KR20040084377A - 항염증 활성을 갖는 클로렐라 추출물을 함유하는 화장료조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 클로렐라 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 클로렐라 추출물은 염증반응에 관여하는 대식세포에서의 산화질소와 수퍼옥사이드 음이온의 생성과 NF-κB활성을 억제하여 항염증 작용을 나타내므로, 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물을 제공한다.

Description

항염증 활성을 갖는 클로렐라 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising an extract of Chlorella having anti-inflammatory activity}
본 발명은 항염증 활성을 갖는 클로렐라 추출물을 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물에 관한 것이다.
화장품은 인체를 청결 또는 미화하기 위하여 바르거나 뿌리는 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 변화 혹은 기능장애를 초래하지 않아야 한다. 화장품 원료는 과거부터 현재에 이르기까지 각 시대의 요청에 따라 조금씩 변화되어 왔는데, 과거에는 합성 화학물질을 많이 사용하였으나 최근들어 천연물을 이용한 화장품이 많이 등장하였다. 그러나 아직까지도 화장품에는 필수적으로 사용되는 성분들 중에 방부제, 계면활성제, 색소, 자외선 흡수제 및 기타 성분들이 오히려 피부세포를 자극하거나, 알레르기 반응을 일으키거나 하여 결국에는 피부에 염증을 유발시킴으로써 피부 부작용의 원인이 될 수 있다. 또한 체내로부터 배출된 피지성분, 땀성분 및 화장품 성분 중의 지방산, 고급알콜, 단백질 등이 피부상에 존재하는 피부상재균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 이들에 의해 피부염증이 유발될 수도 있으며, 태양의 자외선에 의해서도 피부에 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다. 특히 방부제는 모두 화학 합성을 통해 제조되어 방부제의 기능을 수행하고 있으나, 소량의 사용에 의해서도 피부의 자극성과 독성이 크기 때문에 피부 알러지(Andrea Countiet al.,Contact Dematitis,37, pp35-36, 1997), 피부 부종을 발생시키는 문제점이 있고, 그 외 향료 등 각각의 구성 성분에 의하여여러 가지 부작용이 발생할 가능성이 있다(Maibach H. I.,Contact Dermatitis,6, pp369-404, 1980). 또한, 최근에는 기능성 화장품에 대한 요구가 증대되면서 피부에 다소 부작용이 있더라도 각종 기능을 가진 성분을 포함한 다양한 화장품이 개발되고 있다. 화장품 부작용의 증상은 화장품 알레르기, 화장품에 의한 자극피부염, 기존에 있던 피부염이 악화되는 경우 등 3가지로 나눌 수 있다.
따라서 각각의 성분들의 효과를 최대한 증진시키고 부작용을 최소화하여 피부염증을 막아주는 것은 화장품에 있어 매우 중요한 문제로 다양한 항염물질의 개발이 필요하다.
염증이란 외부 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻하며, 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방어 반응과정으로, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 일반적으로 염증반응은 감염, 허혈, 상처 등과 같은 자극에 의해 유도되며 홍반, 부종, 통증 등과 같은 임상증상을 나타낸다. 이런 염증 반응에 관여하는 물질에는 NO(nitric oxide), 프로스타글란딘 E2, 트롬복산 등이 있다. 프로스타글란딘과 트롬복산은 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)에 의해 합성되며 외부자극에 의해 그 발현이 유도되는 COX-2는 염증반응과 암을 비롯한 퇴행성질환의 발병과 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Shenet al., Eur. J. Pharmacol., 446, pp187-194, 2002). NO는 iNOS(inducible nitiric oxide)에 의해 합성되며 대식세포에서 만들어지는 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)과 결합하여 강력한페록시니트리트(peroxynitrite)와 히드록시페록사이드(hydroxyperoxide)를 생성하여 조직을 손상시킨다(Yen and Lai,Food and Chemical Toxicology,40, pp1433-1440, 2002). 이러한 분자물질들의 발현은 전사유도인자(inducible transcription factor)인 NF-κB(nuclear factor-κB)의 신호전달에 의해 조절된다. NF-κB는 Rel 유전자과(Rel gene family)의 핵단백질이며 세포질에서는 IκB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나 활성산소(reactive oxygen), TNF-α, IL-1과 같은 케모카인(chemokines) 및 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 다양한 자극에 의해 활성화된 후 핵으로 이동하여 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Oh GT., et al.,Atherosclerosis,159(1), pp17-26, 2001; Epstein, FH., et al.,The New England J. of Medicine,336(15), pp1066-1071, 1997; Zhang WJ., et al.,FASEB J,15(13),pp2423-2432, 2001; Denk A., et al.,J. of Biol. Chem.,276(30), pp28451-28458, 2001; Sahnoun Z., et al.,Therapie,53(4), pp315-339, 1998; Lindner V., et al.,Pathobiology,66(6), pp311-320, 1998; Landry DB., et al.,Am J. of Pathol.,151(4), pp1085-1095, 1997; Gerritsen ME., et al.,Am J. of Pathol.,147(2), pp278-292, 1995). 대표적인 항염증제로 알려진 아스피린도 NF-κB의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Rainer Amann et al.,European J. of Pharmacology,447, pp1-9, 2002). 따라서, 염증반응을 조절하는 대식세포에서의 NF-κB 활성이나 NO, 수퍼옥사이드 음이온의 생성을 억제하는 물질은 항염증제로서의 효능을 가진다고 할 수 있다.
클로렐라(Chlorella)는 녹조식물 클로렐라과에 속하는 담수조류의 일종으로서, 녹민물·습지 등에서 흔히 볼 수 있으며 광합성에 의해 성장, 증식하는 독립영양성과 유기탄소원을 이용하여 증식하는 종속영양성의 두 가지 생육 성질을 갖는 단세포 식물로서 엽록소(chlorophyll a, b)를 다량 함유하고 있다. 클로렐라의 55 %를 차지하는 단백질에는 필수아미노산이 골고루 함유되어 있을 뿐만 아니라 비타민 A군, B군, 무기질을 다량 함유하고 있어 건강식품으로 알려져 있으며(김 동호, 식품저널,1, pp64-69, 1998; 박 민경,J. Korean Soc. Food Sci. Nutr.,31(2), pp225-229, 2002), 광합성능력이 뛰어나 다른 식물에 비해 증식속도가 매우 빠르고 배양하기 쉽기 때문에 일찍이 인간의 식량문제를 해결하고자 연구되어 왔다. 클로렐라의 생리적 작용으로는 다이옥신류의 해독작용(Morita K., et al.,J. Nutr.,129, pp1731-1736, 1999), 콜레스테롤 저하 작용(Shibata S. et al.,J. Nutr. Sci. Vitaminol.(Tokyo),47(6), pp373-377, 2001; Sano T. et al.,Artery,14(2), pp76-84, 1987)등의 생리활성 효과가 있는 것으로 보고되었고 클로렐라의 열수 추출물은 미생물에 대한 생육촉진효과(김 동호, 식품저널,1, pp64-69, 1998)와 항균력 증강 효과(Takashi H., et al.,International J. of Immunopharmacology,22, pp877-885, 2000)가 있는 것으로 보고되었다.
한국등록특허 제354293호에서는 클로렐라를 함유하는 혈 중 지질 개선제에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제354292호에서는 클로렐라를 함유하는 간기능 장해 개선제에 관해 개시하고 있다. 그러나 지금까지 클로렐라의 염증반응 억제효과에 대해서는 보고된 바가 없다.
또한, 상기와 같은 염증반응 억제 및 염증질환의 치료를 위해서, 여러 가지항염증 물질이 연구, 개발되었는데, 현재까지 항염의 목적으로 의약품에 사용되는 대표적인 물질로는 인도메타신이 있고, 화장품에 사용되는 대표적인 물질로는 알란토인, 비사보롤 등이 있으나, 알란토인은 물이나 오일 등에 용해도가 나빠 제품에 사용하는데 한계가 있으며, 비사보롤은 항염효과는 우수하나 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기의 문제점을 해결하기 위한 여러 가지 연구가 진행된 결과, 한국공개특허 특2002-0048703에서는 항염증 작용을 하는 프레닐화된 프라보노이드 유도체들 및 이들을 함유하는 고삼 추출물을 개시하고 있고, 한국공개특허 특2003-0001658에서는 항염증 작용을 하는 곰취 추출물 및 그 분획물에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제140293호에서는 더덕추출물이 함유된 화장료 조성물에 대해 개시하고 있으나, 클로렐라 추출물의 항염증 작용에 대해서는 개시된 것이 없다.
따라서, 본 발명에서는 클로렐라 추출물의 염증반응 억제효과를 알아보기 위해, LPS(lipopolysaccharide)로 자극시킨 RAW 264.7 동물 대식세포와 C57BL/6 생쥐에 클로렐라 추출물을 다양한 농도로 첨가하고 염증반응인자에 미치는 영향을 생화학적 분석과 더불어 분자생물학적인 실험을 통하여 실시한 결과, 본 발명에 따른 클로렐라 추출물이 대식세포에서의 NO와 수퍼옥사이드 음이온 생성 및 염증성 전사인자인 NF-κB의 활성을 뛰어나게 억제시킴으로, 항염증 효과를 갖는다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 클로렐라 추출물을 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
도 1 은 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포에 세포독성을 나타내는지를 관찰한 도이고,
도 2 는 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포의 NO 생성능에 미치는 영향을 측정한 도이며,
도 3a 및 도 3b는 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포의 NF-κB 활성에 미치는 영향을 관찰한 것으로, 도 3a는 전기영동실험결과에서 NF-κB 밴드를 확인한 도이고, 도 3b는 실험의 분석결과를 평균 ±표준편차로 표시한 도이며,
도 4 는 실험동물의 복강대식세포에서 클로렐라 추출물의 수퍼옥사이드 음이온의 생성 억제 효과를 측정한 도이고,
도 5a 및 도 5b는 실험동물에서 클로렐라 추출물의 NF-κB 활성 억제 효과를 관찰한 것으로, 도 5a는 전기영동실험결과에서 NF-κB 밴드를 확인한 도이고, 도 5b는 실험의 분석결과를 평균 ±표준편차로 표시한 도이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 항염증 효과를 나타내는 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물을 제공한다.
상기 클로렐라 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급알콜 및 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 클로렐라 추출물은 건조시켜 분쇄화 한 후, 클로렐라 건조 중량의 약 5 내지 25배, 바람직하게는 약 20배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 20 내지 50 ℃의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 50 내지 70 ℃에서 감압농축한 후 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조하여 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 클로렐라 추출물을 얻을 수 있으며, 수득된 클로렐라 추출물은 -20 ℃에서 보관하면서 실험에 이용하였다.
본 발명은 상기 방법으로 수득된 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물을 제공한다.
상기에서 수득된 클로렐라 추출물의 항염증제로서의 효능을 조사하기 위하여, LPS(lipopolysaccharide)로 자극시킨 RAW 264.7 동물 대식세포와 C57BL/6 생쥐에 클로렐라 추출물을 다양한 농도로 첨가하고 염증반응인자에 미치는 영향을 생화학적 분석과 더불어 분자생물학적인 실험을 통하여 실시한 결과, 본 발명에 따른 클로렐라 추출물이 대식세포에서의 NO와 수퍼옥사이드 음이온 생성 및 염증성 전사인자인 NF-κB의 활성을 뛰어나게 억제시킴을 확인하였다.
본 발명은 추출물의 양이 전체 화장료 조성물의 0.01 내지 30 중량 %, 바람직하게는 0.01 내지 5.0 중량 %를 갖는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물을 제공하며, 클린징, 세안제, 비누, 샴푸, 린스 및 트리트먼트에 첨가하여 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용하는 화장료 조성물의 새로운 용도를 제공한다.
본 발명의 클로렐라 추출물을 유효성분을 함유하는 조성물은 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 위한 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.
수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.
유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-α-토코페롤, d-α-토코페롤, d-δ-토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-α-토코페롤, 니코틴산dl-α-토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.
고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.
고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.
스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피트스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.
해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.
본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.
에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴·카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.
탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, α-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.
실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산,도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산·메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산·메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.
불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.
동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.
보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.
지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.
수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린등을 들 수 있다.
지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈·에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈·헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.
에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.
계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE·POP (폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE·POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.
음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.
양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.
양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민, 카본블랙 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.
유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-β-알라닌칼슘, N-라우로일-β-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; Nε-라우로일-L-리진, Nε-팔미토일리진, Nα-파리토일올니틴, Nα-라우로일아르기닌, Nα-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; α-아미노카프릴산, α-아미노라우린산 등의 α-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.
자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리친산페닐, 살리친산옥틸, 살리친산벤질, 살리친산부틸페닐, 살리친산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필·디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.
pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.
알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 ∼ 5 중량 %, 보다 바람직하게는 0.01∼ 3 중량 % 배합된다.
본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
화장료의 형태의 예로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료, 비누 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료의 구체예로서는 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드크림, 립스틱 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료는 필수성분인 클로렐라 추출물 이외에 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택되는 성분(필요에 따라 상기에 예시되는 것 이외에 첨가해도 되는 배합 성분 등)을 공지의 방법, 예를 들어 「경피 적용 제제 개발 메뉴얼」 마츠모토미치오 감수 제 1판 (세이시 서원 1985년 발행) 등에 기재된 방법에 준하여 조제함으로써 얻을 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 화장료 첨가물을 제공한다.
상기의 화장료 첨가물은 기존의 화장품 및 세안제재 등의 생산공정 과정이나 완제품 상에서 첨가되어 사용되어 질 수 있으며, 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 기능을 갖는다.
또한, 크림제, 로션제, 마사지 팩, 전신세정제, 비누제, 샴푸제, 기타 관리용 제제에 사용가능하다.
본 발명의 클로렐라 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 클로렐라 추출물의 제조
본 발명에 사용한 클로렐라는 국내산 클로렐라인 (주)한국 클로렐라의 제품으로 건조시켜 작은 조각으로 분쇄한 후 건조된 클로렐라 500 g에 건조무게의 약 20배에 달하는 메탄올 10 ℓ를 가하여 25 ℃에서 일정시간 간격(12 h, 12h)으로 2회 반복하여 환류냉각으로 연속추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압여과한 다음 여액을 모아 진공회전농축기로 60 ℃에서 감압농축 한 후 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조하여 클로렐라 건조 추출물 34.8 g을 얻었고, -20 ℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
실험예 1. 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포의 세포독성에 미치는 영향
클로렐라 추출물의 항염증 효과를 알아보기에 앞서, 실험에 사용하는 농도의 클로렐라 추출물 첨가가 대식세포에 세포독성을 나타내는지 관찰해 보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
먼저, RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 2mM L-글루타민(L-glutamine)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)배지에 넣고 37 ℃, 5% CO2를 함유한 항온기에서 배양하였다. 실험군은 세포에 각각 25, 50, 100, 150 ㎍/㎖ 클로렐라 추출물과 LPS(2㎍/㎖)를 첨가한 군과 DMSO만 첨가한음성대조군(negative control, untreated), 그리고 DMSO와 LPS(2㎍/㎖)를 첨가한 양성대조군(positive control)으로 나누었다. 세포 생존률은 트립판 블루(trypan blue)법을 이용하여 측정하였다(Yen and Lai.,Food and Chemical Toxicology,40, pp1433-1440, 2002). 즉 24 웰(well)에 세포 (8 x 105cells/well)를 주입한 후 부착시키고 여기에 클로렐라 추출물을 농도별로 2시간 처리한 후, 2㎍/㎖ LPS를 첨가하여 20시간 배양하고 세포를 수확한 후 트립판 블루 용액으로 염색하였다. 트립판 블루에 염색된 세포를 측정하여 세포 생존율을 구하였다. 실험의 분석결과는 평균권±표준편차로 표시하였으며, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지의 일원분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 던칸의 다중범위 테스트(Duncan's multiple range test)로 분석하였다.
실험 결과, LPS를 처리하지 않은 군에 비해 LPS를 처리한 대조군에서 세포의 생존이 저하됨을 알 수 있었고 클로렐라 추출물을 농도별로 처리하였을 때 세포의 생존률이 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 1).
따라서 본 실험에 사용한 농도의 클로렐라 추출물 첨가는 대식세포에 세포독성을 나타내지 않는 것으로 사료된다.
실험예 2. 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포의 NO 생성능에 미치는 영향
NO는 대식세포에서 만들어지는 수퍼옥사이드 음이온과 결합하여 강력한 페록시니트리트와 히드록시페록사이드를 생성하여 조직을 손상시켜 염증반응에 관여하므로, 클로렐라 추출물이 염증반응인자인 NO 생성능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
NO(Nitric oixde) 생성 정도는 그린 등의 방법(Green LC., et al.,Anal Biochem.,126, pp131-138, 1982)으로 아질산염(nitrite)의 생성량을 측정하였다. 즉 24 웰에 8×105개의 RAW264.7 세포를 주입한 후 세포를 웰에 부착시켰다. 클로렐라 추출물을 각각 25, 50, 100, 150 ㎍/㎖ 농도별로 처리하여 37 ℃, 5 % CO2에서 2시간 배양한 후 웰 당 2㎍의 LPS 주입하여 20시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 그리스 시약(Griess reagent, 5 % phosphoric acid에 1% 함유되어 있는 sulfanilamide와 0.1 % naphthylethylenediamine dihydrochloride 혼합액) 100 ㎕를 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 NaNO2를 농도별로 조제하여 사용하였다.
실험 결과, LPS로 자극시킨 RAW264.7 세포에서 클로렐라 추출물은 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났다(도 2).
실험예 3. 클로렐라 추출물이 RAW264.7 세포의 NF-κB 활성에 미치는 영향
3-1. 핵단백 추출
10 mm 페트리 디쉬(petri dish)에 배양된 RAW264.7 세포에 클로렐라 추출물을 농도별로 처리하여 2시간 배양 시킨 후 2 ㎍ LPS를 주입하고 다시 20시간 배양하였다. 차가운 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4)로 3회 세척한 후 수확된 대식세포는 0.6 % NP 40(Igepal), 0.15 M 염화나트륨, 10 mM 트리스(pH 7.9), 1 mM EDTA 완충용액에 1000: 1의 비율로 단백질 분해효소 저해제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail, Sigma사, 미국)을 혼합한 RNA 용해액으로 균질화하였다. 이것을 얼음에서 5분간 배양하고 4 ℃, 10분간 2,300 rpm(1250×g)에서 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하고 위의 과정을 한번 더 반복하여 상등액을 완전히 제거하였다. 여기에 10 mM HEPES (pH7.9), 0.1 mM EDTA, 1.5 mM 염화마그네슘, 420 mM 염화나트륨, 25 % 글리세롤을 혼합한 완충용액에 1: 0.03의 비율로 단백질 분해효소 저해제 칵테일, 1: 0.01의 비율로 50 mM DTT(Dithiotreitol, Sigma사)를 혼합하여 만든 추출 완충액 60 ㎕을 넣어 혼합하고 얼음에서 20분간 배양시키고 4 ℃, 10분간 2,300 rpm(1250×g)에서 원심분리하였다. 상등액 중 일부는 단백질 농도 결정을 위해 브래드포드 시험법을 실행하며, 나머지는 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay, Protean Ⅱ xi Cell, Bio-Rad사, 미국)를 이용하기 위해 -70 ℃에 보관하였다.
3-2. 단백질 농도 결정
단백질 농도 결정은 브래드포드 시험법(Bradford,Ann. Biochem.,72, pp248-54, 1976)을 이용하였다. 즉, 10㎕ 시료에 200㎕ 염료 시약을 혼합한 후 실온에서 15분간 방치시키고 595nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선은 표준 단백질(Bovine Serum albumin, Sigma사, 미국) 제품을 농도별로 희석하여 작성하였다. 이 때 브래드포드 염료 시약(Bio-Rad사, 미국)은 5배 희석한 것을 사용하였다.
3-3. EMSA(Electrophoresis mobility shift assay)
염증반응인자인 NO, 수퍼옥사이드 음이온과 같은 분자물질들의 발현은 전사유도인자인 NF-κB의 신호전달에 의해 조절된다. 따라서 클로렐라 추출물이 NF-κB 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
먼저, G-25 스핀 컬럼(MicroSpinTMG-25 Columns, Pharmacia사)을 이용하여 프로브(probe)를 제조하였다. 컬럼을 3000 rpm에서 1분간 원심분리한 후, 컬럼의 중심에 TE 완충용액 1×(V6231, promega사) 50 ㎕ 가하여 원심분리하였으며, NF-κB 올리고뉴클레오티드 2 ㎕, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 1 ㎕, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 10×완충용액 1 ㎕(gel shift assay core system, Promega사), 핵산분해효소가 제거된 물(nuclease-free water) 5 ㎕(Promega사), [γ-32P]ATP(3000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1 ㎕를 넣어 혼합액을 만든 후, 37 ℃에서 10분간 방치하였다. 0.5 M EDTA 1 ㎕를 첨가하여 반응을 멈추고, 이 용액에 TE 완충액 1×를 89 ㎕을 가하였으며, 이 혼합액을 컬럼 중앙에 분주한 후 3000 rpm에서 2분간 원심분리하고 이것을 프로브로 사용하였다. 일정 농도의 단백질량이 되도록 시료의 양을 계산한 후, 바인딩 완충액 5×(Promega사) 2 ㎕를 넣고 전체 용량을 핵산분해효소가 제거된 물로 보정한 후 실험을 행하였다. 혼합액은 얼음 위에서 10분간 방치한 후 프로브 1 ㎕를 첨가하여 실온에서 20분간 방치하였으며, 여기에 젤 로딩 완충액 10×를 1 ㎕ 첨가하였다. 음성대조군은 젤 로딩 완충액에 0.02 % 브로모페놀 블루가 함유된 염료를 1 ㎕ 첨가하였으며, 시료는 4 % 아크릴아미드젤(Sigma사)에 로딩한 후, 200 V, 25 mA에서 전기영동을 실시하였으며, 전기영동이 끝난 젤은 젤 드라이어를 이용하여 말린 후 12시간 동안 스크린에 노출시켰으며 포스포 이미지 시스템(phospho image system, Packard사, 미국)을 이용하여 정량하였다. 경쟁적 시험법(competitive assay)은 대조군을 사용하여 100배 정도 진한 1 ㎕의 비방사성의 NF-κB 올리고를 첨가하여 NF-κB 밴드를 확인하였다. 실험의 분석결과는 평균 ±표준편차로 표시하였으며, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지의 일원분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 던칸의 다중범위 테스트(Dunkan's multiple range test)로 분석하였다.
실험 결과는 하기의 도 3a 및 도 3b에 나타내었으며, 도 3a에서 레인1은 음성 대조군(untreated), 레인 2는 양성 대조군(control), 레인 3은 양성 대조군 + 비표지(control+cold)를 말하며, 레인 4 내지 7은 클로렐라 추출물 농도를 각각 25, 50, 100, 150 ㎍/㎖로 처리한 군을 말하여, 하기의 도 3a 및 3b에서 볼 수 있는 것처럼 클로렐라 추출물은 NF-κB 활성을 농도 의존적으로 억제하였다.
실험예 4. C57BL/6 생쥐에서 클로렐라 추출물의 수퍼옥사이드 음이온 생성 억제효과
4-1. 실험 동물
실험동물은 생후 5주령, 체중 18 ±0.05g의 수컷 C57BL/6 생쥐(효창사이언스)를 처음 1주간 스톡 다이어트(stock diet)를 이용하여 예비 사육하였으며, 예비 사육 후 체중에 따라 난괴법(completely randomized design)으로 3마리씩 플라스틱케이지에 넣고, 각 군 당 12마리씩 3그룹(대조군, 0.2 % 클로렐라 추출물, 0.35 % 클로렐라 추출물)으로 나누어 12주간 사육하였으며, 해당 식이와 물은 자유급식법(ad libitum feeding method)으로 공급하였다. 사육기간 동안 식수로는 지하수를 공급하였으며, 사육실의 온도는 22∼25 ℃로 실온을 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등을 하였다.
4-2. 식이 조성 및 시료 수집
상기 실시예 1에서 제조한 클로렐라 추출물을 분쇄하여 40메쉬의 체로 거른 후 각각 0.2 %, 0.35 %로 식이에 첨가하였다. C57BL/6 생쥐에 스트레스를 유발하기 위해 고지방 고콜레스테롤 식이를 섭취시켰으며, 사료 100 g에 대하여 코코아버터 7.5 %, 옥수수 오일 7.5 %, 콜레스테롤 1.25 %를 각각의 식이에 혼합하였다. 그 외 조성은 AIN-76(American Institute of Nutrition-76) 조성을 따랐다. 미네랄 혼합물, 비타민 혼합물, DL-메티오닌(DL-methionine), 콜린 바이타르타레이트(choline bitartrate), 소듐 콜레이트(sodium cholate)는 ICN 제품을 이용하였고, 카제인은 천일상사, 옥수수 전분은 두산 옥수수 전분, 수크로스는 삼양설탕(정제당)을 사용하였고, 코코아버터는 롯데 삼강제품, 옥수수 오일은 오뚜기 식용유를 사용하였다. 12주간 사육한 실험동물은 희생 2일전 복강에 4 %의 티오글리콜레이트 (thioglycollate)를 주입하여 염증성 대식세포의 생성을 촉진하였으며 PBS(pH 7.4, filtered)로 복강으로부터 대식세포를 수확하였다.
4-3. 복강대식세포에서 수퍼옥사이드 음이온 생성능 측정
티오글리콜레이트에 의해 유도된 복강 대식세포로부터 수퍼옥사이드 음이온 생성억제에 대한 효과를 알아보기 위해 엘리자베스의 방법(Elizabeth A. Kirk, et al.,Arterioscler Thromb Vasc. Biol.,20, pp1529-1535, 2000)을 수정하여 하기 실험을 실시하였다.
즉, PBS(pH7.4)에 혼합되어 있는 대식세포 수를 1.56 ×106개가 되도록 계산한 후 일정량 취하고 여기에 총 부피가 700 ㎕이 되도록 PBS를 주입하였다. 10 ㎎/㎖의 시토크롬 C(cytochrom C)(Sigma사)용액을 78 ㎕, 40 ㎛ol의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma사, 미국) 6 ㎕ 가하여 550 nm에서 1분 간격으로 10분간 흡광도 변화를 측정하였다.
실험 결과, PMA로 자극된 대식세포에서 수퍼옥사이드 음이온의 생성은 대조군에 비해 클로렐라 섭취군에서 현저히 저하됨을 관찰할 수 있었다(도 4). 즉 클로렐라의 장기간 섭취는 염증성 복강대식세포에 생성되는 수퍼옥사이드 음이온 생성을 감소시키는 것으로 사료된다.
실험예 5. C57BL/6 생쥐에서 클로렐라 추출물의 NF-κB활성 억제효과
티오글리콜레이트에 의해 유도된 복강 대식세포의 NF-κB 활성을 알아보기 위해 실시예 3과 같은 방법으로, 클로렐라 추출물의 농도를 각각 0.2 %, 0.35 %로 처리하고, 실험을 수행하여 측정하였다.
실험 결과는 하기의 도 5a 및 도 5b에 나타내었으며, 도 5a에서 A는 NF-κB의 초대이동 분석결과(Supershift assay of NF-κB)로, 레인 1은 마이크로파지의 핵 추출물이고, 레인 2는 100배 정도 진한 비방사성의 NF-κB 비특정 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 배양된 마이크로파지의 핵 추출물이며, 레인 3은 2㎍의 정상생쥐혈청을 첨가하여 배양된 마이크로파지의 핵 추출물이고, 레인 4는 안티 p65를 첨가하여 배양한 마이크로파지의 핵 추출물이며, 레인 5는 안티 p50를 첨가하여 배양된 마이크로파지의 핵 추출물이며, B의 레인 1은 양성 대조군(control), 레인 2는 0.2 % 클로렐라 추출물처리군(CE), 레인 3은 0.35 % 클로렐라 추출물처리군(CE)이며, 화살표는 안티세라(antisera)에 의해 이동된 밴드를 나타낸다. 따라서, 하기의 도 5a 및 5b에서 볼 수 있는 것처럼 클로렐라 추출물을 12주간 섭취한 생쥐의 복강에서 수확된 대식세포에서도 염증전사인자인 NF-κB의 활성이 농도 의존적으로 저하되었다.
NF-κB활성은 여러 문헌에 기재된 바와 같이 항산화제나 영양상태에 의해 억제되어질 수 있는 전사인자이다(Davis J. N.,et al.,Free Radic. Biol. Med.,30(11), pp1293-1302, 2001; Liao F.,et al.,J. Clin. Invest.,91, pp2572-2579, 1993; Miyoshi, H.,et al.,Am. J. Pathol.,158, pp967-975, 2001; Wheeler, M.,et al.,J. Leukoc. Biol.,69, pp622-630, 2001; Muller D. N.,et al.,FASEB J,15(10), pp1822-1824, 2001; Spear B. T.,et al.,J. Nutr.,132(10), pp3178-3185, 2002). 그러므로, 클로렐라 추출물의 장기간 섭취는 대식세포에서의 NF-κB 활성을 억제하여 조직의 염증반응을 억제할 수 있을 뿐만 아니라염증반응에 의해 발생하는 동맥경화, 암 등의 퇴행성 질환의 예방에도 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 이상의 결과는 클로렐라 추출물이 염증반응에 관여하는 대식세포에서의 NO와 수퍼옥사이드 음이온 생성과 NF-κB 활성을 억제함으로써 클로렐라 추출물을 함유하는 항염증제제 개발을 위한 근거를 제시하였다.
하기에 상기 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
비누 제조
실시예 1의 클로렐라 추출물..........................1~30 (%)
유지................................................적당량
수산화나트륨........................................적당량
염화나트륨..........................................적당량
향료................................................소 량
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.
로션 제조 1
실시예 1의 클로렐라 추출물...........................3.00 (%)
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염......................1.00
수용성 콜라겐 (1% 수용액)............................1.00
시트르산나트륨.......................................0.10
시트르산.............................................0.05
감초 엑기스..........................................0.20
1,3-부틸렌글리콜.....................................3.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 로션을 제조하였다.
로션 제조 2
실시예 1의 클로렐라 추출물...........................3.00 (%)
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염...................... 1.00
수용성 콜라겐 (1 % 용액).............................1.00
시트르산나트륨.......................................0.10
시트르산.............................................0.05
1,3-부틸렌글리콜.....................................3.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비로 로션을 제조하였다.
로션 제조 3
실시예 1의 클로렐라 추출물...........................4.00 (%)
갈조 엑기스..........................................1.00
시트르산나트륨.......................................0.10
시트르산.............................................0.05
1,3-부틸렌글리콜.....................................3.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 로션을 제조하였다.
크림 제조
실시예 1의 클로렐라 추출물...........................1.00(%)
폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트.....................2.00
자기유화형모노스테아르산글리세린..................... 5.00
세틸알코올...........................................4.00
스쿠알렌.............................................6.00
트리2-에틸헥산산글리세릴.............................6.00
스핑고당지질.........................................1.00
1.3-부틸렌글리콜.....................................7.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비로 크림을 제조하였다.
팩 제조
실시예 1의 클로렐라 추출물............................5.00(%)
폴리비닐알코올.......................................13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염......................1.00
라우로일히드록시프롤린...............................1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액)...........................2.00
1,3-부틸렌글리콜.....................................3.00
에탄올...............................................5.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비로 팩을 제조하였다.
미용액 제조
실시예 1의 클로렐라 추출물............................2.00(%)
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액)..................12.00
크산탄검(2 % 수용액)..................................2.00
1,3-부틸렌글리콜......................................6.00
진한 글리세린.........................................4.00
히알루론산나트륨 (1 % 수용액).........................5.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.
본 발명이 제공하는 클로렐라 추출물을 이용한 화장료 조성물은 염증반응에 관여하는 염증반응인자의 활성을 억제하여 뛰어난 항염증효과는 나타내므로 크림, 스킨, 로션, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 비누 등의 다양한 화장료에서 항염증 물질로 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 클로렐라(Chlorella) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급알콜 및 이들의 혼합용매로 추출된 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물의 양이 전체 조성물의 0.01 내지 5 중량 %를 갖는 화장료 조성물.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 영양수, 화장수, 팩, 비누, 샴푸, 린스, 클렌징, 전신 세정제, 세안제, 트리트먼트, 미용액인 화장료 조성물.
  5. 클로렐라 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 손상 및 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 화장료 첨가물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기의 첨가물은 크림제, 로션제, 마사지 팩, 전신세정제, 비누제, 샴푸제 및 기타 관리용 제제에 사용가능한 화장료 첨가물.
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