KR20040065066A - 가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스훼칼리스 Probio-053 및 이를 함유한 생균활성제 - Google Patents

가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스훼칼리스 Probio-053 및 이를 함유한 생균활성제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 유해 병원성 미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053) 및 이를 함유한 생균활성제에 관한 것으로, 본 발명 세균인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053은 동물체의 체내 및 장내에서 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 미생물 및 살모넬라 갈리나룸의 생육을 효과적으로 억제하고 내 산성, 내 담즙산성 기능을 가지고 있으므로, 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에게 투여하거나 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등으로 사용하여 장내미생물 균총의 안정화를 이루며 설사 등 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성 미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 및 이를 함유한 생균활성제{Acid tolerant probiotic Enterococcus faecalis Probio-053 that can suppresses the growth of pathogenic microorganisms and Salmonella gallinarum}
본 발명은 가금티푸스 유발 살모넬라 갈리나룸 및 유해 병원성 미생물 생육 억제능을 갖는 신규 내산성 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053 KCTC 10391BP) 및 이를 함유한 생균활성제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가금의 대장으로부터 분리된 신규 미생물로서 내 산성, 내 담즙산성, 항생제 저항성을 지니면서 동시에 가금티푸스 원인균 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)과 유해 미생물의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053)과 상기 미생물을 함유하는 가축용 생균활성제 및 이를 이용한 가금티푸스 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
국내·외 가금 사육현장에서 산발적으로 발생하는 가금티푸스(Fowl typhoid)는 급. 만성의 전염병으로 모든 일령에서 나타나며, 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징인 질병으로, 살모넬라균의 일종인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)이 원인균이다. 살모넬라에 의한 질병은 현재 항생제를 사용하여 치료하고 있으나 완치가 불가능하며, 사균 백신으로 예방하고 있으나, 완벽한 예방이 불가능한 실정이다. 또한 치료의 목적으로 사용하는 항생제는 체외로 완전히 배설이 되지 않고 숙주내에 잔존하게 되며 지속적인 투여시 병원균들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료가 불가능하고 인류의 보건에 치명적인 항생물질 내성 병원균의 발생을 야기한다. 일반적인 증상은 추백리와 비슷하나 추백리가 어린 병아리에 주로 폐사를 일으킨다면 가금티푸스는 중추 및 성계 등 모든 일령의 닭에 감염되어 높은 폐사를 일으키는 것이 특징이므로 경제적인 손실이 막대한 실정이다.
인체 및 동물체의 장내에는 다양한 미생물들이 존재하면서 장내의 미생물 균총을 이루고 있다. 이러한 미생물 중에는 숙주 동물에 유용한 것으로 알려져 온 유산균 등의 유익한 미생물들이 있는가 하면 반대로 숙주에 직접적 또는 잠재적인 유해성을 가지는 대장균, 살모넬라, 포도상구균 등의 미생물들이 있다. 인체 및 동물체의 경우 스트레스의 증가, 유해세균의 감염, 외부 환경의 변화에 의해서 장내 미생물 균총이 파괴될 경우 유해 미생물들의 급격한 성장을 초래하여, 숙주동물의 건강상태를 악화시키게 된다. 이러한 변화는 설사에서부터 심지어는 폐사의 위험으로까지 진행될 수 있으며, 이때 치료의 목적으로 항생제를 투여하게 되고, 사용된 항생제는 체외로 완전히 배설이 되지 않고 숙주 내에 잔류하며, 지속적인 투여 시 유해미생물들이 내성을 가지게 되므로 효과적인 치료를 할 수 없게 된다. 또한 현재는 가축의 경우 육류, 우유, 난 등의 항생제 잔존량에 대한 규제가 갈수록 엄격해지고 있으므로 계속적인 항생제의 사용 및 남용은 제고해야 할 문제로 이미 대두 되어왔다. 이에 대한 대안으로 현재 생균활성제인 프로바이오틱스에 대한 관심이 증대되고 있다. 생균활성제인 프로바이오틱스는 인체나 동물의 장내에 서식하는 유익한 미생물을 분리하여 제제화한 것으로 호기성균군, 혐기성균군, 유산균, 효모균들이 사용되고 있으나 유산균들이 주요 균주로 이용되고 있다. 이러한 유산균들은 전통적으로 식품의 발효와 가공과정에 다양하게 이용되었으며, 그들의 안전성은 오래 전부터 인지되어 미국의 FDA는 GRAS(Generally recognized as safe) 목록에 이들 중의 일부를 포함시키고 있다. 따라서 유산균을 이용한 생균활성제 프로바이오틱스는 항생제 남용으로 인해 발생할 수 있는 부작용을 일으키지 않고, 장내 유해 세균의 이상발효를 억제하여 안정된 장내 균총을 유지하며 유해 미생물의 감염으로 인한 질병을 감소시킬 수 있다. 또한 생균활성제의 지속적인 투여는 사료효율을 높여주고 건강 유지를 통해 증체량의 증대를 꾀할 수 있다. 생균활성제로서의 효과적인 사용을 위해서는 유해한 미생물에 대한 억제 활성뿐만 아니라 내 산성, 내 담즙산성을 지니는 것이 매우 중요하다. 동물체에 생균활성제를 투여할 후 경우 장에 도착할 때까지는 강산인 위액을 만나게 되고 그 다음 담즙산을 만나게 된다. 이들 위액과 담즙산은 일반적으로 세균을 죽이거나 활성을 떨어뜨리기 때문에 투여된 생균활성제가 무사히 장에 도달하여 그 기능을 발휘하기 위해서는 위액과 담즙산에 견딜 수 있는 성질을 가지고 있어야 한다.
본 발명자들은 기존의 생균활성제 보다 유해 미생물들을 더욱 효과적으로 억제할 수 있고 내 산성, 내 담즙산성을 지니며, 특히 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인균인 살모넬라 갈리나룸의 생육을 탁월하게 억제하는 신규 프로바이오틱 미생물의 탐색을 시도한 결과, 닭의 대장으로부터 유해 미생물에 대한 억제활성과 내산성, 내 담즙산성 능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 살모넬라 갈리나룸의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 균주를 혐기적으로 분리 동정하였으며, 이 균주가 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053)이라는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 및 동물에는 해가 없고, 내 산정 및 내 담즙성이 뛰어난 신규 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 KCTC 10391BP(Enterococcus faecalis Probio-053 KCTC 10391BP)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기존 항생제의 대체용으로 가축에게 투여하거나 , 의약품, 사료첨가제, 동물약품 등으로 사용하여 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인균인 살모넬라 갈리나룸의 생육을 탁월하게 억제할 뿐만 아니라, 장내의 유해한 병원성 미생물도 억제할 수 있는 생균활성제 함유 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물을 이용하여 가금티푸스를 유발하는 살모넬라 갈리나룸에 의한 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 미생물을 이용하여 장내 유해 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 이들 미생물에 의한 장내 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 목적들 및 잇점들은 하기 구성을 통해 보다 명백히 이해될 것이다.
도 1은 본 발명 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053에 의해 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 생육이 억제되어 형성된 억제환의 모습을 나타내는 그림이다.
본 발명의 상기 목적은 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인균인 살모넬라 갈리나룸의 생육을 탁월하게 억제하고, 유해한 병원성 미생물을 억제할 수 있는 내 산성, 내 담즙산성 신규 프로바이오틱 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 KCTC 10391BP(Enterococcus faecalis Probio-053 KCTC 10391BP), 상기 프로바이오틱 미생물을 포함하는 식품, 의약품, 동물약품, 사료첨가제 등의 식품학적 또는 약리학적 조성물, 상기 미생물을 이용하여 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인균인 살모넬라의 생육과 장내 서식 유해 미생물의 생육을 억제할 수 있는 방법을 제공함으로써 달성되었다.
본 발명 신규 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 KCTC 10391BP (Enterococcus faecalis Probio-053 KCTC 10391BP)은 닭에서 유래한 장내세균으로, 혐기 상태에서 생존할 수 있으며 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인균인 살모넬라 갈리나룸 및 다른 해로운 장내 세균들의 생육을 억제할 수 있어, 결과적으로 가축의 설사병을 예방 및 치료 할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 가금류, 특히 닭 급,만성 전염병으로 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징인 살모넬라 균 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료 개선 방법을 연구한 것으로, 현재 살모넬라에 의한 질병은 항생제 및 사균백신으로는 치료 및 예방이 불가능하고, 항생제의 경우는 체내 잔류 및 내성 숙주 출현을 야기시키는 문제점이 있어 아직 완벽한 예방이나 치료방법이 개발되지 못하고 있는 실정인데, 본 발명은 이러한 가금티푸스 원인균인 살모넬라 및 장내 유해 미생물들의 감염과 관련된 가금류 질병을 치료할 수 있는 효과적이고 잠재력 있는 프로바이오틱 미생물을 제공한다. 그러므로, 본 발명 프로바이오틱 미생물 및 이를 함유한 생균활성제는 가축의 장내에 서식하거나 침입하는 가금티푸스 원인균 및 장내 유해 미생물의 수를 감소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명 신규 프로바이오틱 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053은 장 세포에 흡착할 수 있을 뿐만 아니라, 다음과 같은 프로바이오틱 특성을 보유한다.
- 가금티푸스 원인균인 살모넬라 및 다른 장내 유해미생물의 생장 억제능
- 호기적, 혐기적 조건 및 다양한 pH에서의 생장능; 이러한 성질은 위장관 내에서 변화되는 다양한 생리적 및 병리적 조건에 잘 적응할 수 있는 능력을 부여한다.
- 위산 및 담즙산 내성
- 동결건조에서의 생균활성 보유능
또한, 본 발명 신규 미생물은 공지의 다른 예방 또는 치료방법과 같이 항생제 내성이나 생물 독성 등의 부작용이 없는 것이 특징이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱(probiotic)' 은 ' 사람을 포함한 동물의 위장관내에서 숙주의 장내 미생물 균형을 개선하여 숙주에 유익한 영향을 미치는 살아있는 미생물' 의 의미로 이해된다. 프로바이오틱 미생물은 프로바이오틱 활성을 갖는 살아 있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 있어서 "살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)"은 닭과 칠면조 등의 가금류에서 패혈증을 일으키는 급, 만성전염병인 가금티푸스(Fowl typhoid)의 원인체로 알려져 있으며, 현재 혈청학적으로 추백리균의 표준형과 구분이 불가능하므로 혈청검사만으로는 추백리와 티푸스의 구별이 잘 되지 않는 특징이 있다.
본 발명에 있어서 "가금티푸스(Fowl typhoid)"는 병아리에서는 추백리와 증상이 유사하며 성계에서는 패혈증을 주증으로 하고 있는 소화기전염병으로서, 난계대전염을 하며, 주요 증상으로는 벼슬이 창백하고 웅크리고 눈을 감은채 앉아 있으며 황색 또는 푸른설사 증상을 보이며 사료섭취가 떨어지고 산란율이 감소되며 폐사가 어느 한 지점을 중심으로 지속적으로 확산되는 경향이 있으며, 주로 여름철에 더위로 인한 스트레스로 인해 발병이 증가하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 유해 미생물 생육억제 활성을 가지는 내 산성, 내 담즙산성 미생물을 탐색하는 과정은 다음과 같았다. 즉, 혐기백 (상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)에 닭의 대장 내용물을 채취하여 호모게나이저로 균질화시키고 3g을 취하여 pH 2로 조정한 혐기 희석액 27㎖에 넣어 1:10 의 비율로 희석한 다음, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1㎖를 옥스갈 (디프코사 제품, 상품명) 0.5%를 첨가한 BL 고체배지 (일본 영연화학사 제품)에 도말하고, 37℃에서 48시간 혐기장치를 이용하여 배양하였다. 배양이 끝난 후 형성된 집락(colony) 350개를 선발하여 GAM semi-agar 배치 (일본 일수제약사 제품)에 옮겨 배양한 뒤, 영하 80℃에서 보존하면서 실험에 사용하였다.
분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등의 문헌 (Kuroiwa et al., 감염증학지, 64, 257, 1990)을 변형하여 cylinder plate 법으로 실시하였다. 배양 후 나타난 억제환의 직경을 측정하여 분리균주의 병원성 미생물에 대한 생장 억제능을 비교하였다. 항생제 평가시 사용되는 미생물 10종은 한국생명공학연구소에서 분양받아 사용하였으며, 그 종류는 다음과 같다. : E. coli KCTC 2441, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella gallinarum , Enterobacter cloacea KCTC 2361, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii KCTC 2006, Methylosinus trichosporium KCTC 2591. 위의 유해 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37℃, 18시간) 후 배양액 0.1㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말 하고 건조시킨 다음 지름 8mm의 cylinder를 배지 위에 올려 놓았다. 분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37℃, 18시간) 후, 분리한 미생물이 생산하는 항균물질을 추출하기위하여 분리 균주 배양액에 같은 양의 차가운 아세톤(4℃)을 넣고, 24시간을 방치한 다음 원심분리하고, 상등액을 감압 농축하여 항균력 측정에 사용하였다. 위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려 놓은 지름 8mm의 cylinder에 농축액 30㎕를 접종하고 배양(37℃, 24시간)하였다. 일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육 억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하고, 유해한 병원성미생물의 생육억제 활성이 가장 우수한 균주를 선별하여 Probio-053으로 명명하였다.
본 발명의 균주 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 (Enterococcus faecalis Probio-053)이 유해한 병원성 미생물의 생장을 억제하는 억제환의 지름은 다음과 같다. E. coli KCTC 2441에 대해 19mm, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208에 대해 15mm, Staphylococcus aureus KCTC 1621에 대해 16mm, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917에 대해 16mm, Salmonella gallinarum에 대해 24mm, Enterobacter cloacea KCTC 2361에 대해 18mm, Salmonella typhimurium에 대해 20mm, Citrobacter freundii KCTC 2006에 대해 15mm, Shigella flexneri KCTC 2008에 대해 14mm, Methylosinus trichosporium KCTC 2591에 대해 16mm로 나타났다. 또한 Probio-053에 의해 Salmonella gallinarum 생육이 억제되어 형성된 억제환의 모습은 도 1과 같다.
Probio-053 균주를 동정하기 위하여, 상기에서 선별된 균주들을 배양한 후, 형태; 생리·생화학적 특성; 16S rRNA 유전자의 염기 서열 결정 및 분석 실험 등을 수행하였다.
Probio-053의 형태 및 생리·생화학적 특성을 조사한 결과, Probio-053은 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이었다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30℃∼37℃가 바람직하였다.
Probio-053의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-053은 엔테로코커스 (Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5%의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼칼리스 (Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-053을 엔테로코커스 훼칼리스 (Enterococcus faecalis)의 균주로 동정하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10391BP). 본 발명 미생물은 장기간 안정적으로 보존하기 위해 글리세롤 성분을 포함하여 영하 80℃에 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결 건조하는 것이 바람직하다. 본 발명 균주는 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 갖고 필드 안정성이 뛰어나거나 또는 보다 뛰어난 항바이러스 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있음은 당업자에게 충분히 이해될 것이다.
본 발명 Probio-053 균주의 특성을 조사해본 결과, 가금티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나룸의 생육을 탁월하게 억제할 뿐만 아니라, 장내 유해 미생물 생육억제 실험결과 이들 위장관내 유해 미생물들에 대해서도 생장 억제능이 우수하며, 항생제에 대한 감수성 실험결과 다양한 가축 항생제에 대해 저항성이 있고 내산성 및 내담즙산염 특성이 있는 것으로 확인되었으며, 특히, 본 발명 미생물은 이미 지적한 바와 같이 가금류인 닭의 장관으로부터 분리된 것으로 정상적인 장내 미생물 균총을 형성하기 때문에 특히 가금류의 사육에 더욱 잇점이 있다.
본 발명의 한 유익한 측면에 있어서, 본 발명은 신규의 프로바이오틱 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053)을 함유하는 식품, 의약품, 동물약, 사료첨가제를 제공한다. 본 발명 미생물은 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로, 또는 첨가되어 사용되거나 가금류가 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명 미생물은 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 부여함) 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품(첨가되어 프로바이오틱 활성을 증강시키거나 보완함)에 첨가되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적, 수의학적 또는 영양학적 조성물은 분리된 프로바이오틱 세균으로 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053(Enterococcus faecalis Probio-053) 또는 이와 함께 2종 이상의 다른 유익한 균주와 적당한 담체를 함께 포함할 수 있다.
예컨대, 본 발명 조성물에 본 발명 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 유해 바이러스나 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이 바람직하다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 Saccharomyces, Candida, Pichia 및 Torulopsis를 포함하는 효모(yeasts), Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium 등과 같은 곰팡이 및 Lactobacillus, Bifidobacterium,Clostridium, Leuconostoc, Bacteroides, Staphylococcus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Propionibacterium, Enterococcus, Pediococcus, 그리고 Micrococcus 속 세균들이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 Saccharomyces cereviseae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faceium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, 및 Staphylococcus xylosus 등을 들 수 있다. 바람직하게는 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 가금티푸스병을 유발하는 살모넬라 갈리나룸 억제능을 나타내는 엔테로코커스 훼시움 Probio-048(Enterococcus faecium Probio-048 KCTC 10390BP) 또는 이들 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명 조성물에 추가로 포함할 수 있다. 본 발명 조성물에 함유될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 균주는 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
본 발명 신규 미생물 및 조성물은 통상적인 항생제 대신에 생균활성제로 동물에 투여되거나 식품, 의약품, 동물약품, 또는 사료첨가제와 함께 동물에 투여될 수 있다. 이러한 생균활성제는 기존 항생제의 대체용으로 장내 유해한 미생물을 억제하며 안정된 장내 균총의 유지를 통해 동물체의 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과, 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 등의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명 조성물은 또한 장내 미생물 균총을 유지하기 위해 항생제 투여 후에도 투여될 수 있다.
특히, 살모넬라 갈리나룸 생육 억제능을 갖는 본 발명 신규 미생물은, 다른 치료법이 비효과적이거나 임상적으로 부작용이 있는 가금티푸스 및 장내 유해미생물 감염의 감염에 의해 유발된 대부분의 증상 완화나 치료에 매우 유용하다.
그리하여, 본 발명은 신규 미생물 또는 이를 유효량 함유한 조성물을 사용하여 살모넬라 갈리나룸 감염에 의한 가금티푸스의 발생을 저지하거나 장내 유해 미생물 감염에 의한 위장염 및 설사 등을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 발명의 권리범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 내 산성, 내 담즙산성 특성을 갖는 세균의 분리
닭의 대장 내용물을 채취하여 혐기백 (상품명 Gas Pack pouch; BBL사 제품)을 이용하여 혐기적으로 운반하였다. 채취한 위 내용물을 호모게나이저로 균질화시키고, 3g을 pH 2로 조정한 혐기 희석액 (0.78% K2HPO4, 염혼합액 37.5㎖, L-cystein0.5g, 25% L-ascorbic acid 2㎖, 8% Na2CO350㎖ 0.1% resazurin 1㎖를 증류수 860㎖에 녹이고, agar 0.5g을 첨가) 27㎖에 1:10 의 비율로 희석하고, 진탕기를 이용하여 120분간 진탕하였다. 진탕액 1 ㎖를 옥스갈 (디프코사 제품, 상품명) 0.5%를 첨가한 BL 고체배지 (일본 영연화학사 제품)[ Lab-lemco powder 2.4g, Proteose peptone No.3 10g, Trypticase 5g, Phytone peptone 3g, yeast extract 5g, liver extract 150ml, glucose 10g, soluble starch 0.5g, sol.A 10㎖, sol.B 5㎖, 10% FS antifoam F-20 5㎖, Tween 80 1g, L-cystein 0.5g, horse serum 50㎖를 증류수 1000㎖에 녹이고, agar 15g을 첨가; sol.A 의 조성, 10% KH2PO4과 10% K2HPO4을 혼합한 것이며; sol.B의 조성, 황산마그네슘 10g, 황산철 0.5g, 소금 0.5g, 황산망간 0.337g을 증류수 250㎖에 녹임) 에 도말하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 일정시간이 지난 후 나타나는 콜로니를 350개 선발하여 GAM semi-agar 배지 (일본 일수 제약사 제품)[peptone 10g, Soya peptone 3g, Proteose peptone NO.3 10g, Peptonized whale serum 13.5g, yeast extract 5g, Beef extract 2.2g, liver extract 1.2g, KH2PO42.5g, NaCl 3g, L-cystein 0.3g, Na thioglycolate 0.3g, glucose 2g를 증류수 1000㎖에 녹이고, agar 1.5g을 첨가] 에 옮겨 37℃에서 배양한 뒤, 영하 80℃에서 보존하였다.
실시예 2 : 분리 동정한 미생물의 열안정성
〈재료 및 방법〉
분리한 미생물의 내열성을 측정하기 위하여, 2차 계대한 미생물 배양액을 80℃ water bath에서 10분간 열처리한 다음 급냉시킨 후, 0.85% NaCl 용액에 10진 희석하여 생균수를 측정하였으며, 생균수 측정용 배지는 BCP를 사용하였다. 열처리 후 생존한 균수를 Log survivors(%)로 표시하였으며, 그 결과는 표 1과 같다.
[표 1]
80℃에서 10분 동안 열처리 한 후 생존한 세균의 수
실시예 3 : 분리된 미생물의 유해 미생물 생장 억제 실험
분리된 미생물들을 대상으로 한 유해미생물의 생장억제실험은 구로이와 등(Kuroiwa et al., 감염증학회지, 64, 257, 1990) 의 방법을 이용하여 항생제 평가시 사용되는 다음의 미생물 10종을 대상으로 하였다. :E. coli KCTC 2441, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Shigella flexneri KCTC 2008, Salmonella gallinarum , Enterobacter cloasea KCTC 2361, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii KCTC 2006, Metyhlosinus trichosporium KCTC 2591. 위의 유해한 병원성 미생물들을 NB(nutrient broth) 액체배지에서 배양한(37℃, 18시간) 후 배양액 0.1㎖를 취하여 NA(nutrient agar) 고체배지에 도말 하고 건조시킨 다음 지름 8mm의 cylinder를 배지 위에 올려 놓았다. 분리한 미생물들은 MRS 액체배지에서 혐기적으로 배양한(37℃, 18시간) 후, 분리한 미생물이 생산하는 항균물질을 추출하기 위하여 분리 균주 배양액에 같은 양의 차가운 아세톤(4℃)을 넣고, 24시간을 방치한 다음 원심분리하고, 상등액을 감압 농축하여 항균력 측정에 사용하였다. 위의 NA(nutrient agar) 배지에 올려 놓은 지름 8mm의 cylinder에 농축액 30㎕를 접종하고 배양(37℃, 24시간)하였다. 일정 시간의 배양이 끝난 다음 형성된 생육억제 환(clear zone)을 측정하여 대조구와 비교하였으며, 유해한 병원성미생물에 대한 억제 활성을 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Probio-053의 여러 유해 병원성 미생물에 대한 억제 활성
표 2에서 보는 바와 같이 Probio-053은 사용된 유해미생물 10종에 대해서 생육 억제 활성을 지니며, 특히 가금티푸스 원인균인 Salmonella gallinarum에 대해서 강한 항균력을 지닌 매우 유용한 미생물인 것으로 확인되었다.
실시예 4 : 분리한 미생물 probio-53의 동정
실시예 1에서 분리된 Probio-53 균주를 MRS 배지(Difco사 제품)에서 37℃ 조건으로 배양하였다. Probio-53 균주를 동정하기 위하여, Probio-53의 형태 및 생리학적 특성은 윤 등(Yoon et al, Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 904, 1997)의 방법과 API 32A 및 CHL 키트(바이오메리오사 제품)를 사용하여 결정하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석은 윤 등(Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.
Probio-053은 그람양성의 세균으로 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 동시에 성장하며 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며, 세포의 형태는 구균이다. 상기 균주의 성장 조건으로는 30℃∼37℃℃ 바람직하다. 가스와 인돌을 생성하지 않으며 용혈성을 나타내지 않고 질산을 환원하지 않는다. 0.5% 담즙산에 내성을 나타낸다.
Probio-053의 16S rRNA 유전자의 염기 서열은 서열번호 1로 기재된다. 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 Probio-053은 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 균주로서 99.5%의 16S rDNA 상동성으로 엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis)의 표준 균주에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 따라서 이상의 결과에 기초하여 Probio-053은 엔테로코커스 훼칼리스(Enterococcus faecalis)의 균주로 동정하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 12월 6일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10391BP).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 엔테로코커스 속의 신규 미생물인 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 KCTC 10391BP(Enterococcus faecalis Probio-053KCTC 10391BP)은 가금티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나룸 및 병원성 세균을 억제하는 프로바이오틱스로 동물의 체내 및 장내에서 유해한 성질을 나타내는 여러 종의 병원성 세균을 효과적으로 억제하고 내 산성, 내 담즙산성의 특성을 가지고 있어서 기존 항생제의 대체용으로 인체 및 각종 가축에게 투여하면 장내미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있다. 또한 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과 육질의 개선, 산유량 및 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.
<110> Probionic Inc. <120> Acid tolerant probiotic Enterococcus faecalis Probio-053 that can suppresses the growth of pathogenic microorganisms and Salmonella gallinarum <130> probio-053 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1516 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis Probio-053 <220> <221> rRNA <222> (1)..(1516) <223> rRNA gene <400> 1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcttctttcc tcccgagtgc 60 ttgcactcaa ttggaaagag gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctaccca 120 tcagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc ataacagttt atgccgcatg 180 gcataagagt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat ggacccgcgg tgcattagct 240 agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg 300 gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 420 aaaactctgt tgttagagaa gaacaaggac gttagtaact gaacgtcccc tgacggtatc 480 taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540 gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa 600 gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggag 660 agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaggaacac cagtggcgaa 720 ggcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840 ttcagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac tctagagata gagctttccc 1020 ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc catcatttag ttgggcactc 1140 tagcgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac aacgagtcgc tagaccgcga 1260 ggtcatgcaa atctcttaaa gcttctctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca 1320 tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc 1440 tttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500 ccgtatcgga aggtgc 1516

Claims (7)

  1. 가금티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 장내 서식 유해미생물의 생육을 억제하는 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053 KCTC 10391BP(Enterococcus faecalis Probio-053 KCTC 10391BP).
  2. 허용 가능한 담체 및 유효량의 상기 제 1항 프로바이오틱 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053을 포함하고 프로바이오틱 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적, 수의학적 또는 영양학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 엔테로코커스 훼시움 Probio-048 KCTC 10390BP(Enterococcus faecium Probio-048 KCTC 10390BP) 또는 이와 1종 이상의 프로바이오틱 미생물을 추가로 포함하는 조성물.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 조성물이 구강 섭취 시 가금류에서의 가금티푸스 예방 또는 치료에 유용한 조성물.
  5. 상기 제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053, 또는 상기 제2항이나 제 3항의 프로바이오틱 조성물을 유효량으로 포함하는 식품, 의약품, 동물약품, 또는 사료첨가제.
  6. 상기 제1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053, 또는 상기 제2항이나 제3항의 프로바이오틱 조성물을 이용하여 살모넬라 갈리나룸에 의한 가금티푸스를 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 상기 제 1항의 엔테로코커스 훼칼리스 Probio-053, 또는 상기 제2항이나 제3항의 프로바이오틱 조성물을 이용하여 장내 유해 병원성미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
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