾性的に伸張する工程;および、
該活性化可能な層を、該試験片から取り除く工程であって、該工程が、該試験片の前記残部から前記標的された試験片の該部分を分離し、それによって該試験片の該部分を該試験片の残部から顕微解剖する工程、
を包含する、プロセス。 - 請求項9に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、ここで、前記活性化可能な層を取り除く工程が、以下:
前記容量膨張を弾性的に収縮する工程であって、該工程が、前記第1間隔内の該容量膨張に結合した該試験片の前記部分を取り除き、それによって、該第1間隔による該活性化可能な層の該試験片からの分離が維持される場合、該容量膨張に結合した該試験片の該部分が、該試験片の、下にあり、かつ残った部分と接触し得ない工程
を包含する、プロセス。 - 請求項7に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
前記活性化可能な層が、相転移と関連して大きな容量変化を伴う、強く長い鎖の熱可塑性ポリマーを含む工程
を包含する、プロセス。 - 請求項7に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
前記活性化可能な層が支持基板に付着する工程、
を包含する、プロセス。 - 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
選択的活性化可能な層を提供する工程であって、該選択的活性化可能な層が、レーザーによって活性化される際に、加熱と同時に容量膨張を引き起こす、工程;
該試験片に曝される該選択的活性化可能な層上に、調製された表面を配置する工程であって、該調製された表面が、該試験片の少なくとも1つの成分と親和性特異的結合を有する、工程;
該試験片の上にある該選択的活性化可能な層を、第1間隔より小さく分離して配置する工程;
該選択的活性化可能な層に対して垂直な膨張成分を有して、該選択的活性化可能な層を加熱し、そして膨張させる工程であって、該工程が、該選択的活性化可能な層の第1内部容量を局所的に加熱および拡大することによって、容量膨張を最初に引き起こす、工程;および、
該選択的活性化可能な層の平面における膨張の成分を伴い、該選択的活性化可能な層の周囲の第2容量を加熱および第1容量へと膨張する工程であって、これによって、該容量膨張の末端において該試験片の部分を局所的に接触するための、全体膨張に関して、該第2容量の該第1容量までの膨張および該第1容量の少なくとも前記第1間隔までの押出しを伴って、全体の容量膨張が生じ、該調製された表面を該試験片へ接触させ、そして活性化可能な層上の、該調製された表面によって定義される特異的表面親和性を有する、該標的された試験片の成分と親和性特異的結合を形成する、工程、を包含する、プロセス。 - 請求項13に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下:
蒸気泡の生成または膨張を含む、前記第1内部容量を加熱および膨張する工程、
を包含する、プロセス。 - 可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
該可視化試験片を支持および観察するための、支持体;
支持基板;
該支持基板上に維持された選択的活性化可能な層であって、活性化の際に、該選択的活性化可能な層は、該容量膨張の末端が該選択的活性化可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた第1間隔を超える容量膨張を引き起こす、層;
該可視化試験片に接触するための、該選択的活性化可能な層上の少なくとも1つの第1表面であって、該可視化試験片上の標的細胞に対し親和性特異的結合を有する、少なくとも1つの第1表面;
該第1間隔より小さな限られた分離において該試験片の上に該選択的活性化可能な層を維持するための、該支持基板と該支持体とを相互連結する装置であって、それによって、該選択的活性化可能な層が活性化した場合に、該選択的活性化可能な層が、該試験片と接触する、装置
該選択的活性化可能な基板を選択的に活性化するための装置であって、局所的に容量膨張を引き起こす、装置
を備える、非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記支持基板と前記支持体とを相互連結する前記装置であって、該装置が、該試験片との直接的な接触に非依存である、装置
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記支持基板上に維持される前記選択的活性化可能な層であって、該層がレーザーによって活性化される、層
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記選択的活性化可能な層がレーザーによって活性化された場合に、該可視化試験片と接触するための、該選択的活性化可能な層上の少なくとも1つの第1表面
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
テープである前記支持基板および前記選択的活性化可能な層
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
テープである前記支持基板および、該テープ上のコーティングである前記選択的活性化可能な層
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
5〜20ミクロンの範囲の、前記第1間隔
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持するためのエアベアリングを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する装置を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
凸状部材である、前記支持基板、
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
円錐状部材である、前記支持基板;
前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持するための円錐状部材上のリムを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する装置;
該試験片から離れた円錐状部材のための支持体;
該円錐状部材の周囲のコーティングを構成する、前記選択的活性化可能な表面、
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
テープである前記支持基板;
前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持するための該テープ上の前記活性化した活性可能な表面を囲む、前記所望の厚みの不活性コーティングを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する装置;および
該不活性コーティング間の凹状の該テープ上のコーティングを構成する、該選択的活性化可能な表面、
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項25に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記テープ上の前記不活性コーティングであって、該コーティングが、前記選択的活性化可能な表面の周囲の円の反対側にある、コーティング、
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 請求項15に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する装置であって、該装置は、以下:
前記支持基板上の前記選択的活性化可能な表面であって、該表面は除去可能なコーティングによって覆われ、該除去可能なコーティングは、該選択的活性化可能な表面と該試験片の間の所望の空間的分離を規定するための厚さを有し、これによって、該除去可能なコーティングが除去されたときに、該選択的活性化可能なコーティングが、該試験片からの所望の空間的分離を有する、表面、
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表面を製造するための方法であって、該方法は、以下:
支持基板を提供する工程;
選択的活性化可能な表面を該支持基板に配置する工程であって、該選択的活性化可能な表面が、該可視化試験片と接触するために、活性化のときに膨張して、間隔を超えて該可視化試験片と接触する、工程;
該支持基板上に、可視化試験片を接触させるための少なくとも第1部分を提供する工程であって、該少なくとも第1部分が該可視化試験片上に標的細胞に対する親和性特異的結合を有する、工程;
該支持基板上に少なくとも第2部分を提供する工程であって、該第2部分は、該可視化試験片に関して近位の間隔に該選択的活性化可能な表面を維持するために、該支持基板上の該第1部分から除去され、かつ該第1部分に関連して支持される、工程、
を包含する、方法。 - 請求項28に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表面を製造するための方法であって、前記提供された支持基板が円錐状部材であり、該方法は、以下:
前記選択的活性化可能な表面の該円錐状部材状への配置を含む、該選択的活性化可能な表面を該支持基板に配置する工程;
リムの円錐状部材上への配置を含む、該支持基板上に少なくとも第2部分を提供する工程であって、該第2部分は、該可視化試験片に関して近位の間隔に該選択的活性化可能な表面を維持するために、該支持基板上の該第1部分から除去され、かつ該第1部分に関連して支持される、工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項28に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表面を製造するための方法であって、前記提供された支持基板がテープであり、該方法は、以下:
該支持基板上に前記第1部分を配置する該工程が、該テープ上の第1棟であって、そして空間をあけた第2棟が、該テープ上の該第1棟から離れている、工程;および
該テープ上の該第1棟および該第2棟の間の凹状の該テープ上のコーティングを構築する、該選択的活性化可能な表面の前記配置工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項30に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表面を製造するための方法であって、該方法は、以下:
前記テープ上の前記第1および第2棟を配置する工程であって、該工程は、前記選択的活性化可能な表面の周囲の円の反対側に該棟の配置を含む、工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項28に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表面を製造するための方法であって、該方法は、以下:
少なくとも前記選択的活性化可能な表面にわたって除去可能なコーティングを配置する工程であって、該除去可能なコーティングは、該選択的活性化可能な表面と該可視化試験片との間の所望の空間的分離を規定するための厚さを有し、それによって、該除去可能なコーティングが除去されたときに、該選択的活性化可能なコーティングが、該可視化試験片からの所望の空間的分離を有する、工程
をさらに包含する、方法。 - 可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
該可視化試験片の支持および観察のための支持体を提供する工程;
支持基板を提供する工程;
該支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する工程であって、該工程は、活性化のときに、容量膨張の末端が、該選択的活性化可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた第1間隔を超える容量膨張を引き起こす、工程;
該可視化試験片に接触するために、少なくとも第1表面を、該選択的活性化可能な層上に配置する工程であって、該可視化試験片上の標的細胞に対して、高い親和性特異的結合を有する単層が、該表面上をコーティングする、工程;
該第1表面を、該可視化試験片に関して近位にあり、該可視化試験片から該第1間隔だけ空間的に離れており、該可視化試験片の全ての部分から空間的に離れて維持するために、該支持基板と該支持体を相互連結する工程;および
該第1表面を該可視化試験片と接触させるために、該選択的活性化可能な層を局所的に活性化する工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
前記支持基板上の前記選択的活性化可能な層が、活性化に関連して大きな容量膨張を有する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
前記組織サンプルの空隙へのポリマーの熱可塑的注入を含む、前記第1表面を該可視化試験片に接触させるために、前記選択的活性化可能な層を活性化させる工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
サンプルの特定の細胞と連結するための特異的テザーを有する前記第1表面に提供することを包含する、該可視化試験片との接触のために、少なくとも該第1表面を前記選択的活性化可能な層上に配置する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
線形熱膨張係数を有する物質を配置することを包含する、前記支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する、工程
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
該可視化試験片を除く全ての側面上の内部の制限された区域に、局所的膨張を制限する物質を含む該支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する工程、
を包含する、方法。 - 請求項33に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下:
前記選択的活性化可能な層内に少なくとも1つの気泡を同封することを包含する、前記支持基板上に該選択的活性化可能な層を配置する工程、
を包含する、方法。 - 請求項34に記載の試験片からレーザーキャプチャ顕微解剖する方法であって、前記サンプルの表面を前処理する工程を包含し、該前処理が、キャプチャされることが所望される該サンプル要素の表面上の、特異的標的分子を認識する特異的親和性テザーに接続したポリマー微粒子(例えば、ポリスチレンラテックス粒子)を用いる標識化を包含する、方法。
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