KR20040094288A - Ａｒｄｓ의 치료에 있어 변형된 ｆⅶ - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간에서 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 변형된 FⅦ의 사용에 관련된다.

Description

ＡＲＤＳ의 치료에 있어 변형된 ＦⅦ{MODIFIED FⅦ IN TREATMENT OF ARDS}

급성 호흡 곤란 증후군("ARDS")은 예를 들어 외상 환자에서 발생할 수 있는 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 한 소견이다. 증후군은 급성 질병으로서, 염증 중재자 방출로 특성결정되고 내피의 활성화로 일반화되며, 결국에는 다중 기관 기능장애 증후군을 일으킨다. 감염성 손상 (예를 들어, 패혈증)은 물론이고, 비감염성 병리학적 원인 (예를 들어, 외상 및 조직 손상)도 SIRS를 초래하고 ARDS를 나타나게 할 수 있다.

ARDS은 "임상적, 방사선학적 및 생리학적 비정상의 집합제와 연관된 염증 및 증가된 투과성의 증후군"으로서 설명된다 (Am-European Consensus, 1994). 이것은 패혈증, 폐렴, 흡인, 허혈 (순환 정지, 출혈성 쇼크), 외상 등과 같은 급성 질병 또는 손상에 대한 합병증으로서 발생한다. ARDS를 갖는 환자에서, 폐의 미세혈관,사이질 및 폐포 공간은 섬유 침전의 1차적 표적이다. 이것은 1차적으로 폐의 넓은 표면 영역 (70 m²) 및 전체 심장 산출을 받는 폐 모세혈관의 위치 때문이다. 그러나, 미세혈전 형성을 파괴하는 것은 다수의 기관에서 발생하며, 폐 및 신장에서 최대로 노출되는데, 이것은 다중 기관 부전 (MOF)를 일으킬 수 있다. 더욱이, 염증 반응은 폐포 공간 내로 혈장 단백질의 혈관 누출을 일으켜서 폐 부종을 야기한다.

ARDS의 특징은 투과 부종의 결과로서 혈액 산소공급의 저하 및 호흡계 탄성이다. 다양한 다른 손상이 ARDS를 일으킬 수 있지만, 통상적인 경로는 산소 유리 라디칼, 라키돈산 대사물질 및 인터류킨-1, 프로테아제, 및 종양 괴사 인자와 같은 염증 중재자가 폐포 모세혈관 막 투과에서의 증가를 일으키는 것과 더불어 폐 손상 및/또는 부전, 폐 내에서 백혈구의 활성화를 일으킨다. 이 거대분자 장벽의 손실로, 폐포는 혈청 단백질로 가득차는데, 이것은 폐 표면의 기능을 손상시킨다 (Said et al. J. Clin. lnvest. 44: 458-464; Holm et al. J. Appl. Physio. 63: 1434-1442,1987). 이것은 상태를 악화시키는 유체정역학적 힘을 생산하여 (Jefferies et al., J. Appl. Physio. 64: 5620-5628,1988), 폐포 부종을 일으키고 동시에 가스 교환 및 폐 탄성에서의 저하를 가져온다.

ARDS는 내과 및 외과 환자 모두에게 영향을 준다. 증후군은 종종 진행성으로서, 상이한 임상적, 해부병리학적, 및 방사선 사진의 징후를 갖는 개별적인 단계에 의해 특성결정된다. 급성, 또는 침투성 시기는 상태에 대한 위험 인자를 가진 환자에서 호흡 부전의 신속한 발병에 의해 나타난다. 보충 산소로 치료되기 어려운 동맥 저산소혈증은 특징적인 성질이다. 방사선 사진으로는, 심장성 폐 부종의 소견과 구분할 수 없다. 양측 침윤물은 반점형이거나 비대칭형이고 늑막 일출을 포함할 수 있다. 폐포 충만, 경화, 및 무기폐는 의존성 폐 구역에서 우세하게 일어나는 반면, 다른 영역은 비교적 면할 수 있다. 그러나, 면하더라도, 비의존성 영역은 실질적인 염증을 가질 수 있다. 병리학적 소견은 폐포 공간에 있는 호중성구, 대식세포, 적혈구 히알린 막, 및 단백질-풍부 부종액을 갖는 확산 폐포 손상, 모세혈관 손상, 및 폐포 상피의 붕괴를 포함한다.

급성 폐 손상 및 ARDS가 급성 시기 후 몇몇 환자에서 완전하게 해결될 수 있음에도 불구하고, 다른 환자에서는 지속성 저산소혈증, 증가된 폐포 사멸 공간, 및 폐포 또는 폐 탄성의 더 이상의 감소를 갖는 섬유형성 폐포염으로 진행한다. 폐 모세혈관계의 소멸로 인한 폐 고혈압은, 심각해질 수 있고 우심실 부전을 일으킬 수 있다. ARDS을 견딘 대부분의 환자에서, 폐 기능은 폐에서의 심각한 손상에도 불구하고 6-12 개월 내에 거의 정상으로 회복된다. 폐 기구의 잔류 손상은 경미한 제한, 폐색, 일산화탄소에 대한 분산 능력의 감손, 또는 운동을 갖는 가스-교환의 비정상을 포함하지만, 이러한 비정상은 일반적으로 무증후성이다. 심한 질병 및 연장된 기계적 통풍은 폐 기능의 영속적인 비정상에 대한 가장 높은 위험에 있는 환자를 확실시한다. 병을 견딘 사람들은 감소된 건강-관련 삶의 질은 물론이고 폐-질병에 특이적인 건강-관련 삶의 질을 갖는다.

ALI 및 ARDS에 대한 대부분의 연구는 40-60%의 치사율을 보고하였다. 사망자의 대부분은 1차적인 호흡 원인 보다는 패혈증 또는 다중기관 기능장애에 의한것이지만, 낮은 주기적 부피를 갖는 통풍의 최근 치료 성공은 몇몇 경우에서 사망이 폐 손상에 직접적으로 관련된다는 것을 가리킨다.

1988년에, 양의 날숨 압력 수준, 흡입된 산소의 부분에 대한 동맥 산소의 분압의 비율, 정적인 폐 탄성, 및 흉부 방사선 사진 상에서 침윤 사건의 정도에 기초된 4-점 폐-손상 채점 시스템을 통해 생리학적 호흡 손상의 양을 정하는 증후군의 확장된 정의가 제시되었다. 평가에 포함되는 다른 인자는 자극 임상 이상 및 폐 외의 기관 기능장애의 존재여부이다. 1994년에는, American-European Consensus Conference Committee에 의해 새로운 정의가 제시되었는데: 첫째로, 임상 폐 손상의 심각성이 변화하고; (300 이하인 흡입된 산소의 부분에 대한 동맥 산소의 분압 비율에 의해 정의된 것과 같이) 덜 심한 저산소혈증을 갖는 환자는 ALI에 걸린 것으로 생각되고, (200 이하의 비율에 의해 정의된 것과 같이) 더 심한 저산소혈증을 갖는 환자들은 ARDS에 걸린 것으로 여긴다는 것을 인정한다. 둘째로, 정의는 임상 세팅에 적용되도록 간단하다. 1994 Consensus 정의 및 1988 폐-손상 채점 시스템 모두의 만연된 허용은 임상 연구 및 시도의 표준화를 개선하였다.

결론적으로, 급성 폐 손상(ALI)은 하기 기준에 의해 정의된다 (Bernard et al.,Am. J. Respir. Crit. Care Med149: 818-24,1994):

- 급성 발병

- 흉부 방사선 사진 상의 양측 침윤

- 18 mm Hg 이하의 폐동맥 쐐기압 또는 좌동맥 고혈압의 임상적 증거의 부재

-300 이하의 PaO₂: FiO₂

ARDS는 하기 기준에 의해 정의된다 (Bernard et al.,Am. J. Respir. Crit. Care Med149: 818-24,1994):

- 급성 발병

- 흉부 방사선 사진 상의 양측 침윤

- 18 mm Hg 이하의 폐동맥 쐐기압 또는 좌동맥 고혈압의 임상적 증거의 부재

- 200 이하의 Pa0₂: FiO₂(Pa0₂는 동맥 산소의 분압을 나타내고, Fi0₂는 흡입된 산소의 분압을 나타낸다)

ARDS는 폐의 직접 손상에 연관된 임상적 이상 및 전신 프로세싱의 세팅에서 간접적인 폐 손상을 야기하는 이상에 의해 촉발될 수 있다 (표 1 참조):

ARDS의 발생에 연관된 임상적 이상

직접 폐 손상	간접 폐 손상
통상적인 원인:- 폐렴- 위 내용물의 흡출	통상적인 원인:- 패혈증- 쇼크 및 다수의 수혈을 동반한 중증 외상
덜 통상적인 원인:- 폐 타박상- 지방 색전- 익수- 재관류 폐 부종	덜 통상적인 원인:- 심폐 대체혈관- 약물 과용- 급성 췌장염- 혈액 생성물의 수혈

전반적으로, 패혈증은 ARDS로 진행할 가장 큰 위험에 연관된다 (약 40%).

패혈증과 같이, 염증이 조절되는 방법을 변화시키는 질병은 숙주 방어의 부적절하고/또는 과량인 자극으로 인해 중증 ALI를 야기한다. 염증 도중, 조직 인자(TF), 활성화된 인자 Ⅶ (FⅦa) 및 X (FXa) 및 트롬빈을 포함하는 외래 응고 경로의 몇몇 성분은 핵심 염증 중재자와 상호작용하여 조직 반응을 조절한다. 응고의 활성화는 혈관 공간 내 전응고 환경의 발생을 수반한 내독소 또는 박테리아의 주입 후 신속히 일어난다. 이 변화는 TF 의존성이고 염증 시토카인의 증가와 연관된다. 폐에서와 마찬가지로, 전응고 상태는 내독소 주입 후의 동물에서 또는 실험적인 ALI로 측정되었다. 유사한 전응고 환경은 ARDS에 걸린 환자의 기관지 꽈리 세척 (BAL)에서 발견되는데, 이것은 혈관외 폐 염증 또한 외래 경로를 활성화시킨다는 것을 제시한다. 염증 중재자가 응고 상에 특이적 효과를 가짐에도 불구하고, 염증 반응에서 조절 인자로서 TF 역할의 뒤바뀐 관계, 및 응고에 관련된 사건은 잘 이해되지 않는다.

업계에는 ALI 또는 ARDS의 치료에 유용한 약물의 필요성이 존재한다. 본 발명자들은 변형된 FⅦ이 급성 폐 손상의 발생 과정에서 염증 및 응고병증 반응 모두를 감약시키고, 확립된 ALI 또는 ARDS를 갖는 피험자에서 변형된 FⅦ로 응고를 봉쇄하는 것은 폐 및 신장 손상을 감약시키며 폐 및 신장 기능을 보존한다는 사실을 밝혔다. 다른 조직 또한 보호된다. 확립된 급성 폐 손상의 모델에서 변형된 FⅦ에 의한 TF/FⅦa 활성의 차단은 유의하게 그리고 극적으로 생존을 연장하였고 염증 및 응고병증 반응을 감약시켰다. 이것은 폐, 신장 및 다른 기관에서 피브린 침전의 본질적인 저지, 기관 기능의 보존 및 IL-6 및 IL-8 방출의 유의한 감약을 나타낸 데이터에 의해 증명되었다.

인용 기술:

국제 출원 No. WO 92/15686은 혈액 응고를 저해하는데 있어서 변형된 인자 Ⅶa, 및 변형된 인자 Ⅶa을 포함하는 조성물의 제조를 위한 변형된 인자 Ⅶa, 핵산 및 포유동물 세포주에 관련된다.

국제 출원 No. WO 94/27631은 혈관 재협착, 조직 인자 활성화, 및 혈소판 침전의 저해 방법에 관련된다.

국제 출원 No. WO 96/12800은 변형된 인자 Ⅶa를 조직 플라스미노겐 활성제 또는 스트렙토키나아제와 함께 포함하는 조성물을 포함하는, 관상 동맥의 급성 폐쇄의 치료 방법에 관련된다.

Miller et al., FASEB Journal 15 (4), A497,7 March 2001: Competitive inhibition of FⅦa attenuates lung injury and proinflammatory cytokine release after intratracheal lipopolysaccharide.

Welty-Wolf et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 158 (2), 610,1998: Bacterial priming increases lung injury in gram-negative sepsis.

Carraway et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 157 (3), 938,1998: Antibody to E-and L-selectin does not prevent lung injury or mortalty in septic baboons.

Taylor et al., Critical Care Medicine 2000,28 (9), S12 : Description of compensated and uncompensated DIC responses in baboon models of intravenous and intraperitonal E. coli sepsis and in the human model of endotoxemia;toward a better definition of DIC.

Bajaj et al., Thrombosis and Haemostasis 78 (1), 471,1997: TFPI ; potential therapeutic applications.

Gando et al., The Journal of Trauma: Injury, Infection and Critical Care 47 (4), 719,1999: Systemic activation of TF dependent coagulation pathway in evolving ARDS and patients with trauma and sepsis.

Taylor et al., Haemostasis 1996,26 (suppl. 1), 83: Role of TF and FⅦa in the coagulant and inflammatory response to LD100 E. coli in the baboon.

Welty-Wolf et al., Abstract Preview from ATS 2001, available at ATS web page in April 2001; Extrinsic coagulation blockade attenuates inflammatory cytokine levels and lung injury in baboons with E. coli sepsis.

발명의 개요

한 양태에서 본 발명은 인간에서 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료를 위한 약물의 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다.

한 구체예에서 약물은 기관 부전의 치료용이다.

한 구체예에서 약물은 추가적인 기관 부전의 예방용이다.

한 구체예에서 약물은 기관 기능의 유지 또는 개선용이다. 한 구체예에서 약물은 폐 고혈압의 치료용이다. 한 구체예에서 약물은 전응고 활성의 감소 또는 최소화를 위한 것이다. 그것의 한 구체예에서 전응고 활성은 폐 상피 세포 및 조직 대식세포에 의한 조직 인자 발현과 연관된다. 한 구체예에서 약물은 염증의 감소 또는 최소화를 위한 것이다. 한 구체예에서 약물은 IL-6 및 IL-8의 생산을 감소 또는 최소화하기 위한 것이다. 한 구체예에서 약물은 폐 가스 교환을 개선하기 위한 것이다. 한 구체예에서 약물은 폐 단백질 누출을 감소 또는 최소화하기 위한 것이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 인간에서 ALI 또는 ARDS와 연관된 만성 기관 부전을 예방하거나 또는 최소화하기 위한 약물의 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다. 한 구체예에서 ALI 또는 ARDS는 변형된 FⅦ이 투여되기 전에 확립된다.

본 발명의 한 구체예에서 기관은 신장, 폐, 부신, 간, 소장, 심혈관계, 또는 지혈계이다. 한 구체예에서 기관은 폐이다. 한 구체예에서 기관은 신장이다. 한 구체예에서 기관은 심혈관계이다. 한 구체예에서 기관은 지혈계이다.

한 양태에서, 본 발명은 인간에서 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서 방법은 기관 부전의 치료, 추가적 기관 부전의 예방, 폐 고혈압의 치료, 전응고 활성의 감소 또는 최소화, 염증의 감소 또는 최소화, IL-6 및 IL-8 생산의 감소 또는 최소화, 폐 가스 교환의 개선, 폐 부종의 감소 또는 최소화, 및 폐 단백질 누출의 감소 또는 최소화를 위한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 인간에서 ALI 또는 ARDS와 연관된 만성 기관 부전의 예방 또는 최소화 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 폐 부전의 치료를 위한 약물의 제조에 FⅦai의 사용을 제공한다. 한 구체예에서 폐 손상은 급성 폐 손상 (ALI)이다. 한 구체예에서 폐 손상은 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 한 구체예에서 폐 손상의 치료는 ALI가 ARDS로 발전하는 것을 예방한다. 나아간 양태에서 본 발명은 확립된 ALI 또는 ARDS에서 더 이상의 폐 손상을 막기 위한 약물의 제조에 FⅦai의 사용을 제공한다. 나아간 양태에서 본 발명은 확립된 ALI 및 ARDS에서 폐 기능의 유지 또는 개선을 위한 약물의 제조에 FⅦai의 사용을 제공한다. 한 양태에서 본 발명은 피험자에서 폐 손상을 치료하는 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 FⅦai의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 폐 손상은 급성 폐 손상 (ALI)이다. 한 구체예에서 폐 손상은 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 한 구체예에서 폐 손상의 치료는 ALI가 ARDS로 발전하는 것을 예방한다. 나아간 양태에서 본 발명은 확립된 ALI 또는 ARDS를 갖는 피험자에서 더 이상의 폐 손상을 막는 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 FⅦai의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 나아간 양태에서 본 발명은 확립된 ALI 또는 ARDS를 갖는 피험자에서 폐 기능의 유지 또는 개선을 위한 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 FⅦai의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 나아간 양태에서, 본 발명은 폐 고혈압의 치료를 위한 약물에 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 피험자에서 폐 고혈압의 치료 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 폐 고혈압은 급성 폐 손상 (ALI)과 연관되고 ; 또다른 구체예에서, 폐 고혈압은 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 또다른 양태에서, 본 발명은 폐에서 전응고 활성을 감소 또는 저해하기 위한 약물에 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 피험자의 폐에서 전응고 활성을 감소 또는 저해하는 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 전응고 활성은 폐 상피 세포 및 조직 대식세포에 의한 조직 인자 발현과 연관된다. 한 양태에서, 본 발명은 혈관외 피브린 침전의 감소 또는 저해를 위한 약물의 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 피험자에서 혈관외 피브린 침전의 감소 또는 저해를 위한 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 혈관외 피브린 침전은 폐에서의 침전이다. 한 구체예에서, 혈관외 피브린 침전은 기관 손상 도중의 침전이다. 한 양태에서, 본 발명은 폐 염증의 감소 또는 저해를 위한 약물의 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 피험자에서 폐 염증을 감소 또는 저해하는 방법을 제공하는데, 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서 변형된 FⅦ는 촉매 3잔기에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ이다. 한 구체예에서 변형된 FⅦ는 위치 Ser344, Asp242, 및 His93 (미국 특허 No. 4,784,950에 설명된 것과 같이 야생형 인간 FⅦ의 서열을 지칭하는 위치)에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 FⅦ이다. 한 구체예에서 활성 부위 잔기인 Ser344는 변형되어, Gly, Met, Thr, 또는 더욱 바람직하게는, Ala으로 교체된다. 한 구체예에서 변형된 FⅦ는 세린 프로테아제 저해제와의 반응에 의해 변형된 FⅦa이다. 한 구체예에서 프로테아제 저해제는 유기인 화합물, 설파닐 플루오라이드, 펩티드 할로메틸 케톤, 또는 아자펩티드이다. 한 구체예에서 프로테아제 저해제는 댄실-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 펩티드 할로메틸 케톤이다. 한 구체예에서 프로테아제 저해제는 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤이다.

한 구체예에서 변형된 인자 Ⅶ은 상응하는 종의 야생형 인자 Ⅶ의 약 5% 미만, 더욱 바람직하게는 약 1% 미만인 촉매 활성을 갖는다.

한 구체예에서 ALI 또는 ARDS는 패혈증에 의해 유도되고; 한 구체예에서 ALI 또는 ARDS는 외상에 의해 유도되었다.

한 구체예에서 본 발명은 인간에서 확립된 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료를 위한 약물의 제조에 변형된 FⅦ의 사용을 제공한다.

한 구체예에서, 변형된 FⅦ는 하나 이상의 환약 주입으로서 투여된다.

한 구체예에서 변형된 FⅦ는 70 kg 환자에 있어서 약 0.05 mg 내지 500 mg/일; 1 mg 내지 200 mg/일; 1 mg 내지 약 150 mg/일; 1 mg to 내지 125 mg/일; 1 mg 내지 약 100 mg/일; 10 mg 내지 약 175 mg/일; 10 mg 내지 약 150 mg/일; 또는 10 mg 내지 약 125 mg/일의 양으로 투여된다.

한 구체예에서 변형된 FⅦ는 다중 정맥내 주사의 방법으로 투여된다.

한 구체예에서 변형된 FⅦ는 1일 (24시간) 당 100 ㎍/kg x 1, 100 ㎍/kg x 2, 100 ㎍/kg x 4, 200 ㎍/kg x 1, 200 ㎍/kg x 2, 200 ㎍/kg x 4, 400 ㎍/kg x 1, 400 ㎍/kg x 2, 400 ㎍/kg x 4, 800 ㎍/kg x 1, 또는 800 ㎍/kg x 2의 용량으로 투여된다. 여기 한 구체예에서, 변형된 FⅦ은 하루동안 환자에게 투여되고; 또다른 구체예에서 변형된 FⅦ는 이틀동안 환자에게 투여되고; 또다른 구체예에서 변형된 FⅦ는 3일동안 환자에게 투여된다.

본 발명은 급성 폐손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료를 위한 약의 제조에 있어서 변형된 FⅦ의 사용 및, ALI 및 ARDS의 치료 방법에 관련된다. 본 발명은 또한 ALI 또는 ARDS와 연관된 만성 기관 부전을 예방 또는 최소화하기 위한 약의 제조에 있어서, 그리고 이러한 만성 기관 부전을 예방 또는 치료하는데 있어서 변형된 FⅦ의 사용에 관련된다.

도 1은E. coli패혈증에서 조직 인자 (TF) 발현을 나타낸다. 웨스턴 블롯 (A)은 FⅦai로의 치료에 의해 예방된 정상 개코원숭이 폐에 비하여 증가된, 패혈증 대조군 동물의 폐에서의 TF 발현을 나타낸다. TFPI로 치료된 두 동물 중 하나는 TF 발현에서의 변화가 없었다. 대표적인 블롯이 나타난다. (B) 패혈증 대조군 및 FⅦai 처리군 상에 광학밀도계측을 수행하고 비-패혈성 정상 대조군 동물의 평균에 대해 표준화하였다. 두 실험군에서 N=6이고 정상 대조군에 있어서 n=3이다. 나타난 데이터는 평균 ± 표준편차이다 (* p < 0.05 vs. 정상 대조군, δ p < 0.05 vs. 패혈증 대조군).

도 2는 패혈증-유발성 폐 손상이 FⅦai에 의해 예방된 것을 나타낸다. 데이터는 t=12인 시간으로부터의 변화로서 나타나 약물 효과를 나타낸다. 그래프는 또한 TFPI로 처리된 두 동물로부터의 데이터 및 본 실험실 유래 패혈증 동물로부터의 누적 데이터를 나타낸다. -●-는 패혈증 대조군 (n=6)이고, -○-는 패혈증 + FⅦai (n=6)이고, …은 누적 패혈증 대조군 (n=11)이고, --은 패혈증 + TFPI (n=2)이다. 데이터는 ±표준편차로서 나타내고 2 인자 ANOVA를 이용하여 분석하였다 (* p< 0.05). FⅦai는 (A) 증가된 동맥-폐포 산소 구배 (AaDO₂, p< 0.0001), (B) 폐 시스템 탄성에서의 쇠퇴 (Cs, p< 0.001), 및 (C) 평균 폐 동맥 압력에서의 증가 (PAM, p< 0.001), 및 (D) 폐 혈관 저항성 (PVR, p < 0.05)을 막는다.

도 3은 FⅦai 처리가 폐 염증을 감소시킨 것을 나타낸다. 폐 MPO 활성 및 BAL LDH는 패혈증 대조군에 비하여 처리 동물군에서 감소되었다 (φ p=0.07 및 * p < 0.01). 두 군 사이에서 BAL 단백질에서의 차이점은 없었다. 데이터는 평균±표준편차로서 나타내고 t-시험을 이용하여 분석하였다.

도 4는 패혈증-유발성 손상의 신장 및 대사물질 지수가 FⅦai 처리 동물군ㄴ에서 개선되었다는 것을 나타낸다. (A) 혈청 [HC0₃]은 FⅦai 처리된 패혈증 동물군에서 더 높았다 (p < 0.01). (B) 혈청 크레아티닌은 패혈증 대조군에서 증가하였으나 FⅦai로 처리된 패혈증 군에서는 그렇지 않았다 (p= 0.059). (C) 및 (D)는 두 집단에서 유사한 체액 밸런스 (정맥내 체액 빼기 요소 방출량)를 나타내지만 FⅦai로 처리된 동물군에서 패혈증 도중 더 높은 요소 방출량을 나타낸다 (p < 0.0001). 데이터는 ±표준편차로서 나타내고 2 인자 ANOVA를 이용하여 분석하였다. -●-는 패혈증 대조군이고 (n=6), -○-은 패혈증 + FⅦai이다 (n=6).

도 5는 FⅦai가 패혈증-유발성 응고병증을 감약하는 것을 나타낸다. (A) 패혈증은 FⅦai로 처리된 동물에서, p < 0.01로 감소된 PTT의 진행성 연장을 야기하였다. 피브리노겐 고갈 (B) 및 TAT 복합체에서의 상승 (C)은 치료군에서 감약되었다 (둘 모두 p < 0.0001). ATIII 활성 (D)은 키트 표준의 %로서 두 집단 모두에서 쇠퇴한 것을 나타나지만 차이점은 통계적으로 유의한 것에 도달하지는 않는다. 데이터는 ±표준편차로서 나타내고 2 인자 ANOVA를 이용하여 분석하였다. -●-는 패혈증 대조군이고 (n=6),-○-는 패혈증 + FⅦai이다(n=6).

도 6은 패혈증에서 염증 사이토카인이 FⅦai에 의해 감약된 것을 나타낸다. 데이터는 ±표준편차로서 나타내고 2 인자 ANOVA를 이용하여 분석하였다. -●-는 패혈증 대조군이고 (n=6), -○-는 패혈증 + FⅦai이다 (n=6). IL-6 (A), IL-8 (B), 및 TNFR-1 (D) 수준에서의 패혈증-유발성 증가는 모두 FⅦai로의 치료에 의해 감약되었다 (모두에 있어서 p < 0.01). IL-1β 수준 (C)은 TF 차단에 의해 변화하지 않았다.

약어

AaD02 동맥-폐포 산소 구배

APTT 활성화된 일부 트롬보플라스틴 시간

ALI 급성 폐 손상

APC 활성화 단백질 C

ARDS 급성 호흡 곤란 증후군

ASIS FFR-rFⅦa

BAL 기관지폐포 세척

BUN 혈액 유레아 질소

BW 체중

CO 심장 방출량, L/분

Cs 폐 시스템 탄성에서의 쇠퇴

D02 산소 송달, L/분

DVT 깊은 정맥 혈전증

F1-2 피브리노겐 단편 1 & 2

Fi0₂흡입된 산소 분압

FFR D-페닐알라닐-L-페닐알라닐-L-아르기닐-트리펩티드

FFR-rFⅦa FFR-비활성화, rFⅦa

FPA 피브리노펩티드 A

FⅦ 인간 응고 인자 Ⅶ

FⅦa 인간 활성화 응고 인자 Ⅶ

IL-1β 인터류킨-1 베타

IL-6 인터류킨-6

IL-8 인터류킨-8

Kg 킬로그램

LPS 리포폴리사카리드

MW 분자량

NIH 미 국립 보건원

NOEL 관찰되는 효과 수준 없음

PAM 평균 폐 동맥 압력에서의 증가

Pa02 동맥혈의 산소 팽창력

PCWP 폐 모세혈관 쐐기압. mm Hg

PT 프로트롬빈 시간

PTCA 경피적 트랜스루미나 관상동맥 형성술

PVR 폐 혈관 내성

RBC 적혈구

rFⅦa 재조합 활성화 인간 인자 Ⅶ

SVR 전신적 혈관 내성, 다인 x cm x kg/10

TAT 트롬빈-항트롬빈 복합체

TF 조직 인자

TNFR-1 TNF 수용체-1

TFPI 조직 인자 경로 저해제

V02 산소 소비량, mL/분

㎍ 마이크로그램

용어 "기관 손상"은 신장, 폐, 부신, 간, 장, 심혈관계, 및/또는 지혈계에 있는 기관의 구조적 손상 및/또는 기능적 손상을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 기관 손상의 예는 형태학적/구조적 손상 및/또는 예를 들어, 폐 청소 감손으로 인한 단백질 (예를 들어 계면활성제) 또는 체액의 축적 또는 폐 변화 기작에서의 손상 또는 폐포-모세혈관 막 손상과 같은 기관의 기능에 있어서의 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "기관 손상" 및 "기관 부전"은 호환적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 기관 손상은 기관 부전을 일으킨다. 기관 부전은 ALI 또는 ARDS를 갖지 않은 사람에서 상응하는 기관의 평균적인, 정상 기능에 비하여 기관 기능에서의 감소를 의미한다. 기관 부전은 기능에 있어서 적은 감소일 수도 있고 (예를 들어, 정상의 80-90%) 또는 기능에 있어서 큰 감소일 수도 있고 (예를 드어, 정상의 10-20%); 감소는 또한 기관 기능의 완전한 부전일 수도 있다. 기관 부전은 예를 들어, 조직 괴사, 사구체 (신장)의 손실, 피브린 침전, 출혈, 부종 또는 염증으로 인한, 감소된 생물학적 기능 (예를 들어, 소변 배출량)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기관 손상은 조직 괴사, 사구체 (신장)의 손실, 피브린 침전, 출혈, 부종 또는 염증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "폐 손상"은 예를 들어, 자가면역 상태의 발병, 이식 후 폐 거부현상, 염증 반응을 일으키는 주사, 폐 내의 압력/부피 관계에서의 변화, 외래 작용인자 (예를 들어, 담배연기 또는 먼지) 또는 유독 또는 독성 작용인자 (예를 들어, 용제 또는 연기)에 상기 포유동물의 노출로 인한 것이거나 또는 치료제로의 노출로부터 야기된 원치않는 부작용과 같은 선천적 비정상 또는 후천성 비정상을 인한 폐 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폐 손상의 예는 예는 형태학적/구조적 손상 및/또는 예를 들어, 폐 청소 감손으로 인한 단백질 (예를 들어 계면활성제) 또는 체액의 축적 또는 폐 변화 기작에서의 손상 또는 폐포-모세혈관 막 손상과 같은 기관의 기능에 있어서의 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "기관 손상" 및 "기관 부전"은 호환적으로 사용될 수 있다.

폐 기능 및 능률을 시험하는 방법, 및 이러한 시험에 적합한 생화학적 또는 임상적 파라미터는 숙련된 임상의에게 주지된다.

기관 기능의 이러한 마커, 또는 생화학적 파라미터는 예를 들어,

호흡: Pa02/Fi02 비율

응고 : 혈소판

간: 빌리루빈

심혈관: 혈압 및 승압제 치료의 필요성

신장 : 크레아티닌 및 소변 방출량이다.

다른 임상적 평가는 무 환기설비 일수, 무 기관 부전 일수, 무 승압제 치료 일수, SOFA 스코어 및 폐 손상 스코어 평가는 물론이고 바이탈 사인을 포함할 수 있다.

응고병증 또는 염증의 시험 방법은 숙련된 임상의에게 주지된다. 이러한 응고 또는 염증 상태의 마커는 예를 들어, PTT, 피브리노겐 침전, TAT 복합체, ATIII 활성, IL-6, IL-8, 및 TNFR-1의 증가이다.

용어 "만성 기관 손상"은 ALI 또는 ARDS에 걸림으로 인해 일어날 수 있는 장기간 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 폐 기구의, 이러한 잔류 손상은 경미한 제한, 폐색, 일산화탄소에 대한 분산 능력의 감손, 또는 운동을 갖는 가스-교환의 비정상, 지속성 저산소혈증을 동반한 섬유형성 폐포염, 증가된 폐포 사멸 공간, 및 폐포 또는 폐 탄성에 있어서 더 나아간 감소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폐-모세혈관계의 폐색으로 인한 폐 고혈압이 심각할 수 있고 우심실 부전을 일으킬 수 있다.

본문에서, 용어 "치료"는 확립된 ALI의 치료, 확립된 ARDS의 치료는 물론이고, 확립된 ALI가 ARDS로 발전하는 것을 막는 것도 포함한다. 치료는 변형된 FⅦ 투여시 ALI 또는 ARDS와 연관된 증상 또는 상태의 감약, 제거, 최소화, 완화 또는 개선을 포함하는데, 이것은 이미 어느 정도의 기관 부전 및/또는 손상을 가진 기관에서 그 이상의 손상 및/또는 부전 예방 뿐만 아니라, 기관 부전 및/또는 손상을 갖지 않는 추가적인 기관의 손상 및/또는 부전의 발생 예방을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 증상 또는 상태의 예는 형태학적/구조적 손상 및/또는 폐, 신장, 부신, 간, 장, 심혈관계, 및/또는 지혈계 등과 같은 기관의 기능 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 증상 또는 상태의 예는 형태학적/구조적 손상 및/또는, 예를 들어 폐 청소 감손으로 인한 단백질 (예를 들어 계면활성제) 또는 체액의 축적과 같은 기관 기능에서의 손상 또는 폐 교환 기작에서의 손상 또는 폐포-모세혈관막에서의 손상, 감소된 소변 배출량 (신장), 조직 괴사, 사구체의 손실 (신장), 피브린 침전, 출혈, 부종 또는 염증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

기관 부전 또는 손상의 "감약"은 기관 기능에 있어서 상기 기관 기능의 적어도 하나의 주지된 마커로 측정하였을 때 개선된 것을 의미하고; 기관 부전 또는 손상이 감약되면 선택된 마커의 수치는 ALI 또는 ARDS를 갖지 않은 인간에서 발견되는 수치에 비교할 때 정상화된다.

"확립된" ALI 또는 ARDS는 환자가 상기-언급된 4-점 폐-손상 채점 시스템에 따라 ALI 또는 ARDS를 가지거나 (Bernard et al.,Am. J. Respir. Crit. Care Med149: 818-24,1994), 또는 ALI 또는 ARDS와 연관된 증상 또는 상태가 환자에서 관찰되는 것을 의미한다.

급성 폐 손상 (ALI)은 위 내용물의 흡출, 폐렴, 패혈증, 다량의 수혈, 다중 외상 및 췌장염 등과 같은 다수의 폐 손상 인자에 노출된 후 발생할 수 있다. 더 적은 수의 환자에서는 약 40-50% 사망률의 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이라 지칭되는, 더욱 심한 폐 손상이 발생한다. ARDS는 위 내용물의 흡출, 폐렴, 패혈증, 다량의 수혈, 다중 외상 및 췌장염 등과 같은 다수의 폐 손상 인자에 노출된 후 발생할 수 있다.

본문에서, 용어 "변형된 인자 Ⅶ"는 "부위-비활성화 인자 Ⅶa", "활성 부위-비활성화 인자 Ⅶa", 또는 "FⅦai"와 호환적으로 사용된다. 변형된 인자 Ⅶ, 또는 FⅦai는, 효소원의 형태 (즉, 단일-사슬 분자)일 수도 있고 또는 그것의 활성화 부위에서 절단될 수도 있다. 따라서, "변형된 인자 Ⅶ"는 조직 인자에 결합하고 인자 IX가 IXa로 그리고 인자 X이 Xa로 활성화하는 것을 저해하는 변형된 인자 Ⅶ 및 변형된 인자 Ⅶa를 포함하는 것을 의미한다. 인간 FⅦa는 예를 들어, 미국 특허No. 4,784,950 (야생형 인자 Ⅶ)에 개시된다. 인자 Ⅶ 서열은 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는데, 여기에서 변형은 혈장 인자 X 또는 IX의 활성을 촉매작용하는 활성화 인자 Ⅶ의 능력을 실질적으로 감소하도록 선택되므로, 응고 활성을 저해할 수 있다. 변형된 인자 Ⅶ은 적어도 하나의 아미노산 치환에 의해 변형된 활성 부위를 가지며 그것의 변형된 형태로 조직 인자와 결합할 수 있다. 변형된 인자 Ⅶ 조성물은 전형적으로 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.

인간 및 소 인자 Ⅶ의 바람직한 구체예에서, 활성 부위 잔기 Ser₃₄₄가 변형되어, Gly, Met, Thr으로, 또는 더욱 바람직하게는, Ala으로 교체된다. 이러한 치환은 촉매 3잔기에 있는 다른 부위에서의 치환과 독립적으로 또는 이와 조합으로 수행될 수 있는데, 이 부위는 His₁₉₃및 Asp₂₄₂를 포함한다.

변형된 인자 Ⅶ은 비타민 K-의존성 혈장 단밸질의 프레-프로 펩티드 및 gla 도메인, 및 gla 도메인이 없는 인자 Ⅶ을 각각 암호화하는 두개의 작동가능하게 연결된 서열 코딩 구역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화될 수 있는데, 여기에서 발현에 있어 상기 폴리뉴클레오티드는 혈장 인자 X 또는 IX를 유의하게 활성화시키지 않고 조직 인자에 결합할 수 있는 변형된 인자 Ⅶ 분자를 암호화한다. 이 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 변형된 인자 Ⅶ 분자는 생물학적으로 활성인 항응고제로서, 응고 카스케이드를 저해하여 피브린 침전 또는 응혈을 저해할 수 있다. 변형된 인자 Ⅶ을 발현하기 위해 폴리뉴클레오티드 분자는 예를 들어, BHK, BHK 570 또는 293 세포주와 같은 포유동물 세포주 내로 트랜스펙션된다.

인자 Ⅶa의 촉매 활성은 촉매 중심, 또는 촉매 3잔기의 화학적 유도체화에 의해 저해될 수 있다. 유도체화는 예를 들어, 유기인 화합물, 설포닐 플루오라이드, 펩티드 할로메틸 케톤 또는 아자펩티드와 같은 비가역성 저해제와 인자 Ⅶ을 반응시킴으로써 또는 아실화에 의해 성취될 수 있다. 바람직한 펩티드 할로메틸 케톤은 PPACK (D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤; (참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 No. 4,318,904 참조), D-Phe-Phe-Arg 및 Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 (FFR-cmk); 및 DEGRck (댄실-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤)을 포함한다.

인자 Ⅶa의 촉매 활성은 또한 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 저해될 수 있다. 바람직한 구체예에서 아미노산 치환은, 여기에서는 인자 Ⅶa 촉매 부위에 기여하는 아미노산을 함유한 구역으로서 정의되는, 인자 Ⅶ 촉매 3잔기의 아미노산 서열에서 행해진다. 촉매 3잔기에서의 치환, 삽입 또는 결실은 일반적으로 촉매 부위를 형성하는 아미노산에 있거나 또는 이에 인접하여 존재한다. 인간 및 소 인자 Ⅶ 단백질에서, "세작용기" 촉매를 형성하는 아미노산은 Ser₃₄₄, Asp₂₄₂, 및 His₁₉₃이다 (아래첨자된 숫자는 서열 내에서의 위치를 가리킨다). 다른 포유동물 종 유래의 인자 Ⅶ에 있는 촉매 부위는 다른 것들 중에서도, 단백질 분리 및 아미노산 서열 분석을 포함하는 현재 이용가능한 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 촉매 부위는 또한 서열을 다른 세린 프로테아제, 특히 그 활성 부위가 종래에 결정된 (Sigler et al.,J. Mol. Biol.,35: 143-164 (1968), 참고문헌으로서 여기 포함) 키모트립신의 서열과 정렬시켜, 그로부터 상기 정렬 유래의 유사 활성 부위 잔기를결정함으로써 측정될 수 있다.

아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 인자 Ⅶa에 의한 인자 X 및/또는 IX의 활성화를 저지 또는 그렇지 않으면 저해하도록 수행된다. 이것은 예를 들어, 지질막에 포매된 TF 및 인자 X를 포함하는 시스템에서 인자 Ⅶa의 인자 Xa 생산력을 측정함으로써 (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997); 또는 수성 시스템에서 인자 X 가수분해를 측정함으로써 (하기 "시험관내 단백질가수분해 검정" 참조) 손쉽게 결정될 수 있다. 그러나, 이렇게 변형된 인자 Ⅶ는 또한 응고 카스케이드에서 조직 인자와의 결합에 있어서 진정한 인자 Ⅶ 및/또는 인자 Ⅶa와 경쟁하는 능력을 보유한다. 이러한 경쟁은 예를 들어, 여기에서 설명된 것과 같은 응혈 검정 (예를 들어, 미국 특허 5,997,864), 또는 예를 들어, 인간 방광암 세포주 J82와 같은, 세포-표면 조직 인자를 갖는 세포주를 이용한 경쟁 결합 검정 (참고문헌으로서 여기 포함된, Sakai et al. J. Biol. Chem. 264: 9980-9988 (1989) 참조)과 같은 수단에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명에 기초한 기구를 이용하여 TF에 대한 그것의 결합력 측정에 의해 (예를 들어, Persson, FEBS Letts. 413: 359-363,1997) 손쉽게 결정될 수 있다.

인간 및 소 인자 Ⅶ에 있는 Ser₃₄₄, Asp₂₄₂, 및 His₁₉₃과 같은, 인자 Ⅶ에서 촉매 부위를 형성하는 아미노산은 치환되거나 아니면 결실될 수 있다. 본 발명 내에서, 하나의 아미노산만을 변화시켜, 분자의 항원성 증가 가능성을 최소화하고 그것의 조직 인자 결합력을 저해하는 것이 바람직하지만, 둘 이상의 아미노산이 변화(치환, 삽입 또는 결실)될 수 있고 치환(군), 삽입(군) 및 결실(군)의 조합 또한 행해질 수 있다. 인간 및 소 인자 Ⅶ에 대한 바람직한 구체예에서, Ser₃₄₄는 Ala으로 치환되는 것이 바람직하지만, Gly, Met, Thr 또는 다른 아미노산이 치환될 수 있다. Asp을 Glu으로 교체하고 His을 Lys 또는 Arg으로 교체하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 치환은 단백질의 4차구조를 가능한 한 적게 붕괴시키도록 선택된다. Dayhoff 등의 모델 (Atlas of Protein Structure 1978,Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D. C., 참고문헌으로서 여기 포함)은 다른 아미노산 치환을 선택하는데 있어서 지침서로서 이용될 수 있다. 인간, 소 또는 다른 종의 적절한 인자 Ⅶ 서열의 촉매 부위에 상기 설명된 것과 같이 잔기 변경을 도입할 수 있고 결과 단백질은 여기에서 설명된 것과 같이 촉매 활성의 저해 및 결과적 항응고 활성의 원하는 수준에 대하여 시험할 수 있다. 변형된 인자 Ⅶ에 있어서 촉매 활성은 일반적으로는 (예를 들어, 하기 "시험관내 단백질가수분해 검정"에서 측정된 것과 같이) 해당 종의 야생형 인자 Ⅶ 촉매 활성의 약 5% 미만, 더욱 바람직하게는 약 1% 미만으로, 실질적으로 저해될 것이다.

변형된 인자 Ⅶ은 재조합 DNA 기술의 이용을 통해 생산될 수 있다. 일반적으로, 클로닝된 야생형 인자 Ⅶ DNA 서열은 원하는 단백질을 암호화하도록 변형된다. 이 변형된 서열은 그 다음 발현 벡터 내로 삽입되는데, 이 벡터는 이후 숙주 세포 내로 트랜스포메이션 또는 트랜스펙션된다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유동물 세포가 숙주 세포로서 바람직하다. 인간 인자 Ⅶ에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 공지된다. 참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 No. 4,784,950를 참조하면, 재조합 인간 인자 Ⅶ의 클로닝 및 발현이 설명된다. 소 인자 Ⅶ 서열은 참고문헌으로서 여기 포함된 Takeya et al.,J. Biol. Chem.263: 14868-14872 (1988)에 설명된다.

아미노산 서열 변경은 다양한 기술에 의해 성취될 수 있다. DNA 서열의 변형은 부위-특이적 돌연변이유발에 의한 것일 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발에 대한 기술은 업계에 주지되며 예를 들어, Zoller 및 Smith (DNA 3: 479-488, 1984)에 의해 설명된다. 따라서, 인자 Ⅶ의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하여 선택의 변경(군)을 도입할 수 있다.

그에 따라 변형된 인자 Ⅶ은 비타민 K-의존성 혈장 단백질인 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S 또는 단백질 Z 중 하나의 gla 도메인으로 치환된 아미노-말단 부분 (gla 도메인)을 갖는 단백질을 포함한다. 비타민 K-의존성 혈장 단백질의 gla 도메인은 감마-카르복시 글루탐산 잔기의 존재에 의해 특성결정되며 일반적으로 각 유전자에서 엑손-인트론 경계의 부분에 해당하는 C-말단을 갖는, 길이로 약 30 내지 약 40 아미노산이다. 이종 gla 도메인을 갖는 인자 Ⅶ의 제조 방법은 참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 No. 4,784,950에 개시된다.

변형된 인자 Ⅶ 제조에서의 사용을 위한 DNA 서열은 전형적으로 인자 Ⅶ 단백질의 아미노-말단에서 프레-프로 펩티드를 암호화하여 알맞은 후번역 프로세싱 (예를 들어, 글루탐산 잔기의 감마-카르복시화) 및 숙주 세포로부터의 분비를 획득할 것이다. 프레-프로 펩티드는 인자 Ⅶ 또는 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S와 같은, 비타민 K-의존성 혈장 단백질의 것일 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 변형된 인자 Ⅶ의 아미노산 서열에서 추가의 변형이 수행될 수 있는데, 이들 변형은 항응고제로서 작용하는 단백질의 능력을 유의하게 손상시키지는 않는다. 예를 들어, 촉매 3잔기에서 변형된 인자 Ⅶ은, 참고문헌으로서 여기 포함된 미국 특허 5,288,629에 일반적으로 설명된 것과 같이, 효소원인 인자 Ⅶ가 그것의 활성화된 2-사슬 형태로 전환하는 것을 저해하도록 활성화 절단 부위에서도 또한 변형될 수 있다.

변형된 인자 Ⅶ은 항인자 Ⅶ 항체 컬럼 상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 참고문헌으로서 여기 포함된 Wakabayashi et al.,J. Biol. Chem.261: 11097-11108, (1986) 및 Thim et al.,Biochem.27: 7785-7793, (1988)에 설명된 것과 같은, 칼슘-의존성 단일클론 항체의 사용이 특히 바람직하다. 추가의 정제는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은, 기존의 화학적 정제 수단에 의해 성취될 수 있다. 바륨 시트레이트 침전법을 포함하는, 다른 정제 방법이 업계에 공지되며, 여기에 설명된 신규 변형된 인자 Ⅶ의 정제에 적용될 수 있다 (Scopes, R.,Protein Purification,Springer-Verlag, N. Y., 1982 참조). 약제학적 사용에 있어서 적어도 약 90 내지 95%의 균질성을 갖는 실질적으로 순수한 변형된 인자 Ⅶ가 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 일단 일부 또는 원하는 균질성만큼 정제되면, 변형된 인자 Ⅶ은 그 다음 치료적으로 사용될 수 있다.

변형된 인자 Ⅶ은 그것의 활성화 부위에서 절단되어 2-사슬 형태로 전환된다. 활성화는 참고문헌으로서 여기 포함된 Osterud, et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, U. S. Patent No. 4,456,591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); 또는 Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42 (1983)에 개시된 것과 같이, 업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 결과적 분자는 하기 설명된 것과 같이 조제되어 투여된다.

투여 및 투약량 :

폐 부전의 치료를 위한 약제학적 조성물은 장관외 투여로 의도된다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 장관외, 즉 정맥내, 피하, 근육내 또는 폐로 투여된다. 장관외 투여를 위한 조성물은 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 변형된 인자 Ⅶ 분자의 용액을 포함한다. 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다 (예를 들어, 물, 완충액, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등). 변형된 인자 Ⅶ 분자는 또한 손상 부위로의 송달 또는 표적화를 위하여 리포솜 제제 내로 조제될 수 있다. 리포솜 제제는 일반적으로, 예를 들어 참고문헌으로서 여기 포함된 U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728, 및 U.S. 4,975,282에 설명된다. 조성물은 기존의, 주지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 결과 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조되는데, 동결건조 제제는 투여에 앞서 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은, pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은, 적절한 생리학적 조건에 요구되는 약제학적으로 허용되는 부형제 물질을 함유할 수 있다 (예를 들어, 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등). 이들 조제물에서 변형된 인자 Ⅶ의 농도는 질량으로 약 0.5% 미만부터, 일반적으로또는 적어도 약 1% 내지 15 또는 20%만큼 광범위하게 변화할 수 있고 선택된 특정 투여 방식에 따라, 유체 부피, 점도 등에 의하여 1차적으로 선택될 것이다.

따라서, 정맥내 주입을 위한 전형적인 약제학적 조성물은 250 ml의 멸균 Ringer 용액, 및 10 mg의 변형된 인자 Ⅶ를 함유하도록 제조될 수 있다. 장관외로 투여할 수 있는 화합물의 실제 제조 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이고 더 자세하게는 예를 들어, 참고문헌으로서 여기 포함된Remington's Pharmaceu-tical Science,16판, Mack Publishing Company, Easton, PA (1982)에 설명된다.

변형된 인자 Ⅶ 분자를 함유한 조성물은 상기 설명된 것과 같이 이미 병에 걸린 환자에게, 병 및 그것의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 일부 억류하기에 충분한 양으로 투여된다. 이것을 성취하기에 충분한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 본 사용에 효과적인 양은 질병의 심각성 및 환자의 체중 및 일반 상태에 의존할 것이지만, 일반적으로는 70 kg 환자에 있어서 부하 및 유지 용량으로서 약 0.05 mg 내지 500 mg/일이고, 더욱 전형적으로는 예를 들어, 1 mg 내지 약 150 mg/일, 1 mg 내지 약 125 mg/일, 1 mg 내지 약 100 mg/일, 10 mg 내지 약 175 mg/일, 10 mg 내지 약 150 mg/일, or 10 mg 내지 약 125 mg/일과 같은 1 mg to 200 mg/일의 범위이다.

본 발명의 재료는 일반적으로 심각한 질병 또는 손상 상태, 다시 말해 생명을 위협하거나 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용될 수 있다는 것을 명심해야 한다. 이러한 경우, 외래 기질의 최소화 및 인간에서 변형된 인간 인자 Ⅶ의 면역원성의 일반적인 부족 측면에서, 이들 변형된 인자 Ⅶ 조성물의 실질적인과량을 투여하는 것이 가능하며 담당의사에 의해 바람직한 것으로 여겨질 수 있다.

약물은 단일 또는 다중 투여 경로로 투여될 수 있다. 1일 유지 수준을 필요로 하는 환자에 있어서, 변형된 인자 Ⅶ은 예를 들어, 이동식 펌프 시스템을 이용한 반복된 정맥 주사 또는 연속적인 주입에 의해 투여될 수 있다. ARDS의 치료에서 변형된 FⅦa의 투여 패턴은, 예를 들어 부하 용량으로서 약 1 mg/kg의 용량 후 유지 용량으로서 0.05 mg/kg/시 이다 (mg/kg은 환자의 체중 kg 당 변형된 인자 Ⅶ mg를 나타낸다). 또다른 패턴은, 예를 들어, 1일 당(24시간) 1회 이상의 변형된 FⅦ 용량을 투여하는 것이다 (예를 들어, 100 ㎍/kg x 1, 100 ㎍/kg x 2, 100 ㎍/kg x 4, 200 ㎍/kg x 1, 200 ㎍/kg x 2, 200 ㎍/kg x 4, 400 ㎍/kg x 1, 400 ㎍/kg x 2, 400 ㎍/kg x 4, 800 ㎍/kg x 1, 또는 800 ㎍/kg x 2). 이 투약은 1일 이상 투여될 수 있다 (예를 들어, (1일당 100 ㎍/kg x 1) x 2 일, (100 ㎍/kg x 2) x 2 일, (100 ㎍/kg x 4) x 2 일, (200 ㎍/kg x 1) x 2 일, (200 ㎍/kg x 2) x 2 일, (200 ㎍/kg x 4) x 2 일, (400 ㎍/kg x 1) x 2 일, (400 ㎍/kg x 2) x 2 일, (400 ㎍/kg x 4) x 2 일, (800 ㎍/kg x 1) x 2 일, 또는 (800 ㎍/kg x 2) x 2 일). 약물은 정맥내 주사로서 투여되는 것이 바람직하다.

변형된 FⅦ 또는 다른 TF 길항제 (예를 들어, 항-TF 항체)는 또한 활성화 단백질 C (APC) 또는 APC의 생물학적 활성을 보유한 그것의 단편 또는 변체와 조합으로 투여될 수 있다. 이 경우에서, 변형된 FⅦ 또는 TF 길항제의 첫번째 양 및 APC 또는 그것의 생물학적 활성 변체 또는 단변의 두번째 양이 투여되는데, 여기에서 첫번째 및 두번째 양은 함께 ALI 또는 ARDS의 치료에서 유효하다.

조성물은 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제 및 APC 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제 모두를 적당한 농도로 포함하는 단일 제제 형태 (단일-투약량 형태)일 수 있다. 조성물은 또한 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제를 포함하는 제 1 단위 투약량 형태 및 APC 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제를 포함하는 제 2 단위 투약량 형태로 구성된 부분 키트 (kit-of-parts)의 형태로 존재할 수 있다. 둘 중 어느 성분이 처음으로 투여되어도 무방하다. 제 1 또는 제 2 또는 제 3 등의 단위 용량이 본 명세서를 통해 언급될 때마다 이것은 투여의 바람직한 순서를 가리키는 것이 아니고, 단지 편의상 정한 것이다. 두 생성물이 동일한 정맥내 주입을 통해 주사되는 것이 바람직하다. 키트는 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷과 같은, 분리된 조성물을 담기 위한 용기 수단을 포함한다. 전형적으로 키트는 분리된 성분의 투여를 위한 설명서를 포함한다. 키트 형태는 분리된 성분이 상이한 투약 형태로 투여되거나, 상이한 투약 간격으로 투여되거나, 또는 조성물 각 성분의 적정농도가 처방의에 의해 요구될 때 특히 유리하다.

본 발명에 따라 투여되는 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제의 양 및 APC 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체의 양은 약 1: 100 내지 약 100: 1 (w/w)의 비율로 변할 수 있다. 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제와, APC 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체의 비율은 예를 들어, 약 1: 100, 또는 1: 90, 또는 1: 80, 또는 1: 70 또는 1: 60, 또는 1: 50, 또는 1 : 40, 또는 1 : 30, 또는 1 : 20, 또는 1 : 10, 또는 1 : 5, 또는 1 : 2, 또는 1 : 1, 또는 2 : 1, 또는 5 : 1,또는 10 : 1, 또는 20 : 1, 또는 30 : 1, 또는 40 : 1, 또는 50 : 1, 또는 60 : 1, 또는 70 : 1, 또는 80 : 1, 또는 90 : 1, 또는 100: 1; 또는 약 1: 90 내지 약 1: 1, 또는 약 1: 80 내지 약 1: 2, 또는 약 1: 70 내지 약 1: 5, 또는 약 1: 60 내지 약 1: 10, 또는 약 1: 50 내지 약 1: 25, 또는 약 1: 40 내지 약 1: 30, 또는 약 90: 1 내지 약 1: 1, 또는 약 80: 1 내지 약 2: 1, 또는 약 70: 1 내지 약 5: 1, 또는 약 60: 1 내지 약 10: 1, 또는 약 50: 1 내지 약 25: 1, 또는 약 40: 1 내지 약 30: 1; 또는 약 10: 1 내지 약 1: 10, 또는 약 5: 1 내지 약 1: 5가 될 수 있다.

변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 (예를 들어, 항-TF 항체)는 또한 TFPI 또는 TFPI의 생물학적 활성을 보유한 그것의 단편 또는 변체와 조합으로 투여될 수 있다. 이 경우에서, 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제의 첫번째 양 및 TFPI 또는 그것의 생물학적 활성 변체 또는 단편의 두번째 양이 투여되는데, 여기에서 첫번째 및 두번째 양은 함께 ALI 또는 ARDS의 치료에서 유효하다.

조성물은 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제 및 TFPI 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제 모두를 적당한 농도로 포함하는 단일 제제 형태 (단일-투약량 형태)일 수 있다. 조성물은 또한 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제를 포함하는 제 1 단위 투약량 형태 및 TFPI 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제를 포함하는 제 2 단위 투약량 형태로 구성된 부분 키트의 형태로 존재할 수 있다. 둘 중 어느 성분이 처음으로 투여되어도 무방하다. 제 1 또는 제 2 또는 제 3 등의 단위 용량이 본 명세서를 통해 언급될 때마다 이것은 투여의바람직한 순서를 가리키는 것이 아니고, 단지 편의상 정한 것이다. 두 생성물이 동일한 정맥내 주입을 통해 주사되는 것이 바람직하다. 키트는 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷과 같은, 분리된 조성물을 담기 위한 용기 수단을 포함한다. 전형적으로 키트는 분리된 성분의 투여를 위한 설명서를 포함한다. 키트 형태는 분리된 성분이 상이한 투약 형태로 투여되거나, 상이한 투약 간격으로 투여되거나, 또는 조성물 각 성분의 적정농도가 처방의에 의해 요구될 때 특히 유리하다.

본 발명에 따라 투여되는 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제의 양 및 TFPI 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체의 양은 약 1: 100 내지 약 100: 1 (w/w)의 비율로 변할 수 있다. 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제와, TFPI 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체의 비율은 예를 들어, 약 1: 100, 또는 1: 90, 또는 1: 80, 또는 1: 70 또는 1: 60, 또는 1: 50, 또는 1 : 40, 또는 1 : 30, 또는 1 : 20, 또는 1 : 10, 또는 1 : 5, 또는 1 : 2, 또는 1 : 1, 또는 2 : 1, 또는 5 : 1, 또는 10 : 1, 또는 20 : 1, 또는 30 : 1, 또는 40 : 1, 또는 50 : 1, 또는 60 : 1, 또는 70 : 1, 또는 80 : 1, 또는 90 : 1, 또는 100: 1; 또는 약 1: 90 내지 약 1: 1, 또는 약 1: 80 내지 약 1: 2, 또는 약 1: 70 내지 약 1: 5, 또는 약 1: 60 내지 약 1: 10, 또는 약 1: 50 내지 약 1: 25, 또는 약 1: 40 내지 약 1: 30, 또는 약 90: 1 내지 약 1: 1, 또는 약 80: 1 내지 약 2: 1, 또는 약 70: 1 내지 약 5: 1, 또는 약 60: 1 내지 약 10: 1, 또는 약 50: 1 내지 약 25: 1, 또는 약 40: 1 내지 약 30: 1; 또는 약 10: 1 내지 약 1: 10, 또는 약 5: 1 내지 약 1: 5가 될 수 있다.

변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 (예를 들어, 항-TF 항체)는 또한 예를 들어, 인슐린과 같이, 바람직하게는 환자 혈장 데시리터당 혈당을 110 mg 이하로 유지할 수 있는 혈당 저하제와 조합될 수 있다. 이 경우에서, 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제의 첫번째 양 및 인슐린과 같은 혈당-저하제 또는 그것의 생물학적 활성 변체 또는 단편의 두번째 양이 투여되는데, 여기에서 첫번째 및 두번째 양은 함께 ALI 또는 ARDS의 치료에서 유효하다.

조성물은 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제 및 인슐린과 같은 혈당-저하제 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제 모두를 적당한 농도로 포함하는 단일 제제 형태 (단일-투약량 형태)일 수 있다. 조성물은 또한 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제 제제를 포함하는 제 1 단위 투약량 형태 및 인슐린과 같은 혈당-저하제 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체 제제를 포함하는 제 2 단위 투약량 형태로 구성된 부분 키트의 형태로 존재할 수 있다. 둘 중 어느 성분이 처음으로 투여되어도 무방하다. 제 1 또는 제 2 또는 제 3 등의 단위 용량이 본 명세서를 통해 언급될 때마다 이것은 투여의 바람직한 순서를 가리키는 것이 아니고, 단지 편의상 정한 것이다. 두 생성물이 동일한 정맥내 주입을 통해 주사되는 것이 바람직하다. 키트는 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷과 같은, 분리된 조성물을 담기 위한 용기 수단을 포함한다. 전형적으로 키트는 분리된 성분의 투여를 위한 설명서를 포함한다. 키트 형태는 분리된 성분이 상이한 투약 형태로 투여되거나, 상이한 투약 간격으로 투여되거나, 또는 조성물 각 성분의 적정농도가 처방의에 의해 요구될 때 특히 유리하다.

본 발명에 따라 투여되는 변형된 FⅦ 또는 또다른 TF 길항제의 양 및 인슐린과 같은 혈당-저하제 또는 그것의 생물학적 활성 단편 또는 변체의 양은 약 1: 100 내지 약 100: 1 (w/w)의 비율로 변할 수 있다. 따라서, 인자 Ⅶ 대 혈당 저하제의 비율은 예를 들어 약 1: 100, 또는 1: 90, 또는 1: 80, 또는 1: 70 또는 1: 60, 또는 1: 50, 또는 1: 40, 또는 1: 30, 또는 1: 20, 또는 1: 10, 또는 1: 5, 또는 1: 2, 또는 1: 1, 또는 2: 1, 또는 5: 1, 또는 10: 1, 또는 20: 1, 또는 30.1, 또는 40: 1, 또는 50: 1, 또는 60: 1, 또는 70: 1, 또는 80: 1, 또는 90: 1, 또는 100: 1; 또는 약 1: 90 내지 약 1: 1, 또는 약 1: 80 내지 약 1: 2, 또는 약 1: 70 내지 약 1: 5, 또는 약 1: 60 내지 약 1: 10, 또는 약 1: 50 내지 약 1: 25, 또는 약 1: 40 내지 약 1: 30, 또는 약 90: 1 내지 약 1: 1, 또는 약 80: 1 내지 약 2: 1, 또는 약 70: 1 내지 약 5: 1, 또는 약 60: 1 내지 약 10: 1, 또는 약 50: 1 내지 약 25: 1, 또는 약 40: 1 내지 약 30: 1; 또는 약 10: 1 내지 약 1: 10, 또는 약 5: 1 내지 약 1: 5가 될 수 있다.

실험의 설명 및 개코원숭이 모델:

패혈증-유발성 조직 인자 (TF) 발현은 폐에서의 응고를 활성화하며 전-응고 환경을 일으키는데, 이것은 피브린 침전을 일으키고 염증을 유발한다. TF-인자 Ⅶa (FⅦa) 복합체에서의 응고 개시를 막는 것은 피브린 침전을 차단하고 염증을 제어함으로써, 급성 폐 손상 (ALI) 및 패혈증에서의 다른 기관 손상을 제한한다. ALI의 개코원숭이 모델은 동물에 사멸된Escherichia coli(E. coli) (1 x 10⁹CFU/kg)를 접종하고, 치명적인 패혈증이 1x10¹⁰CFU/kg의 살아있는E. coli주입 12시간 후에 유발될 때 이용하였다. 치료군 내의 동물에 살아있는 박테리아의 주입 시 TF, 부위-비활성화 FⅦa (변형된 FⅦ)의 경쟁 저해제를 정맥내로 투여하고 또다른 36 시간동안 생리학적으로 모니터링하였다. FⅦai는 극적으로 가스 교환 및 폐 탄성을 보호하였고, 폐 부종 및 폐 고혈압을 예방했으며, 담체에 비해 신장 기능을 보존하고 (p < 0.01) 인터류킨-6와 같은 전신적 전-염증 사이토카인 반응을 감소시켰다 (p < 0.01). 패혈증-유발성 ALI에서 TF 차단의 보호적 효과는 조직 인자 경로 저해제 (TFPI)를 사용하여 확인하였다. 결과는 show TF-FⅦa 복합체가 패혈증성 영장류에서 전-염증 사이토카인 방출 및 피브린 침전의 선택적 자극을 통해 기관 손상을 일부 조절한다는 것을 나타낸다.

그람-음성 패혈증을 갖는 환자는 높은 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 다중 기관 부전 (MOF)의 발병률을 갖는다. 이들 환자의 폐는 피브린이 패혈증에서 ARDS의 발병에 기여한다는 증거가 정황적임에도 불구하고 폐포 및 세포간 구획에서 피브린 침전을 나타낸다. 파종 혈관내 응고 (DIC)를 예방함으로써 패혈증을 치료하도록 디자인된 전략은 쇼크 증상을 갖는 인간 및 비-인간 영장류에서의 사망률을 감소시키지만, 이들 연구는 유의한 잔류 사망률, 기관 특이정 분석의 부족, 및 ARDS와 유사한 급성 폐 손상 (ALI) 재생에 대한 동물 모델의 무력함에 의해 제한되었다. ARDS는 패혈증 환자에서 상당한 병적상태 및 사망률을 야기하기 때문에, 본 발명자들은 ARDS 및 MOF의 비-인간 영장류 모델을 이용하여 패혈증에서 폐 및 전신기관 손상에 대한 조직 인자 (TF) 개시 응고 및 피브린 침전의 기여를 연구하였다.

내독소 또는 박테리아가 순환에 들어오면, 외래 응고가 신속하게 활성화되고 전응고 환경이 혈관 공간에서 발생한다. 이것은 TF에 의존하며 내독소의 전응고 효과를 중재하는 염증 사이토카인의 증가와 연관된다. 이와 유사하게, 전응고 환경은 내독소 주입 후 또는 급성 폐 손상 (ALI) 실험 도중에 동물의 폐에서 그리고 ARDS를 가진 환자의 기관지폐포 세척 (BAL)에서 나타난다. 전신 순환에서와 같이, 폐에서의 전응고 활성은 TF 발현에 관련되고, 이것은 혈관외 염증 또한 외래 경로를 활성화시킨다는 것을 제시한다. 전응고 활성 및 폐 손상 간의 연관에도 불구하고, TF 및 다른 응고 인자에 대한 특정 병인학적 역할은 폐의 손상 반응에서 정의되지 않았다. TF와 마찬가지로, 활성화된 인자 Ⅶ (FⅦa) 및 X (FXa), 트롬빈, 및 피브린은 혈관 투과성, 염증 세포 이주, 및 폐에서의 계면활성제 기능장애를 변경할 수 있는 세포 신호전달에 특정 효과를 갖는다. 패혈증으로의 반응에서 응고와 염증 사이의 이 복잡한 혼선의 정확한 기여는 공지되지 않는다.

그람-음성 패혈증 도중 응고의 차단은 응고-관련 염증 반응을 감약시킴으로써 ALI 및 다른 기관 손상을 막는다. 이것은 확립된Escherichia coli(E. coli) 패혈증의 개코원숭이 모델에서 시험하였는데, 여기에서 전신적 염증 반응은 사멸된 박테리아의 기폭 주입에 의해 사전-활성화된다. 제 2의, 박테리아의 치명적 용량을 투여한 후, 동물은 과역동 심혈관 반응 및 ARDS를 갖는 인간과 유사한 폐 및 신장 부전을 일으켰다. 본 발명자들은 천연 FⅦa 보다 5배 더 높은 TF에 대한 친화도로 인해 FⅦa를 완전히 차단하는 부위-비활성화 FⅦa (FⅦai)를 이용하여 박테리아의 기폭 용량 후 TF-FⅦa 복합체에서의 응고 개시를 차단하였다. 하기 연구는 FⅦai를 이용한 응고 차단이 패혈증 증후군에서 전신적 염증 및 피브리노겐 고갈을 감소시키며 폐 및 신장에서의 손상을 막는다는 것을 나타낸다.

본 연구는 치명적인 패혈증에서 응고의 개시를 차단한 후 말단 기관 기능에서의 특이적인 개선을 나타낸 최초의 연구이다. 본 발견은 패혈증-유발성 호흡 및 신장 부전에서 TF의 병인학적 역할을 확립하고 TF의 차단이 폐 및 신장 기능 모두를 효과적으로 보존한다는 것을 나타낸다. 치료 효과를 평가하기 위한 본 접근법은 기폭된 개코원숭이의 생리학적 및 해부학적 반응이 인간에서의 패혈증에 대한 반응과 매우 근접하기 때문에 설득력이 있다. 패혈증에서의 응고를 차단하기 위해 다양한 전략을 이용한 종래 동물 연구는 TF 차단 또는 항응고 후 더 나은 생존을 보고하였으나, 말단 기관 손상의 평가는 중증 패혈성 쇼크의 존재에 의해 악화되엇다. 기폭은 염증을 사전활성화시키고 인간에서 실험적 내독혈증과 유사한 폐 가스 교환, 기구, 및 혈역학에서의 경미한, 자기-제한 변경을 야기한다. 이후의 압도적인 그람-음성 패혈증은 진행성 폐 및 신장 손상, 염증 사이토카인의 영구 상승, 및 응고병증을 일으킨다. 이들 동물에서의 면역 반응은 복잡하고 백혈구 부착 분자에 대한 mAb와 같은 어떤 치료는 기폭된 동물에서의 결과를 악화시킨다. 반대로, TF-FⅦa 복합체의 차단은 응고병증 및 피브린 침전을 감약시키고 치명적인 E. coli 주입 후 폐 및 신장 손상을 막는다.

과거에는, 패혈증에서 응고 차단의 1차적인 목적이 혈관 구획에서의 피브린 침전을 저해하는 것이었으나, 본 발명자들은 기관 손상 도중 혈관외 피브린 침전또한 중재할 수 있음을 예증하였다. 피브린은 조직 회복에서 세포 이주 및 콜라겐 형성에 중요한 매트릭스를 제공하지만 또한 염증을 자극할 수도 있다. 폐에서, 피브린의 유조직 축적은 염증성 세포 이주, 계면활성제 기능장애, 및 전섬유형성 (profibrotic) 과정에 기여할 수 있다. 가스 교환 및 폐수가 본 연구에서 크게 개선되었지만, FⅦai 처리 동물의 폐에 있는 폐포 구역 및 작은 혈관 주위에서 잔류 피브린이 검출되었다. 이것은 TF 차단의 강력한 보호 효과가 전적으로 피브린의 부재에 의한 것이 아니며 응고에 관련된 핵심적인 보수 과정은 FⅦai로의 치료 도중 온전하게 남아 있을 수 있다는 것을 제시한다.

FⅦai는 패혈증의 36 시간 후 폐 및 신장에서의 관내 피브린 응혈을 막는데, 이것은 조직 보호에 기여할 수 있었다. 관내 피브린 침전은 작은 영양 혈관 내의 폐색성 혈전의 직접적인 결과로서 그리고 내피-백혈구 상호작용의 향상을 통해 기관 부전에 기여한다. 혈관내 피브린이 몇몇 조직 및, 예를 들어 압도적인 쇼크 및 조직 관류저하가 발생할 때와 같은 어떤 임상 셋팅에서 중요한 것으로 생각되지만, 상피 세포 및 조직 대식세포에 의한 혈관외 TF 발현 또한 전응고, 사전-염증 사건을 일으킨다. 거주성 및 침투성 대식세포는 물론이고, 고정된 세포 집단은 염증성 폐 및 신장 질병에서 TF의 공급원으로서 관련되었고 이는 응고가 혈관외 유조직에서 상이하게 조절된다는 것을 제시한다.

TF는 직접 또는 FXa, 트롬빈 및 피브린의 형성을 통해 면역 기능을 조절할 수 있는 제 II군 사이토카인 수용체로, 이들 모두는 염증과의 혼선을 나타낸다. 각각의 성분은 염증성 반응에 대해 독립적인 효과를 가지며, TF의 개시 차단은 경로중 후속의 단계에서 염증성 상호작용을 생략하는데 유리하다. TF는 ALI의 발달에 관련된 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 사이토카인 조절을 활성화시켰다. 상세하게는, IL-6은 ARDS에서 지속성 염증 및 나쁜 결과와 관련되었다. 시험관내에서, FⅦai는, 촉매적으로 활성화하는 FⅦa가 이들 경로를 통한 TF 시그널화에 필요하다는 것을 증명하는, MAPK 활성화를 저해한다. FⅦa에 의한 TF의 결찰은 IL-1β , IL-8 및 기타 케모킨(chemokines)을 포함한 다수의 면역조절 유전자, 응고 및 성장 인자, 및 콜라겐분해효소를 유도한다. 발명의 패혈증 개코원숭이에서, FⅦai는 IL-6, IL-8 및 TNFR-1의 혈장 수준을 감소시켰다. 이는 TF 시그널화의 감소, 또는 FXa 및 트롬빈 하위반응 생성의 감소를 방지하며, 또한 전-염증성 사이토카인을 유도한다. IL-6 및 IL-8는 TF 발현을 더욱 증가시키며, FⅦai와 함께 TF-차단은 폐에서 패혈증-유도 TF 발현을 현저하게 감소시킨다. 급성 폐 손상, 예를 들면 VEGF의 기타 중요한 중재자에 대한 조절은 TF-FⅦa 에 의한 FXa의 발생 또는 TF의 세포질측을 필요로 할 수도 있다. 결국, 다른 데이터는 TF가 고도로 발현될 때, 보조-인자로서 기능하여 시그널화 사건을 개시하는 다른 막통과 단백질에 FⅦa를 제공하도록 한다는 것을 시사한다. 패혈증에서 TF가 고도로 과 발현될 때 그 같은 상호작용이 중요한 경우, FⅦa에 대한 직접적인 표적화는 TF를 저해하는 다른 발명에 대해서도 유리하다.

급성 패혈증을 갖는 동물에 대한 앞서의 연구에서, 세개의 시험용 약물 TFPI, 항-TF mAb, 및 DEGR-FⅦa가 TF-개시된 응고에서 표적화되었다. 이들 약물은 생존을 개선하였으나, 활성화된 단백질 C(APC) 및 항트롬빈 III(ATIII)을 포함하는, TF-FⅦa 복합체에 연관되지 않는 프로테아제의 천연 저해제 역시 생존 효율성을 나타내었다. 이들 전략은 모두 이전에 문제되지 않았던 동물들에서 시험되었고, 진행성 쇼크를 급속하게 발생시키기 때문에, 응고 활성도가 TF-FⅦa 복합체로부터의 쇼크 하위 반응에서 사망률에 기여하는 것이 가능하다. 항-TF 약물과 같이, ALI 및 MOF에 대한 그들의 영향은 연구되지 않았다.

상기의 연구들에서, 혈청 IL-6 및 IL-8에서의 감소가 관찰되고, 이는 개선된 생존을 위한 메카니즘으로서 생각되었다. 이들 중재자에 대한 중대한 영향은 국한시키는데 어려움이 있고, 응고 및 사이토카인을 생존과 일관되게 연결하지 못했다. FXa 및 트롬빈에서 응고를 저해하는 ATIII은 사망률, 응고병증 및 IL-6 생성을 감소시켰으나, 이들 결과는 인간 시험에서는 되풀이되지 않았다. 대조적으로, DEGF-FⅦa는 응고병증 및 IL-6 생성을 감소시켰으나, 생존에는 가변적인 효과를 가져 사이토카인 수준과 상호 관련이 없었다. 또한, 비활성화된 FXa는 응고병증을 감소시켰으나, 급성 패혈증성 쇼크에서의 생존은 개선하지 못했다. 그같은 연구들에서 응고 차단에 대한 효과는 기관 기능에 대한 생리적 종말점과 상호관련이 없었다. 인간에서, TFPI와 함께 TF 차단은 응고에 대한 활성화는 방지하였으나, 저용량의 내독소 주입과 함께 IL-6 수준에는 영향을 미치지 않았다. 더불어 이들 연구는 특히, 염증 유발 진행시에 영장류에서의 염증 및 응고 프로테아제의 응고 기능에 대해 다른 발단을 의미한다.

본 발명의 동물들에서, FⅦai는 전체적으로 응고를 차단함없이 폐 염증을 방해한다. 신규한 관찰은 출혈이 관련된 패혈성 환자들에게 희망을 제시한다. 비록 FⅦai는 TF를 효과적으로 제어하지만, 시험관내에서 불완전하게 응고를 차단한다. 따라서, TF-FⅦa의 보다 큰 활성화는 응고보다 염증에 대해 필요로 될 수 있으며, 이 연구에서 사용된 FⅦai용량에서 심각한 출혈은 나타나지 않았다. 게다가 응고에 대한 약물의 효과는 출혈이 발생하지 않을 경우 인간 재조합 FⅦa로 전환될 수 있다.

요약하여, 발명자는 TF-FⅦa 복합체에서의 응고의 차단은 인간을 제외한 영장류에서E. coli패혈증 동안의 폐 및 신장의 손상을 방지한다. 다른 조직은 다양한 정도로 보호되며, 패혈증에서의 손상에 대한 TF-기재 기여도는 기관들에서 차이가 있다. ARDS로 위독한 인간에서, 발명자는 지속성 염증의 존재하에서 이 전략을 시험하였으며, 여기에서 지연된 사이토카인 발현은 기능적인 결과에 대해 중요한 영향을 미칠 수 있다. 응고에 대한 다른 측면을 근거로한 패혈증성 쇼크에 대한 이전의 전략은 다양한 임상적인 성공을 거두었다.

이것은 아마도 패혈증에 대한 이질적 손상 및 염증과 관련한 다른 응고 프로테아제들간의 상호작용 둘 모두를 초래한다. 본 발명의 데이터는 응고 캐스케이드에서 직접적으로 작용하는 약물이 패혈증에서의 폐 및 신장의 손상에 대해 보다 긍정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.

다음의 실시예들은 예시를 위해 제공되었을뿐, 한정을 위해서는 아니다.

실시예

실시예 1: FⅦ의 생물학적 활성도

인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅶa 변체의 활성도는, 100-1000 nM의 농도에서 적절하게, 인자 X와 같은 생리적 기질을 사용하여 측정할 수 있으며, 여기에서 발생된 인자 Xa는 적절한 발색성의 기질의 첨가 후에 측정한다(예를 들면, S-2765). 게다가, 활성도 분석은 생리적 온도에서 이루어질 수도 있다.

"시험관내에서의 단백질 분해 분석"

천연 (야생형) 인자 Ⅶa 및 인자 Ⅶa 변체 (둘 모두 이후 "인자 Ⅶa"라 한다)를 그들의 특이적 활성도와 직접 비교하는 동시에 분석하였다. 분석은 마이크로타이터 플레이트(MaxiSorp, Nunc, 덴마크)에서 수행하였다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl₂및 1 mg/ml 소혈청알부민를 함유하는 100 μL 50 mM Hepes, pH 7.4중에서 인자 Ⅶa (10 nM) 및 인자 X (0.8 μM)를 15분동안 인큐베이팅하였다. 다음으로 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA 및 1 mg/ml 소혈청알부민를 함유하는 50 μL 50 mM Hepes, pH 7.4를 첨가하여 인자 X 분할을 정지시켰다. 발색성 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아닐리드 (S-2765, Chromogenix, 스웨덴), 최종 농도 0.5 mM을 첨가하여 발생된 인자 Xa의 양을 측정하였다. SpectraMax^TM340 플레이트 리더 (Molecular Devices, 미국)에서 405 nm에서의 흡광도를 연속적으로 측정하였다. FⅦa를 함유하지 않는 블랭크 웰에서 흡광도의 감산 후, 10분 동안 발생된 흡광도를 사용하여 변체와 야생형 인자 Ⅶa의 단백질 분해 활성도 사이의 비를 계산하였다:

비 = (A405 nm 인자 Ⅶa 변체)/ (A405 nm 인자 Ⅶa 야생형).

이것을 토대로, 실질적으로 천연 인자 Ⅶa보다 더 낮은 활성도를 갖는 인자Ⅶa 변체가, 예를 들면, 변체의 활성도와 천연 인자 Ⅶ (야생형 FⅦ) 의 활성도 사이의 비가 5%이하 또는 1%이하 또는 이보다 더 낮은 변체임을 확인할 수 있었다.

실시예 2

외인성 응고의 차단은 확립 그램-음성 패혈증과 함께 개코원숭이에서의 폐 손상을 감소시킨다

살아있는 박테리아의 주입시에 활성 부위-비활성화 Ⅶa (ASIS)로 응고 개시를 차단하는 것은 개코원숭이에서의 패혈증-연관 급성 폐 손상 (ALI) 및 신부전을 감소시키는 것으로 증명되었다. 본 발명자는 확립E. coli패혈증이 또한 감소된 ALI 및 신부전과 함께 ASIS로의 치료에 반응한다는 것을 보였다.

살아있는E. coli1X10¹⁰/kg의 정맥내 투여에 앞서 12시간전에 성인 웅성 개코원숭이에 1x10⁹/kg 열-사멸E. coli를 주입하였다. 동물을 48시간 동안 기계적으로 환기시키고, 체액을 공급하여 8-12 mmHg의 PCWP (폐 모세혈관 쐐기압)를 유지하도록 하였다. 살아있는 박테리아의 주입 후 1시간 뒤에 여섯마리의 동물을 ASIS (1 mg/kg 정맥내 투여, 이어서 50 g/kg/hr)로 처리하였다. 여섯 마리의 동물은 패혈증 대조군으로서의 역활을 하였다. 값을 평균 ±SE로 나타내었다.

ASIS는 외인성 경로에 대한 치료적인 차단과 함께, 혈장 피브리노겐 결핍을 방지하였다. 패혈증 유도 호중구 감소증 및 혈소판 감소증은 영향을 받지 않았다. 48시간 후, 처리된 동물은 감소된 폐 습윤/건조 중량 (C=6.9±0.8, ASIS = 5.0±0.2)와 함께 가스 교환(△AaD02, mmHg: C=25.4±3.9, ASIS=14.4±5.2)을 유지하였다. ASIS-처리 패혈성 동물에서 폐 조직은 감소된 염증을 나타내었다. ASIS로 처리된 패혈성 동물에서, 소변 배출량은 더 높았으며(UOP, ml/kg/hr C= 5.7±1, ASIS = 12.3±1.7, p ≤ 0.01), 대사산증은 감소되었다(△HCO₃-, meq/dl: C=-4.3±2.9, ASIS = +3±1.1, p≤ 0.05). ASIS-처리 동물에서의 신장은 패혈증 대조군과 비교하여 관 구조가 보존되었음을 나타내었다. 약물의 주입은 출혈성 합병증없이 양호한 내성을 나타내었다. 결과는 외인성 응고의 개시를 억제하는 것이 확립 패혈증에서의 급성 폐 및 신장을 보호한다는 것을 나타낸다.

ASIS는D-Phe-Phe-Arg-FⅦa이다.

실시예 3

시험용 급성 폐 손상에서의 조직 인자 차단

본 발명자는E. coli패혈증으로부터의 ALI와 함께 개코원숭이에서의 TF-개시된 응고에 대한 차단을 연구하였다. 활성부위 비활성화 FⅦ (ASIS)는 외인성 응고를 차단하였으며, 인터류킨 (IL)-6, IL-8 및 종양 괴사 인자 수용체-1을 포함하는 전신적 사이토카인 반응을 감소시켰다. 또한, 폐, 신장 및 다른 조직에서의 패혈증-관련 손상을 감소시켰다. 혈장 피브리노겐 및 트롬빈-항-트롬빈 III (TAT) 복합체에 대한 측정으로 ASIS의 처리 후 혈관내 응고의 활성화가 감소됨을 확인하였다.

비-처리된 패혈성 동물에서, 피브린 침전은 폐 및 기타 조직에서의 혈관 내 및 외 구역 둘 모두에서 현저하였다. 이것은 ASIS로 처리된 패혈성 동물에서 제거되는 것이 아니라 감소되어, TF-차단에 대한 보호 효과가 피브린 발생의 감소로 인한 것만은 아님을 나타내었다. ASIS로의 TF 차단은 또한 호중구 침윤을 포함한 폐에서의 염증성 변화를 감소시키고, 부종 및 출혈을 감소시켰다. ASIS에 의한 응고의 차단 및 피브린 침전의 감소는 가스 교환 및 탄성을 유지함으로써 폐 기능을 개선시키고, 폐동맥 고혈압을 감소시키고, 신장기능을 개선시켰다. TFPI로 처리한 두마리의 패혈성 개코원숭이 역시, ASIS로 처리한 것들보다 더 작은 정도이긴 하지만, 가스 교환 및 폐 탄성에서의 개선을 나타내었다. 이들 결과는 TF-FⅦa 복합체가 패혈증에 대한 병적 반응의 중요한 조절 부위임을 나타낸다.

패혈증에서의 응고 차단에 대한 한 가지 가능한 보호 메카니즘은 전-염증성 사이토카인 생성의 감소이다. 응고와 염증간의 혼선이 조절되지 않는 염증의 중요 요소일 가능성은, 종말 기관 손상의 정도와 관련된다. 폐에서, 폐 상피 세포 및 대식세포에 의해 폐포 및 장내 공간에서 발현된 TF는, 패혈증에서 전-혈액응고성, 전-염증성 사건를 개시하여 TF 차단에 의해 변형될 때 폐 기능을 개선시킬 수 있다.

ASIS는 D-Phe-Phe-Arg-FⅦa이다.

실시예 4

방법

동물 준비.14 내지 20 kg중량의 성인 웅성 개코원숭이(Papiocyanocephalus)를 최소 4주간 격리시키고, 사용전 무결핵인지를 측정하였다. AAALAC 지침에 따라서 동물을 다루고, 듀크 유니버시티 인스티튜셔널 애너멀 케어 엔 유즈 커미티(Duke University Institutional animal Care and Use Commitee)에 의해 시험용 프로토콜을 승인받았다. 이들을 무작위로 처리군과 패혈증 대조군(각 n=6)으로 나누었다. 처리 동물에 살아있는 박테리아의 주입에 앞서 즉각적으로 t=12시에 정맥내로 활성 부위-비활성화 FⅦa (FⅦai, Novo Nordisk, 코펜하겐) 1 mg/kg을 투여하고, 이어서 50 mcg/kg/h를 정맥내 투여하였다. 비처리 동물은 단지 부형제만을 정맥내 투여하였다. 약물은 인간 재조합 FⅦa로부터 유도되고, 여기에서 활성부위는 소 펩티드의 병합에 의해 차단되고(D-Phe-L-Phe-L-Arg 클로로메틸 케톤), 인간 환자에서의 안전성 연구를 근거로하여 용량을 선택하였다. 변형은 단백질 분해 활성을 차단하고 TF 친화력을 5배 강화시킨다. TF에 대한 독립적 저해제로 발견물을 확인하기 위해, 추가의 2마리의 개코원숭이를 동일한 용량으로 조직 인자 경로 저해제(TFPI, gift of Abla Creasy, Chiron, Emeryville, CA)를 갖는 동일한 프로토콜로 처리하였다.

밤새 절식시킨 후, 각 동물을 근육내 케타민(20-25 mg/kg)으로 안정화시키고, 삽관하였다. 케타민 (3-10 mg/kg/h)과 디아제팜 (2시간마다 0.4-0.8 mg/kg)으로 중증 안정화(Heavy sedation)를 유지하였다. 동물을 용량제한 환기기로 환기시키고, 호흡 측정전 판큐로늄(4 mg 정맥내 투여)으로 간헐적으로 마비시켰다. Fi0₂는 0.21이고, 일회호흡량은 12 mg/kg, 양성 호흡 결핵호기말기압은 2.5 cm H₂0이고, 비율을 조절하여 40 mmHg의 동맥성 PC0₂를 유지하도록 하였다. 혈류역학 모니터링을 위해 동맥 유치관 및 폐 동맥 카테터를 넙다리 절단을 통해 설치하였다. 모델에 대한 상세한 설명은 공개되어 있다(예를 들면, Welty-Wolf et al.,Am J Resp Crit Care Med1998; 158: 610-619).

모든 동물에 살아있는E.coli에 앞서 t=o 시, 12 시에 60분 주입으로서 약 10⁹CFU/kg 열-사멸E. coli를 투여하였다. 60분에 걸쳐 50ml의 부피로 10¹⁰CFU/kg의 살아있는E. coli를 주입하는 것에 의해 t=12 시에 패혈증이 유도되었다. 살아있는E. coli의 주입 완료 후 60분에 젠타마이신 (3 mg/kg 정맥내 투여)과 케프타지딤 (1 gm 정맥내 투여)을 투여하였다. 폐 모세혈관 쐐기압(PCWP)을 8-12 mmHg로 유지하고, 혈압을 지지하는데 필요시 체액을 제공하였다. 체액에도 불구하고 평균동맥혈압(MAP)이 65 mm Hg이하로 떨어질 때 저혈압에 대해 도파민을 사용하였다. 48시간 후(살아있는 박테리아 주입 후 36시간) 동물을 깊게 마취시키고, KCl를 주사하여 죽였다. 미리 정해진 최종 기준은 난치성 저혈압 (MAP 60 mmHg 미만), 저산소혈증 (40%보다 큰 FiO₂를 필요로 한다), 또는 난치성 대사산증 (정상 PaCO₂와 함께 pH < 7.10)을 포함한다.

혈류역학 모니터링.심장박동수 (HR), 온도, 동맥 혈압, 폐동맥 혈압, 환기기 매개변수, 및 체액 섭취량를 포함하는 생리적 매개변수를 매시간마다 기록하였다. 보고된 바와 같이, 열희석법에 의한 심장 배출량 (CO), 중심 정맥압 (CVP), PCWP, 동맥 및 혼합 정액 혈액 가스, 산소 포화도, 산소 함유량 및헤모글로빈(Hgb)에 대해 매 6시간 마다 측정하였다(예를 들면, Welty-Wolf et al.,Am J Resp Crit Care Med1998; 158: 610-619). 뇨 카테터 배출량을 매 6시간마다 측정하고, 체액 발란스를 총 정맥내 섭취량에서 소변 배출량을 빼어 계산하였다.

E. coli 의 준비. E. coli(American Type Culture Collection, Rockville, MD; serotype 086a: K61)를 설명한 바와 같이 준비하고(REFS 7-10), 조절하여 각각의 개코 원숭이(LD₁₀₀)에 대해 1 x 10¹⁰CFU/kg의 최종 용량을 제공하였다. 적어도 30분동안 65℃에서 수조중에서 박테리아 관을 가열하여 열-사멸E. coli를 준비하였다. 세균의 수와 열 사멸의 효율성을 부어심기 평판을 사용하여 클로니수를 세어서 확인하였다.

전체 혈액, 혈장, 및 혈청에 대한 측정.0,12,13,18,24,36, 및 48시에 혈액 샘플을 채취하였다. 전체 혈액에 대해 전혈구 계수를 수행하였다(Sysmex-1000 Hemocytometer, Sysmex, Inc., Long Grove, IL). (구연산 첨가 혈액에서의)혈장 및 혈청을 분리하고, -80℃에서 보관하였다. ST4 기계적 응고 분석기(Diagnostiga Stago, Parsippany, NJ)를 사용하여 피브리노겐을 측정하였다. 프로트롬빈 시간 (PT)과 활성화된 부분 프로트롬빈 시간 (aPTT)을 2번씩 측정하고, 항 트롬빈 III (AT III) 활성도를 MDA 응고 분석기 (Organon Teknika; Durham, NC)에서 발색성의 분석으로 측정하고, 키트 표준에 대해 %로서 표현하였다. ELISA를 사용하여 혈장 트롬빈-항트롬빈 (TAT) 복합체 (Dade Behring, Deerfield, IL) 및 혈장과 BAL (Novo Nordisk, 코펜하겐)중에서의 FⅦai 수준을 측정하였다. 혈청 샘플을 ELISA키트 (R and D Systems, Inc., Minneapolis, MN)를 사용하여 인터류킨 1β (IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNF 수용체-1 (TNFR-1)에 대해 분석하였다. 혈액 요소 질소 (BUN)와 크레아티닌을 표준 임상 기술로 측정하였다.

조직 수집과 준비.시험 후, 흉곽을 열고, 왼쪽 주 기관지를 결찰하고, 좌폐를 제거하였다. 좌상엽에 대해 240 ml 0.9% 식염수로 BAL을 수행하였다. 좌하엽에서의 폐 조직 샘플을 수동으로 팽창시키고, 광학 현미경 및 면역 조직화학을 위해 4% 파라포름알데히드중에 담궜다. 큰 혈관 및 기관지 구조물을 피해 주의하면서 습윤/건조 중량 측정을 위해 좌폐의 나머지로부터 무작위로 4개의 샘플을 얻었다. 폐, 신장, 간, 작은 창자, 심장 및 부신으로부터의 추가의 샘플을 액체 질소중에서 급속 냉각하고, 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 생화학적 연구를 위해 -80℃에서 보관하였다. 우폐 전체를 0.85 M Na 카코딜산염 완충액 (pH 7.4)중의 2% 글루타르알데히드에서 30 cm 고정 압력에서 15분 동안 팽창-고정하였다. 신장, 간, 작은 창자, 심장 및 부신으로부터의 추가의 조직을 4-파라포름알데히드중에서의 액침에 의해 고정하였다. 작은 창자의 샘플 4개를 습윤/건조 중량 측정을 위해 무작위로 선택하였다.

생화학적 측정:폐 균등질의 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성도와 단백질 농도 및 BAL 체액의 단백질 및 락트산 디히드로게나제(LDH) 농도를 설명된 바와 같이 측정하였다(예를 들면, Carraway et al., AM J Resp Crit Care 1998,157: 938-949). MPO 활성도를 흡광도/min/g 습윤 중량 조직에서의 변화로서 표현하였다. LDH값을 리터당 활성도의 단위(U/L)로 표현하였다.

웨스턴 블롯팅.폐 샘플을 찬 용해 완충액(150 mM NaCl, 50 mM 트리스, pH 7.6 1% SDS, 3% 노니데트(Nonidet) P-40, 5 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 2 mM 1,3-디클로로이소쿠마린, 2 mM 1,10-페난트롤린, 및 0.4 mM E-64) 중에서 균질화하고, 15,000 x g에서 10분동안 원심분리하였다. 상층액을 래믈리(Laemmli)완충액과 혼합하고 -80℃에서 냉각하였다. 환원 조건하에서 12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동하였다. 랜을 당량의 단백질로 부하하고, 호에퍼 미니겔 시스템(Hoefer minigel system) (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA)으로 전기영동을 수행하였다. 이동 후, 항-TF mAb (mouse anti human, American Diagnostica, Greenwich, CT) 및 HRP-접합 제2 Ab (goat anti. mouse, Transduction Laboratories, Lexington, KY)을 사용하여 TF발현에 대해 블롯을 프로브하였다. ECL 검출로 시그널을 발생시키고, 상업적으로 입수가능한 소프트웨어(Quantity One, BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 블롯을 감작하였다.

조직학 및 면역화학.파라포름알데히드 고정 조직을 파라핀에 포매하고, 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하고, 광학 현미경으로 조사하였다. 폐, 신장, 부신 및 작은 창자의 파라핀 절편들에 대해 mAb(anti-human fibrinogen β-chain, American Diagnostica, Greenwhich, CT)를 사용하여 파라핀에 대한 면역 정위(Immunolocalization)를 수행하였다. 이 Ab는 피브린과 강하게 반응하고 피브리노겐과는 약하게 반응한다. 절편(5 미크론)을 크실렌 중에서 탈 파라핀화하고, 다단계 알콜중에서 재 수화하고, 항-피브린 Ab로 4℃에서 밤새 인큐베이팅 하기에 앞서서 세척하였다. 다음으로 절편을 세척하고 바이오티닐레이트화(biotinylated) 제 2 Ab로 인큐베이팅하고, 퍼옥시다제-접합 아비딘 및 아미노벤지딘으로 시그널을 발생시켰다. 일차 배양을 비-면역 마우스 혈청(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)으로 하는 것을 제외하고는, 상기와 같이 음성 대조군을 처리하였다.

통계.데이타를 컴퓨터 스프레드시트에 넣고, 상업적으로 입수가능한 소프트웨어(StatView, Calabasas, CA)를 사용하여 분석하였다. 생리적 데이터 및 일련의 혈액 채취물로부터 얻어진 데이터를 2-인자 ANOVA에 의해 분석하였다. BAL로부터 얻어진 생화학적 데이터 및 시험의 종료시에 얻어진 조직을 대응하지 않는 t-테스트(unpaired t-test)를 사용하여 분석하였다. 평균 ±SEM 및 p 값을 그림 및 표에 제공하였다; p < 0.05 는 유의성이 있는 것으로 간주되고, p < 0.10에 대해서는 경향을 나타내었다.

결과

치사용량의 살아있는E. coli의 주입전, 죽은 바테리아에 의해 응고 및 염증 둘 모두 활성화되었다. 살아있는E. coli의 투여직전에, 동물은 TAT 복합체와 aPTT에서의 증가, 혈소판 감소 및 급성기 반응과 함께 피브리노겐의 증가와 더불어 가벼운 응고병증에 걸렸다. 염증성 중재자 IL-6, IL-8, 및 TNFR-1은 2-10 배 증가하였다. 이들 동물에서 살아있는 박테리아의 주입은 광범한 폐 손상, 신부전, 및 간, 창자, 및 부신을 포함한 기타 생체 기관에의 손상을 야기한다. 지속적인 주입으로서 FⅦai의 정맥내 투여는 응고 및 염증의 추가적인 활성화를 효과적으로 차단하고, 기관 손상을 방지하고, 혈관 내 및 외의 피브린 침전을 감소시켰다. 피브린의 조직 침전에 대한 효과는 폐 및 신장에서 가장 중요하며, 여기에서 FⅦai 처리 동물은 부형제 처리 패혈성 대조군과 비교하여 가스 교환 및 신장 기능에서 현저한 개선을 나타내었다. 비처리 패혈증 대조군 동물은 폐에서 TF에 대해 강력한 상향 조절을 가져 FⅦai를 방지하였다(p < 0.05, 도 1). 약물의 수준은 혈장 및 BAL에서 측정되었으며, 폐포 구획내로의 FⅦai의 침투를 나타내었으며, 여기에서 BAL 체액중에서의 수준은 시험 종료시에 194.2±34.7 ng/mg단백질이었다. 혈장 수준은 표 1에 나타내었다. 이들 동물에서 FⅦai 처리에 의한 폐 및 신장의 보호화에 대한 분석은 아래에 제시되었다.

패혈증에서의 급성 폐 손상.FⅦai 처리는 패혈증-유도 저산소혈증, 폐동맥 고혈압, 및 폐 시스템 탄성의 상실을 방지하였다. 이들 생리적 데이터를 도 2에 나타내었으며, 약물 효과를 나타내기 위해 t=12 시에서부터의 변화로서 플롯팅하였다. 보다 앞서 비처리 동물(n=11) 및 TFPI로 처리한 두 마리의 패혈성 동물로부터의 과거 데이터는 단지 비교를 위해 그래프에서 파선으로 나타내었다(데이터는 통계적인 분석에 포함되지 않았다). 폐포 동맥 산소 기울기 (AaDO₂)는 사멸 박테리아의 주입 후 두 군 모두에서 증가되었으며, 살아있는 박테리아성 패혈증의 발병 후 t=12시에 패혈증 대조군에서 점진적으로 악화되었다. 패혈증 대조군에서의 한 마리의 동물은 보조 산소를 필요로 하였다. FⅦai로의 처리는 패혈증 동안에 가스교환의 저하를 방지하며(p < 0.0001), 12 시에서 비교했을때 그들 동물에서 최종 AaDO₂는 실제로 개선되었다. 평균 폐동맥 혈압 (PAM) 및 폐 혈관 저항성 kg (PVR*kg)에서의 패혈증-유도 증가는 FⅦai에 의해 감소되었다(p < 0.001 및 p < 0.02 대 비처리 패혈증 대조군). FⅦai는 또한 패혈증 대조군 동물에서 보여진 폐 시스템 탄성의 상실을 방지하였다(p < 0.001). 사멸 공간은 유사하게 증가하였으며, 시험동안 두 군 모두 분시환기량(V_E)에서의 30-35% 증가를 필요로 하였다(표 1). 두 군에서 PaCO₂는 40 mm Hg로 조절되었다(V_E및 PaC0₂둘 모두에 대해 p = 의미없음).

죽은 후에, FⅦai로 처리한 동물의 폐는 무상의 환기된 동물에서의 폐와 유사하게 정상을 나타내었다. 대조적으로, 패혈증 대조군 동물에서의 폐는 치밀하고 출혈성이었다. 폐 습윤/건조 중량, 호중구 (PMN) 축적, 및 세척 LDH에 대한 정량적인 측정은 처리군 모두에서 개선되었다(도 3). FⅦai 처리 동물에서의 5.05±0.09와 비교하여 패혈성 대조군에서의 폐 습윤/건조 중량은 5.81± 0.19이었다(p < 0.01, 정상 기준 범위는 4.6-5.0이다). BAL LDH는 거의 60% 감소되고(p < 0.01), 폐 MPO 활성도는 40% 넘게 감소되었다(p = 0.07). BAL 단백질은 두 군사이에 현저한 차이가 없었다.

폐 조직학은 FⅦai로 처리한 패혈성 동물에서 표지된 보호를 나타내었다. 폐의 대표적인 절편은 항-피브린 항체로 염색되었다. 패혈증 대조 동물의 폐는 두꺼운 폐포 격벽, 반점형 폐포 부종 및 출혈, 및 대식세포 및 PMNs와 함께 폐포내 염증성 세포 침윤을 가졌다. 항-피브린 염색은 격벽을 따라, 폐포내 염증성 세포 위에 및 폐포 체액내에서 광범한 미만성 피브린 침전을 나타내었다. 폐 중 일부 작은관은 피브린 덩이를 함유하였다. 처리 동물의 폐는 정상적인 폐포 격막 구조, 최소 폐포 PMN 침윤, 및 무 폐포 부종을 가졌었다. 이들 동물에서, 피브린에 대한 격막 염색은 비균질이며, 패혈증 대조군에서의 것에 비해 덜 광범위하다. 처리 동물에서, 피브린 염색은 종종 작은 관을 직접 둘러싸는 구역에 한정되지만, 혈관내 피브린 덩이는 식별할 수 없었다. 폐포 대식세포 및 혈관내 단핵구는 중점적으로 염색되었다.

패혈증에서의 신장 및 기타 기관 손상.FⅦai는 또한 패혈증에서의 신부전을 방지하였다(도 4). 혈청 크레아티닌은 패혈증 대조군에서 두배가 되었지만, 처리군에서는 정상으로 남아있었다(p = 0.05). 비처리 동물에서, 살아있는E. coli의 주입 후 소변배출량에서의 상응하는 감소가 있었다. 대조적으로, 처리군에서 소변 배출량은 유지되거나 증가되었다(p < 0.0001). 이는 소생에서의 차로 인해 체액 발란스 (도 4) 및 전신의 혈류역학 (표 1)이 두 군에서 동일하기 때문이다. 혈액 pH 및 혈청 [HC0₃ ^-]은 비처리 동물에서 더 낮아졌다(각각 p < 0.001 및 p < 0.1, 도 4).

사후에 비처리 동물에서의 신장은 팽창되고 출혈성이지만, FⅦai 처리 동물에서는 정상으로 나타났다. 비처리 동물의 신장의 H&E 염색 절편은 급성 관상 괴사 (ATN)의 반점형 구역 및 상실된 사구체를 가졌다. 몇몇 ATN의 소 병소를 제외하고는, 처리 동물의 신장은 정상적인 신장 구조를 나타내었다. 면역염색은 모세관 구조의 폐색과 함께 패혈증 대조 동물의 사구체에서의 피브린 침전을 나타내었다. 관 상피 역시 염색되었으며, 일부 관은 피브린에 대해서 역시 양성인 무정형 물질을함유하였다. 피브린 덩이에 의해 패색된 관은 쉽게 확인되었다, 처리동물에서, 사구체 피브린 침전은 없었으며, 최소 관상 상피 염색이 몇몇 동물들에서만 나타났다.

FⅦai 처리 동물에서, 부신, 간, 및 작은 창자의 모양 역시 정상이었다. 대조적으로, 비처리 동물에서의 부신은 팽창되고 출혈성이었으며, 작은 창자는 전체적으로 부종성이었다. 비처리 동물에서 작은 창자 습윤/건조 중량은 보다 높았지만, 창자 손상에서의 높은 변이성은 통계적인 차를 허용하지 않아 군들 사이에 도달하였다(처리군에서 6.36±0.51 대 비처리군에서 8.30±1.13, p = 0.15). 폐 및 신장에서의 감소된 피브린 염색과는 대조적으로, 처리 및 비처리 패혈성 동물 둘 모두에서의 부신 및 작은 창자에서 병소의 피브린 침전이 나타났다. 그러나, 이 부신 피질 울혈 및 출혈과 작은 창자 출혈 및 부종이 FⅦai로 처리한 패혈성 동물에서 감소되었다. 폐 이외의 기관에서의 PMN 함유량에 대한 FⅦai의 통계적으로 유의성있는 효과는 없었다. 신장, 간 및 작은 창자에서의 MPO 활성도는 대조 동물에서 가변적이었으며, 차는 두 군사이에 통계적으로 유의성이 없었다.

패혈증-유도 응고병증.응고에 대한 내혈관 활성화는 대조군과 비교하여 FⅦai로 처리한 패혈성 동물에서 감소되었다(도 5). 응고 매개 변수에 대한 초기 값은 이 종들에서의 정상적인 범위내였다. 응고에 대한 치료적 차단으로 기대한 바와 같이 약물 처리는 혈장 피브리노겐 결핍을 방지하였다(p < 0.0001). 패혈증 대조군에서 살아있는E. coli이후 TAT 복합체가 증가하여 13-18시에 정점에 달하였으며, 다음으로 AT III 활성도 수준이 감소됨에 따라 감소하였다. TAT 복합체에서의 증가는 처리 동물에서 감소되었지만(p < 0.0001), AT III 활성도에서의 감소는 통계적으로 차이가 없었다. 시험에서 비처리 패혈성 동물중에서의 TAT 수준이 늦게 감소했지만, 그들 개코원숭이에서 응고가 진행되었다. 두 군 모두에서 aPTT는 점진적으로 증가하였지만 비처리 동물보다 높았다(p < 0.01). 분석에서 약물 효과로 인해 PT는 처리군에서 더 높았고, 약물 주입 기간동안 53 내지 67s 사이였다(p < 0.0001). 비처리군에서 PT는 12시에서 17.8± 0.4 (살아있는E. coli주입 전) 에서 시험 종료시에는 25.5± 3.6로 점진적으로 증가하였다.

살아있는E. coli의 주입 후 동물 군 둘 모두에서 호중구 감소증, 혈소판감소증 및 빈혈이 발생하였다(표 1을 보라). WBC는 주입 후 1시간에(t=13시) 두 군 모두에서 약 1,500 (x 10³/㎕)의 최저에 도달하였고, 시험이 종료시까지 기저선 근처의 정도로까지 점진적으로 증가하였다(처리 동물에서 9,400± 1,800 대 비처리 동물에서 13,000± 3,900, p = 0.08). 살아있는E. coli의 주입후 12시까지(t=24시) 모든 동물은 혈소판 감소성이었으며, 평균 혈소판 계수는 시험 종료시에 두 군 모두에서 30,000 미만이었다. Hgb는 두 군중 어느쪽에서도 유의성있는 출혈의 흔적없이 두 군 모두에서 유사하게 감소하였다(표 1).

전-염증성 사이토카인 수준.염증성 사이토카인의 상승은 FⅦai의 처리에 의해 감소되었다(도 6). IL-1β, IL-6, IL-8, 및 TNFR-1의 혈중 수준은 살아있는E.coli의 주입후 처리 및 비처리 동물 둘 모두에서 급속하게 상승하였다. 피크 IL-6 수준은 두 군사이에 차이가 없었으나, IL-6는 FⅦai 처리 동물에서 보다 더 급속하게 감소되고(p < 0.001), 천연 동물에서 발견되는 수준으로까지 회복되었다. 마찬가지로, 대조군과 비교하여 IL-8 및 TNFR-1 수준은 감소되었다(p < 0.01 및 p < 0.001). IL-8 수준에 있어서 두 군사이의 차이는 없었다.

계의 혈류역학 매개변수.HR, MAP, PCWP, CO/kg, 및 계의 혈관 저항성*kg (SVR*kg)를 포함한 혈류역학 측정은 FⅦai의 처리로 인해 바뀌지 않았다(표 1). 두 군 모두에서 저혈압이 IV 체액에 반응하였다; 처리군에서의 한 동물은 살아있는 박테리아의 주입 후 잠깐 저 용량의 도파민을 필요로 하였다. 12마리의 동물중 10마리가 프로토콜의 예정된 최종 지점까지 생존하였다. 한마리의 패혈증 대조 동물이 난치성 저산소혈증 및 호흡산증과 함께 ALI로 인해 30시에 죽었으며(살아있는 박테리아 주입후 18시), FⅦai 처리군 중 한 동물이 연구 종료전 3시에 기관내 삽관의 합병증으로 죽었다. 각 군에서 두마리의 동물이 시험동안 자가-제한적 혈뇨증이 발생하였으며, FⅦai 처리군에서 한 마리의 동물이 죽은 후에 중간 기관지에서 덩이가 있었다. 두 군에서 대부분의 동물은 연구중 일부 지점에서의 흡인과 관련된 일부 혈액이 약간 섞인 분비물을 가졌다. 어느 군에서도 중증 또는 생명을 위협하는 출혈성 합병증은 발생하지 않았다.

TFPI 주입 후 폐 및 신장 손상. E. coli패혈증에서 ALI에 대한 TF 차단효과를 확인하기 위해, 동일한 시험용 프로토콜로 두마리의 개코원숭이를 TFPI로 처리하였다. 패혈증에서 응고에 대한 활성도는, 혈장 피브리노겐 수준에서의 유사한 개선과 함께 TFPI 주입 후 차단되었다. 그들 동물에서의 최종 피브리노겐 수준(t=48시)은 12시 값의 75% 및 95% 이었다. FⅦai와 같이, TFPI는 계의 혈류역학 매개변수를 바꾸지 않았다. 양쪽 동물에서 가스 교환 및 폐 역학은 보호되었다(도 2를 보라). TFPI 후 조직병리학 및 폐 조직의 피브린 면역염색은 폐에서 감소된 염증성 세포 침윤물, 감소된 격막 두께 및 감소된 피브린 침전을 나타내었다. FⅦai 처리군에서와 같이, 신장 구조는 정상이고, 신장에서의 피브린 염색은 TFPI 후 없어졌다.

표 1: 패혈증 대조군 및 FⅦai 처리 패혈증군에서의 계의 측정. 열사멸 박테리아를 t=0시에 주입하고, 살아있는 박테리아를 t=12시에 주입하였다. 데이터는 평균 ±SEM으로서 나타내어졌으며, 2-인자 ANOVA로 분석하였다. 처리군으로서의FⅦai 약물 수준은 ng/ml 혈장으로 나타내어졌다. 약호: Temp (온도, ℃), Hgb (헤모글로빈), V_E(분시 환기량, L/분), HR (심장박동수), MAP (평균 동맥혈압, mmHg), CO (심장 배출량, L/분), DO₂(산소 전달량, mL/분), V0₂(산소 소비량, mL/분), SVR (계의 혈관 저항성, 다인 x cm x kg/10), PCWP (폐 모세혈관 쐐기압, mmHg).

Claims (55)

1. 인간에서 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 변형된 FⅦ의 사용.
2. 제 1 항에 있어서, 기관 부전의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
3. 제 2 항에 있어서, 기관은 신장, 폐, 부신, 간, 소장, 심혈관계, 또는 지혈계인 것을 특징으로 하는 사용.
4. 제 3 항에 있어서, 혈관 부전은 폐의 부전인 것을 특징으로 하는 사용.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 기관 기능의 유지 또는 향상을 위한 것을 특징으로 하는 사용.
6. 제 1 항에 있어서, 폐 고혈압의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
7. 제 1 항에 있어서, 전응고 활성의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
8. 제 7 항에 있어서, 전응고 활성은 폐 상피 세포 및 조직 대식세포에 의한 조직 인자 발현과 연관되는 것을 특징으로 하는 사용.
9. 제 1 항에 있어서, 염증의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
10. 제 9 항에 있어서, IL-6 및 IL-8 생산의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
11. 제 1 항에 있어서, 폐 가스 교환의 향상을 위한 것을 특징으로 하는 사용.
12. 제 1 항에 있어서, 폐 부종의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
13. 제 1 항에 있어서, 폐 단백질 누출의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FⅦ는 촉매 3잔기에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 사용.
15. 제 14 항에 있어서, 변형된 FⅦ는 Ser₃₄₄, Asp₂₄₂, 및 His₁₉₃위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 사용.
16. 제 15 항에 있어서, 활성 부위 잔기 Ser₃₄₄는 변형되고, Gly, Met, Thr, 또는 더욱 바람직하게는, Ala으로 교체되는 것을 특징으로 하는 사용.
17. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FⅦ은 세린 프로테아제 저해제와의 반응에 의해 변형된 FⅦa인 것을 특징으로 하는 사용.
18. 제 17 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 유기인 화합물, 설파닐 플루오라이드, 펩티드 할로메틸 케톤, 또는 아자펩티드인 것을 특징으로 하는 사용.
19. 제 18 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 댄실-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 펩티드 할로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 사용.
20. 제 19 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 사용.
21. 인간에서 ALI 또는 ARDS와 연관된 만성 기관 부전의 예방 또는 최소화를 위한 약물의 제조에 있어서 변형된 FⅦ의 사용.
22. 제 21 항에 있어서, ALI 또는 ARDS는 변형된 FⅦ가 투여되기 전에 확립되는 것을 특징으로 하는 사용.
23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 기관 부전은 신장, 폐, 부신, 간, 소장, 심혈관계, 또는 지혈계의 부전인 것을 특징으로 하는 사용.
24. 제 23 항에 있어서, 기관 부전은 폐의 부전인 것을 특징으로 하는 사용.
25. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FⅦ은 촉매 3잔기에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 사용.
26. 제 25 항에 있어서, 변형된 FⅦ은 Ser₃₄₄, Asp₂₄₂, 및 His₁₉₃위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 사용.
27. 제 26 항에 있어서, 활성 부위 잔기 Ser₃₄₄는 변형되고, Gly, Met, Thr, 또는 더욱 바람직하게는, Ala으로 교체되는 것을 특징으로 하는 사용.
28. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 프로테아제 저해제와의 반응에 의해 변형된 FⅦa인 것을 특징으로 하는 사용.
29. 제 28 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 유기인 화합물, 설파닐 플루오라이드, 펩티드 할로메틸 케톤, 또는 아자펩티드인 것을 특징으로 하는 사용.
30. 제 29 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 댄실-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 펩티드 할로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 사용.
31. 제 30 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 사용.
32. 인간에서 급성 폐 손상 (ALI) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 치료 방법으로서, 방법은 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 기관 부전의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 기관 부전은 신장, 폐, 부신, 간, 소장, 심혈관계, 또는 지혈계의 부전인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 기관 부전은 폐의 부전인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 기관 기능의 유지 또는 향상을 위한 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 32 항에 있어서, 폐 고혈압의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 32 항에 있어서, 전응고 활성의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 전응고 활성은 폐 상피 세포 및 조직 대식세포에 의한 조직 인자 발현과 연관된 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 32 항에 있어서, 염증의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 40 항에 있어서, IL-6 및 IL-8 생산의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 32 항에 있어서, 폐 가스 교환의 향상을 위한 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 32 항에 있어서, 폐 부종의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 32 항에 있어서, 폐 단백질 누출의 감소 또는 최소화를 위한 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 32 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FⅦ는 촉매 3잔기에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 45 항에 있어서, 변형된 FⅦ는 Ser₃₄₄, Asp₂₄₂, 및 His₁₉₃위치에서 적어도 하나의 아미노산 잔기 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 FⅦ인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 활성 부위 잔기 Ser₃₄₄는 변형되고, Gly, Met, Thr, 또는 더욱 바람직하게는, Ala으로 교체되는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 32 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 FⅦ은 세린 프로테아제 저해제와의 반응에 의해 변형된 FⅦa인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 48 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 유기인 화합물, 설파닐 플루오라이드, 펩티드 할로메틸 케톤, 또는 아자펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 49 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 댄실-L-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및L-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Pro-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤, 댄실-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 및 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤으로부터 선택되는 펩티드 할로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 50 항에 있어서, 프로테아제 저해제는 D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 인간에서 ALI 또는 ARDS과 연관된 만성 기관 부전의 예방 또는 최소화 방법으로서, 방법은 변형된 FⅦ의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 52 항에 있어서, ALI 또는 ARDS는 변형된 FⅦ이 투여되기 전에 확립되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서, 기관 부전은 신장, 폐, 부신, 간, 소장, 심혈관계, 또는 지혈계의 부전인 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 54 항에 있어서, 기관 부전은 폐의 부전인 것을 특징으로 하는 방법.