KR20040105709A

KR20040105709A - 신규한 펩티드 유도체, 이의 제제와 치료 및 미용학적 응용

Info

Publication number: KR20040105709A
Application number: KR10-2004-7011955A
Authority: KR
Inventors: 안느-마리 삐넬
Original assignee: 엥스띠뛰 웨로뺑 드 비올로지 셀리레르
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2004-12-16
Also published as: WO2003064458A8; WO2003064458A3; US7268108B2; AU2003222347A1; US20050187164A1; FR2835528A1; WO2003064458A2; EP1470157A2; JP4237067B2; JP2005531496A; CA2474719A1; FR2835528B1

Abstract

본 발명은 식 (1) R-V¹-Ala²-His³-X⁴-Y⁵-Trp⁶-NH₂의 펩티드에 관한 것인데, 상기 식에서, R은 벤조일기, 토실기, 벤젠 설포닐기, 벤질옥시카르보닐기, 피리딘프로피오닐기 중에서 선택될 수 있는 보호기 또는 수소원자를 나타낸다;

V는 천연 아미노산을 나타내거나 또는 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline) 및 2-N-Me-노르류신(Me-norleucine)으로부터 선택된다;

X는 천연 아미노산을 나타내거나 L 또는 D 형의 페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 페닐글리신, 벤조티에닐알라닌, 4,4'-비페닐알라닌, 3,3-디페닐알라닌, 호모페닐알라닌, 인다닐글리신, 4-메틸페닐알라닌, 티에닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, 할로게노페닐알라닌 로부터 선택되는 방향족 특성을 가진다;

Y는 아르기닌, 리신 또는 오르니틴, 거울상 이성질체 또는 부분이성질체 및 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물 중으로부터 선택된 염기성 특성을 가진 L형의 천연 아미노산을 나타낸다.

본 발명은 이들의 제조방법 및 약리학 또는 미용학 분야에서의 이들의 응용에 관한 것이다.

Description

신규한 펩티드 유도체, 이의 제제와 치료 및 미용학적 응용{NOVEL PEPTIDE DERIVATIVES, PREPARATION AND THERAPEUTIC AND COSMETIC APPLICATION THEREOF}

알파-MSH는 인체에 의해 천연적으로 생산되고, 다수의 생리학적 활성: 해열성, 항 염증성 안료착색 활성을 갖는 것이 알려진 물질이다.

매개체로서, 알파-MSH는 특이적 수용체를 갖고, 이들 중 5개가 설명되고 있고, 각각은 7개의 막 관통 도메인(transmembrane domain)을 가진다. 피부에 있어서, 상기 활성은 "멜라노코르틴-1(melanocortin-1)" 수용체(MC-lr)을 포함한다. 이 수준에서, 알파-MSH의 결합은 G 단백질(Gγs형의 알파-서브유닛을 나타내는)의 활성화를 유발하고, 이는 그 자체로 아데닐릴 사이클라아제(adenylyl cyclase)를 자극하여 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(즉, cAMP)를 생산한다.

cAMP의 생산은 타입A 단백질 키나아제의 활성화를 유도하고, 이는 인산화반응에 의해 세포 유전자의 DNA의 cAMP 반응 인자와 결합할 수 있는 단백질(즉, CREB)을 활성화한다. 이에 의해, 타깃 세포에 대해 이들의 효과를 발휘하는 매개체가 발현된다.

포유 동물에 있어서, 피부 및 모발의 착색은 공통적인 카테고리 색소인 멜라닌에 기인한다. 이들 멜라닌은 멜라닌세포에 의해 피부 중에 생산되는데, 이들 세포는 표피의 기저막의 수준 및 모낭 중에 위치한다. 멜라닌 합성은 효소: 티로시나아제(tyrosinase)의 활성에 의해 제어된다. 알파-MSH가 이의 수용체 MC-1와 결합에 의해 자극되면 상기 효소(및 관련 효소: TRP-1 & TRP-2)가 생산된다.

티로시나아제에 의한 멜라닌의 생산은 세포 소기관: 멜라닌전소체(premelanosome)에서 발생한다. 일단 이들이 멜라닌으로 충전되면, 이들 소기관은 멜라닌소체(melanosome)로 불리고, 멜라닌세포의 가지돌기(dendrite)을 통하여 인접 세포: 각질세포(keratinocyte)로 이송된다. 따라서 멜라닌은 표피 내에 분포함으로써, 햇볕에 그을림(tanning)을 제공하여 이를 보호한다.

이의 자유 라디칼 포착(scavenging) 특성 및 태양 방사선-흡수 특성으로 알려진 천연 색소인 멜라닌은 피부의 보호제이다. 인간에게서 이러한 색소의 생성을 자극할 수 있는 어떤 이용가능한 화합물도 피부미용학에서는 존재하지 않는다.

또한, 알파-MSH의 항 염증성 효과의 메커니즘은 완전히 명백하게 밝혀지지 않았지만, 다수의 실험 사실이 수집되어 그 결과, 알파-MSH가 MC-1 수용체에 결합함으로써, NOSi(또는 NOS₂) 및 NFKB의 유도를 억제하고, mRNA의 발현을 유도함으로써 항 염증성 사이토카인 IL-10의 생산을 유도한다는 사실에 이르렀다. 이 사이토카인은 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α 또는 γINF 등의 염증성 사이토킨의 방출을 방해한다.

표피의 세포 집단의 95%를 구성하는 각질세포는 IL-1 저장소인 것으로 추정되고, 이들 세포 표면에는 MC-1 수용체를 갖는다. 따라서, 알파-MSH가 이들 수용체에 결합함으로써 국부 염증성 현상을 조절하게 된다.

알파-MSH는 식: 아세틸-Ser¹-Tyr²-Ser³-Met⁴-Glu⁵-His⁶-Phe⁷-Arg⁸-Trp⁹-Gly¹⁰-Lys¹¹-Pro¹²-Val¹³-NH₂(여기서, Ser=세린, Tyr=티로신, Met=메티오닌, Glu=글루탐산, His=히스티딘, Phe=페닐알라닌, Arg=아르기닌, Trp=트립토판, Gly=글리신, Lys=리신, Pro=프롤린 및 Val=발린)의 트리데카펩티드이다. 다수의 과학적 연구의 결과, 알파-MSH 중에서 활성을 나타내는 서열을 확립하였는데, 통상적으로 헵타펩티드 4-10가 멜라닌친화 효과를 보이며(Haskell-Luevano 등 J. Med. Chem. 1997, 10, 2133-2139), 트리펩티드 11-13가 항 염증성 효과를 나타낸다(Hiltz M. E. and Lipton J. M. 펩티드 1990, II, 979-982)고 설명한다.

또한, 최근의 연구에 의해 다양한 저자가 환상 구조를 개시하는 특허(Hruby 등 US 5,674,839 및 US 6,054,556)를 출원하였다.

본 발명은 알파-MSH(Melanocyte Stimulating Hormone, 멜라닌 세포 자극 호르몬)의 주변 효과를 재생하는 가성펩티드(pseudopeptide) 유도체, 이의 제제 및 치료 및 미용학적 응용에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 멜라닌친화성 및/또는 항 염증성, 항 알레르기 활성을 나타내는 작은 직쇄상 가성 펩티드 화합물을 제공하는 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명의 대상은 식 (I)에 대응하는 신규한 펩티드이다.

R-V¹-Ala²-His³-X⁴-Y⁵-Trp⁶-NH₂(I)

상기 식에서,

R은 수소원자를 나타내거나 또는, 아세틸기, 벤조일기, 토실기, 벤젠설포닐기, 벤질옥시카르보닐기 또는 피리딘프로피오닐기 중에서 선택될 수 있는 보호기를 나타낸다;

V는 노르류신(norleucin), 노르발린(norvaline) 및 2-N-Me-노를류신 중에서 선택되는 천연 또는 비천연 L-형 아미노산을 나타낸다;

X는 페닐알라닌, 1-나프틸닐알라닌, 2-나프틸알라닌, 페닐글리신, 벤조티에닐알라닌, 4,4'-비페닐알라민, 3,3-디페닐알라닌, 호모페닐알라닌, 인다닐글리신, 4-메틸페닐알라닌, 티에닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, 및 할로페닐알라닌 중에서 선택되는 실질적으로 방향족인 천연 또는 비천연 L-형 또는 D-영 아미노산을 나타내고, 상기 할로겐은 페닐기의 메타, 오르토, 파라 위치에서의 염소, 브롬, 요오드 또는 플루오르 원자일 수도 있다;

Y는 아르기닌, 리신 및 오르니틴 중에서 선택되는 본질상 염기성인 천연 L-형 아미노산을 나타낸다.

식 (I)의 펩티드에서 2, 3 및 6 위치에서 각각 아미노산 Ala, His 및 Trp는 L-형이다.

식 (I)의 펩티드는 1개 이상의 비대칭 탄소 원자를 포함할 수도 있다. 이들은 거울상이성질체(enantiomer) 또는 부분입체이성질체(diastereoisomer)의 형태로 존재한다. 이들 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 및 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물은 본 발명의 일부분이다.

이들 신규한 펩티드는 피부 또는 점막에서, 색소형성의 자극 및/또는 국부적 염증 현상의 한정에 대한 활성을 가진다.

구체적으로, 본 발명의 펩티드는, 세포 수준에서 개시되어 천연 매개체를 모방하는 화합물의 직접적인 개입에 의해 약화될 수 있는, 아토피피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 홍반(erythema), 염증성 탈모증(inflamatory alopecia), 습진(eczema), 또는 천식(asthma) 등의 병변의 예방 및/또는 치료에 유효하다.

그러므로, 본 발명의 대상인 펩티드는 피부 보호의 관점에서 특별한 혁신을 구성한다.

따라서, 본 발명은 또한 항 염증성 및/또는 항 알레르기 효과를 갖는 의약품을 생산하기 위한, 식 (I)의 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이고, 또한 멜라닌친화 활성을 갖는 미용학적 용품을 생산하기 위한 식 (I)의 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 대상인 식 (I)의 화합물 중에서, 바람직한 화합물은 하기와 같이 정의될 수 있다:

R은 아세틸기, 벤젠설포닐기, 토실기 또는 피리딘프로피오닐기 중에서 선택될 수 있는 보호기를 나타내고,

V는 노르류신 및 2-N-Me-노르류신 중에서 선택되는 L-형인 천연 또는 비천연아미노산을 나타내고,

X는 페닐알라닌, 2-나프틸알라닌, 호모페닐알라닌, 티에닐알라닌 또는 p-니트로페닐알라닌 중에서 선택되는 본질상 방향족인 D-형 또는 L-형 천연 또는 비천연 아미노산을 나타내고,

Y는 아르기닌 또는 리신 중에서 선택되는 본질상 염기성인 천연 L-형 아미노산을 나타낸다.

식 (I)의 펩티드에서 2, 3 및 6 위치에서 각각 알라닌, 히스티딘 및 트립토판은 L-형 이다.

본 발명에 따라서, 일반식 (I)의 화합물은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 특히 용액 중에서 또는 고체 지지체 상에서 화학적 합성의 방법에 따라 제조될 수 있다. 수지 지지체상의 합성이 특히 적합하다. 사용할 수 있는 수지 중에서, 링크(Rink) 아미드형 수지(또는 4-(2'-4'-디메톡시페닐-fmoc-아미노메틸)페녹시 수지)(H. Rink, Tetrahedron Let., 1987,28, 3787) 및 MBHA 수지(또는 4-메틸벤즈히드릴아민 수지)(G. R. Matsueda 등 Peptides, 1981, 2, 45)를 들 수 있다.

출발 생성물은 보호된 아미노산이다. 보호기는 주된 아민 관능기 상의 아세틸(Ac)기 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, 측쇄의 관능기 상의 tert-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 트리틸(Trt)기 또는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc)기일 수 있다. 세정, 커플링 및 탈보호 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들면, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach: W. C. Chan and P. D. White(Oxford University Press) 또는 Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins -Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio, Ernest Giralt(CRC Press Boca Raton, N.Y.)에서 설명되어 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예 1: 표의 화합물 No.1

(L-형에서 R=Ac, V=Nle, X=DPhe, Y=Arg, Ala², His³및 Trp⁶)

이 펩티드는 링크 아미드형 수지와 고체-지지체 합성에 의해 합성하였고, 이의 기능화는 수지의 0.3 내지 0.6 mmol/g이었다.

우선, 링크 아미드 수지를 DMF(2회 세정)로 세정하여 제조하고, 이어서, 탈보호를 하기 설명된 바와 같이 실시하였다. 거플링되는 각각의 아미노산에 대하여, 아미노산의 커플링, 수지의 세정, 아미노산의 주쇄의 아민 관능기의 탈보호, 및 재차의 수지의 세정으로 이루어지는 단계를 반복하였다.

커플링: DMF 중에서 2시간 동안 BOP(또는 HBTU) 2 당량, DIEA(또는 NMM) 2 당량 및 Fmoc-AA-OH 2 당량.

세정: DMF로 2회 세정, 메탄올로 1회 세정, 디클로로메탄으로 2회 세정 및 DMF로 1회 세정.

탈보호: 일단 3분간, 다음에 7분간 에탄디올(자유 라디칼 포착제) 2%에서 80/20 DMF/피페리딘 혼합물.

세정:(상기 항목).

다양한 아미노산을 커플링한 후, 1.5시간 동안 에탄디올 2%과 함께 50/50 TFA/디클로로메탄 혼합물을 사용하여 수지로부터 펩티드를 잘라내었다.

디클로로메탄과 TFA를 질소 증기하에서 증발시킨 후, 디에틸에테르로 침지, C18 역상 칼럼을 이용한 분취 액체 크로마토그래피로 정제를 실시하였다.

Ac-Nle-Ala-His-DPhe-Arg-Trp-NH₂의 합성을 다음의 보호된 아미노산 (Fmoc-AA-OH)으로 실시한다:

Fmoc-Trp(Boc)-OH

Fmoc-Arg(Pmc)-OH

Fmoc-DPhe-OH

Fmoc-His(Trt)-OH

Fmoc-Ala-OH

Ac-Nle-OH

약어:

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

TFA: 트리플루오로아세트산

DMF: 디메틸 포름아미드

BOP: 1-벤조트리아졸릴옥시트리스(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트

HBTU: 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라-메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

DIEA: 디이소프로필에틸아민

NMM: N-메틸모르폴린

원하는 펩티드를 수득한 후, 이에 대한 분석 결과를 하기 표에 나타내었다.

실시예 2: 표의 화합물 No.2

(L-형에서의 R=Ac, V=Nle, X=DPhe, Y=Lys, Ala², His³및 Trp⁶)

합성은 실시예 1에 설명과 것과 동일한 절차에 따라 실행하였다. 합성에 사용된 아미노산은 하기와 같다:

Fmoc-Trp(Boc)-OH

Fmoc-Lys(Boc)-OH

Fmoc-DPhe-OH

Fmoc-His(Trt)-OH

Fmoc-Ala-OH

Ac-Nle-OH

이 펩티드의 분석 특성을 하기의 표에 나타낸다.

하기의 표는 화학적 구조를 나타내고, 본 발명의 일부 화합물의 분석 결과 및 또한 g/mol로 표시되는 이들 분자량(MM)을 반복한다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분석 및 질량 분석법(MS)에 의한 분석을 각각의 본 발명의 화합물에 대해 실시하였다.

HPLC:

정지상: C18 역상형 칼럼, 이의 치수는 4.6 x 50㎜, 3.5㎛이다.

이동상: 물(TFA 0.1%와 함께) 및 아세토니트릴(TFA의 0.1%와 함께)로 이루어진 2원 혼합물.

방법:12분에 걸쳐 아세토니트릴(TFA 0.1%)의 0% 내지 80%의 구배.

검출 파장: 214㎚.

표에 있어서, 순도는 정제하기 전의 미가공 생성물의 피크의 표면적에 대한 상대적인 퍼센트로서 표시되고, 유지 시간(R.T.)은 분으로 표시된다.

M.S:

9V의 콘 전압, 120℃에서 소스 온도 및 6초의 스캔 시간에서의 양성 전기스프레이.

표는 분자 이온 [M+H]⁺및, 일부 경우에 있어서, 쌍 전하 이온 [M+2H]²⁺의 값을 나타낸다.

(표)

R-V¹-Ala²-His³-X⁴-Y⁵-Trp⁶-NH₂(I)

이 표에서:

- Ac는 아세틸기를 나타내고,

- BzlSO₂는 벤젠술포닐기를 나타내고,

- PyrProp는 피리딘프로피오닐기를 나타내고,

- Tos는 토실기를 나타내고,

- DHomoPhe는 D-형 호모페닐알라닌을 나타내고,

- DThi는 D-형 티에닐알라닌을 나타내고,

- DpNO₂Phe는 D-형 p-니트로페닐알라닌을 나타내고,

- L2,Nap는 D-형 2-나프틸알라닌을 나타내고,

- DPhe는 D-형 페닐알라닌을 나타내고,

- Nle는 L-형 노르류신을 나타내고,

- NMe-Nle는 L-형 2-N-Me-노르류신을 나타낸다.

이들 화합물들은, 실시예 1에서 설명되는 바와 같이, 링크 아미드형 수지와 지지체 상에서 합성을 실시할 수 있다.

필요하다면, 아미노산은 측쇄 상에 보호된 형태로 도입하고, 주된 아민 관능기를 Fmoc기로 보호한다. 이들 합성에 사용된 분자는 하기 위치에 따른다:

Trp⁶: Fmoc-Trp(Boc)-OH

Y⁵: Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH

X⁴: Fmoc-DPhe-OH, Fmoc-D-pNO ₂ Phe-OH, Fmoc-DThi-OH, Fmoc-L2,Nap-OH,

Fmoc-DHomoPhe-OH

His³: Fmoc-His(Trt)-OH

Ala²: Fmoc-Ala-OH

Ala¹: Ac-Nle-OH, 아세틸 보호 이외의 말단 보호의 경우에서의 Fmoc-Nle-OH.

이 경우에 있어서, 말단 보호(R)는 탈보호 단계 이후, 커플링에 의해, 다음의 시약: 벤젠설포닐 클로라이드, 피리딘프로피오닐 클로라이드 및 토실 클로라이드를 사용하여 도입될 것이다.

본 발명의 펩티드는 적합한 독성 테스트 및 내성(tolerance) 테스트에 의해 이들의 무해성을 확인한 후, 이들의 효과를 측정하기 위해 약리학적 시험을 행하였다.

1. cAMP의 생성에 의해 멜라닌 세포주에 대한 생체외(in vitro)에서 MCl-r 수용체에 대한 표의 펩티드의 친화성을 입증하였다.

알파-MSH와 비교한, 생체외에서 유지되는 멜라닌 세포에 의한 아데닐릴 사이클라아제의 활성화에 대한 본 발명의 펩티드의 영향의 검증은 특히 베아보 제이. 에이.등(Beavo J. A. et al. Mol. Pharmacol.,6(6), 597-603, 1970) 및 몬타구 더블유.등(Montague W. Cook J. R., Biochem J.,122(1), 1971)에 의해 서술된 방법을 사용하여 수행하였다. 멜라닌을 합성할 수 있는 쥐과 멜라닌 세포(세포주 S91 Cloudman)를 사용하였다.

cAMP 생성은 공급자의 추천에 따라 EIA 방법(Amersham Pharmacia Biotech, Biotrack kit ref RPN225)에 의해 추적하였다. 알파-MSH(100%)와 비교하여 스크린된 다양한 분자에 의해 유도되는 백분율 반응을 측정하였다. 모든 실험 조건은 반복하여 수행하였다.

실시예 3에 따른화합물 No.	cAMP 생성(α- MSH의 % 로서)
α- MSH	100
1	80
2	40
3	10
4	70
5	100
6	55
7	100
8	65
9	75
10	115
11	150
12	50
13	55
14	45

티로시나아제 생성에 대한 펩티드 no.1 및 알파-MSH의 작용은 인간 멜라닌 세포에서 유지되는 생체외에서 실험하였다. 티로시나아제 생성은 항-인간 티로시나아제 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 M4Be 세포주에 대하여 추적하였다.

24시간 배양한 후, 알파-MSH 또는 펩티드 no.1 을 최종농도 10^-7M이 되도록 세포에 첨가하였다. 24시간 후, 이들 세포를 긁어모아 분리하고 50mM의 NaH₂PO₄버퍼, pH 6.8 + 1％ 트리톤 X100 + 1mM PMSF에서 용균시켰다. 다양한 샘플에서의 단백질의 양은 비신코닌산(bicinchoninic acid)으로 분석하여 측정하였다. 15％ 아크릴아미드/비스아크릴아미드 전기영동겔에 웰당 샘플 100 μg을 로딩하였다. 샘플을 70mA에서 3시간 동안 이동시켰다. 이어서, 10V에서 밤샘 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인(Schleicher & Schuell, ref Protan)으로 이동시켰다. 멤브레인을 pH 7.6 (200mM Tris; 1.37 M NaCl; 1M HCl)의 버퍼 + 0.1％ Tween + 5％ BSA로 37℃에서 1시간동안 블로킹하였다. 현시를 위해, 먼저, 1/1000으로 희석한 항-인간 티로시나아제 염소 항체(Santa Cruz, ref SC-7833)로 4℃에서 밤샘 처리하였다.이어서, 1/1000으로 희석한 퍼옥시다아제-연결된 항-염소 면역글로불린 항체(Sigma, ref A8919)로 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, ECL 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech, ref RPN2109)를 사용하여 화학적 루미네슨스에 의해 티로시나아제의 존재를 가시화 하였고, 이것을 도 1에 나타낸 것 처럼 광사진 필름(Amersham Pharmacia Biotech, ref RPN2103K)에 노출시켰다.

2. 표의 펩티드 no.1의 국부적 투여에 의한 멜라닌 자극효과에 관한 더블-블라인드 연구(double-blind study)를 인간에서 수행하였다.

10 ppm에서의 펩티드 no.1의 겔 및 이들의 플라시보(placebo)를 동의를 얻은 12명의 정상 피험자의 팔뚝의 내부면에 3주에 걸쳐 하루 두번씩 적용하였다. 팔들은 태양에 노출시키지 않았기 때문에 16 내지 20일간 하루 한번씩 0.6 MED (minimum erythema dose)의 조정된 인공 태양광에 노출시켰다.

최종 처리후 24시간에, 치료된 부위의 임상적 평가를 블라인드로 실시하고, 착색의 강도를 5단계의 지표 스케일에 따라 표시하였다. 이어서, 생성된 멜라닌을 정량하고 치료의 초구조적 결과를 평가하기 위하여 생체검사 샘플을 취하였다.

상피 멜라닌의 정량은 AgNO₃로 표지한 후 이미지 분석에 의해 조직학적 절단물에 대하여 수행하였다. 상피의 활성층만을 디지털화한 후(Sony CCD camera) Leica Quantimet을 사용하여 분석하였다.

멜라닌세포 및 멜라닌소체를 전자 현미경을 사용하여 초구조 분석을 하였다. 얇은 절단물에 대하여 이중-콘트라스트 기술을 사용하였고, 이어서, x 12000 까지의 확대 배율 범위에서 관찰(Jeol 1200EX)하였다.

플라시보와 비교하여, 표의 펩티드 no.1은 54％의 피부 갈색화(피부 그을림) (P< 0.05, Student's test)라는 통계학적으로 의미 있는 증가를 유도하였다. 처리된 부분을 임상적으로 관찰하였을 때, 과민증(intolerance)의 징후는 없었다.

플라시보와 비교하여, 표의 펩티드 no.1은 피험자의 상피내에서 멜라닌양의 통계학적으로 의미 있는 증가(+ 68%, p < 0.01)를 유도하였다. Fisher test에 따른 변화분석을 통해 1％ 이하의 위험도를 갖는 매우 의미 있는 생성된 효과를 나타내었다.

또한, 개인의 결과를 비교하였을 때 2가지 방법 사이의 우수한 상관관계를 나타내었다.

멜라닌세포의 초구조 분석을 하였는데, 큰 세포와 함께, 발달된 핵에는 뭉친염색질(heterochromatin)이 거의 나타나지 않았고, 세포 소기관이 매우 풍부하였으며, 진성멜라닌소체로 축적된 가지돌기를 나타내는 등 처리의 상당한 영향을 보여주었다. 이러한 모든 징후는 생리학적으로 강력한 멜라닌 생합성 활성을 완전히 반영하는 것이다.

각질세포에서 멜라닌소체를 연구한 결과, 이들이 세포핵의 꼭대기 수준에서 자연적으로 축적되어 전형적인 "핵 양산(nuclear parasol)"을 구성하였다.

국부적으로 적용된 표의 펩티드 no.1은 인간에서의 피부 멜라닌 합성을 상당히 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이는 국부적 수준에서 완전히 참을 수 있는 것이다.

3. 항-염증 활성은 다음과 같이 증명하였다:

피부상에서 계면활성제와 같은 자극제가, 인터루킨-1-알파(IL-1α)와 같은 사이토카인의 세포외 발현이 특징인 염증성 반응을 초래한다. SDS-자극성 각질세포 배양모델을 표의 펩티드 no.1의 항-염증성 잠재력을 평가하기 위하여 사용하였다.

NCTC 2544 인간 각질세포를 농도 10^-6M의 표의 펩티드 no.1와 함께 72 시간동안 배양하였다. 세정 후, 85 mg/l 농도의 SDS를 도입시키고 24시간 동안 접촉시켰다.

상청액내에서의 세포외 IL-1α수준을 SDS에 의한 방해가 없도록 선택한 ELISA 방법(Immunotech, ref 0755)에 의해 측정하였다.

SDS-자극된 NCTC2544 각질세포에 의한 IL-1α방출에 대한 표의 펩티드 no.1의 효과:

	대조군	펩티드 no.1을 10^-6M로 처리
IL-1αPg/10⁹세포	38	22

펩티드 no.1은 배양액에서 SDS-처리된 각질세포에 의한, IL-1α의 발현을 약 42％ 감소시켰다.

4. 인간 광-유도 홍반에 대한 표의 펩티드 no.1의 생체내(in vivo) 영향을측정하였다.

광타입 클래스 Ⅲ & IV (적은 양 및 중간 양) 및 50 내지 28°의 개인 활자 각(Individual Typological Angle, ITA°)을 가진 양쪽 성의 14명의 정상 성인 피험자들이 본 연구에 참여할 것을 동의하였다.

처리는 75㎠에 대하여 2㎕/㎠의 속도로 2주간 2회/1일 팔뚝의 내부면에 국부적으로 적용하는 것으로 구성하였다. 연구 동안, 태양에 대해 어떠한 노출도 없었다.

290 내지 390 mm 범위의 UVA & UVB 스펙트럼을 가진 150W 제논 아크 램프로 태양 방사를 제공하였다. 25％의 기하급수적 광 강도의 6개의 양을 액체 광 가이드를 통하여 처리된 부분에 적용하였다.

착색계 계수는 Chromatometer^TMCR 300을 사용하여 측정하였다. 색도 좌표(L; a & b*)를 비-조사된 근접 영역에 대하여 측정하였다. 미분 Δa* > 2.5로 MED을 정확하게 규정하는 것이 가능하다.

최종 처리 24시간 후에, 처리영역 및 대조군영역은 각 개인의 MED를 넓히기 위하여 계산된 UV 용량을 증가하여 조사하였다. 24시간 및 72시간 후에, 조사된 부분은 착색계 측정 수단을 사용하여 평가하였다.

평가 기준은 MED이다 : 홍반을 일으키는 UV A & UV B의 최소량

MED에서의 통계학적으로 의미 있는 증가는 표의 펩티드 no.1으로 처리한 경우에서 관찰된다.

UV A & UV B에 노출 후 MED의 평가 J/cm²:

	대조군 영역	처리된 영역
노출 후 24시간	1.5	1.8*
노출 후 72시간	1.5	1.7

* 통계학적으로 의미 있는 값 (LSD 및 쌍(paired)"t" 테스트, p < 0.05)

겔의 형태로, 표의 펩티드 no.1을 국부적으로 적용하면 과도한 광 조사에 의해 초래되는 홍반 발생에 대한 피부의 저항을 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 펩티드는 항-염증성, 항-알레르기 및 멜라닌친화 활성을 가지는 것처럼 보인다.

따라서, 본 발명의 펩티드는 알레르기, 특히 피부 알레르기, 염증성 반응 및 멜라닌형성 병리적 상태를 치료할 의도의 의약품의 제조를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 의약품의 용도는 아토피피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 홍반(erythema), 특히 광 유도 홍반, 염증성 탈모증(inflamatory alopecia), 습진(eczema) 및 천식(asthma)의 치료, 특히 예방 및/또는 치료를 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 본 발명은 활성성분으로서 본 발명의 펩티드를 함유하는 약리학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약리학적 조성물은 특히 피부 및 점막에의 국부적 적용에 적합할 수 있다.

따라서, 이러한 약리학적 조성물은 본 발명에 의한 펩티드의 유효량 및 하나 이상의 적합한 약리학적 첨가제를 포함한다.

상기 첨가제는 약리학적 형태 및 원하는 투여 방식에 따라 선택한다.

경구, 혀밑, 피하, 근육내, 정맥내, 국부적, 기관내, 코안, 경피적(패치) 또는 직장 투여를 위한 본 발명의 약리학적 조성물에서, 상기 식(I)의 활성성분 또는 이들의 임의의 염 또는 수화물은 통상적인 약리학적 첨가제와의 혼합물로서, 상기 병리적 상태 또는 질병의 치료 또는 예방을 위하여, 동물 및 인간에게 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태는 정제(tablet), 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구 용액 또는 현탁액과 같은 경구투여를 위한 형태, 혀밑, 입안, 기관내 및 코안 투여형태, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다. 국부적 적용을 위해서는, 본 발명에 의한 화합물은 크림, 연고, 액체 에어로졸 또는 스프레이 에어로졸(스프레이), 겔, 로션 및 패치의 형태로 사용될 수 있다.

투여경로가 무엇이든지, 하나 이상의 복용량으로 주어진다면, 1일당 투여되는 활성성분의 복용량은 0.5mg/kg에 이를 수 있다.

고복용량 또는 저복용량이 적합한 특별한 경우가 있을 수 있지만, 이러한 복용량도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 통상적인 경우에 따라, 각 환자에 적합한 복용량은 투여 방법 및 상기 환자의 체중 및 반응에 따라 의사(physician)에 의해 결정된다.

고체의 조성물이 정제의 형태로 제조되는 경우에, 주요 활성성분은 젤라틴, 녹말, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석(talc), 아라비아검 등과 같은 약리학적 첨가제와 혼합된다. 정제는 셀룰로오스 유도체 또는 다른 물질과 함께 수크로오스로 코팅될 수 있다. 정제는 직접타정법(direct compression), 건식 과립화법(dry granulation), 습식 과립화법(wet granulation) 또는 핫 멜팅법(hot melting)과 같은 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다.

겔 캡슐의 제조는 활성성분을 희석제와 혼합하고, 이렇게 얻어진 혼합물을 연질 또는 경질 겔 캡슐에 따라 붓는다.

비경구적 투여를 위해서는, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜과 같은 약리학적으로 사용 가능한 분산제 및/또는 습윤제를 포함하는 수성 현탁액, 등장 염수용액 또는 멸균 및 주사 가능한 용액으로 만들어져 사용될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 의한 펩티드 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염의 투여를 포함하는, 상기 지적된 병리상태를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

점막 또는 국부적으로 투여될 수 있는 식(I)의 화합물을 포함하는 미용학적 조성물도, 멜라닌친화 효과를 갖는 미용학적 생산물을 제조하기 위한 식(I)의 화합물의 용도처럼, 본 발명의 일부분이다.

마지막 관점에서, 본 발명의 주제는, 특히, 태양 노출에 대한 피부의 준비를 위한 작용제, 태양에 의한 피부 그을림 가속화제, 백색 모발의 재염색제, 피부 진정제, 항-홍반제로서 사용될 수 있는, 용액, 로션, 에멀젼, 액체 에어로졸 또는 스프레이 에어로졸(스프레이), 겔 또는 크림의 형태일 수 있는 국부적 적용을 위한, 본 발명에 의한 식(I)의 펩티드를 포함하는 피부미용학적 조성물이다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 주제인 본 발명에 의한 펩티드 혼합물을포함하는 약리학적 조성물, 미용학적 생산물 또는 피부미용학적 조성물도 또한 본 발명의 일부분이다.

5. 덱사메타손(dexamethasone)과 비교한 펩티드 no.1에 의한, 정상 피험자로부터의 SAEC 세포(작은 기도 상피 세포, Small Airway Epithelial Cell), 또는 다핵호중성백혈구(polyneclear neutrophils) 및 중증 천식을 겪는 외피-의존성 환자로부터의 단핵세포의 자극 효과:

a) 상피세포:

ㆍSAEC (배양된 제1 인간 상피세포)

기원 : 정상 피험자의 작은 기관지

ㆍ플라스크에서의 증식, 트립신처리 및 웰(48-웰 플레이트)로의 이동

ㆍ콘플루언시(confluency)에서, 웰에서 24시간동안 인큐베이션

ㆍ비-자극, + TNF알파 (25ng/ml) + 10^-5M 내지 10^-8M의 표의 펩티드 no.1 + 덱사메타손 10^-7M

ㆍ상청액을 회수하고, -20℃에서 보관,

ㆍELISA 키트를 사용하여 IL-8을 분석

펩티드 no.1에 의한 SAEC 세포의 자극 효과는 도 2에 나타내었다. (NS = 비-자극, DEX = 덱사메타손).

b) 중증 천식을 겪는 8명의 피질-의존성 환자:

ㆍ헤파린 첨가 혈액 : 30ml,

ㆍ퍼콜 농도구배(Percoll gradient, 62-72%)상에서 분리,

ㆍ단핵세포 및 호중성백혈구 > 95% 생존율 > 99%,

ㆍ세포를 수득하고 RPMI에서 세정

ㆍ107세포/ml, 웰에서 24시간동안 배양

ㆍ비-자극, + 10^-6M 내지 10^-8M의 표의 펩티드 no.1 + 덱사메타손 10^-7M

ㆍ상청액을 회수, -20℃에서 보관,

ㆍELISA 키트를 사용하여 IL-8을 분석

펩티드 no.1에 의한 피질-의존성(cortico-dependent, CD) 단핵세포 자극 효과는 도 3에 나타내었다. (NS = 비자극, DEX = 덱사메타손).

펩티드 no.1에 의한 피질-의존성(cortico-dependent, CD) 다핵 호중성백혈구세포 자극 효과는 도 4에 나타내었다. (NS = 비자극, DEX = 덱사메타손).

이러한 결과는 표 1의 펩티드 no.1의 활성이 덱사메타손의 것보다 10배 크다는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT EUROPEEN DE BIOLOGIE CELLULAIRE <120> NOVEL PEPTIDE DERIVATIVES, PREPARATION AND THERAPEUTIC AND COSMETIC APPLICATION THEREOF <130> 346 449 - KR <150> PCT/FR 03/00 300 <151> 2003-01-31 <150> FR 02/01 202 <151> 2002-02-01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Norleucine, Norvaline or 2-N-Me-Norleucine <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> BLOCKED <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> phenylalanine, 1-naphtylalanine, 2-naphtylalanine, phenylglycine, benzothienylalanine, 4,4'-biphenylalanine, 3,3-diphenylalanine, homophenylalanine, indanylglycine, 4-methylphenylalanine, thienylalanine, p-nitro-phenylalanine, halogenophenylalanine <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Arginine, Lysine or Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 1 Nle Ala His Phe Arg Trp 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa = 2-naphtylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> AMIDATION <400> 2 Nle Ala His Xaa Lys Trp 1 5 1

Claims

식 (I) R-V¹-Ala²-His³-X⁴-Y⁵-Trp⁶-NH₂의 펩티드.

상기 식에서, R은 아세틸기, 벤조일기, 토실기, 벤젠설포닐기, 벤질옥시카르보닐기, 피리딘프로피오닐기로부터 선택될 수 있는 보호기 또는 수소원자를 나타내고;

V는 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline) 및 2-N-Me-노르류신으로부터 선택되는, 천연 또는 비천연 L-형 아미노산을 나타내고;

X는 페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 페닐글리신, 벤조티에닐알라닌, 4,4'-비페닐알라닌, 3,3-디페닐알라닌, 호모페닐알라닌, 인다닐글리신, 4-메틸페닐알라닌, 티에닐알라닌, p-니트로페닐알라닌 및 할로겐이 페닐기의 메타, 오르토 또는 파라 위치에 있는 염소, 브롬, 요오드 또는 플루오르 원자일 수 있는 할로페닐알라닌으로부터 선택되는 사실상 방향족인, 천연 또는 비천연, L- 또는 D- 형 아미노산을 나타내고;

Y는 아르기닌, 리신 또는 오르니틴, 이들의 거울상 이성질체(enantiomer) 또는 부분입체이성질체(diastereoisomer) 및 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물로부터 선택되는 사실상 염기성인, 천연 L-형의 아미노산을 나타내고;

2, 3, 및 6의 위치에서의 아미노산 Ala, His 및 Trp는 각각 L-형이다.
제1항에 있어서,

R은 아세틸기, 벤젠설포닐기 및 피리딘프로피오닐기로부터 선택될 수 있는 보호기 또는 수소원자를 나타내고,

V는 노르류신 및 2-N-Me-노르류신으로부터 선택되는, 천연 또는 비천연 L-형 아미노산을 나타내고,

X는 페닐알라닌, 2-나프틸알라닌, 호모페닐알라닌, 티에닐알라닌 및 p-니트로페닐알라닌으로부터 선택되는 사실상 방향족인, 천연 또는 비천연, L-형 또는 D- 형 아미노산을 나타내고,

Y는 아르기닌, 또는 리신, 이들의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 및 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물로부터 선택되는 사실상 염기성인, 천연 L-형의 아미노산을 나타내고;

2, 3, 및 6의 위치에서의 아미노산 Ala, His 및 Trp는 각각 L-형인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

Ac-Nle-Ala-His-Dphe-Arg-Trp-NH₂,

Ac-Nle-Ala-His-Dphe-Lys-Trp-NH₂,

Ac-Nle-Ala-His-DThi-Arg-Trp-NH₂,

BzlSO₂-Nle-Ala-His-Dphe-Arg-Trp-NH₂,

Tos-Nle-Ala-His-Dphe-Arg-Trp-NH₂,

BzlSO₂-Nle-Ala-His-Dphe-Lys-Trp-NH₂,

BzlSO₂-Nle-Ala-His-DpNO₂Phe-Lys-Trp-NH₂,

BzlSO₂-Nle-Ala-His-DThi-Lys-Trp-NH₂,

Ac-Nle-Ala-His-DThi-Lys-Trp-NH₂,

PyrProp-Nle-Ala-His-DpNO₂Phe-Lys-Trp-NH₂,

PyrProp-Nle-Ala-His-DpNO₂Phe-Arg-Trp-NH₂,

Ac-Nle-Ala-His-L2,Nap-Lys-Trp-NH₂,

Ac-MeNle-Ala-His-DhomoPhe-Arg-Trp-NH₂,

Ac-Nle-Ala-His-DhomoPhe-Arg-Trp-NH₂,

이들의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 및 라세미 혼합물을 포함하는 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
제조공정이 수지를 가진 지지체상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물로 이루어지는 것을특징으로 하는 의약품.
적합한 임의의 첨가제와 조합한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 점막 또는 국부적 투여를 위한 미용학적 생산물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌친화 활성(melanotropic activity)을 가진 미용학적 생산물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 태양 노출에 대한 피부의 준비 및 피부의 햇볕 그을림을 가속화하기 위한 작용제, 백색 모발을 재염색하기 위한 작용제, 피부를 누그러뜨리기 위한 작용제 또는 항-홍반 작용제인 미용학적 생산물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용액, 로션, 에멀젼, 액체 에어로졸 또는 분사된 에어로졸, 겔 또는 크림의 형태일 수 있는 국부 적용을 위한 피부미용학적 조성물.
알레르기, 특히 피부 알레르기, 염증성 반응 및 멜라닌형성 병리상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 의도의 의약품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물의 용도.
제11항에 있어서, 아토피피부염(atopic dermatitis), 습진(eczema), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 홍반(erythema), 특히 광 유도 홍반, 염증성 탈모(inflamatory alopecia) 또는 천식(asthma)을 치료하기 위한 의도의 의약품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물의 용도.
멜라닌친화 및 항-홍반 효과를 갖는 미용학적 생산물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 식(I)의 화합물의 용도.