KR20040046785A

KR20040046785A - 혈관내피세포 특이적 발현 벡터

Info

Publication number: KR20040046785A
Application number: KR1020020074807A
Authority: KR
Inventors: 이영주; 조정윤
Original assignee: 이영주
Priority date: 2002-11-28
Filing date: 2002-11-28
Publication date: 2004-06-05
Also published as: KR100486878B1

Abstract

본 발명은 혈관내피세포 특이적 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 암 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 내피세포에서 특이적으로 발현하며 저산소 상태에서 발현량이 증가하기 때문에 혈관 생성에 의존하는 암 또는 심혈관계 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈관내피세포 특이적 발현 벡터{Expression vector specifically expressing target protein at the endothelial cells}

본 발명은 내피세포 특이적 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현하는 벡터에 관한 것이다.

전세계적으로 연간 600만 정도의 암(또는 종양) 환자가 발생하며, 미국의 사망률 순위에서는 심장 질환에 이어 암이 2위를 차지하여 암이 주요한 건강 문제로 대두되고 있다. 다행히 대부분의 암은 초기에 진단되고, 악성 종양을 제거하기 위해 수술, 방사요법등의 적출법이 시행되지만 잔류된 종양은 전이에 의해 확산되어 최후의 치료 방법으로 화학요법만이 적용되고 있는 실정이다. 또한, 반복되는 치료로 인해 내성이 발생하기 때문에 전이된 암의 경우 5-10% 만이 치료가 가능한 실정이다. 불치 혹은 난치라고 할 수 있는 암을 치료하기 위해 선진 각국에서는 막대한 예산을 들여 암퇴치를 위한 각종 연구를 활발히 진행시키고 있어 암치료율이 많이 향상되었으나 아직도 암은 에이즈와 함께 인류의 가장 심각한 질환중의 하나로 여겨지고 있으며, 미국에서는 매년 약 50만정도의 환자가 암으로 사망한다. 항암제의 경우 현재까지 획기적인 특효약이 개발되어 있지는 않지만 21세기에 모든 유전자의 기능이 밝혀지게 되면 유전자 정보를 이용하여 최첨단 신약으로서 우수한항암 유전자를 이용한 유전자 치료제의 개발이 기대되고 있다.

유전자 치료는 1990년 ADA-SCID에 처음 적용된 후(Rosenberg S. A.et al.,New Engl. J. Med., 1990, 323, 570-578) 빠른 속도로 발전하여 현재 프로토콜은 370여건, 임상시험 환자수는 3200명에 이르고 있다. 유전자 치료는 원래 유전병, 특히 1개 유전자의 고장에 의해 생기는 단일 유전성 질병(monogeneic disease)에 대해 가장 이상적인 치료방법일 것으로 생각되었던 기술이지만 현재 진행되고 있는 유전자 요법 임상 연구의 주요 대상질환으로는 암, 유전질환, 후천성 면역 결핍증이 있다. 현재 진행중인 유전자 요법의 약 2/3는 암환자를 대상으로 삼고 있고, 암 중에서도 백혈병과 같은 혈액 종양보다는 고형암이 주를 이루고 있으나 나머지 모든 암도 임상 연구의 대상이 되고 있다.

유전자 요법의 핵심기술은 크게 3가지로 나눌 수 있는데, 치료효과를 실제로 나타내는 치료 유전자, 유전자를 인체에 전달해주는 매개체(벡터) 및 인체에 유전자를 전달하는 기술이다. 상기 유전자 치료의 3가지 분야 중 가장 관건인 분야는 유전자 전달 벡터 기술 분야로 유전자 전달 벡터로는 비바이러스성 플라스미드 벡터 및 바이러스성 플라스미드 벡터가 있다. 현재까지는 유전자 전달의 안전성 및 효율성의 문제로 인해 유전자 치료 요법이 대중화 및 산업화되지 못하고 있는데 특히, 질병을 치료할 수 있는 정도의 많은 양으로 단백질이 생산되지 못하고, 유전자 발현 시간이 예상보다 짧으며, 안정성이 확립되어 있지 않다는 것이 큰 문제점으로지적되고 있다.

비바이러스성 플라스미드 벡터는 제조와 대량 생산이 용이하고, 면역반응을 유도하지 않으며, 복제 및 재조합의 가능성이 없고, 전달될 유전자의 크기 제한이 없는 여러 가지 장점을 가지고 있다. 비록 비바이러스성 플라스미드 벡터는 유전자 전달 효율이 낮거나 유전자 발현이 일시적이라는 단점이 있어 그 사용이 제한되어 있기는 하나 최근 그 적용례가 급격히 증가하고 있고, 생체내(in vivo)에서 충분한 유전자 발현을 유도할 수 있는 비바이러스성 벡터는 없으나 이를 보다 광범위하게 사용하기 위한 노력이 계속되고 있다.

현재 비바이러스성 벡터의 단점중의 하나인 유전자의 발현이 낮고 지속 기간이 짧은 점을 보완하기 위하여 몇 가지 연구들이 진행중이다. 일례로 유전자 전달 플라스미드의 유전자 발현 효율은 사용되는 프로모터에 의하여 좌우되기 때문에 강력한 프로모터를 사용하여 유전자 발현을 높이는 방법이 있다. 프로모터에는 바이러스 프로모터, 진핵세포내에 항상 유전자 발현을 유도하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터, 특정조직에서 유전자가 발현되도록 조절한 조직-특이적 프로모터등이 있다(Smith RLet al.,J Virol,2000, 74(23), 11254-61).

그러나, 바이러스 프로모터는 이종 유전자 유래의 염기서열인 관계로 항원, 항체 반응을 유발하는 경우가 있고 하우스키핑유전자의 경우 유전자 발현율이 낮으며 발현이 조직특이적이지 못한 단점이 있다. 조직-특이적 프로모터를 이용하여치료 유전자를 환자의 필요한 부위에 적절하게 발현시키는 벡터를 개발한다면 암과 같은 난치병을 치료할수 있는 안전하고 효율적인 치료제를 개발할 수 있으므로 유전자 치료시 원하는 표적세포에서만 특이적으로 강력하게 발현시키는 것이 요구되고 있으며, 환경에 반응하여 필요할 때 필요한 양의 유전자 발현이 이루어지는 벡터를 개발하는 방향으로 나아가고 있다.

또한, 암세포의 성장은 혈관공급에 의존하기 때문에 혈관을 형성하는 내피세포에 암세포가 높은 비율로 의존하게 되어 내피세포는 암치료를 위한 표적 세포로 적합하다. 항혈관형성 약재(Antiangiogenic drug), 예를들어 안지오스타틴(Angiostatin) 및 엔도스타틴(Endostatin)은 암세포의 성장을 저해할 수 있고, 또한 혈관 신생에 대한 내생성 억제제(Endogenous inhibitor)는 암을 억제시킬 수 있다. 따라서, 치료 유전자를 암 치료에 사용하는데 있어 내피세포 특이적 벡터는 유용하며, 심혈관 질환의 치료에도 유용하게 쓰일 수 있다. 현재 미국에서는 레트로바이러스 벡터를 중심으로 내피세포 특이적 벡터가 개발 중이다(Mavria Get al.,Gene Therapy,2000, 7, 368-376; Martin SGet al.,Advanced Drug Reviews,2000, 41, 223-233).

이에, 본 발명자들은 암을 치료하기 위한 안전하고 효율적인 대안인 유전자 치료를 함에 있어 치료 유전자를 좀더 효율적으로 발현하기 위한 벡터를 개발하던중 내피세포에서 특이적으로 발현하는 벡터를 제조하였고 상기 벡터가 혈관형성에 의존하는 암 또는 심혈관계 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현하는 벡터를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 발현벡터를 클로닝하여 벡터의 효율을 확인하는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 2는 PCR 증폭된 PPET-1 절편을 전기영동한 사진이고,

레인 1: 사이즈 마커, 레인 2: PPET-1

도 3은 PPET-2를 pGEMTeasy 벡터의EcoRI 위치에 삽입한 후EcoRⅠ으로 절단한 단편을 전기영동한 사진이고,

레인 1: 사이즈 마커,

레인 2, 3, 4, 5, 6, 7: 각 클론의 PPET-2/EcoRⅠ 절편

도 4는 COS 세포에 pcDNA3-PPET-1 또는 pcDNA3-PPET-2를 형질도입한 후 루시퍼레이즈 활성을 측정한 그래프이고,

도 5는 COS, BAEC, HUVEC 및 CPAE 세포에 pcDNA3-PPET-2를 형질도입한 후 루시퍼레이즈 활성을 측정한 그래프이고,

도 6은 CPAE 세포에 pcDNA3-PPET-2를 형질도입한 후 정상 상태 또는 저산소 상태로 배양한 후 루시퍼레이즈 활성을 측정한 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현시키는 발현 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 암 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현시키는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 내피세포 특이적 프로모터는 인간 내피세포 유전자인 ppET-1 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터 하류의 해독되지 않은 엑손 1을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 벡터는 내피세포에서 특이적으로 목적 유전자를 발현시키고, 저산소 상태에서 유전자의 발현을 증가시킨다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 인간 내피세포 유전자인 ppET-1 유전자의 프로모터, 상기 프로모터 유전자 하류의 해독되지 않은 엑손을 포함하는서열번호 5로 기재되는 서열을 갖는 유전자를 pcDNA 3.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 이를 'pcDNA3-PPET-2'로 명명하였다. pcDNA3-PPET-2 벡터를 세포에 형질도입한 후 프로모터 활성을 측정하기 위해 루시퍼레이즈 활성을 측정한 결과, 내피세포인 CPAE 세포에서 발현량이 가장 높았고(도 5참조), 상기 벡터를 형질 도입한 CPAE 세포를 정상상태 또는 저산소 상태로 배양하여 프로모터 활성을 측정한 결과, 정상 상태에서보다 저산소 상태에서 발현량이 높음을 알 수 있었다(도 6참조).

본 발명자들은 내피세포에서 특이적으로 발현하고, 저산소 상태에서 발현량이 높음을 확인한 상기 벡터를 대장균(E. coli)에 형질도입하여 2002년 10월 15일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10436).

본 발명의 벡터는 비바이러스성 벡터이기 때문에 유전자 치료시 안전하게 사용될 수 있으며, 본 발명의 벡터에 치료 유전자를 삽입하면 내피세포에서 특이적으로 치료 유전자를 발현시킬 수 있고, 또한 저산소 상태에서 치료 유전자의 발현을 증가시킬 수 있어 내피세포로부터 혈관공급을 받음으로써 성장하는 암세포를 공격하여 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 아울러 본 발명의 벡터를 이용하여 암 및 고혈압, 동맥경화 또는 허혈성질환 등과 같은 심혈관계 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터에 포함될수 있는 치료 유전자에는 VEGF(vascular endothelial growth factor), EPO(erythropoietin) 또는 VEGF 안티센스 올리고머 등이 있으나, 여기에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 벡터는 내피세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 포함하고 있어 목적 단백질을 내피세포에서 과발현 시킬 수 있다. 이에, 치료 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터를 제조한 후 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제조하여 암 또는 심혈관계 질환 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 벡터를 포함하는 암 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 ∼ 1 mg/kg 이고, 바람직하기로는 0.05 ∼ 0.5 mg/kg 이며, 하루 1 ~ 3 회 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> ppET-1 유전자 프로모터의 클로닝

본 발명자들은 내피세포에서 특이적으로 목적 유전자를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 내피세포에서 발현되고 실험실내(in vitro)에서 특성이 잘 나타나며, 저산소 반응 부위(hypoxia response element, HRE)가 있어 저산소상태에서 유전자의 발현을 증가시킨다고 알려져 있는 인간 내피세포 유전자-1(human preproendothelin-1, 이하 'ppET-1'이라 칭함)의 프로모터(Yamashita Ket al.,J. Biol. Chem.,2001, 20;276(16), 12645-53)를 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하였다(도1).

<1-1> ppET-1 프로모터의 증폭

본 발명자들은 프로모터의 유전자 발현 효율을 높이기 위해, ppET-1 유전자의 프로모터를 제조시에 프로모터 뿐만 아니라 프로모터의 활성을 크게 증가시킨다고 알려져 있는 해독되지 않는 엑손과 인트론 부위(Lee YJet al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 272(1), 230-5)도 함께 삽입하여 증폭하였다. 구체적으로, 인간 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 ppET-1 프로모터 유전자중 -177에서 +33까지의 유전자를 증폭하여 ppET-1 프로모터 서열만 포함하는 유전자를 증폭하고, 다음으로 -177에서 +267(시작코돈 바로전)까지의 유전자를 증폭하여 ppET-1 프로모터 서열에 해독되지 않는 엑손 1 부위도 삽입시킨 유전자를 증폭하였다.

먼저 ppET-1 프로모터 서열 -177에서 -133까지의 프로모터 부위뿐만이 아니라 해독되지 않는 엑손 1의 일부(+1 ~ +33)를 포함하는 프로모터를 증폭하기 위해 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 인간 게놈 DNA에MluⅠ 제한효소 서열을 포함하는서열번호 1로 기재되는 프라이머,HindⅢ 제한효소 서열을 포함하는서열번호 2로 기재되는 프라이머, dNTP, 10 ×PCR 버퍼 및 Taq 중합효소를 첨가하여 94℃에서 5분 동안 반응하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초동안 반응을 30회 수행한후, 72℃에서 5 분, 4℃에서 10 분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 반응후 얻은 반응 산물을 전기영동한 결과, ppET-1 프로모터 서열 -177에서 +33까지의 유전자 서열과 프라이머의 제한효소 서열을 포함하는 약 210 bp 크기의 DNA 절편임을확인하였다(도 2). 상기 확인된 약 210 bp의 DNA 절편을 pGEMTeasy 벡터(promega)에 삽입한 후 T7/SP6 프라이머 위치를 이용하여 염기서열 분석을 한 결과, ppET-1 프로모터 서열과 엑손 1의 일부를 포함하는 서열을 가지는서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하여 이를 'PPET-1'이라고 명명하였다.

다음으로, ppET-1 프로모터 서열 -177에서 +267까지의 유전자로 ppET-1 프로모터(-177 ~ -1)에 해독되지 않는 엑손 1의 전체(+1 ~ +267)를 포함하는 유전자를 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 인간 게놈 DNA에MluⅠ 제한효소 서열을 포함하는서열번호 1로 기재되는 프라이머,HindⅢ 제한효소 서열을 포함하는서열번호 4로 기재되는 프라이머, dNTP, 10 ×PCR 버퍼 및 Taq 중합효소를 첨가하여 94℃에서 5분 동안 반응하고, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초동안 반응을 30회 수행한 후, 72℃에서 5분, 4℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 반응후 얻은 반응 산물을 pGEMTeasy 벡터(promega)에 삽입한 후EcoRⅠ으로 절단하여 전기영동한 결과 ppET-1 프로모터 서열 -177에서 +267까지의 유전자와 프라이머의 제한효소 서열을 포함하여 약 460 bp의 크기를 가짐을 확인하였다(도 3). 또한, 상기 약 460 bp 크기의 PCR 산물이 삽입된 pGEM.Teasy 벡터의 T7/SP6 프라이머 위치를 이용하여 염기서열 분석을 한 결과, ppET-1 프로모터 서열과 엑손 1의 전체 서열을 포함하는서열번호 5로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하여 이를 'PPET-2'라고 명명하였다.

<1-2> ppET-1 프로모터의 클로닝

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 증폭한 PPET-1 또는 PPET-2 프로모터 유전자를 pcDNA 3.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 증폭한 PPET-1 또는 PPET-2 DNA 단편 각각을MluⅠ 및HindⅢ로 절단한후 pCDNA 3.1 벡터의MluⅠ/HindⅢ 위치에 삽입하여 pcDNA 3.1 벡터의 CMV 프로모터와 대체하고, 벡터의 효능을 확인하기 위해 리포터 유전자로 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자를HindⅢ/XbaⅠ 위치에 삽입하여 PPET-1 또는 PPET-2 프로모터가 삽입된 발현벡터를 제조하고, 이를 각각 'pcDNA3-PPET-1' 및 'pcDNA3-PPET-2'로 명명하였다.

또한, 상기 발현 벡터의 효율을 비교하기 위해 pcDNA3.1 벡터에 루시퍼레이즈 유전자를 삽입한 대조군 벡터를 제조하고, 이를 'pcDNA3-루시퍼레이즈'라 명명하였다.

<실시예 2> 내피세포 발현 벡터의 효율 측정

본 발명자들은 내피세포 발현 벡터의 효율을 측정하기 위해 상기 실시예 1에서 제조한 내피세포 발현 벡터를 세포에 형질도입한 뒤 리포터 유전자의 발현량을 측정하였다.

<2-1> 세포 배양

본 발명자들은 벡터 pcDNA3-PPET-1 또는 pcDNA3-PPET-2를 형질도입하기 위해 소의 폐 내피세포(bovine pulmonary endothelium)인 CPAE 세포(한국 세포주은행, 10209), 인간의 탯줄 혈관 내피세포(Human umbilical vein endothelial cells )인HUVEC 세포(ATCC), 소의 대동맥 내피세포(Bovine aortic endothelial cells)인 BAEC 세포(Kim HPet al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,1999, 263, 257-262) 및 원숭이 신장 세포인 COS 세포(한국 세포주은행)를 사용하였다. HUVEC 세포는 EBM 킷트(Bio Whittaker, Inc)를 이용하여 배양하고, BAEC 세포는 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가하여 배양하였으며, COS 세포는 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가하여 배양하였고, CPAE 세포는 RPMI 배지에 20% FBS를 첨가하여 배양하였다.

<2-2> 형질 도입

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작한 벡터를 칼슘 포스페이트 침전(calcium phosphate coprecipitation) 방법으로 상기 실시예 <2-1>에서 배양한 각각의 세포에 형질도입하였다. 구체적으로, 형질도입하기 전날 세포를 플레이팅하고, 다음날 세포의 밀도가 50%가 되었을 때 새로운 배지로 교체하였다. pcDNA3-PPET-1, pcDNA3-PPET-2 또는 pcDNA3-루시퍼레이즈 벡터 DNA 각각에 2 M CaCl₂와 물을 섞어주며 DNA-CaCl₂혼합액을 만들었다. 상기 혼합액에 HBS(28 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na₂HPO₄, 12 mM 덱스트로스 및 50 mM HEPES)를 한방울씩 넣어주었다. 잘 섞인 상기 혼합액을 세포에 뿌려준 후 24시간이 지난후 새로운 배지로 교체하였다.

<2-3> 루시퍼레이즈 활성 측정

본 발명자들은 COS 세포주에 pcDNA3-PPET-1, pcDNA3-PPET-2 또는 pcDNA3-루시퍼레이즈 벡터를 형질도입한 후 세포를 PBS로 세척하고 용해 버퍼(125 mM Tris pH 7.8, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 50% 글리세롤 및 5% 트리톤 X-100)를 넣어 세포를 파괴한 후 상층액을 얻어 브래드포드 방법(bradford assay)을 사용하여 단백질양을 측정하였다. 루시퍼레이즈 활성은 분석버퍼(20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O, 2.67 mM MgSO₄, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 270 μM 코엔자임 A(리튬 솔트), 470 μM 루시페린 및 530 μM ATP)를 가한 후 루미노스캔(luminoskan ascent, Labysystems)을 이용하여 측정하였다. 그리고, 프로모터의 활성을 분석하기 위해, pcDNA3-루시퍼레이즈 벡터가 도입된 세포의 루시퍼레이즈 활성에 대한 pcDNA3-PPET-1 또는 pcDNA3-PPET-2 벡터가 도입된 세포의 루시퍼레이즈 활성을 비교하였다.

그 결과, COS 세포주에서는 pcDNA3-PPET-2의 루시퍼레이즈 활성이 pcDNA3-PPET-1의 루시퍼레이즈 활성보다 2.5배나 더 높았다(도 4). 따라서, 전사가 시작되는 부위에서 스타트 코돈까지의 거리가 유전자의 발현에 있어서 중요함을 알 수 있었다.

다음으로, 상기에서 루시퍼레이즈 활성이 뛰어남을 확인한 벡터 pcDNA3-PPET-2를 COS 세포, BAEC 세포, HUVEC 세포 및 CPAE 세포에 형질도입한 후 루시퍼레이즈 활성을 비교한 결과, pcDNA3-PPET-2의 루시퍼레이즈 활성은 COS 세포에 비해 HUVEC 세포는 약 2배, BAEC 세포는 약 1.8배 및 내피세포인 CPAE 세포에서는 약 8배나 더 높았다(도 5). 따라서, 본 발명의 발현 벡터 pcDNA3-PPET-2는 내피세포에 특이적으로 발현함을 알 수 있었다.

또한, 상기에서 내피세포 특이적으로 발현하는 벡터임을 확인한 pcDNA3-PPET-2의 발현량이 저산소 상태(hypoxia)에서 증가되는지 확인하기 위해 CPEA 세포에 pcDNA3-PPET-2를 형질도입한 뒤 정상 상태(normoxia) 또는 저산소 상태(hypoxia, 코발트 클로라이드(cobalt chloride) 100 μM, 24시간)로 배양한 후 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 그 결과, pcDNA3-PPET-2의 발현율은 정상 상태일때에 비해 저산소 상태에서 약 1.6배 높았다(도 6). 따라서, 본 발명의 내피세포 발현벡터는 저산소 상태에서 목적 유전자의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

본 발명자들은 내피세포에서 특이적으로 목적 유전자를 발현시키고 저산소 상태에서 발현량이 높은 pcDNA3-PPET-2 벡터를 대장균(E. coli)에 형질도입하여 2002년 10월 15일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10436).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 발현 벡터는 혈관내피세포에서 특이적으로 목적 유전자를 발현시키고, 특히 저산소 상태에서 발현이 증가하므로 혈관 공급에 의존하는 암 또는 심혈관계 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

내피세포 특이적 프로모터를 포함하여 목적 단백질을 내피세포에서 특이적으로 발현시키는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 내피세포 특이적 프로모터는 인간 ppET-1 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터 하류의 해독되지 않은 엑손 1로 구성된 서열번호 5로 기재되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 pcDNA3-PPET-2 벡터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터(수탁번호; KCCM-10436).
제 1항의 발현 벡터를 유효성분으로 함유하는 암 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물.