JP2002532680A - 非接触レーザーキャプチャ顕微解剖のための設計 - Google Patents
非接触レーザーキャプチャ顕微解剖のための設計Info
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Abstract
Description
rodissection」と題された、米国仮出願第60/111,662号
(1998年12月10日出願)(この出願の開示は、本明細書中に参考として
援用される)の一部継続出願であり、そして同出願の利益を主張する。
ーザーキャプチャ顕微解剖(以下、LCMとしても知られている)は、可視化後
に、スライドから試験片のサンプルを集めるプロセスに関する。このプロセスに
おいて、活性化可能な表面は、選択された領域で、可視化された試験片の上に置
かれ、この表面は、試験片を接着するために活性化され、そしてこの活性化可能
な表面は、付着した試験片の選択された部分で取り除かれる。
いての物理的プロセスおよび設計が記載され、そして活性化におけるポリマーは
、目的の顕微鏡視野内にある標的被験体を「手を伸ばしてつかむ」ために、顕著
に延びる。冷却により、この活性化可能な層は収縮し(蓄積弾性応力に応じて冷
却の間または冷却後のいずれかで)、それによって「キャプチャされた」顕微鏡
標的を、最初のポリマー表面の近くに戻す。これらの物理的プロセスおよび特定
の設計を用いて、「非接触LCM」は、スライド上に取り付けられた組織サンプ
ルなどの試験片からの固定された分離距離(5〜20ミクロンのオーダー)で、
活性化可能なコーティングを選択的に配置することによって行われ得る。試験片
が、顕微解剖から選択された物質を有し(典型的には、透過またはエピ蛍光によ
る顕微鏡内の可視化による)、そしてレーザー照射を用いて活性化可能なコーテ
ィングが活性化される場合、活性化可能なコーティングの膨張およびそれに続く
収縮は、サンプル内の標的要素の正確なキャプチャおよび摘出を引き起こす。活
性化は、表面を接着性にする(例えば、熱可塑性接着または光化学的接着)。代
替の設計においては、活性化可能なコーティングの側面に曝された試験片は、活
性化可能なコーティングを有する薄い表面層を有し得、支持基板と試験片に曝さ
れた薄い表面層との間に、表面下層を形成する。表面下層の外向きの拡張は、薄
い表面層の、複合組織表面との接触をもたらす。この代替の設計においては、こ
の表面層は、特定の標的に対する特異的親和性を分子的に示し得、試験片から顕
微解剖のために選択された物質を標的とする特異性に加えて、結合特異性を提供
する。
分離するために、長い間実施されてきた。これは、特定の細胞(例えば、幹細胞
)あるいは細胞の塊(例えば、腎臓の糸球体)または細胞より小さい要素(例え
ば、中期染色体または染色体の特定のバンド)でさえ、次の生化学的分析のため
に所望され得る、複雑な生物学的サンプルにおいては、特に重要である。フロー
サイトメトリーおよび細胞選別は、単一の細胞懸濁液から特定の細胞の集団を分
離するために、20年間以上使用されている。1976年に、Meier−Ru
geらは、侵襲性の癌細胞の酵素活性の分析を行うために、組織試験片中の侵襲
性の癌細胞の縁に沿って切り取るために使用された、パルスUV−レーザー顕微
鏡について記載した。SchindlerおよびHolland(特許)は、走
査レーザービームにより不必要な細胞を殺すか、または所望の領域を除く全ての
領域を切り取るかのいずれかにより、細胞培養物から特定の生細胞を分離するた
めに使用されるレーザー顕微鏡について記載した。Shibataら(Am.J
Pathol.141:539,1992)は、複雑な組織切片の目的の特定
の顕微鏡領域上に、単純なUV−吸収マスクを置き、そして他の全ての領域のD
NAをUV照射により損傷させる、同様のプロセスを記載した。保護された領域
の少量のDNAは、組織内の癌細胞における特定の変異を評価するために、抽出
され、そしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅される。Whetse
llら(Oncogene 7:2355,1992)は、複雑な病理試験片に
おける純粋な細胞の集団の分離および続く分子分析のために適用される、種々の
手動の顕微解剖技術を記載し、この技術は、以下:標的領域を針またはマイクロ
ピペットの先端部を用いて屑にする工程、細胞懸濁液を作製するために液体を注
入する工程、次いで懸濁した微小サンプルを、次のマクロ分子分析のためにこの
先端部に引き戻す工程、を含む。Lance A.Liottaらによる、「I
solation of Cellular Material Under
Microscopic Visualization」と題された米国特許出
願第08/203,780号(1994年3月1日出願)において、試験片の可
視化された物質をプローブの先端部に接着させ、次いでこの先端部を除去して、
獲得したサンプルを分子分析のために溶液中に置くというアイデアが記載された
。
lular Material Under Microscopic Vis
ualization」と題されれた米国特許出願第08/544,388号(
1995年10月10日出願)において、純粋な癌細胞の集団において特異的に
発現される遺伝子のcDNAライブラリーを構築するために、癌細胞を顕微解剖
する概念が開示された。2つの特定の顕微解剖の概念が提案された:1)手動の
「針」顕微解剖および2)組織細胞と接触して配置される活性化可能な結合層の
、光(レーザー)ビームによる限局的な活性化。後者の概念は、レーザーキャプ
チャ顕微解剖と称される顕微解剖に発展している(Emmert Buckら、
Science 274:998,1996およびBonnerら、Scien
ce 278:1481,1997)。この開示において、試験片の顕微鏡可視
化は、抽出のための組織を選択することが行われた。その後、活性化可能なコー
ティングを含むフィルムが試験片の上に配置され、そしてこのフィルムは、この
試験片と選択された物質で接着される状態になるように、レーザーにより活性化
された。活性化されたフィルムが除去された場合、この試験片の接着した部分は
、同様に除去されて所望の解剖をもたらす。
えられ、これは、活性化可能なフィルムの標的の領域が活性化された場合にのみ
起こる。組織サンプル上に置かれたコーティングの他の全ての部分は、非結合で
あるとみなされた。実際には、組織の病理切片は、顕微鏡的な層の不規則な表面
を示し、そして標的の組織部位に限局的にレーザー結合させるために使用される
熱可塑性ポリマーは、組織表面にあるピーク、または下にある顕微鏡スライドと
強く結合していない領域全体をピックアップし得る。この問題は、目的の移送が
起こる領域を、選択的に切り取り得るかまたは打ち抜き得る、活性化可能なフィ
ルムの発展を導き、それによって、レーザーにより活性化されない「移送フィル
ム」の広い領域から生じる、非特異的な汚染を、劇的に減少させた。
合を作製するために使用される熱可塑性ポリマーを用いる先行技術において、結
合の強度は、適用圧力、溶融ポリマーの流動性および活性化の時間に依存する。
従って、組織との強力な結合(すなわち、顕微鏡ガラススライドに対する組織の
結合の強さより強い結合)の必要性は、強力な接触圧力または長い活性化パルス
を必要とするようである。Robert F.Bonnerらによる「PREC
ISION LASER CAPTURE MICRODISSECTION
USING SHORT PULSE LENGTH」と題された米国仮特許出
願番号第60/094,871号(1998年7月20日出願)において、最も
小さいLCM顕微解剖(例えば、直径<10ミクロン)を作製するために、短い
パルスが必要とされ、そしてその作製を可能にしたことが開示された。
−Buckら、およびBonnerらに記載されたように)あるいは、フィルム
の活性化された領域は、最初は試験片(顕微鏡)から短い距離で離れており、そ
して活性化が起こった場合に試験片と接触するようになることのいずれかは、1
995年のLiottaらの開示において固有のことである。しかし、最初の1
995年のLiottaらの開示においては、フィルムのある部分は常に試験片
と接触している。所望の顕微解剖においてより優れた精度を得るための、全ての
活性化可能なコーティングの試験片からの意図的な間隔についての示唆は存在し
ないことに、注目することが重要である。いずれかの場合において、試験片の選
択された部分は、フイルムに接着し、そしてフィルムと共にもぎ取られる。
lular Material Under Microscopic Vis
ualization」と題されたPCT出願第PCT/US96/16517
号(1996年10月9日出願)において;レーザーキャプチャ顕微解剖を増強
したものが記載された。種々のフィルムおよび活性化エネルギー源が記載された
。
ATION OF CELLULAR MATERIAL UNDER MIC
ROSCOPIC VISUALIZATION」と題された米国特許出願第0
9/364,927号(1997年2月7日出願)において、レーザーキャプチ
ャ顕微解剖の基礎技術に関するさらなるパラメーターが記載された。この場合も
また、活性化可能なコーティングと試験片との間の分離を意図的に維持すること
の特定の長所は、詳細には記載されなかった。
る「MECHANICAL HANDLING SYSTEMS FOR LA
SER CAPTURE MICRODISSECTION」と題された仮特許
出願第60/073,480号(1998年2月3日出願)において、レーザー
キャプチャ顕微解剖についての、活性化可能なコーティングと試験片被験体との
間の意図的な空間的な分離を有するアイデアが記載された。
る「CONVEX GEOMETRY ADHESIVE FILM SYST
EM FOR LASER CAPTURE MICRODISSECTION
」と題された米国特許出願第08/883,821号において、レーザーキャプ
チャ顕微解剖のために有用なフィルムを保持するための、円柱状の表面の使用を
開示した。この出願において、ロッド(典型的には、円錐形の端部を有する)は
、試験片に接触した。従って、従来の活性化が起こり(典型的には、レーザーに
よる)、ロッド上のコーティングを活性化して、この試験片の選択された部分と
接触させる。
る「Mechanical Handling Systems for La
ser Capture Microdissection」と題された米国仮
出願第60/073,480(1998年2月3日出願)において、本発明者ら
は、活性化される層と試験片表面との間に小さい空間的分離を有することの長所
を、詳細に記載した。この開示は、本明細書全体に記載される場合、本出願にお
いて相互参照される。
送フィルムの体積の拡大を利用する物理的現象を開示し、これは、1)移送表面
と組織との間の小さい分離を同時に広げ、そして2)移送表面に、非常に短いパ
ルス(例えば、<<1m秒)においてさえも強力な結合を形成するために必要な
、分子接触を生じさせるために十分な、接触力を作り出す。この物理的プロセス
の使用は、活性化可能な層の独特の設計および特性、ならびに支持基板およびレ
ーザーキャプチャ顕微解剖(LCM)の間の、サンプルからのこの分離を維持す
るために特異的に設計された特別の表面コーティングの両方を利用する、種々の
開示された発明を導く。
活性化により組織サンプルに対して並べられる、微小並置のためのLCM装置お
よびプロセスが記載される。典型的な場合において、活性化可能な熱可塑性の層
によるレーザー照射の吸収は、標的の方向を限定し、そして所望の微小並列をも
たらす、容積拡大を引き起こす。活性化された体積の開示された微小拡大は、複
雑なサンプル内の標的の要素との局所的な接触を引き起こし、そして以下のいず
れかに対して十分な接触圧を生じる:1)この標的における全ての空間に流れ込
み(例えば、その中の空気または液体を置換する)、そして強力な力学的結合を
形成する、または、2)限局的な標的特異的な結合および親和力特異的な結合を
作製するために、活性化された表面または調製された表面を、標的サンプルと密
接に結合させる(例えば、移送フィルムの調製された表面と結合した特定の高親
和性のリガンドと接触する特定の細胞表面レセプターを有する細胞)。
し、その下表面で標的と結合する)は、通常、最上層全体の上に接着した、非吸
収性の支持基板を有する。この活性化可能な層の下表面は、典型的には試験片か
ら5〜20ミクロン離れて維持される。この分離は、活性化可能な移送層が、試
験片表面のピーク(例えば、組織表面の凹凸のピーク)と接触する部分がないこ
とを、再現可能に保証するために十分大きくなければならず、従って、試験片の
厚みの平坦さまたは均等性に依存する。
への集中を可能にする(例えば、このサンプルにおけるこれらの要素の最初の(
より大きい)分離にかかわらず、10um移動して、移送フィルム表面上の位置
の特定の20umアレイ上に配置する)。これは、サンプルにおける個々の要素
の、標的、結合および分離のプロセスが、選択された分離距離を変更することな
く、任意の回数繰り返されうることを必要とする。この場合において、キャプチ
ャされた物質は、活性化された層の最初の下表面と同一平面に引き戻されるか、
またはキャプチャされた物質全体が、残されたサンプルの上表面を越えるのに十
分近くに引き戻されるかのいずれかである。
100℃)で、組織の空間に流れ込み、そしてすぐに強力な結合を形成し得るよ
うな、低い融点を有しかつ融点を超える温度上昇に伴い急速に粘度が減少する熱
可塑性ポリマーを、特に選択した。その最も頑強な形態において非接触LCMを
達成するために、本発明者らはさらに、この熱可塑性ポリマーにおいて、溶解し
た場合に、可逆的な大きい体積増加を必要とした(これは、冷却される際に再凝
固するように、回復し得る)。この様式において、限局的に溶解する場合、この
ポリマーは、その全体の厚みの大部分を顕微鏡試験片中の標的要素に向かって移
送させられ、分離している隙間を埋め、そしてサンプル内の「液体間隙」を満た
すため、または標的要素を囲むために、さらに拡がる。従って、埋められた厚み
は、分離の空隙とサンプル試験片の厚みとの和にほぼ等しい。通常、このLCM
熱可塑性ポリマーは、レーザーパルスの終了後、非常に急激に冷却されるので(
試験片が載っている顕微鏡スライドの高い熱伝導率のため)、活性化された体積
のこのポリマーは、伸展した状態で凝固する(すなわち、限局的に弾力的に変形
する)。
pont ELVAX 410または4310)を使用することにより、溶解し
た場合、活性化されたポリマーは大きい距離(100um厚の層に対して>20
ミクロン)を移動し得、すぐに標的との強力な結合を形成し、そして顕微鏡スラ
イドとのその結合(およびその本来の非標的サンプル要素)から分離されるよう
にこの標的要素の保持を保ち、次いで弾性圧力を放出して弾性的に縮む。この大
きな動きおよび続く弾性的収縮を使用し、最初の移送表面から10um離れた1
0um厚の標的要素は、「基礎を築かれ」(隙間が埋められ)得、活性化された
ポリマーによりその空隙を埋められ、そして強力に結合され、次いで、移送され
ない試験片のピーク(例えば、組織切片表面の凹凸)を越えるように、移送フィ
ルム基板に向かって10umを超えて引き戻される。
またはその部分的な体積変化により予想される、その本来の厚みよりも大きい距
離でさえも、届き得る(典型的には、フィルム厚の約20%)。これは、溶融し
た中核の円柱に拡がる、周囲のポリマーの溶融なしで加熱することにより達成さ
れ得る。この溶融した中核の円柱への拡がりは、中心の中核を効率的に圧搾して
より遠くへ移動させる。同様に、迅速な溶融および拡がり、次いで、冷却および
半径方向の温度勾配の動力学は、活性化されたポリマーの中心が、一連のパルス
で標的試験片に向かって少しずつ進むのを可能にする(中心のピークおよび周囲
の環状の減少領域を形成する)。さらに、熱可塑性ポリマーの上表面に対してよ
り大きな力を適用することにより、このポリマーを、下表面の溶融と同時に上表
面で気化させて気泡にし得る。この気泡の圧力は、活性化されたポリマーを、さ
らにより遠くの距離に進める(これは、溶融の体積変化よりさらに大きな、気化
による体積変化である)。一般的に、このポリマーの急速な冷却は、拡がった泡
を凝固させる。この大きな拡がりによる標的のキャプチャおよび分離の後に、第
二の低いエネルギーパルスがこのポリマーを再溶融させ、そして気泡(部分的に
減圧)を崩壊させる場合、大きな弾性的な反跳が達成される。
ないポリマー表面との間の大きな間隙を埋めるその能力を増大させるために、こ
のポリマーフィルムの上の領域に配置され得る。このような全ての改良において
、拡大のより大きな可逆性が好ましい。なぜならこれは、LCMがキャプチャし
た要素を、より完全に最初のポリマー表面と同一表面に引き戻すからである。例
えば、活性化されたポリマー層の拡大が完全に可逆性であり、そして10umの
厚みである場合、標的要素が、空隙の70%の部分が拡大するポリマーにより完
全に満たされ、次いで本発明者らは、キャプチャされた要素が3umだけ活性化
されていないポリマーフィルムから突き出ることを予測する。従って、この組織
の表面のピークが+3umであり、最初の間隙が5um以上である場合、キャプ
チャされたサンプルは、このフィルムおよびその基板が、移送表面の最初の平均
に戻された場合、組織表面接触との移送表面の分離が起こらないように、十分に
引き戻される。隣接する活性化されていないポリマー表面は、先にキャプチャさ
れた要素が、このサンプルの表面に接触するといういかなる心配もなく、さらな
る要素を標的とするために使用され得る。このような手順は、複数の要素が、一
連の工程で、移送フィルム上の並んでいる「パーキング位置(parking
place)」の任意の禁止された配列に移送されることを可能にする。この集
中機能は、次の分析(分子分析または光学分析のいずれか)が、向上した感受性
および特異性、より早い反応速度、ならびに少量の試薬に関連した低いコストを
必要とする場合は常に、非常に重要である。
択的に活性化可能な表面のためのホルダーの構造、組織サンプルあるいは参照表
面と接触させるホルダーの構造、または、さらに設計された空間的分離を維持す
るためのメカニズム(例えば、空気保持方法または片持ち梁式方法)により維持
され得る。所望の空間的分離を確立するための方法が、開示される。
と接触し、試験片を並べる。次いで、この選択的に活性化可能な表面は、組織サ
ンプルに関して接着性になり得、組織サンプルに圧力を与え得、組織サンプルを
走査し得、または調製された表面を、組織サンプルと局所顕微的に制御して接触
させ得る。
より接触させられる、2つの表面の間の限局的に特異的な並列を作製する、先行
技術においては知られていない方法を記載する。この限局的に特異的な活性化は
、密接な接触がこの表面上の活性化された部位でのみ作製されるように、他の表
面に対する1つの表面の移動を引き起こす。
に必要とされる。この局所的な結合は、多数の異なる形態であり得る: 1)ポリマーの標的サンプルの隙間への熱可塑的注入および強力な限局的な力
学的結合への急速な固化、 2)拡大する表面が範囲(領域)を包み込むように、力学的または高い表面親
和力により特定の範囲へ結合する(例えば、サンプルにおける特定の細胞に結合
した、ポリスチレンラテックス微粒子抗体)、ポリマーの熱可塑的拡大、 3)ポリマー表面上の単層コーティングの細胞表面との密接な分子接触(単層
の外側の表面上の特定のリガンドが、目的の細胞表面(例えば、このリガンドに
対して特異的なレセプターを有する細胞)への高い親和性の強力な特異的結合を
形成し得るように)を作製する、ポリマーの熱可塑的拡大(これは、先の顕微鏡
標的決定に対する標的の、目に見えない分子組成物に基づく特異的な選択を付加
する)、 4)強力かつ熱可塑性ポリマーに対して親和性の下にあるポリマー層と結合す
る、細胞の間へのポリマーの熱可塑的拡大(例えば、目的の細胞の周りにバスケ
ットを形成する−生細胞全体または個々の染色体もしくは細胞小器官などの、最
も小さい顕微鏡的に観察可能な被験体に対して特に有用である)、および 5)ポリマーの高い親和性の表面が、標的細胞における特定の高分子と結合す
るような、乾燥した組織切片の隙間への、ポリマーの熱可塑的注入(これは、ポ
リマーが、標的の試験片由来の特定の分子成分の精製手段を提供する、アフィニ
ティーカラムとして作用することを可能にする)。
活性化、および限局的な加熱を用いるその容積拡大が、ポリマー表面の、正確な
用量依存性の距離での限局的な拡大を引き起こすことの発見である。次いで、こ
の熱可塑性ポリマーは、標的サンプルとの分離を埋めるように拡大し得、これら
2つの表面の限局的な接触をもたらす。この拡大は、以下により引き起こされ得
る: 1)加熱と共作用の線形熱的拡大、およびサンプル組織(または標的)に直面
する表面を除く全ての面において限局的に加熱されたポリマーの慣性拘束、 2)加熱により固体(例えば、結晶)から液体への相転移を起こすような、ポ
リマーの体積増加、および標的に直面する表面を除く全ての面において限局的に
加熱されたポリマーの慣性拘束、および 3)限局的に液体になる(すなわち、低粘度の)標的の熱可塑性ポリマーに囲
まれた気泡を加熱することにより引き起こされる、急速な圧力過渡、そしてそれ
によって、この増加した限局的圧力に限局的に反応する。
合、ナフタロシアニンで染色された低融点のEVAフィルム(例えば、Elva
x410、200W、および4310処方物)が、数十ミクロン弾性的に拡張す
ることをなし得ることを発見した。この拡張された材料は、そのような距離でオ
リジナルから分離された新しい表面と接触され得、次いで、急速に冷却した際に
この新しい表面と強力な結合を形成し、同時に、弾性ポリマーに応力を作り出す
。標的サンプルとその基質の付着を切断する際に、ポリマーの弾性応力が解放さ
れ、結合された標的がオリジナルのポリマー表面に向かって戻り得る。この機構
を使用する場合、標的の表面を見つけ、分子レベルについてこの表面を適合させ
るために、このポリマー表面を動かすことが可能である。このパルスの間、2つ
の表面の非応力分子相互作用は、ポリマーの急速な冷却の前に(パルスが停止し
た後に)これらの特定の分子結合が形成され得るように、達成され得る。これに
よって、標的は、ポリマーフィルムに、およびそれを介してフィルムの下にある
固体基板に物理的に結合され得る。
の非特異的相互作用および部分的移動を避ける)、 2)複合体サンプル(同じ形態学および/または分子表面同一性を有する)の
異なる領域の反復サンプリング、および移動フィルムの1つ以上の正確に特定さ
れた領域上への結合(例えば、複数の標的が、複合体(組織)サンプル(単数ま
たは複数)のオリジナルの間隔に関係なく、平坦なフィルム上に一緒に接近して
配置され得る)、それによって、希薄な要素を移動表面の小さな規定された表面
に効果的に濃縮すること[効果的な顕微鏡検査およびインサイチュラベリング、
ならびにこのようにプールされたサンプルから非常に小さな体積への巨大分子の
効果的な抽出を可能にする]、 3)特異的巨大分子標的による標的細胞による捕捉プロセスならびに同時の顕
微鏡的イメージングによる形態学的同定におけるさらなる巨大分子特異性の可能
性、ならびに 4)機械的リンカーの細胞表面への特異的結合による、湿ったサンプル表面お
よび生きた細胞の捕捉を可能にすること(以前のLCM方法は、水の存在下で効
果的に結合されなかった)。
いう特別な性質を使用するために、活性化されていないポリマーと標的表面との
間の正確な分離(例えば、複合体組織の5〜10um厚さの部分)を作製するた
めの新規な方法を考え出すことが必要である。例えば、本発明者らは、焦点光ビ
ーム(例えば、近IRレーザーダイオード)によって活性化されたポリマー表面
を作製し、その結果、5〜20ミクロンのオーダーの正確な距離がこの表面を標
的サンプルから分離するためのプロセスを記載する。これは、境界材料または正
確なスペーサーによってなされ得、これは、これが押しつけられる組織、または
生物学的調製表面と結合を形成しない。
れ得るポリマー表面を組織表面から固定した距離(これは、通常、組織試験片の
厚さよりも大きいが、ポリマー層の厚さよりもずっと小さい)に保持する圧力プ
レートを含む。以前に開示されたLCMの概念および材料を使用すると、このア
センブリは、目的の領域、顕微鏡によって同定され、レーザービームによって標
的化される特異的な組織成分上に置かれ得る。レーザービームは、適用される場
合、ポリマーを加熱し、それによってそのポリマーを拡張し、接触させ、結合さ
せる(例えば、標的中の流体または空気の空間を含浸し、次いで、その場所で冷
却し、標的に対して局所的に強力な結合を形成する)。
レンビニルアセテート)に対して使用している標準的なEVAポリマーが、室温
からその融点に局所的に加熱された場合、典型的に>10%拡張することを示し
た。従って、標的ポリマーフィルムが、局所的点において頂部から底部まで融解
する場合、これは、台座としておよそ10%のフィルム厚さを拡張する。従って
、局所的に溶解される場合、100ミクロンの厚さのフィルムが、10ミクロン
より大きく拡張し、従って、フィルムが組織を見出すまでフィルムと組織との間
のこの厚さの空気の隙間を探索し得る。フィルムが組織を見出した場合、これは
、組織の空隙に拡張し、強力な局所的結合を形成する。
れるより高い温度に起因して、これらの値よりも2〜3倍大きくなり得ることを
観察した。この拡張は、放射熱フローに起因すると考えられ、これによって、周
りの固体ポリマーが融解したゾーンを半径方向に狭窄し、オリジナルのポリマー
表面からさらにポリマーの台座を押し出す。一般に、ポリマーが冷却される場合
、フィルムが組織(生物学的)試験片を急速に「剥ぐ(peel)」かまたは持
ち上げるまで組織内で拡張し続け、これは、含浸されたゾーン(典型的には円柱
状の台座)の境界において引き裂く。この点において、ポリマーおよび含浸され
た標的組織が、オリジナルのポリマー表面にパチンと戻る(snap back
)。典型的には、はね返り(recoil)は、オリジナルの拡張の50%より
大きい。従って、LCMに使用される本発明者の既存のEVAポリマーについて
、本発明者は、均一な5ミクロンの空気の隙間を架橋するために、10ミクロン
拡張するために100ミクロンの厚さのポリマー層を活性化し、次いで、それが
強く結合する5ミクロンの厚さの組織のスライスを含浸し得る。組織からの分離
の際に、組織ポリマー表面は、5ミクロンより大きく縮小し、その結果、この領
域は、以前に述べた境界ゾーンを除いて何処にも接触を作製しないで、組織試験
片の異なる領域上に再び置かれ得る。
よって)なされ得、移動表面上の小さな中心ゾーンにおいて濃縮され得る(すな
わち、組織部分内よりもずっと小さい標的−標的間隔に置く)。一旦、十分に均
一な生物学的標的がこの移動表面上の蓄積されると、これは、抽出および分子分
析のための微小容器上または微小容器内に置かれ得る。
バの開口頂部への環状シーリング(annular sealing)を含む。
このシーリングは、移動組織(生物学的標的)をチャンバの中心においてまたは
蓋を形成するポリマーの表面の内側に配置してチャンバをシールする様式で生じ
る。さらなる特異的な改良は、EVAフィルムの熱可塑性のシーリング性質を使
用し、この緊密なシールを環状のレーザー源(または円で走査される点)によっ
て、または環状に加熱された圧力プレートによってのいずれかで形成する。この
後者のアプローチは、凹状の熱可塑性ポリマーがオリジナルで形成される基板が
、100〜200ミクロンの厚さのMylar(ポリエステル)フィルムのよう
に比較的薄い場合、より容易に理解される。
の凹部の量だけ所望の熱可塑性接着ポリマーの厚さより大きくなるように、「非
粘着性」ポリマーテープを製造することである。これは、EVAおよび「非粘着
性」境界の異なる拡張によって、EVAが高温で平坦な表面を形成し、これが冷
却時に所望の凹部を導くように、高温で基板上に鋳造することによるEVAの製
造によって達成され得る。例えば、本発明者らは、中心チャネル4mmの厚さを
形成するために、両端上に200ミクロンの厚さのストリップのポリアミド(3
mmの幅)を有する200ミクロンの厚さのポリエステル(1cmの幅)の積層
体を形成し得た。この構築物によって形成される間隔において、ホットElva
x410(IR吸収色素を有する)の微細な連続的ビード(bead)(ロッド
)が押し出される。次いで、押し出された材料は、平滑化ドラム(smooth
drum)によって熱ロールされ、平坦な表面を形成する。冷却時に、押し出
された材料は、ポリエステル(これは、このポリエステルに結合されたポリイミ
ドの境界ストリップから20ミクロンだけ凹状である)上にELVAX410の
4mmの幅の中心部分を有する1cmの幅のテープを残す。従って、本発明者ら
は、「非接触LCM」に対する正確に凹状にされたテープの製造のための単純な
スキームを提案する。代替物が、堅い基板上の同じ種類の放出表面(ポリイミド
)境界を形成し、次いで、中心領域をEVAで満たすことに注意すること。
され得るように、テープを周期的にマーキングするための以前に開示された設計
を使用する。もともと、この概念は、少しの移動領域を抽出および分子分析容器
にパンチ(punching)することが、移動領域の別々の光学的位置なしで
実施され得るように、開発された。その本発明での使用において、「非接触LC
M」テープは、周期的なインジケーターマーカーに対して固定された増分だけ並
進され得る。LCM移動の各セットの間で、サンプルが集められ得る。プロセス
の最後において、個々の標的の複数の移動のセット(これらは均一である)が、
分子分析について1つのサンプルにプールされ得る。移動の各セット内の個々の
LCM移動間のずっと小さな分離は、小さな領域内の各セット(上記例において
、これは、0.5mm以内であり得るが、異なるセットは、2mmの中心の間隔
にされ得る)についてのクラスターを作製する。分子抽出および分析に使用され
る微小チャンバは、微小移動セット間のテープ並進と正確に同じ周期的な繰り返
し(上の例において2mm)を有する、ウェルの直線アレイ(個々の移動クラス
ターよりもわずかに大きい直径を有するか、または上の例においてd>0.5m
m)として形成され得る。このスキームによって、多数のセットの移動が連続テ
ープ上に集積され得、次いで連続的に移動され得、分子抽出および分析のために
微小チャンバの直線アレイ上に(熱)シールされ得る。これは、流れ(curr
ent)LCMプロセスの効率を大きく増加し、分析がより手早く、より低試薬
費用で、そしてより正確に実施され得るような小さな体積に分子分析システムの
体積を減少するための手段を提供する。さらに、この設計またはその類似物は、
分析の自動化および流れLCM移動キャップに渡るサンプルの追跡(特に、従来
技術の微小容積の流体プロセッシングを組み込む場合)にかなりの利点を提供す
る。
がない、本発明者らが現在示している種々の手段によって、テープおよび圧力プ
レートによって達成され得る。例えば、テープが、圧力プレート/堅い基板と標
的試験片表面との間の隙間よりも、正確に所望の非接触隙間だけ小さい均一な厚
さであり得る。さらなる例として、試験片(例えば、5ミクロンの厚さ組織スラ
イス)が配置されるガラススライドの頂部は、試験片がないその縁部近くの規定
されたステージ表面に対して保持される。この後者の場合において、LCM移動
フィルムについての圧力プレートまたは堅い基板は、ガラススライドの頂部の上
に正確に72ミクロンで機械的に配置され、テープは、均一に60ミクロンの厚
さであり、圧力プレートのより下の表面に対して保持される。ガラススライド上
の組織部分は、(組織を切断するミクロトームを調節することによって)5ミク
ロンの厚さにされた。この場合、移動フィルムのより下の表面は、最も近い表面
の組織試験片の7ミクロン上にある(移動フィルムが組織試験片と接触する活性
化時のみおよび所望の標的点のみ)。圧力プレートが球形または楕円形である場
合、レーザー活性化および分離(標準LCM段階)の後のテープの並進、以前に
移動された領域が、さらに組織表面から除去され、そして濃縮を有する平坦フィ
ルム非接触LCMに必要な「はね返り」が、もはや必要ないことに注意すること
。これは、非接触LCMを実行する最も簡単なフィルムおよび手段であり、本発
明者が現在試験している分離手段または代替のものが、市販であり正確に規定し
維持するのが容易である場合、非接触LCMのこの変形は、最も広く使用されそ
うである。
て本発明者らは、これを達成するためのいくつかの方法を議論するものの、非接
触LCMは捕捉および濃縮に基礎的な方法である。これは、隙間に渡り、そのす
ぐ下(従来の意味での下)の標的を捕捉するのに十分な熱ポリマーの拡張に頼る
。これは、引き続く分析に役立つ移動フィルム上の特定の位置への、希薄な対象
物の濃縮、一連の標的の特異的移動および蓄積のような多くの利点を提供する−
(例えば、マイクロリットル以下の体積を有する微小分析チャンバに配置するこ
とによる)。たとえ、移動フィルムの底部の表面が平坦であるか、または凸状で
あっても、所望の標的上の特定の隙間において移動フィルムを正確に配置し得る
電気化学的/光学的システムを設計することが可能である。本発明者らは、一対
のこのようなシステムを組み立て、その上に内在的にオフセット空間を有するそ
れらのフィルムの相対的な利点を評価している。
ectionと題され、1999年12月10日に出願された、上で参照された
仮特許出願番号第60/111,662号の出願から、本発明者は、本明細書と
ともに含まれる図1Gおよび1Hに関して詳細にされた重要な発見をなした。詳
細には、本発明者らは、試験片の選択された部分を顕微解剖した後に、活性化可
能な材料上の材料の任意の台座を実質的に崩壊させ、実質的に除去することが可
能であることを見出した。これは、顕微解剖捕捉および分離が完了下後に、励起
照射の第2パルスを使用することによって達成され得る。この台座の収縮は、繰
り返し可能であり、予測可能であることが分かっている。これは、試験片から収
集され、選択された材料の部分の不注意な損失または汚染を妨げるという利点を
有し、収集物質の隣接部分への類似の細胞の濃縮を可能にする。
Mの底部から来る視野経路を有する、いわゆるEPI顕微鏡に関して、概略的に
示す。光源Lは、試験片Mを照射する。同時に、接眼レンズEが、試験片Mの下
からの逆転した経路に沿った試験片を表示する。具体的に、試験片Mは、選択さ
れた部分M1で可視化される。この部分が選択されると、本開示にさらに記載さ
れるように、レーザー捕捉顕微解剖が起こる。この解剖の一部として、レーザー
源Zが、テープT上に含まれる活性化可能なコーティングに入射されることが必
要である。
から5〜20ミクロン以上のオーダーの正確な距離で溝が付けられるように、焦
点が合わせられた光線(例えば、近IRレーザーダイオード)によって活性化さ
れるポリマー表面を作製するための方法を記載する。この周辺材料は、それが押
し付けられる組織または生物学的な調製表面と結合を形成しない(図2Dを参照
のこと)。さらに、本方法は、圧力プレート(例えば、円柱状ロッドR−図6を
参照のこと)を含み、このプレートは、活性化可能なポリマー表面18を組織表
面から固定された距離で維持しながら、組織表面と直接接触する周辺ゾーンまた
はリム16を配置する(このプレートは、通常、組織試験片の厚さよりも厚いが
、ポリマー層よりも非常に薄い)。以前に開示されたLCM概念および材料を使
用して、このアセンブリは、目的の領域、顕微鏡によって同定され、そしてレー
ザービーム(これは、ポリマーを加熱し、それを広げさせ、そして接触させ、そ
して結合させる(例えば、流体または空気空間を標的中に含浸させ、次いで、焦
点に標的との強い結合を形成する場所を冷却する))によって標的化される特定
の組織成分上に配置され得る。
ーからのパルスの間、活性化可能な材料Eの体積が徐々に増加する。5〜20ミ
クロンの範囲の一貫したギャップが存在するのが、サンプルMと活性化可能な材
料Eの低面との間であることに、注意すべきである。
。これは、試験片Mの選択された部分M1に接触し、そしてこの場合、それと結
合するための、下部部分7の拡張にを引き起こす。
ることが分る。このことは、細長い部分が、弾性的に圧力が加えられるか、また
は引張られるということが生じる。読者は、いくつかの場合において、この引張
りが、実際に、サンプルの選択された部分M1が、図1Dに示されるように、完
全に分離されることを理解する。あるいは、図1Dを参照して、活性化可能な層
Eが十分な距離引かれて、所望の顕微解剖および活性化可能な層Eの応力の緩和
を引く起こし得る。いずれかの場合において、図1Dの構成が生じる。
起こる。この場合、サンプルの、もともと分離され、選択された部分が、濃縮さ
れ得る。
可能な材料Eが、活性化された第1体積V1と共に示される。この体積において
、拡張を補助する気泡Gが、示される。この気泡は、材料内に以前に置かれたか
または溶解した気体、活性化可能な材料の揮発性成分、または活性化された体積
V1内に、活性化の際に気体を発生する実質的に任意の成分であり得る。
活性化することが、可能である。この円柱状体積V2は、体積V1に向かう成分を
有する円柱状体積の拡張を作り出す一般的な効果を有する。このことは、活性化
可能な材料Eを、チューブから絞り出される歯磨き粉と異ならない様式で、拡張
させる。この後者の例とは異なり、活性化可能な材料が冷えると、有効に押出さ
れた体積の収縮が起こり得る。
いて本発明者らが使用したEVAポリマー(Dupont ELVAX 410
&200W&4310エチレンビニルアセテート)は、典型的に、>10%まで
膨張する。従って、標的ポリマーフィルムが、焦点において上部から底部まで、
溶融される場合、フィルム厚さの10%より大きく、台座Pとして前方に膨張す
る。図2Fに示されるように、これは、スライド14上の試験片Mに向かって起
こる。従って、100ミクロン厚のフィルムが、焦点で溶融される場合、10ミ
クロンより大きく膨張する。この膨張ポリマーは、従って、これが、組織を見出
すまで、それと組織との間のこの厚さエアギャップを探る。膨張する支柱が、組
織または台座Pを見出す場合、収縮点での支柱は、強い焦点結合を形成する組織
の間隙空間へ膨張する。
および発見した。この過剰な膨張は、照射されたセグメントにおいて達せられる
より高い温度に一部起因し、そして周りの固体ポリマーが溶融ゾーンを放射状に
収縮させる放射状の熱フローに起因すると考えられている。この溶融ゾーンの放
射状の収縮は、ポリマー台座Pをもともとのポリマー表面からさらに遠くへ押す
。
織から、急速に「剥がされる」か、または昇離させられるまで組織内で膨張し続
ける。台座のこの上昇により、含浸されたゾーン(典型的に、円柱状台座)の境
界で裂く。この点で、ポリマーおよび含浸された標的組織は、収縮された台座P
’として、もとのポリマー表面に跳ね返る。
全ではないことが発見された。試験片を横たえる収集された試験片を例示する通
常の配置が図1Gに示される。
0日の提出以来、発明者らは発見をした。発明者らは、LCMの間に作り出され
るこの台座が、顕微解剖後に減縮され得ることを発見した。このペダルの減縮は
レーザーエネルギーの第2のパルスの使用と共に起こる。具体的に、標的サンプ
ルが分離された後(図1Gを参照のこと)、第2の低出力でかつ広く焦点合わせ
されたビームが、膨張されかつ活性化された材料Eに当てられる。図1Hに示さ
れるように、台座Pの実質的に完全な退縮が起こる。この発見の重要性のいくつ
かの議論を順に示す。
を有することは、所望ではない。この種類の突出は、収集されたサンプルを外れ
るか、または試験片の他の非特異的な部分に接触させ、それを含むことに脆弱に
する。第1の場合において、所望のサンプルが全体的に失われる。第2の場合に
おいて、非特異的な移動が試験片の品質を低下させる。
の使用は、試験片M1の接着されかつ選択された部分の予想可能なかつ繰返し可
能な膨張および収縮を生じさせることを本発明者らは明らかにした。
。さらに、発明者らは、実質的に完全である収縮を見出した。
かし、発明者らは、図1Hに示されるように、より低出力のより長くまたはより
広く分散したビームを好ましいと考える。
な材料の表面張力は、収縮の原因となり得る。交互に、活性化可能な材料は、冷
却の際に、自然な均一な厚さを求め得る。代りに、第2の「アニーリングパルス
」によって引き起こされる収縮は、標的の捕捉および/または分離の間にポリマ
ーにおいて、引き起こされる応力の緩和に起因し得る。第2のパルスの前に分離
工程が生じる場合、収縮のみが起こる。いずれの状況においても、観測された挙
動は、非接触LCMにおいて非常に有用であることを本発明者らは発見した。
は、反跳が、もとの伸張の50%を超えることを見出した。従って、LCMにお
いて使用される発明者らの現存するEVAポリマーと共に、例えば、発明者らは
、均一な5ミクロンの空気ギャップを横切るように、100ミクロン厚のポリマ
ー層を活性化させて、10ミクロン伸ばし、次いで、それに強く結合する5ミク
ロン厚の組織スライスを含浸させる。組織からの分離の際に、組織ポリマー表面
は、約7ミクロンに収縮し(図2Hを参照のこと)、その結果、この領域は、先
に記載された境界ゾーンを除くどことも接触させられることなく、組織試験片(
これは、2ミクロン以内で平らである)の異なる領域上に、再び配置され得る。
動によって)なされ得、そして濃縮される(すなわち、組織切片内の標的対標的
間隔よりもずっと狭い標的対標的間隔で配置される)。これは、全ての所望の蓄
積された要素が移動表面上の小さな中心ゾーン内に濃縮されることを生じ得る。
一旦十分な均一な生物学的な標的が、この移動表面上に蓄積されると、これは、
抽出および分子分析のためにミクロ容器上か、またはその中に配置され得る。
ルムの(円柱状)ミクロチャンバの開口頂部への環状密閉を含む。これは、フタ
を形成するポリマーの内面チャンバまたは中心に配置された生物学的な標的とし
て移動された組織と共にチャンバを密封するような様式で起こり得る。
環状レーザー源(または円内で走査されたスポット)によって、または環状の加
熱された圧力板によってのいずれかで、この密接したシールを形成する。溝を付
けられた熱可塑性ポリマーがもともと形成された基板が200ミクロン厚未満の
Mylar(ポリエステル)フィルムのように比較的薄い場合、この後者のアプ
ローチは、より容易に実現可能である。
可能なポリマーにおける所望の溝の量による所望の熱可塑性接着性ポリマーの厚
さよりも大きいように、「非粘着性」ポリマーテープを製造するためである。こ
れは、高温で基板上にキャスティングすることによるEVAの製造によって達成
され得、その結果、EVAおよび「非粘着性」境界の差動的な膨張が、EVAに
、冷却の際に所望の溝を導く平坦な表面を、高温で形成する。
2を有する。基板20は、4mmの厚さである中心チャネル24を形成する両方
の縁上の200ミクロンの厚さのストリップのポリアミド(3mm幅)からなる
リッジ22を有する200ミクロンの厚さのポリエステル(1cm幅)からなる
。中心チャネル24は、「U」形状の領域(図3Aを参考のこと)を規定し、そ
こへ熱ELVAX 410(IR吸収色素を有する)の微細で連続的なビードB
(ロッド)が押出される(図3Bおよび3Cを参照のこと)。次いで、これは、
滑らかなドラムによる熱ロール26によって、熱ローリングされ、平坦な表面を
形成する(図2Bを参照のこと)。加熱されながら、活性化可能な表面18は、
リッジ22と同一平面である(図2Bを参照のこと)。冷却時に、活性化可能ポ
リマーは収縮して凝固する(図2Cを参照のこと)。これは、ポリエステル上の
ELVAX 410の4mm幅中心切片を有する1cm幅のテープに導き、ポリ
エステルに結合されたポリアミドの境界ストリップから20ミクロンまで溝を付
けられている。
めの単純なスキームを提案する。
し、次いでEVAで中心領域を満たすことであることに注目のこと。
ングのための、以前に記載された設計を使用し、その結果、移動が、よく規定さ
れた位置(例えば、位置28a〜28E)で周期的に配置され得る。本来は、こ
の概念は、小さな移動領域を抽出物に打ち抜き、そして分子分析容器が移動領域
の光学的位置を分離することなく、実施され得るように、開発された。
カー30に対して一定の増分で、LCM移動の各セットの間で並進され得る(図
4を参照のこと)。図4に示すように、移動のセットは、個々の標的の複数の移
動を示し、これらの標的は均一であり、そして分子分析のために1つのサンプル
にプールされる。各セットの移動内での個々のLCM移動間のより小さな分離が
、小さな領域(上記実施例においては、これは0.5mm以内であり得るが、一
方で異なるセットは、中心が2mm間隔を空け得る)内での各セットについての
クラスターを作製することは、可能である。
Cは、間隔をあけた微小チャンバHを含むことが見られる。分子の抽出および分
析のために使用される微小チャンバHは、ウェル(個々の移動クラスターよりわ
ずかに大きな直径を有するか、または上記実施例においてはd>0.5mm)の
直線状アレイとして、マイクロ移動セット間でのテープの並進と正確に同じ周期
的繰り返し(上記実施例においては2mm)を有して、形成され得る。このスキ
ームは、多数のセットの移動が連続したテープ上に蓄積され、次いで分子の抽出
および分析のための微小チャンバの直線状アレイ上に、連続的に並進されて(熱
)シールされることを、可能にする。このことは、現行のLCMプロセスの効率
を大いに増加させ、そして分子分析システムの容量を、その分析がより迅速に、
より低い試薬費用で、そしてより大きな正確さで実施され得るような小容量まで
減少させる手段を提供する。さらに、この設計またはその類似物は、特に従来技
術の微小容量のマイクロフルイディックスプロセッシングを組み込む場合に、分
子の分析およびトラッキングの自動化のために、既存のLCM移動キャップに勝
る有意な利点を与える。
20は、層を完全に横切って置かれる活性化可能ポリマー表面18を有する。活
性化可能ポリマー表面18の頂部には、中心周期的開口32を有するコーティン
グ表面31が配置される。このコーティングおよび開口は、試験片Mからの活性
化可能ポリマー表面18の所望の凹部を形成する。
34をコーティングする場合に、活性化可能ポリマー表面18のスペーシングを
含む。活性化可能ポリマー表面18の、試験片Mからの所望のスペーシングを実
施する目的で、リム16が配置される。これは、円柱状ロッドRの遠位端の位置
である。円柱状ロッドRの一端が試験片に対して保持されるので、所望されるこ
とは、リム16が試験片Mに接触することのみであることを、読者は理解する。
円柱状ロッドRが、円錐状端部34を試験片Mに対して平行に配置するよう整列
される角度を与えると仮定すれば、この試験片からの所望の空間的分離が生じる
。レーザーキャプチャ微小解剖のための表面のこの実施形態に関するさらなる情
報のために、読者の注意は、本明細書の名指しされた発明者の1人であるSet
h R.Goldsteinらによる、CONVEX GEOMETRY AD
HESIVE FILM SYSTEM FOR LASER CAPTURE
MICRODISSECTIONの表題の、米国特許出願第08/883,8
21号に促される。
体のための、ホルダHを図示する。各場合において、基板Sは、ホルダ中のキャ
ビティを通して適用される真空によって、ホルダHに保持される。各場合におい
て、このキャビティの深さは、下にある試験片Mから間隔をあけてコーティング
Eを維持するような程度にされる。
に延びるに十分な幅を有し、そしてこの基板の中心に活性化可能コーティングE
(これは、通常はテープの形態である)を有する。キャビティ40の深さ、基板
SおよびコーティングEは、真空Vが適用される場合に、活性化可能コーティン
グEがスライドG上の試験片Mから間隔を空けるようにされる。
Mに粘着していない非常に薄いコーティングCが、基板Sおよび活性化可能コー
ティングEを試験片Mから間隔をあける点で、図7Bと異なり、この場合の活性
化可能コーティングEは、基板Sの全幅に延びる。
リップを受容し、そして保持するように、設計される。図7A〜7Cの場合と同
様に、試験片Mからの間隔は、スライドまたは試験片のいずれかとの接触により
、確立される。
活性化可能コーティングEでコーティングされている。テープ45は、真空Vに
よってホルダHに保持され、ここでキャビティ48の深さ、基板S、活性化可能
コーティングEの全てが、5〜20ミクロンの分離を保持するよう設計されてい
る。
とは異なる。アクチュエータAは、代表的に、精密なスペーシングデバイスであ
る。これらは、スライドG上の試験片Mからの活性化可能コーティングEの精密
なスペーシング、ならびに接着サンプルの活性化可能コーティングEへの分離の
補助の両方を、可能にする。
ルダHの空間的分離を実施する。他の全ての局面において、この実施形態は、図
8Bに類似する。
ち状になっている場合を図示する。これらの図の各々が、いわゆるEPI経路(
視野およびレーザーによる活性化の両方が、試験片Mの下から来、そしてこの試
験片の下から、活性化可能なコーティングを局所的に見、そして活性化する)と
共に使用されることを、読者は理解する。
を支持する。テープ56は、リール52、54の間に逐次的に供給される。試験
片Mを有するスライドGは、下に顕微鏡対物レンズOを有する。調節は、スライ
ド50をスライドGおよび試験片Mの方におよびそれらから離れるように移動さ
せることにより、達成される。
上にあることを除いて、図10Aに類似する。簡単な梁64は、旋回接続60お
よび調節可能接続62を有する。調節可能接続62を調節することによって、テ
ープ56の方へおよびそれから離れてのスペーシングが、スライドG上の試験片
Mから生じる。
表面上に配置される活性化可能コーティングと共に使用される。
面70を有する。円柱状ロッドRは、ソケット72を設置し、このソケットが次
に、シャフト74およびステッパモータ76に同心的に固定される。
てここで、上端84および下端86において始動される。具体的には、活性化可
能コーティングEの試験片MおよびスライドGからの空間的関係の荒い調節が、
リードスクリューアクチュエータ90、および上端84におけるロッカーアーム
80への板バネ接続によって、生じる。精密な調節は、アクチュエータ表面98
におけるロッカーアーム80の下端86上のアクチュエータ96の、差動マイク
ロメータ94によって生じる。観察され得るように、ロッカーアームは、代表的
に、顕微鏡ステージ100に設置される。
との間に可能である1ミクロンの許容を有して、高度に所望されることを示した
。
る方法を図示する。図11を参照すると、マーカーMが、活性化可能コーティン
グEの表面上のEPI対物レンズOを通して焦点を合わせられる。このようなマ
ーカーは、プラス約1ミクロンまたはマイナス約1ミクロンを作製し得る。
らのアクチュエータAが次に、間に試験片Mを有してスライドGに支持されるこ
とが見られる。多くの基板Sが活性化可能コーティングE(例えば、EVA)で
コーティングされる場合には、このEVAはこのような切断の線に沿ったバリ(
burrs)蓄積に蓄積される傾向があることが、見出された。図12に示す凸
状の断面形状は、このようなバリを小さな間隙から処分する。
れる。第一に、活性化可能コーティングは、常に、間隙によって試験片から空間
的に離れて維持する。第二に、活性化されると、活性化可能コーティングは、こ
の間隙を架橋し、そして標的領域において試験片Mと少なくとも接触する。
基板」と共に使用される場合には、基板の凸状表面および活性化可能ポリマーの
層が、このテープを凸状加圧プレートに適合させることによって達成され得るこ
とが、理解される。
係数を有する。非接触キャプチャは、焦点膨張が、周囲の層の膨張よりずっと大
きいことを要求する。本発明者らは、パルスの間および終了後に、集中的にポリ
マーを加熱するが、その熱は放射状に流れ続け、これによって周囲の材料がその
熱に比例して膨張し、直線的な熱膨張を呈した。実際に、活性化されたポリマー
に関連する相変化におけるより大きな容量変化(すなわち、溶融または溶融およ
び蒸発/含まれる気泡の膨張)は、簡単な直線的な熱膨張と比較して非接触LC
Mを大いに容易にし、そしてより大きな膨張が高度に局在化されることを可能に
する。
され得るが、熱はパルスの終了後の放射状に流れ、従って局所的な活性化領域に
完全には適合しないことに注目のこと。しかし、本発明者らは、ポリマーを溶融
させるために十分な加熱が起こる容量を、制限し得る。非接触LCMの本発明者
らの用法において、この相変化(またはその内部に作製されるより小さな蒸気泡
)は、周囲の固体の「非活性化」ポリマーおよびその「不活性な」基板のより小
さな直線的な膨張係数と比較して、大きな容量膨張に関連する。周囲の「溶融し
ていない」構造は「剛性」であるので、膨張した溶融容量は、強制的に「間隙」
を横切って流され、試験片中の所望の標的に接触し、そしてキャプチャする。
とは、必要ではない。例えば、活性化可能コーティングは、試験片Mに対して常
に粘着する表面を備え得る。さらに、このようなコーティングは、試験片に対す
る選択的なアタッチメントを有し得る。例えば、このコーティングは、活性化領
域において、特定のタンパク質に優先的に付着し得る。
コーティング、および活性化可能コーティングを活性化するためのレーザーを図
示するレーザー捕捉顕微解剖の斜視図である。
グのそれぞれの図である。 図1Aは、サンプルの上の最初の活性化を示す。
グのそれぞれの図である。 図1Bは、完全な活性化および活性化された下部分とサンプルの材料との接触
を示す。
グのそれぞれの図である。 図1Cは、応力下で収縮するポリマーを示す。
グのそれぞれの図である。 図1Dは、現在冷却された活性化可能材料に付着された組織サンプルの標的部
分を示す。
グのそれぞれの図である。 図1Eは、濃縮を可能するためにサンプルに対する活性化可能コーティングの
相対的運動を示す。
グのそれぞれの図である。 図1Fは、標的試験片を収集するための台座の押出しを示す。
試験片を有する台座(ここで、図1Fの試験片および台座に類似して示される)
を示す。
、台座が実質的にオリジナルのテープの寸法に戻ることが可能となり、顕微解剖
された試験片をさらにテープに向かって引っ込めて試験片の損失を避け、他の類
似の試験片の近接収集を可能にする。
離れた位置に配置された非粘着性境界を示す。
を示す。
さな分離が今やコーティングの底部からオプティカルフラットに存在することに
注意のこと。
接触が非粘着性境界においてのみ生じ、試験片から凹状にされた活性化可能コー
ティングを示す。
性化を示す図2Eの基板および試験片を示し、より詳細には、試験片の選択され
た領域と接触するためにカラムを形成するための活性化可能コーティングの膨潤
を示す。
部分が付着されて、カラムが縮み、収縮される。
の組織を有する異なる試験片に配置された基板を示す。
かの側面で積層された非粘着性境界を有するテープ状基板を示す。
グが引き続いて、形成される材料のビードを示す。
である。
熱ローリングを示す。
微小チャンバの一連のカプセル化を含むシーリングアレイの側面に沿った、図3
A〜3Dで生成されるテープに類似したテープを示す。
有するテープの3次元的図である。
めの遠位リムを有するロッド状部材を示し、ここで、試験片の部分の収集が起こ
る。
表面ホルダーの実施形態である。 図7Aは、組織サンプルに対して参照表面上に静置し、活性化可能表面を組織
サンプルから間隔を空けて離れた距離に保持するための真空作動ホルダーを示す
。
表面ホルダーの実施形態である。 図7Bは、ホルダーの内側表面が丸くされた、図7に類似の真空ホルダーを示
す。
表面ホルダーの実施形態である。 図7Cは、スライド表面と接触した非接着コーティングを除いて、活性化表面
がホルダー内の材料全てを占める、図7Bに類似の真空ホルダーを示す。
照表面と接触する実施形態の図である。 図8Aは、活性化可能表面が、ホルダー内に制限され、ホルダーからの組織サ
ンプルからのその分離を確立して示す。
照表面と接触する実施形態の図である。 図8Bは、組織サンプルからの選択された材料の分離を行うためのアクチュエ
ーターを有するホルダーを示す。
ベアリングによってスライドに対して吊るされた、図8Bに類似の実施形態を示
す。
ずれとも接触しない実施形態である。 図10Aは、テープホルダーが、テープホルダーに関して片持ち梁のようにさ
れる場合を示す。
ずれとも接触しない実施形態である。 図10Bは、テープが組織サンプルに関して単純な梁上で旋回し、サンプルの
観測が、サンプル中へのスライドを通るいわゆるEPI経路に沿って生じる場合
を示す。
ずれとも接触しない実施形態である。 図10Cは、本発明を使用する凸状表面装置の側部立面である。
の間の距離の測定を行う。
す要件なしに、組織サンプルとテープの間の必要とされる間隔を確立するための
アクチュエーターおよびエアベアリングを示す。
Claims (46)
- 【請求項1】 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであっ
て、該プロセスは、以下: 選択的活性化可能な層を提供する工程であって、活性化の際に、該選択的活性
化可能な層が、該選択的活性化可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた
、第1間隔を超える容量膨張の末端を有する該容量膨張を引き起こす、工程; 該第1間隔より小さな、限られた分離において、該試験片の上にある該選択的
活性化可能な層を配置する、工程;および 該容量膨張の末端において、該試験片の部分を局所的に接触するために、少な
くとも該第1間隔まで容量膨張を引き起こすために、該選択的活性化可能な層を
選択的に活性化する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項2】 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 支持基板を提供する工程;および 前記選択的活性化可能な層を、該支持基板に接着する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項3】 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 該試験片を可視化する工程;および 該試験片の可視化された部分内の所望される標的の上にある、前記選択的活性
化可能な層を選択的に活性化する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項4】 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、ここで、前記選択的に活性化する工程が、以下: 該試験片の標的された部分と、機械的な結合を形成する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項5】 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記試験片に曝される前記選択的活性化可能な層上に、調製された表面を配置
する工程であって、該調製された表面が、該試験片の少なくとも1つの化合物と
親和性特異的結合を有する、工程;および 該選択的活性化可能な層を選択的に活性化する工程であって、該調製された表
面を該試験片へ接触させ、そして活性化可能な層上の、該調製された表面によっ
て定義される特異的表面親和性を有する、該標的された試験片の成分と親和性特
異的結合を形成する、工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項6】 請求項1に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 該試験片内の異なる標的要素の対応する接触およびキャプチャを引き起こすた
めに、前記選択的活性化可能な層の異なる部分の選択的活性化を繰り返す工程、
を包含する、プロセス。 - 【請求項7】 請求項6に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記試験片に関して、前記選択的活性化可能な層を移動する工程であって、前
記一連のキャプチャされた要素を、該試験片内のそのスペーシングと比較して、
前記活性化された層上に集中する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項8】 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであっ
て、該プロセスは、以下: レーザーで活性化された選択的活性化可能な層を提供する工程であって、該選
択的活性化可能な層は、レーザー活性化の際に熱により発生する容量膨張を引き
起こし、そして冷却の際に弾性的に収縮し、該容量膨張の末端が、該選択的活性
可能な層の表面に対して実質的に垂直にとられた第1間隔を超える、工程; 該第1間隔より小さな分離において、該試験片の上に該選択的活性化可能な層
を配置する、工程;および、 加熱するためにレーザーエネルギーを用いて該選択的活性化可能な層を選択的
に活性化する工程であって、該活性化が、該容量膨張の該末端において、該試験
片の部分と局所的に接触および結合するために、少なくとも該第1間隔まで容量
膨張を引き起こす、工程; レーザー活性化を取り除く工程;および 容量膨張を冷却する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項9】 請求項8に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖
のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記容量膨張を冷却する工程であって、該工程が、該容量膨張の収縮を引き起
こし、該試験片の残部から該試験片の標的された部分を分離させ、それによって
該試験片の残部から該試験片の部分を顕微解剖する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項10】 請求項8に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微
解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記容量膨張を冷却する工程が、該試験片の部分への付着を維持し、一方で、
前記活性化可能な層の該容量膨張を弾性的に伸張する工程;および、 該活性化可能な層を、該試験片から取り除く工程であって、該工程が、該試験
片の前記残部から前記標的された試験片の該部分を分離し、それによって該試験
片の該部分を該試験片の残部から顕微解剖する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項11】 請求項10に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微
解剖のプロセスであって、ここで、前記活性化可能な層を取り除く工程が、以下
: 前記容量膨張を弾性的に収縮する工程であって、該工程が、前記第1間隔内の
該容量膨張に結合した該試験片の前記部分を取り除き、それによって、該第1間
隔による該活性化可能な層の該試験片からの分離が維持される場合、該容量膨張
に結合した該試験片の該部分が、該試験片の、下にあり、かつ残った部分と接触
し得ない工程 を包含する、プロセス。 - 【請求項12】 請求項8に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解
剖のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記活性化可能な層が、相転移と関連して大きな容量変化を伴う、強く長い鎖
の熱可塑性ポリマーを含む工程 を包含する、プロセス。 - 【請求項13】 請求項8に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微解
剖のプロセスであって、該プロセスは、以下: 前記活性化可能な層が支持基板に付着する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項14】 試験片からのレーザーキャプチャ顕微解剖のプロセスであ
って、該プロセスは、以下: 選択的活性化可能な層を提供する工程であって、該選択的活性化可能な層が、
レーザーによって活性化される際に、加熱と同時に容量膨張を引き起こす、工程
; 該試験片の上にある該選択的活性化可能な層を、第1間隔より小さく分離して
配置する工程; 該選択的活性化可能な層に対して垂直な膨張成分を有して、該選択的活性化可
能な層を加熱し、そして膨張させる工程であって、該工程が、該選択的活性化可
能な層の第1内部容量を局所的に加熱および拡大することによって、容量膨張を
最初に引き起こす、工程;および、 該選択的活性化可能な層の平面における膨張の成分を伴い、該選択的活性化可
能な層の周囲の第2容量を加熱および第1容量へと膨張する工程であって、これ
によって、該容量膨張の末端において該試験片の部分を局所的に接触するための
、全体膨張に関して、該第2容量の該第1容量までの膨張および該第1容量の少
なくとも前記第1間隔までの押出しを伴って、全体の容量膨張が生じる、工程、
を包含する、プロセス。 - 【請求項15】 請求項14に記載の試験片からのレーザーキャプチャ顕微
解剖のプロセスであって、該プロセスは、以下: 蒸気泡の生成または膨張を含む、前記第1内部容量を加熱および膨張する工程
、 を包含する、プロセス。 - 【請求項16】 可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 該可視化試験片を支持および観察するための、支持体; 支持基板; 該支持基板上に維持された選択的活性化可能な層であって、活性化の際に、該
選択的活性化可能な層は、該容量膨張の末端が該選択的活性化可能な層の表面に
対して実質的に垂直にとられた第1間隔を超える容量膨張を引き起こす、層; 該可視化試験片に接触するための、該選択的活性化可能な層上の少なくとも1
つの第1表面; 該第1間隔より小さな限られた分離において該試験片の上に該選択的活性化可
能な層を維持するための、該支持基板と該支持体とを相互連結する装置であって
、それによって、該選択的活性化可能な層が活性化した場合に、該選択的活性化
可能な層が、該試験片と接触する、装置 該選択的活性化可能な基板を選択的に活性化するための装置であって、局所的
に容量膨張を引き起こす、装置 を備える、非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する装置。 - 【請求項17】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記支持基板と前記支持体とを相互連結する前記装置であって、該装置が、該
試験片との直接的な接触に非依存である、装置 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項18】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記支持基板上に維持される前記選択的活性化可能な層であって、該層がレー
ザーによって活性化される、層 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項19】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記選択的活性化可能な層がレーザーによって活性化された場合に、該可視化
試験片と接触するための、該選択的活性化可能な層上の少なくとも1つの第1表
面 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項20】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: テープである前記支持基板および前記選択的活性化可能な層 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項21】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: テープである前記支持基板および、該テープ上のコーティングである前記選択
的活性化可能な層 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項22】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 5〜20ミクロンの範囲の、前記第1間隔 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項23】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持
するためのエアベアリングを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する装置
を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項24】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 凸状部材である、前記支持基板、 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項25】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 円錐状部材である、前記支持基板; 前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持
するための円錐状部材上のリムを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する
装置; 該試験片から離れた円錐状部材のための支持体; 該円錐状部材の周囲のコーティングを構成する、前記選択的活性化可能な表面
、 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項26】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: テープである前記支持基板; 前記第1表面を、該可視化試験片のすべての部分から、空間的に分離して保持
するための該テープ上の前記活性化した活性可能な表面を囲む、前記所望の厚み
の不活性コーティングを含む、前記支持基板と支持体とを相互連結する装置;お
よび 該不活性コーティング間の凹状の該テープ上のコーティングを構成する、該選
択的活性化可能な表面、 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項27】 請求項26に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記テープ上の前記不活性コーティングであって、該コーティングが、前記選
択的活性化可能な表面の周囲の円の反対側にある、コーティング、 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項28】 請求項16に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
装置であって、該装置は、以下: 前記支持基板上の前記選択的活性化可能な表面であって、該表面は除去可能な
コーティングによって覆われ、該除去可能なコーティングは、該選択的活性化可
能な表面と該試験片の間の所望の空間的分離を規定するための厚さを有し、これ
によって、該除去可能なコーティングが除去されたときに、該選択的活性化可能
なコーティングが、該試験片からの所望の空間的分離を有する、表面、 を備える、非接触顕微解剖する装置。 - 【請求項29】 可視化試験片から非接触顕微解剖するために調製された表
面を製造するための方法であって、該方法は、以下: 支持基板を提供する工程; 選択的活性化可能な表面を該支持基板に配置する工程であって、該選択的活性
化可能な表面が、該可視化試験片と接触するために、活性化のときに膨張して、
間隔を超えて該可視化試験片と接触する、工程; 該支持基板上に、可視化試験片を接触させるための少なくとも第1部分を提供
する工程; 該支持基板上に少なくとも第2部分を提供する工程であって、該第2部分は、
該可視化試験片に関して近位の間隔に該選択的活性化可能な表面を維持するため
に、該支持基板上の該第1部分から除去され、かつ該第1部分に関連して支持さ
れる、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項30】 請求項29に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
ために調製された表面を製造するための方法であって、前記提供された支持基板
が円錐状部材であり、該方法は、以下: 前記選択的活性化可能な表面の該円錐状部材状への配置を含む、該選択的活性
化可能な表面を該支持基板に配置する工程; リムの円錐状部材上への配置を含む、該支持基板上に少なくとも第2部分を提
供する工程であって、該第2部分は、該可視化試験片に関して近位の間隔に該選
択的活性化可能な表面を維持するために、該支持基板上の該第1部分から除去さ
れ、かつ該第1部分に関連して支持される、工程、 をさらに包含する、方法。 - 【請求項31】 請求項29に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
ために調製された表面を製造するための方法であって、前記提供された支持基板
がテープであり、該方法は、以下: 該支持基板上に前記第1部分を配置する該工程が、該テープ上の第1棟であっ
て、そして空間をあけた第2棟が、該テープ上の該第1棟から離れている、工程
;および 該テープ上の該第1棟および該第2棟の間の凹状の該テープ上のコーティング
を構築する、該選択的活性化可能な表面の前記配置工程、 をさらに包含する、方法。 - 【請求項32】 請求項31に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
ために調製された表面を製造するための方法であって、該方法は、以下: 前記テープ上の前記第1および第2棟を配置する工程であって、該工程は、前
記選択的活性化可能な表面の周囲の円の反対側に該棟の配置を含む、工程、 をさらに包含する、方法。 - 【請求項33】 請求項29に記載の可視化試験片から非接触顕微解剖する
ために調製された表面を製造するための方法であって、該方法は、以下: 少なくとも前記選択的活性化可能な表面にわたって除去可能なコーティングを
配置する工程であって、該除去可能なコーティングは、該選択的活性化可能な表
面と該可視化試験片との間の所望の空間的分離を規定するための厚さを有し、そ
れによって、該除去可能なコーティングが除去されたときに、該選択的活性化可
能なコーティングが、該可視化試験片からの所望の空間的分離を有する、工程 をさらに包含する、方法。 - 【請求項34】 可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する
方法であって、該方法は、以下: 該可視化試験片の支持および観察のための支持体を提供する工程; 支持基板を提供する工程; 該支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する工程であって、該工程は、活
性化のときに、容量膨張の末端が、該選択的活性化可能な層の表面に対して実質
的に垂直にとられた第1間隔を超える容量膨張を引き起こす、工程; 少なくとも第1表面を、該選択的活性化可能な層上に配置するか、または該可
視化試験片に接触するように配置する、工程; 該第1表面を、該可視化試験片に関して近位にあり、該可視化試験片から該第
1間隔だけ空間的に離れており、該可視化試験片の全ての部分から空間的に離れ
て維持するために、該支持基板と該支持体を相互連結する工程;および 該第1表面を該可視化試験片と接触させるために、該選択的活性化可能な層を
局所的に活性化する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項35】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 前記支持基板上の前記選択的活性化可能な層が、活性化に関連して大きな容量
膨張を有する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項36】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 前記組織サンプルの空隙へのポリマーの熱可塑的注入を含む、前記第1表面を
該可視化試験片に接触させるために、前記選択的活性化可能な層を活性化させる
工程、 を包含する、方法。 - 【請求項37】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: サンプルの特定の細胞と連結するための特異的テザーを有する前記第1表面に
提供することを包含する、該可視化試験片との接触のために、少なくとも該第1
表面を前記選択的活性化可能な層上に配置する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項38】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 該可視化試験片と接触するために、少なくとも第1表面を、前記選択的活性化
可能な表面上に配置する工程であって、該可視化試験片上の標的細胞に対して、
高い親和性特異的結合を有する単層が、該表面上をコーティングする、工程 を包含する、方法。 - 【請求項39】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 線形熱膨張係数を有する物質を配置することを包含する、前記支持基板上に選
択的活性化可能な層を配置する、工程 を包含する、方法。 - 【請求項40】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 該可視化試験片を除く全ての側面上の内部の制限された区域に、局所的膨張を
制限する物質を含む該支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項41】 請求項34に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 前記選択的活性化可能な層内に少なくとも1つの気泡を同封することを包含す
る、前記支持基板上に該選択的活性化可能な層を配置する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項42】 請求項34に記載の試験片からレーザーキャプチャ顕微解
剖する方法であって、該方法は、以下: 所望の標的への特異的表面親和性ならびに前記選択的活性化可能な層への特異
的表面親和性を有する要素を含む溶液を用いて、前記サンプルの表面を前処理す
る工程、 を包含する、方法。 - 【請求項43】 請求項42に記載の試験片からレーザーキャプチャ顕微解
剖する方法であって、該方法は、以下: キャプチャされることが所望される前記サンプル要素の表面上の、特異的標的
分子を認識する特異的親和性テザーに接続したポリマー微粒子(例えば、ポリス
チレンラテックス粒子)を用いる標識化を包含する、前記前処理、 を包含する、方法。 - 【請求項44】 可視化試験片から非接触レーザーキャプチャ顕微解剖する
方法であって、該方法は、以下: 該可視化試験片を支持し、観察するための支持体を提供する工程; 支持基板を提供する工程; 該支持基板上に選択的活性化可能な層を配置する工程であって、該工程は、活
性化のときに、容量膨張の末端が、該選択的活性化可能な層の表面に対して実質
的に垂直にとられた第1間隔を超える容量膨張を引き起こす、工程; 該第1表面を、該可視化試験片に関して近位にあり、該可視化試験片から該第
1間隔だけ空間的に離れており、該可視化試験片の全ての部分から空間的に離れ
て維持するために、該支持基板と該支持体を相互連結する工程; 該第1表面を、材料の台座において該可視化試験片と接触させ、該試験片の前
記選択部分と接着するために、該選択的活性化可能な層を局所的に活性化する工
程; 該試験片の選択部分を顕微解剖するために、該選択的活性化可能な層を分離す
る工程;および 該分離工程の後で、該選択的活性化可能な層を局所的に活性化する工程であっ
て、該工程が、該活性化可能な層から突出している任意の台座を引っ込めること
を引き起こす、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項45】 請求項44に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 前記分離工程の後で、前記選択的活性化可能な層を局所的に活性化するために
、照射のより広いビームを利用する工程であって、該工程が、該活性化可能な層
から突出している任意の台座を引っ込めることを引き起こす、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項46】 請求項44に記載の可視化試験片から非接触レーザーキャ
プチャ顕微解剖する方法であって、該方法は、以下: 前記分離工程の後で、前記選択的活性化可能な層を局所的に活性化するために
、照射のより低出力のビームを利用する工程であって、該工程が、該活性化可能
な層から突出している任意の台座を引っ込めることを引き起こす、工程、 を包含する、方法。
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