KR20040084876A - 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발 - Google Patents

고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발 Download PDF

Info

Publication number
KR20040084876A
KR20040084876A KR1020040068379A KR20040068379A KR20040084876A KR 20040084876 A KR20040084876 A KR 20040084876A KR 1020040068379 A KR1020040068379 A KR 1020040068379A KR 20040068379 A KR20040068379 A KR 20040068379A KR 20040084876 A KR20040084876 A KR 20040084876A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pepper
transgenic
pepest
plant
pepdef
Prior art date
Application number
KR1020040068379A
Other languages
English (en)
Inventor
김영순
고문경
서효현
조정현
송필순
Original Assignee
금호석유화학 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 금호석유화학 주식회사 filed Critical 금호석유화학 주식회사
Priority to KR1020040068379A priority Critical patent/KR20040084876A/ko
Publication of KR20040084876A publication Critical patent/KR20040084876A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

안정한 고추 형질전환이 아그로박테리움 매개 방법을 이용하여 수립되었다. 고추 식물은 PepEST 또는 PepDef 유전자로 형질전환되었고 식물 내 핵산 서열의 발현은 야생형 식물과 비교하여 진균 감염에 대한 증가된 저항성을 나타내었다. 형질전환 식물에 의해 생성된 종자를 포함한 농작물이 제공된다. 또한 각각 PepEST 및 PepDef를 코드하는 핵산을 포함한 벡터 및 숙주 세포가 제공된다.

Description

고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발{Fungal resistant transgenic pepper plants and their production method}
본 발명은 탄저균에 저항성인 형질전환 고추 및 상기 형질전환 고추의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 PepEST 또는 PepDer 유전자를 지니는 신규한 특이적 고추 형질전환계뿐만 아니라 이의 제조방법에 관한 것이다.
고추(Capsicum annumL.)는 전세계적으로 고소득 농작물로 특징지워진 중요한 채소 농작물이다. 그러나 모든 통상적인 품종이 탄저균에 민감하고 연간 산출량의 10∼15% 손실을 유발한다. 따라서 고추 생물공학의 현재 목표는 탄저균에 대한 고추의 저항성을 증가시키는 것이다. 현재 고추의 형질전환이 게놈 내로 유용한 유전자를 도입시키기에 일반적으로 적용가능하지 않기 때문에 고추의 개선은 통상적인 품종개량에 제한되어 있다.
식물의 형질전환 시스템은 효과적인 식물 재생뿐만 아니라 유전자 전달방법에 유능한 조직 배양을 요구한다. 고추에서 조직 배양 기술이 체세포 배아 및 반수체 식물을 제조하는데 사용되었다. 또한 그의 '시험관 내' 재생이 많은 실험실에 의해 보고되었다. 이러한 종의 조직 배양 장점에도 불구하고 고추는 유전적으로 형질전환되기 어려운 식물로 알려져 있다. 최근 고추를 형질전환시키는 시도가 있었으나 유전적으로 안정한 형질전환 고추에 대한 보고가 없었다. 여기서 우리는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 효과적인 고추의 형질전환 방법을 수립하였고 형질전환 고추의 트랜스유전자의 안정한 유전을 증명하였다.
식물 형질전환은 원하는 유전자의 식물 게놈 내로의 이전 및 형질전환된 세로포부터 전체 식물의 재생을 포함한다. 유전자를 식물 내로 이전시키기 위해 아그로박테리움이 많은 식물 종에 널리 사용된다. 아그로박테리움 감염 및 유전자 이전은 식물 내 상처 부위에서 발생한다. 고추의 경우 아그로박테리움 감염은 감염 부위에서 페놀 화합물의 과도한 축적을 유발하고, 조직의 더한 생장이 저지된다. 따라서 조직 배양 방법의 프로토콜은 아그로박테리움 감염 후 생장 지연을 회피하도록 고안되었다. 이후 형질전환체는 항생제를 지닌 조직 배양 배지 내에서 분열하고 생장하는 능력에 의해 선택되었다. 여기서 우리는 아그로박테리움을 이용하여 재생가능한 고추의 안정한 형질전환 방법을 보고한다.
유전공학의 도래로 PepEST(미국특허 제6,018,038호) 및 PepDef(미국특허 제6,300,489호)와 같은 질병 저항 유전자의 도입은 형질전환 고추의 개발을 이끌었다. 에스테라제의 멤버를 인코드하는 PepEST 유전자는 숙성 고추 열매로부터 분리되었고 탄저균에 대한 비양립성 감염을 나타내었다. PepEST 단백질은 아프레소리움(appresorium) 형성을 저지하고 질병-저항성 신호 경로를 활성화함으로서 식물-병원균 상호적용에서의 이중 역할 즉, 진균성 감염의 억제를 지시한다. 반대로 많은 식물 디펜신(defensin)은 마이크로몰 농도에서 광범위한 진균의 생장을 억제할 수 있으나 포유류 및 식물 세포 모두에 비독성이다. 식물 디펜신은 초파리(Drosophila melasnogaster)에서 발견된 항균성 펩타이드인 드로소마이신(drosomycin)과 같은 곤충 디펜신에 구조적으로 관련된다. 디펜신 패밀리에 속하는 PepDef 단백질은 항균 활성을 지닌 작은 시스테인-리치(cystein-rich) 펩타이드이다. 따라서 PepEST 및 PepDef 유전자 각각은 탄저균성 질병을 제어하기 위해 고추 식물 내로 도입되었다. 본 발명은 PepEST 또는 PepDef 유전자를 지닌 신규한 특이적 고추 형질전환계 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 탄저균에 저항성인 형질전환 고추 및 상기 형질전환 고추의 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 PepEST 또는 PepDer 유전자를 지니는 신규한 특이적 고추 형질전환계뿐만 아니라 이의 제조방법을 제공한다.
도 1은 형질전환 고추 외식편의 생장 및 재생을 나타낸 것이다. 형질전환되지 않은 야생형(WT) 및 형질전환된(T) 배축 외식편의 하이그로마이신(hygromycin) B에 대한 민감도가 0, 5, 10, 20, 50 mg/l의 하이그로마이신 B를 함유한 슈트 유도 배지를 이용함으로서 측정되었다(A). 하이그로마이신 B 상에서 생장한 배축 외식편의 중량(B).
도 2는 형질전환 고추 식물 내 GUS 유전자의 통합 및 발현을 나타낸 것이다. 게놈 DNA는 T-DNA 내에서 단일 절단을 생성하는 효소로 분해되었다.32P-표지된 GUS 프로브가 하이브리디제이션에 사용되었다. 결과는 pCAMBIA1301의 T-DNA의 단일 카피가 각각의 형질전환계 내에 통합되었음을 나타낸다(A). 9개의 개별적 형질전환 고추가 pCAMBIA 1301 또는 1304를 지닌 아그로박테리움 감염 후 GUS 발현에 대해 분석되었다. 결과는 GUS 유전자가 시험된 9개 형질전환계에 발현되었다(B).
도 3은 GUS 수용체 유전자를 포함한 형질전환 고추로부터의 다양한 조직 자체(A-a) 또는 추출물(A-b) 내에서 처리된 GUS 특이적 활성을 나타낸 것이다. T1형질전환 식물은 하이그로마이신 B 저항성을 이용함으로서 T0식물의 자손으로부터 스크린되었다. 또한 GUS 염색은 형질전환된 자손 내의 GUS 유전자 발현을 조사하는데 사용되었다. 형질전환 고추의 수확된 종자 21개 중(No. 2) 15 묘목이 하이그로마이신 B(20 mg/ml)에 대한 저항성을 나타내는 형질전환 자손으로 생장하였다. 모든 저항성 식물은 GUS 양성이었다(B).
도 4는 형질전환 고추 식물(PepEST-TP) 내 PepEST 유전자의 통합 및 발현을 나타낸 것이다. 게놈 DNA는 T-DNA 내에서 단일 컷을 생성하는 HindⅢ 제한효소로 분해되었다.32P-표지된 PepEST 프로브는 하이브리디제이션에 사용되었다. 결과는 T-DNA의 1 또는 2 카피가 각각의 형질전환계(A-a) 게놈 내로 통합되었다. 7개 형질전환계가 노던 하이브리디제이션에 의해 PepEST 유전자의 발현에 대해 분석되었다(A-b), 더욱이 T1묘목은 T-DNA의 안정한 유전을 나타내었다(B). 형질전환 식물(No. 21)로부터 유도된 형질전환 자손의 서던 블롯팅은 HPT 뿐만 아니라 그의 부모 식물 내에서 나타난 PepEST 유전자의 동일한 통합된 패턴을 나타내었다.
도 5는 형질전환 식물(PepEST-TP)로부터 추출된 용해성 단백질의 SDS-PAGE(A-a) 및 PepEST 단백질 밴드를 나타내는 (a)에서와 동일한 프랙션의 웨스턴 분석을 나타낸 것이다. PepEST 단백질의 양은 ELISA 방법을 이용하여 용해성 단백질 내에서 측정되었다(B).
도 6은 PepEST 또는 PepDef를 지니는 형질전환 식물로부터의 미숙성 고추 열매의 저항성을 나타낸 것이다. 접종된 열매는 탄저균의 감염 9일 후에 사진촬영되었다. 대조군으로서 야생형의 미숙성 열매가 사용되었다.
본 발명에 따라 각각PepEST형질전환 고추(PepEST-TP) 및PepDef형질전환 고추(PepDef-TP)로 명명된 신규한 형질전환 고추 라인이 제공된다. 따라서 본 발명은 형질전환 고추 계통, 형질전환 고추 계통의 종자 및 아그로박테리움에 의해 매개된 형질전환 고추 식물의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 형질전환 PepEST-TP 및 PepDef-TP로부터 유도된 다른 형질전환 고추 계통의 수립에 관한 것이다. 본 발명은 다른 고추 계통으로 형질전환 PepEST-TP 및/또는 PepDef-TP를 교차시킴으로서 제조된 식물을 잡종 식물에 관한 것이다.
이하 본 발명의 실시태양을 통해 상세히 설명한다.
식물 물질
고추 종자는 0.2% 차아염소산나트륨 내에서 5분간 표면 멸균되고 멸균 증류수로 여러 차례 세척된 후 암 조건에서 Murashige and Skoog(MS) 배지 상에서 발아되었다. 인큐베이션 7일 후 묘목은 6시간 동안 광에 노출되었다. 이후 자엽 및 배축이 아그로박테리움 접종을 위해 절제되었다.
PepDef 유전자(서열번호: 1) 및 PepEST 유전자(서열번호: 2)의 전체 길이 cDNA가 고추로부터 분리되었다. PepEST cDNA는 BamHI 제한 사이트를 지닌 전방 프라이머 서열(5'- ggatccaaaatggctagccaaagttttgttcc-3': 서열번호: 3) 및 역 프라이머 서열(5'-aatttgtagtagcacatatgaa-3': 서열번호: 4)을 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 본 단편은 BamHI- 및 SmaI-분해된 pBI121 내로 서브클론되었다. 이후 발현 카세트는 HindⅢ 및 EcoRI로 제한되었고 pCAMBIA1300의 클로닝 사이트 내로 결찰되었고 pCAM-EST로 명명되었다. PepDef cDNA를 클론하기 위해 XbaI를 지닌 전방용(5;-gggtctagaaaaatggctggcttttccaaagtg- 3': 서열번호: 5) 및 BamHI를 지닌 역방용(5'-ctcggatcctaattaagcacagggcttcgt-3': 서열번호: 6) 프라이머가 사용되었다. 이후 PCR 생성물은 pCAMBIA1300 내로 클론되었고 pCAM-Def로 명명되었다. 마지막으로 플라스미드 DNA는 각각 A. 튜메파시엔스 GV3101 내로 동원되었다.
식물 형질전환을 위해 이원 벡터를 지니는 아그로박테리움 스트레인 GV3101이 사용되었다. 아그로박테리아는 28℃의 YEP 배지 내에서 로그 페이스로 배양되었다. 박테리아는 독성(virulence)를 유도하기 위해 20 μM 아세토시린곤(acetosyringon)을 함유한 MS 약체 배지 내에서 4시간 동안 재현탁되고 교반되었다.
고추 형질전환
배축으로부터 절제된 고추 외식편이 아그로박테리움으로의 접종 전에 CIM 배지(0.5 mg/l IAA 및 0.2 mg/제아틴이 보충된 MS 배지) 상에서 인큐베이트되었다. 인큐베이션 48시간 후 외식편은 5분간 아그로박테리움 현탁액 내에 침수되었고, 블롯-건조되었고, CIM 배지 상에서 암조건의 28℃로 48시간 동안 동시-배양되었다. 감염된 외식편은 2주간 500 mg/l 세포탁심(cefotaxime) 및 20 mg/l 하이그로마이신 B를 지닌 CIM 배지로 선택을 위해 옮겨졌다. 이후 2주마디 외식편은 슈트 재생을 유도하기 위해 2가지 모두의 항생제를 함유한 SIM 배지(0.2 mg/l IAA 및 1 mg/l 제아틴이 보충된 MS 배지) 상으로 서브클론되었다. 캘러스로부터 재생된 슈트는 10 mg/l 하이그로마이신 B를 함유한 MS 배지 상에서 뿌리생장되었다. 수립된 묘목(plantlet)은 더한 분석을 위해 비닐하우스에 순응되었다.
형질전환 자손의 유전 분석
형질전환 고추 라인은 비닐하우스에서 유지되었고 종자를 생성시키기 위해 자가-수분되었다. 형질전환 자손은hpt유전자에 의해 제공된 하이그로마이신 저항성에 의해 스크린되었다. T0형질전환 고추의 종자는 표면 멸균되었고 발아를 위해 7일간 20 mg/l 하이그로마이신 B를 함유한 반 강도의 MS 배지 상에 놓였다. 마지막으로 건강한 녹색 식물이 카운트되었고 토양으로 옮겨졌다.
PCR에 의한 형질전환 고추의 스크리닝
중합효소 연쇄 반응(PCR)이 트랜스유전자의 존재를 조사하기 위해 추정되는 형질전환 식물 및 그의 자손으로부터 게놈 DNA로 수행되었다. 특정한 프라이머 세트가 각각 GUS, PepEST 및 PepDef를 증폭시키는데 사용되었다. 프라이머 세트는 (ⅰ) 뉴클레오타이드 포지션 847-874에 상응하는 CaMV35S 프로모터의 서열에 기초하여 고안된 전방 프라이머 및 (ⅱ) 각 유전자에 대해 상기 기술된 역방 프라이머로 구성된다. PCR 조건은 94℃에서 5분, 94℃의 35 사이클 30초 및 72℃에서 1분 연장 기간을 지닌 60℃에서의 어닐링 30초이다. 증폭된 단편은 1% 아가로스 겔 상에서 분리되었다.
서던 분석
선택된 형질전환 고추 식물로부터의 게놈 DNA는 서던 하이브리디제이션에 사용되었다. 10 ㎍의 게놈 DNA가 HidⅢ 또는 EcoRI 50 유니트로 밤새 분해되었다. DNA 겔 블롯팅이 수행된 후 프리하이브리디제이션이 65℃에서 2시간 동안 수행되었고, 프리하이브리디제이션 용액 내에서 [α-32P] dCTP-표지된 cDNA 프로브로 65℃에서 밤새 하이브리디제이션되었다. 방사성동위원소 표지된 프로브는 무작위 프라이머-표지 키트를 이용하여 제조되었다. 이후 블롯은 2X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 10분간 1회, 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 1회 세척되었다. 블롯은 X-선 필름에 노출되었다.
노던 분석
총 RNA는 RNeasy Plant Kit(Qiagen)에 의해 제조사의 지침에 따라 개별적 형질전환 고추로부터 추출되었고 -80℃에서 보관되었다. RNA 겔 블롯팅이 수행되었고 프리하이브리디제이션이 65℃에서 2시간 동안 수행되었고, 프리하이브리디제이션 용액 내에서 [α-32P] dCTP-표지된 cDNA 프로브로 65℃에서 밤새 하이브리디제이션되었다. 블롯은 2X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 10분간 1회, 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 1회 세척되었다. 블롯은 X-선 필름에 노출되었다. 방사성동위원소 표지된 프로브는 무작위 프라이머-표지 키트를 이용하여 제조되었다.
GUS 효소 에세이
형질전환 식물의 GUS 조직화학 염색이 Jefferson et al(1987)에 의해 기술된 바와 같이 37℃에서 50 mM NaPO4(pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM K3[Fe(CN)6], 0.5 mM K4[Fe(CN)6], 0.1% 살코실(sarcosyl), 0.1% β-멀캅토에탄올, 0.1% 트리톤 X-100, 1 mg/ml X-gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산)의 용액 내에서 밤새 수행되었다. 다양한 기관으로부터의 조직 표본의 GUS 플루오로제닉 에세이(fluorogenic assay)이 Jefferson et al(1987)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 추출물은 GUS 활성에 대해 분석되었고 단백질 농도는 Bradford 에세이(Bio-Rad)에 의해 결정되었다. 시간 간격에 따른 형광은 TD-700 플루오로미터(Turner Design, 미국)를 이용하여 320∼390 nm에서의 여기(excitation) 및 415∼650 nm에서의 방사에 의해 측정되었고 기울기가 측정되었다. GUS 효소의 특정 활성은 pmol 4-메틸 움벨리페론(methyl umbelliferone, MU) 분/mg 총 단백질로서 계산되었다. GUS 활성은 3 반복 에세이의 평균으로부터 평가되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅
단백질 표본은 잎 또는 열매로부터 2X 로딩 완충액 내로 직접 추출되었고 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 단백질 농도는 Bradford 에세이(Bio-Rad)에 의해측정되었다. 단백질은 PVDF 멤브레인(Bio-Rad)로 옮겨졌고 TBS(10 mM Tris(pH 8.0), 150 mM NaCl) 내의 5% 스킴 밀크 파우더에 의해 블록되었다. 폴리클론 항-PepEST 토끼 IgG가 5% 블록킹 용액 내에서 1 : 4000로 희석되어 사용되었다. 항-PepDef는 1 : 3000로 희석되어 사용되었다. 단백질은 ECL 화학발광 블럿팅 기질(Amersham)을 이용하여 퍼옥시다제(Sigma)에 컨쥬게이트된 마우스 항-토끼 IgG의 1 : 8000 희석을 이용하여 검출되었다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색되었다.
ELISA
단백질은 형질전환 식물의 잎 재료로부터 분리되었고 단백질 농도는 Bradford(1976)에 따라 비가공 추출물 내에서 측정되었다. 용해성 단백질 프랙션은 PepEST 또는 PepDef의 양을 측정하기 위해 ELISA되었다.
형질전환 식물의 저항성 평가
탄저균의 포자는 28℃에서 감자 덱스트로스 아가(PDA) 배지 상에서 배양되었다. 포자는 수집되고 멸균수에 희석되었다. 이후 포자 현탁액은 2겹의 거즈로 여과되었고 여과물은 5분간 1,500 rpm에서 원심분리되었다. 분생자의 침전물이 5X 105/ml으로 조정된 농도로 멸균수에 재현탁되었다.
C. 글로에오스포리오이데스(gloeosporioides)로의 접종은 성체 미숙성-녹색 열매 상에 10 ㎕의 포자 현탁액을 적용함으로서 수행되었다. 포자 현탁액을 지닌 열매는 28℃에서 암조건으로 균사 발아에 의해 감염을 자극시키기 위해 2일간 높은 습도에 놓였다. 이후 열매는 그로스 챔버 내에서 더욱 인큐베이트되었다. 감염된 열매가 드롭-접종된 지역에서 별도로 수집되었다. 대조군으로서 10 ㎕의 증류수가 미숙성 고추 열매 상에 적용되었다.
(실시예)
(실시예 1) 식물 발현 벡터의 구조
이원 벡터 pCAMBIA1300이 식물 발현 벡터에 대한 골격으로서 사용되었다. CaMV35S 프로모터 및 Nos 종결자에 의해 조종된 저항성 유전자를 함유한 발현 카세트는 pCAMBIA1300의 멀티-클로닝 사이트 내로 클론되었다. 수득된 발현 벡터는 각각 PepEST 및 PepDef를 지녔고 pCAM-EST 및 pCAM-Def로 명명되었다. 벡터의 T-DNA 구역은 CaMV35S 프로모터에 의해 조종된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phophotransferas, HPT) 유전자 및 유전자 발현 카세트를 지닌다.
(실시예 2) 고추 형질전환
고추 외식편에 대한 재생 조건을 최적화하기 위해 외식편은 다양한 농도의 옥신 및 시토키닌 상에서 시험되었다; 슈트 재생에 대한 최상의 조합은 각각 0.1∼0.5 및 1∼2 mg/L의 IAA 및 제아틴이었다. 시험된 많은 유전형이 이들 조건에서 잘 재생되었다. 식물의 연령은 재생 및 형질전환 모두에 일부 영향을 미쳤다. 무균성 식물은 7일간 암조건으로 발아되어야 하고 사용 바로 전 6시간 동안 광에 조명되어야 한다. 외식편은 실제 입의 출현 전에 분리되어야 한다.
아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 고추 외식편 상의 감염 동안 pH, 온도, 화학물질과 같이 다양한 방식으로 시험되었다. 하이그로마이신 B(20 mg/l)의 높은 투여량 하에서 감여된 외식편 상의 캘러스 발달을 스코어하였다. 캘러스 형성은 26℃, pH 5.5의 배지 상에서 접종 후 효과적으로 발생하였다. 접종의 지속기간은 형질전환 빈도 상에 영향을 미쳤다. 더 긴 접종 시간이 고추 외식편의 갈변을 유발하였다. 따라서 2일간의 접종이 아그로박테리움으로의 외식편 동시배양에 최적이었다.
외식편이 어린 배축 및 자엽으로부터 분리되었기 때문에 슈트 발달에 대한 효과적인 형태학적 잠재력을 보유하였다. 특히, 새로운(de novo) 재생 외식편의상부에 발생하였다. 외식편의 녹색 부분으로부터의 농축된 엽액 슈트를 쉽게 발견할 수 있다. 따라서 선택 배지 내 항생제의 약한 강도가 '의사 양성 슈트'의 생장을 적당하게 억제하지 않기 때문에 엄격한 선택 조건 하에서 형질전환된 세포를 선택하는 것이 중요하다. 더욱이 의사 양성 슈트는 형질전환 세포의 분열을 완전하게 차단한다. 외식편의 녹화는 광을 제한함으로서 또한 높은 하이그로마이신 B 농도에 의해 억제될 수 있다. 건강한 형질전환 캘러스가 외식편의 절단 가장자리로부터 발달되었다. 이후 형질전환 캘러스는 20 mg/l 하이그로마이신 B를 함유한 슈트 유도 배지 상에서 슈트를 재생시키게 되었다.
(실시예 3) 고추 세포의 하이그로마이신 민감도
도 1은 0, 5 10, 20 및 100 mg/l 하이그로마이신 B로 보충된 SIM 배지 상에서의 고추 세포의 상대 생장을 나타낸다. 5 mg/l 농도의 항생제가 배양 14일 후 생장에 심한 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 형질전환 세포는 50 mg/l까지의 하이그로마이신 B에 대한 저항성을 나타내었다. 형질전환 세포의 선택은 모든 실험에서 20 mg/l 하이그로마이신 B를 함유한 배지 내에서 수행되었다.
(실시예 4) GUS 유전자 발현 형질전환계
효과적인 고추 형질전환 방법이 선택 배지 상에서의 고추의 슈트 재생 시스템에 기초하여 수립되었다. 형질전환 시스템의 신뢰성을 시험하기 위해 GUS 수용체 유전자가 고추 식물 내로 도입되었다. pCAMBIA1301 또는 1304를 지닌 아그로박테리움으로 접종된 고추 외식편은 안정하게 형질전환 캘러스 및 식물으 생성할 수 있었다. GUS 유전자의 통합 및 발현은 각각 서던 및 노던 하이브리디제이션에 의해 확인되었다(도 2). 형질전환 고추 내의 GUS 효소 활성은 조직화학 및 형광계 방법에 의해 분석되었다. pCAMBIA1301을 지니는 아그로박테리움으로의 외식편 접종은 어떠한 일시적 GUS 활성도 나타내지 않는 것으로 나타났다. GUS 활성의 부재는 pCAMBIA1301 벡터의 GUS 코딩 프레임을 지닌 CAT 인트론의 존재에 기인하였다. 결과는 CaMV35S 프로모터의 조절 하에서의 GUS 유전자의 발현이 형질전환 고추 내 식물 발달과 전체적으로 일치함을 나타내었다(도 3A). 형질전환 식물의 모든 자손(T1)은 하이그로마이신 저항성에 대한 예측된 격리 패턴을 나타내었고 이는 T-DNA가 세대를 통해 자손에 안정하게 유지됨을 나타내었다(도 3B).
(실시예 5) PepEST 단백질을 과발현하는 형질전환계
에스테라제를 인코드하는 PepEST가 성숙 고추 열매 내로 클론되어 탄저균에 대한 저항성을 나타내었다(Kim et al., 2001). 질병 저항성에 대한 PepEST 유전자의 기능을 조사하기 위해 그의 유전자가 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 고추 내로 도입되었다. 식물 내에서 36.5 kDa PepEST 단백질을 발현시키기 위해 cDNA 서열이 CaMV35S와 Nos 종결자 사이에 플라스미드 pCAMBIA1300 내로 결찰되었다. 형질전환 식물에서 서던 및 노던 분석이 PepEST 서열을 이용한 트랜스유전자의 존재 및 발현을 확인하기 위해 수행되었다(도 4A). 또한 격리 분석이 하이그로마이신 B를 함유한 배지 상에서 셀페드(selfed) 형질전환 식물로부터 묘목을 선택함으로서 자손에서 수행되었다. 결과는 트랜스유전자가 식물의 게놈 내로의 T-DNA 통합을 통해 안정하게 유지되었음을 나타낸다(도 4B). PepEST 단백질의 축적은 웨스턴 블롯 및 ELISA 에세이에 의해 조사되었다. PepEST 폴리클론 항혈청에 의해 특이적으로 인식된 단백질 밴드는 7개 형질전환 유전자 내의 PepEST의 발현을 확인하였다(도 5A). PepEST는 형질전환 식물 내 0.01%의 용해성 단백질로 간주되었다(도 5B).
(실시예 6) PepDef를 과발현하는 형질전환계
고추 디펜신, PepDef는 과일 숙성 동안 높게 축적되었다. PepDef의 역할은 생물적 및 무생물적 스트레스에 대한 생식 기관을 보호하는 것으로 제안되었다(Oh et al., 1999). PepDef의 제안된 기능에 기초하여 C. 글로에오스포리오이데스에 대한 형질전환 저항성 고추를 생성하기 위해 키메라 컨스트럭트가 고안되었다. PepDef 유전자의 전사는 CaMV35S와 Nos 종결자의 제어 하에 놓였다.
컨스트럭트는 아그로박테리움 스트레인 GV3101을 이용하여 고추 내로 형질전환되었다. 형질전환 식물을 스크린하기 위해 PCR이 전방 프라이머로서 CaMV35S 프로모터로부터의 서열과 역방 프라이머로서 PepDef cDNA의 3'-비번역 구역으로부터의 서열을 결합함으로서 구조되었다. 형질전환 고추 종자는 개별적 형질전환계로부터 수집되었다(데이터는 나타나지 않음).
(실시예 7) PepEST 또는 PepDef를 발현하는 형질전환 고추 열매 내 C. 글로에오스포리오이데스에 대한 질병 저항성
형질전환 식물 내 질병 저항성을 분석하기 위해 독성 C. 글로에오스포리오이데스의 분생자가 형질전환 고추의 미숙성 열매를 접종시키는데 사용되었다. 형질전환 열매는 건강하게 유지되었으나 야생형 식물로부터의 미숙성 열매는 전형적인 탄저병 징후를 발달시켰다. 도 6에 나타난 바와 같이 형질전환 열매는 탄저병에 대한 높은 수준의 질병 저항성을 나타내었다. 이들 결과는 고추 내의 탄저병에 대한 유전적 저항성의 신규한 공급원으로서의 PepEST 또는 PepDef의 이용을 증명한다. 또한 형질전환 고추가 탄저균에 대한 저항성의 고추 라인을 생성하는 실용적인 품종개량에 적용될 수 있음을 제안한다.
본 발명의 효과는 형질전환 고추 계통, 형질전환 고추 계통의 종자 및 아그로박테리움에 의해 매개된 형질전환 고추 식물의 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 형질전환 PepEST-TP 및 PepDef-TP로부터 유도된 다른 형질전환 고추 계통을 수립한다. 한편 본 발명은 다른 고추 계통으로 형질전환 PepEST-TP 및 또는 PepDef-TP를 교차시킴으로서 제조된 식물을 잡종 식물을 제공한다.
<110> KOREA KUMHO PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> FUNGAL RESISTANT TRANSGENIC PEPPER PLANTS AND THEIR PRODUCTION METHOD <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 225 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 atggctggct tttccaaagt ggttgcaact atttttctta tgatgttgct ggtttttgct 60 actgatatga tggcggaggc aaagatctgc gaggcgttga gcggcaactt caaggggttg 120 tgccttagta gccgcgattg tggtaatgtt tgccgtagag agggatttac cgatggctct 180 tgcattggat tccgtcttca atgcttctgc acgaagccct gtgct 225 <210> 2 <211> 1217 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 2 ttatctgtgt gatcaattat tatggctagc caaagttttg ttcctccaat ttttgaaaat 60 ccctttctta acattgaaga attagcaggt gacacaattg tacgtaaacc tgaacccctc 120 acacaagcca attctgatcc caatggcacg tccttagttg tatctaaaga cgtagacctt 180 gacatcaaca aaaagacatg gctgcgaata tacgtcccac aacgaataat cacaaatcat 240 aatgatgatg aaaaattgcc tgtcattttc tactaccatg gtggaggctt tgttttcttc 300 catgccaata gttttgcctg ggatttgttt tgtcaaggac ttgctggaaa ccttggggca 360 atggttatct cccttgaatt tcgtctggcc cctgaaaatc gccttcctgc agcttacgac 420 gatgccatgg atgggttata ttggattaaa tcaactcaag atgaatgggt ccgaaaatat 480 tcagatttga gtaacgttta tctttttgga tctagttgcg gtggaaacat agcttaccat 540 gcagggttac gggtagcagc tggggcatat aaagaactag agccagtgaa gatcaaaggg 600 ctaattttgc atcaaccata tttcagtgga aaaaacagga cagaatctga agagaagcta 660 aaggatgatc aacttttgcc attacatgca attgacaaaa tgttcgactt gtccttgcca 720 aaagggacac ttgatcatga tcatgaatat tccaatccat ttcttaatgg agggtccaag 780 catttagatg atgtgatcgc acaaggctgg aagattcttg taactggtgt ctctggagat 840 cctctggttg ataatgcgcg caactttgca aattttatgg aagaaaaagg cataaaaact 900 ttcaagctct ttggagatgg ttatcatgca attgaggggt ttgaaccatc aaaggcagca 960 gctttaattg gcgccaccaa agatttcata tgtgctacta caaattaaaa atatgtaacg 1020 tagcatcctg ctagcgttgt gtttgtttca tttccttcaa ataaatcaag tgagcttctt 1080 tgtgcaaata agaggggttt acaccctcct tcctgttaga gattacttta aaatattata 1140 tttctcttga agatcaaagt tttagagatg agttattgct gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaa 1217 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccaaaa tggctagcca aagttttgtt cc 32 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatttgtagt agcacatatg aa 22 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gggtctagaa aaatggctgg cttttccaaa gtg 33 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcggatcct aattgagcac agggcttcgt 30

Claims (7)

  1. a) 고추 디펜신(PepDef) 유전자(서열번호: 1) 또는 고추 에스테라제(PepEST) 유전자(서열번호: 2)를 지니는 폴리뉴클레오타이드; 및
    b) 상기 폴리뉴클레오타이드가 고추 세포 내에서 발현되도록 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을
    포함하고 :
    상기 발현은 상기 고추 세포 내에서 상기 고추 디펜신(PepDef) 또는 고추 에스테라제(PepEST)의 과발현을 유발함을 특징으로 하는 고추 세포의 형질전환을 위한 발현 벡터
  2. 제 1항의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 고추 세포
  3. 제 2항의 형질전환 고추 세포로부터 생장된 형질전환 고추 식물
  4. 제 1항의 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 제 3항의 형질전환 고추 식물의 자손
  5. ⅰ) 형질전환 고추 식물을 생성하기 위해 제 1항의 벡터를 적어도 하나 이상의 고추 식물 세포이 게놈 내로 도입시키고;
    ⅱ) 고추 디펜신(PepDef) 또는 고추 에스테라제(PepEST)를 인코드하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 형질전환 고추 식물 내에서 과발현됨을 특징으로 하는 상기 형질전환 고추 식물을 생장시키는 것을
    포함한 고추 식물 내 고추 디펜신(PepDef) 또는 고추 에스테라제(PepEST)의 과발현 방법
  6. 제 5항에 있어서, 상기 고추 디펜신(PepDef)의 과발현은 생물적 및 무생물적 스트레스에 대한 고추 생식 기관의 보호를 부여함을 특징으로 하는 방법
  7. 제 5항에 있어서, 상기 고추 에스테라제(PepEST)의 과발현은 고추 내 탄저균에 대한 유전적 저항성을 부여함을 특징으로 하는 방법
KR1020040068379A 2004-08-30 2004-08-30 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발 KR20040084876A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040068379A KR20040084876A (ko) 2004-08-30 2004-08-30 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040068379A KR20040084876A (ko) 2004-08-30 2004-08-30 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20040084876A true KR20040084876A (ko) 2004-10-06

Family

ID=37368182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040068379A KR20040084876A (ko) 2004-08-30 2004-08-30 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20040084876A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101145689B1 (ko) * 2009-12-09 2012-05-24 전남대학교산학협력단 제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101145689B1 (ko) * 2009-12-09 2012-05-24 전남대학교산학협력단 제초제 저항성 및 병 저항성을 갖는 형질전환 잔디

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dutta et al. Constitutive and phloem specific expression of Allium sativum leaf agglutinin (ASAL) to engineer aphid (Lipaphis erysimi) resistance in transgenic Indian mustard (Brassica juncea)
EP2465933B1 (en) Disease-inducible promoters
Li et al. FveRGA1, encoding a DELLA protein, negatively regulates runner production in Fragaria vesca
Liu et al. Transgenic Brassica napus L. lines carrying a two gene construct demonstrate enhanced resistance against Plutella xylostella and Sclerotinia sclerotiorum
JP5608552B2 (ja) 改変プロモーターを使用する植物老化の操作
CN111134006A (zh) 一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用
Rani et al. Fusion gene construct preparation with lectin and protease inhibitor genes against aphids and efficient genetic transformation of Brassica juncea using cotyledons explants
JP2010524474A5 (ko)
US5770786A (en) Method for the isolation and/or testing of genes and promoters involved in plant-nematode interactions using plants of the genus arabidopsis
CN108192920B (zh) 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法
CN110714023B (zh) 番茄cti1基因在提高植物根结线虫抗性中的应用
US20060037100A1 (en) Fungal resistant transgenic pepper plants and their production method
Ignacimuthu et al. Agrobacterium-mediated transformation of an elite indica rice for insect resistance
Ko et al. Stable production of transgenic pepper plants mediated by Agrobacterium tumefaciens
EP0967278A2 (en) Flowering regulating gene and its use
CN110914436B (zh) 包含转基因事件CIGBDt-Def1或CIGBIs-Def5的大豆植物
KR20040084876A (ko) 고추 형질전환 방법 및 병 저항성 고추 형질전환체 개발
EP1169463B1 (en) Method for conveying bnyvv resistance to sugar beet plants
KR100255474B1 (ko) 형질전환된 벼 고엽고 바이러스 저항성 벼 및 그 제조방법
JP5858368B2 (ja) 農業形質を最適化した複合病害抵抗性単子葉植物
US8399739B2 (en) Manipulation of plant senescence using modified promoters
WO2010093015A1 (ja) 冠水応答関連遺伝子及びその利用
JP2020043830A (ja) 植物師部組織を増産する植物体及びその利用
CN114891801B (zh) 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
JP4953050B2 (ja) 植物の節特異的遺伝子発現プロモーター、およびその利用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application