KR20040022128A - 항산화 활성을 가진 감인 추출물 및 분획물과 이들을함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감인 추출물 및 분획물과 이들을 함유한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출물은 바람직하게는 70％메탄올 감인 추출물이고, 분획물은 바람직하게는 에틸아세테이트, 부탄올, 물, 핵산 또는 디클로로메탄에 의해 추출된 분획물이다. 본 발명에 따른 추출물 및 분획물은 라디칼 소거 활성, 과산화지질 억제 활성, 활성산소종에 의한 세포 사멸체의 형성을 저해하는 활성, 및 세포내의 항산화 효소의 활성을 촉진하는 활성을 나타내므로, 활성산소종에 의해 손상된 세포의 치료를 위한 약물로 활용될 수 있다.

Description

항산화 활성을 가진 감인 추출물 및 분획물과 이들을 함유하는 화장료 조성물{Extracts and fractions of Euryale ferox with antioxidant activity and cosmetic compositions containing the same}

본 발명은 항산화 활성을 가진 감인(Euryale ferox)의 추출물 및 분획물과 이들을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

세포에 산화적 손상을 일으키는 요인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)은, 산소의 분압이 높을 때 인체 등의 유산소 호흡을 하는 생명체의 호기성 물질 대사에서 생기는 부산물이다. 이들은 반응성이 매우 크고, 생체내의 여러 물질과 반응하여 산화적 손상을 일으키며, 이로 인해 세포의 기능이 저해되고 세포의 사멸(apoptosis)이 초래된다. 활성산소종에 의한 DNA, 단백질, 지질 및 작은 세포 분자들의 산화적 손상은 심장 질환(Witzum, 1993), Alzheimer병과 같은 뇌신경계 장애(Frlich and Riederer, 1995), 돌연변이나 암(Borek, 1991)등과 같은 많은 질병들과 노화 현상을 일으키는 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Finkel and Holbrook, 2000). 광에 의한 피부 노화는, 태양광 중 자외선에 의해 생성된 반응성이 높은 활성산소종과 같은 자유 라디칼(free radical)종이 단백질, 핵산, 세포막 지질등의 생체 성분을 산화시키거나 변성시켜 노화로 나타나는 현상이다(한국 공개특허특2001-0058419). 활성산소종의 하나인 과산화수소(hydrogen peroxide; H₂O₂)는 세포 내에서 지질의 과산화와 DNA 손상을 야기하고(S. Ahmad, 1995), 50μM 이상의 농도에서 다양한 동·식물과 박테리아 세포에 독성을 나타내는 것으로 알려졌다(B. Halliwell et al., 2000).

세포 내에는 자체적으로 라디칼을 제거할 수 있는 항산화 물질들이 있는데, 이러한 항산화 작용을 하는 효소로는 수퍼 옥사이드(superoxide)를 분해하는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase; SOD)나 과산화수소를 물과 산소로 전환시키는 카탈라아제(catalase; CAT), 셀레늄을 활성 자리에 포함하고 있는 효소로서 과산화 수소뿐만 아니라 다른 과산화물들을 파괴하는 글루타치온 페록시다아제(glutathione peroxidase; GPX) 등이 있다(Blake et al., 1987). 또한, 활성산소종과 반응할 수 있는 다른 분자내 물질로는 글루타치온(glutathione; GSH), 플라보노이드(flavonoid), 유비퀴놀-10(ubiquinol-10), 글루코오스(glucose),알부민(albumin)등이 있다. 그 밖에 항산화 작용을 위해 외부에서 섭취할 수 있는 물질들로는 비타민 C, E, A 와 프로 비타민(pro-vitamin) A, 소량의 셀레늄(selenium)과 아연(zinc)등이 있다(Halliwell and Gutteridge, 1998).

상기 항산화 효소들과 같은 항산화 물질들의 활성을 증대시키거나 항산화 활성이 있는 천연물에 대한 중요성이 증가하고 있다. 과일이나 야채(Cao et al., 1996; Wang et al., 1996; Brown and Rice-Evans, 1998), 유지 종자(Deiana et al., 1999), 차(Roedig-Penman and Gordon, 1997), 딸기류의 과실(Wang and Jiao, 2000), 프로폴리스(Banskota et al., 2000), 인삼 추출물(Keum et al., 2000) 등의 다양한 천연 항산화 물질에 대한 연구와 보고가 이어지고 있다. 포도 껍질에 다량 함유 된 레즈베라트롤(resveratrol)은 활성산소종에 의해 유도된 rat pheochromocytoma(PC12) 세포의 사멸을 감소시킴으로써 항산화 작용을 한다고 보고되었다(M.V. Clement et al., 1998 ).

항산화제는 광범위한 생화학적 활성을 가지는 물질로 활성산소종의 형성을 억제하고 세포 내 생성된 라디칼을 직·간접적으로 소거하며 세포내의 산화·환원력을 변화시킨다(C.K. Sen , 1998). 몇몇 항산화제는 세포사멸(apoptosis)의 억제제로서 사용되어 오기도 했다. 왜냐하면 세포는 산화적 스트레스에 의한 손상의 결과로 세포사멸이라는 과정을 거쳐 사멸하게 되기 때문이다(D.M. Hockenhery et al. , 1993). N-acetylcysteine이나 dimercaptopropanol과 같이 황(sulfur)을 포함한 항산화제들은 형질전환된 세포주에서 p53-종양 억제 유전자를 통해 세포사멸을 일으킨다고 알려졌다( M. Liu et al., 1998). 지금까지 항산화제로서 많은 종류의 천연 약재들이 연구되고 있다.

본 연구에서 사용된 감인은 동양 한의학에서 전통적으로 쓰여온 강장제로서 탈장이나 냉대하의 치료에 이용되고 있다. 그에 대한 연구로는 Zhao 등이 핵자기공명분석법과 질량분석법을 이용하여 감인 내의 구성 성분 중 하나인 글리코실스테롤(glycosylsterols)과 세레브로사이드(cerebrocides)를 분리 분석한 보고가 있었고(Zhao et al., 1989, 1994), Puri 등은 출산 후 산모의 면역에 미치는 감인의 효과에 대해 연구한 바 있다(Puri et al., 2000). 그러나 감인의 생화학적 활성에 대한 연구는 현재까지 미비한 실정이다.

본 발명의 목적은, 세포 손상의 주요 원인이 되는 라디칼을 제거하여 세포 손상을 방지 또는 치료하는 약물에 사용될 수 있는 감인 추출물 및 분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 세포내의 항산화 물질의 활성을 증가시키는 약물에 사용될 수 있는 감인 추출물 및 분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 피부에 대한 산화적 스트레스를 제거하여 피부 노화를 방지 또는 지연할 수 있도록 안전하면서 라디칼 소거 효과가 높은 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

도1은 감인 추출물과 분획물이 DPPH 라디칼 소거 활성(radical scavenging activity)이 있음을 나타낸 것이며, 그 값은 평균 ±S.D.으로 표시하였다. 도1의 각 도형은 다음을 의미한다. ●- 메탄올 추출물, ○- 헥산 분획물, ▲- 디클로로메탄 분획물, △ - 에틸아세테이트 분획물, ■- 부탄올 분획물, □- 물 분획물.

도2는 감인 추출물과 분획물이 과산화 수소에 의한 V79-4세포의 산화적 손상을 방어하는 활성이 있음을 나타낸 것이며, 그 값은 평균 ±S.D.으로 표시하였다. 도2의 각 도형은 다음을 의미한다. ●- 메탄올 추출물, △ - 에틸아세테이트 분획물, ■- 부탄올 분획물.

도3는 감인 추출물과 분획물이 과산화지질의 형성을 억제하는 활성이 있음을 나타내며, 그 값은 평균 ±S.D.으로 표시하였다. 도3의 각 도형은 다음을 의미한다. ●- 메탄올 추출물, △ - 에틸아세테이트 분획물, ■- 부탄올 분획물.

도4, 도5, 및 도6은 감인 추출물이 과산화수소에 의해 유도된 V79-4 세포 사멸 (apoptosis)에 대하여 방어 효과가 있음을 나타내며, 200배율의 형광현미경으로 세포의 형태적 변화를 관찰한 것이다. 도4는 정상 세포, 도5는 1mM의 과산화수소를 가한 세포, 도6는 100㎍/㎖의 감인 추출물로 처리한 후 과산화수소를 가한 세포를 각각 나타낸다.

도7, 도8,및 도9는 감인 추출물과 분획물이 각각 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase; SOD)(도7), 카탈라아제(catalase; CAT)(도8), 및 글루타치온 페록시다아제(glutathione peroxidase; GPX)(도9) 활성을 촉진하는 활성이 있음을 나타내며, 그 값은 평균 ±S.D.으로 표시하였다. 알파벳 표시는 각각 T는 메탄올 추출물, E는 에틸아세테이트 분획물, B는 부탄올 분획물을 나타내며, 도면상의 검정 막대, 빗금친 막대, 흰색 막대는 각각 시료의 4, 20, 100㎍/㎖농도를 나타낸다.

본 발명에 따른 감인 추출물 및 분획물은 항산화 활성을 나타낸다.

본 발명의 감인 추출물은 극성용매에 의해 추출된 것이며 바람직하게는 70% 메탄올 추출물이다. 본 발명에 따른 감인 분획물은 핵산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 또는 물에 의해 추출된 분획물이다. 본 발명에 따른 추출물 또는 분획물은 과산화지질 억제 활성, 라디칼 소거 활성, 라디칼에 의한 세포 사멸체의 형성을 저해하는 활성을 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 추출물 또는 분획물은, 항산화물질, 예를 들면, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 카탈라아제(CAT), 또는 글루타치온 페록시다아제(GPX)와 같은 항산화 효소들의 활성을 촉진한다. 또한, 본 발명에 따른 추출물 또는 분획물은 바람직하게는 세포내에서(in vivo) 상기 SOD, CAT, 또는 GPX의 활성을 증가시킨다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상술한 항산화 활성을 가진 추출물 또는/및 분획물을 유효성분으로써 함유한다. 이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1. 추출물 및 분획물 제조

1) 감인의 메탄올 추출물 및 분획물의 제조

감인은 경동시장에서 구입하였으며 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 구입한 감인을 잘게 분쇄한 후 둥근 플라스크에 약 100g과 70％ 메탄올을 넣고, 80℃로 가열하여 환류하면서 3시간 이상 추출하였다. 이를 상온으로 온도를 낮추고 거름종이를 이용하여 추출액을 걸러 남은 시료를 다시 위와 같은 방법으로 1회 반복하여 추출하고 거른액을 합쳐서 감압 농축하였다. 이를 증류수에 녹여 동결 건조시켜 분말로 만든 후 -70℃에 보관하였다. 분획은 감인의 메탄올 추출물 수용액에 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올을 단계적으로 가하여 추출한 후 각 용매 추출물과 남은 물층의 용매를 감압 농축기(Eyela, Japan)로 증발시키고 디메틸 술폰산(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 100㎍/㎖가 되도록 녹여 -70℃에 보관하였다. 본 연구에서는 이들을 세포배양배지 또는 생리 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)에 여러 가지 농도로 희석하여 사용하였다.

2) 세포배양

본 발명에서 사용한 세포주는 쥐의 폐로부터 분리된 V79-4 세포(Chinese hamster lung fibroblast; ATCC CCL-93)이며 배양액으로는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, BRL, USA) 배지에 5％ FBS(fetal bovine serum, BioWhittaker, USA), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin), 100unit/㎖의 페니실린(penicillin)과 2mM_L-글루타민(_L-glutamine)을 넣고 37℃에서 5％ CO₂/95％ 공기의 조건하에 배양하였다.

실험예 1. 항산화 활성(antioxidant activity) 측정 실험

실험예 1-1. DPPH 라디칼 소거 활성 측정 실험

Blosi의 방법(Blosi, 1958)에 따라 1.5 ×10^-4M DPPH(Sigma, USA) 600㎕에 각 생약 추출물의 농도가 100, 20, 4 및 0.8㎍/㎖가 되도록 각각 가한 후 메탄올 용액을 가하여 최종 부피를 3㎖로 만들었다. 이를 10초간 진탕하여 잘 섞은 후 520㎚에서 흡광도를 측정(Ultraspec 2000 UV/Visible spectrometer, Pharmacia Biotech)하여 다음 식에 의하여 DPPH 라디칼의 소거 활성을 산정하였다.

라디칼 소거 활성(％) = (흡광도_대조군- 흡광도_시료)/흡광도_대조군× 100

각 시료의 항산화 작용은 IC₅₀(DPPH 라디칼 형성을 50%로 억제하는데 필요한 시료의 농도)값으로 나타내었다(도1).

실험예 1-2. 세포 생존율 측정 실험

세포 생존은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma, USA) 분석법을 이용하였다. V79-4 세포를 96공 플레이트(96 well plate)에 1.2 ×10⁵cells/㎖의 농도로 접종하였고 16시간 후에 감인의 메탄올 추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 각각 4, 20, 100㎍/㎖의 농도가 되도록 가하였다. 1시간 후 과산화수소를 100 μM 되도록 가하고 24시간 동안 배양하였다. MTT는 생리식염수(PBS)에 5㎎/㎖로 녹이고 마지막 4시간 전에 세포에 20㎕를 가하여 배양한 후 각 공의 배양액을 제거하고 형성된 포마잔(formazan)염을 0.04N HCl이 함유된 이소프로판올 100㎕로 완전히 용해시킨 후 96공 플레이트 측정 장치(ELISA reader, Bio-Rad, USA)를 이용하여 570㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 과산화수소만을 가한 대조 세포에 대해, 추출물 및 분획물 처리를 한 후 과산화수소를 가한 세포의 생존비를 백분율로 나타내었다(도2).

실험예 1-3. 과산화지질 억제 활성(lipid peroxidation inhibitory activity) 측정

과산화지질 억제 활성을 측정하기 위하여, 배양한 V79-4 세포에 각 감인 추출물의 농도가 100, 20 및 4㎍/㎖가 되도록 가한 후 1시간 동안 배양하였다. 다음에 산화적 스트레스를 일으키기 위하여 과산화수소의 농도가 1mM 되도록 가한 후 다시 1시간 동안 배양하였다. 처리한 세포를 생리식염수로 잘 씻은 후 1.15％ 염화칼륨 500㎕를 가하여 세포를 수확하고 원심분리기용 튜브(microfuge tube)로 옮긴 다음 4℃를 유지하면서 균질화하여 사용하였다. 이 마쇄 균질액 100㎕에 Ohkawa 등의 방법(Ohkawaet. al., 1979)에 준해 8.1％ SDS(sodium dodecyl sulfate) 200㎕, pH를 3.5로 조절한 20％ 아세트산(acetic acid) 1.5㎖ 및 0.8％ TBA(thiobarbituric acid) 1.5㎖를 각각 가하고 증류수로 최종 부피가 4㎖ 되도록채웠다. 이 용액을 잘 섞은 후 95℃에서 2시간 동안 가열하여 반응시키고 실온으로 냉각한 다음 생성된 홍색의 착색 물질을 부탄올 : 피리딘(n-butanol : pyridine, 15:1, v/v) 혼합액으로 추출하여 1800rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해 532㎚에서 흡광도를 측정하고 과산화지질 억제 활성을 구하였다(도3).

실험예 1-4. DNA 형광 염색(Nuclear staining with propidium iodide)

V79-4 세포를 60mm 배양 접시에 배지 1㎖당 1.2 ×10⁵의 농도로 계대하였다. 16시간 후에 감인의 메탄올 추출물을 100㎍/㎖이 되도록 가하고 1시간 후에 과산화수소수를 1mM의 농도가 되도록 가하였다. 24시간 동안 배양한 후에 세포를 수확하고 생리식염수로 씻어주었다. 세포를 4 ×10⁵의 농도가 되도록 생리식염수에 분산시키고 일정량을 취해 현미경 슬라이드 위에 떨어뜨린 후에 cytospin (Hanil, Korea)을 이용하여 부착시켰다. 세포가 부착된 슬라이드를 에탄올 용액 속에 넣어 세포를 고정시키고 생리식염수로 씻어주었다. 세포 핵 내의 DNA를 염색하기 위하여 2.5㎍/㎖의 프로피디움 요오다이드(propidium iodide)와 100㎍/㎖의 DNase-free RNase를 슬라이드 위에 부착된 세포에 떨어뜨린 후 형광 현미경 (E800, Nikon, Japan)으로 염색된 세포의 모양을 관찰하였다(도4, 도5, 도6).

<실험예 1의 결과 분석>

감인의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성(실험예 1-1),세포 생존율(실험예 1-2), 과산화지질 억제 활성(실험예 1-3), 세포사멸체 형성의 억제 효과를 관찰하기 위한 DNA 형광염색(실험예 1-4)등에 의해 측정되었다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 도1에 도시하였는데, 감인의 메탄올 추출물은 IC₅₀5.6㎍/㎖의 높은 소거 활성을 나타내었다. 분획물에서는 에틸아세테이트와 부탄올 분획물의 IC₅₀값이 각각 1.5와 2.2㎍/㎖로서 가장 높은 소거 활성을 보였다.

세포 생존율은 도2에 나타낸 바와 같이 가해준 시료의 농도가 증가함에 따라 생존율이 증가하는 농도 의존성을 보였다. 메탄올 추출물의 IC₅₀값은 16.7㎍/㎖이었고, 특히 100㎍/㎖의 에틸아세테이트 분획물을 가했을 때 큰 상승 효과를 나타내었다.

감인의 메탄올 추출물과 분획물의 과산화지질 억제 활성은 도3에 도시하였다. 메탄올 추출물로 처리한 세포의 과산화지질 억제 활성은 IC₅₀20.5㎍/㎖로 다소 낮은 값을 보였다. 에틸아세테이트와 부탄올 분획물의 경우엔 각각 IC₅₀5.1과 6.3㎍/㎖의 높은 과산화지질 억제 활성을 나타내었다.

세포 사멸을 억제하는 감인의 효과를 조사하기 위하여 DNA 특이 형광 염료인 프로피디움 요오다이드를 이용하여 세포 내 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 도4, 도5, 및 도6에서 보는 바와 같이 정상 세포의 경우 완전한 핵의 모양을 관찰할 수 있는 반면에(도4), 세포에 1mM의 과산화수소를 가한 후 관찰한 결과에서는 세포 내 핵의 크기가 정상 세포의 경우보다 작은 크기이거나 세포막이 파괴된 형태로 관찰되어 세포 사멸의 현상 중 하나인 핵의 분절화 (nuclear fragmentation)가 일어났음을 볼 수 있었다(도5). 그러나, 100㎍/㎖의 감인 추출물로 세포를 미리 처리한 후 과산화수소를 가한 결과에서는 정상 세포에서와 거의 비슷한 핵의 모양이 관찰됨으로써(도6) 감인 추출물이 과산화수소에 의해 유발되는 세포 사멸의 한 형태인 핵 분절화에 대해 방어 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실험예 2. 세포내에서(in vivo) 항산화 효소의 활성(antioxidant enzyme activity)의 측정실험

항산화 효소 활성을 측정하기 위하여 감인의 메탄올 추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 4, 20, 100㎍/㎖의 농도가 되도록 세포에 각각 가하였다. 세포는 각 측정 방법에서 요구하는 적당한 완충용액으로 용해시킨 후 사용하였고, Bradford(1976) 방법에 따라 단백질을 정량하였다. 결과는 시료를 가하지 않은 대조 세포에 대한, 시료를 가한 세포에서의 효소 활성의 증가를 백분율로 나타내었다(도7, 도8, 및 도9).

실험예 2-1. 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 활성 측정

SOD 활성은 Beauchamp와 Fridovich(1971)의 NBT(nitroblue tetrazolium) 방법으로 측정하였다. 감인 추출물을 처리한 세포에 0.05M 탄산 나트륨 완충용액(pH 10.2)을 가하여 균질화하여 사용하였다. 이 마쇄 균질액 50㎕에 3 mM크산틴(xanthine), 0.75 mM NBT, 3 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 1.5 ㎎/㎖ BSA(bovine serum albumin)을 가하여 진탕한 후 0.1㎎/㎖의 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 50㎕를 가하고 상온에서 30분 동안 방치하였다. 반응은 6mM 염화 구리(II)를 가하여 멈춘 후 1500rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 취해 560nm에서 흡광도를 측정하고 SOD 활성을 구하였다(도7).

실험예 2-2. 카탈라아제(CAT) 활성 측정

시료를 처리한 마쇄 균질액 100㎕에 3％ 과산화수소 12㎕를 가하고 50mM 인산 완충용액(pH 7.0)으로 최종 부피가 1㎖ 되도록 채웠다. 이 용액을 37℃에서 2분 동안 방치한 후 240㎚에서 5분 동안 과산화수소의 흡광도 변화를 측정하였다(Carrillo et al., 1991)(도8).

실험예 2-3. 글루타치온 과산화효소(GPX) 활성 측정

Paglia와 Valentine(1967)의 방법에 따라 시료를 처리한 마쇄 균질액 100㎕에 1mM EDTA, 10mM GSH, 1mM 아지드화 나트륨(NaN₃), 1 unit의 글루타치온 환원효소(glutathione reductase), 1.5mM NADPH를 가한 후 3℃에서 10분 동안 방치하였다. 이 용액에 과산화수소를 1mM 되도록 각각 가한 후 340㎚에서 NADPH의 흡광도 변화를 측정하였다(도9).

<실험예 2의 결과 분석>

감인의 항산화 작용에 의한 세포내(in vivo) 항산화 효소 활성의 변화를 알아보기 위하여 감인 추출물로 처리한 V79-4 세포 내의 SOD(실험예 2-1), CAT(실험예 2-2), GPX(실험예 2-3) 활성을 측정하였다. 메탄올 추출물의 농도를 4, 20, 100㎍/㎖으로 증가시킴에 따라 SOD 활성도 9, 20, 24 ％로 증가하였다(도7). 분획물에서는 에틸아세테이트를 100㎍/㎖의 농도로 처리한 세포에서 34%의 가장 높은 활성 증가를 나타내었으며, 부탄올 분획물의 경우에는 100㎍/㎖의 농도에서 26％의 증가를 보였다. 분획물에서도 농도가 증가함에 따라 SOD 활성도 증가하는 농도 의존성을 나타내었다. 시료를 처리하지 않은 대조 세포에서의 SOD 활성은 24.9 ±1.5 U/㎎ 단백질이었다.

CAT 활성도 SOD 활성과 유사한 경향을 나타내었다. 메탄올 추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 100㎍/㎖의 농도로 가했을 때 각각 23, 32, 26％로 CAT 활성이 증가되었다(도8). 모든 시료는 4내지 100㎍/㎖의 농도 범위에서 농도 의존적인 CAT 활성 증가를 보였으며, 에틸아세테이트 분획물을 처리했을 때 가장 큰 증가 효과를 나타내었다. 대조 세포의 CAT 활성은 14.9 ±1.9 U/㎎ 단백질이었다.

감인의 추출물들은 SOD나 CAT에 비해 특히 GPX의 활성을 크게 증가시켰다. 메탄올 추출물과 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 100㎍/㎖의 농도로 처리했을 때 GPX 활성은 각각 50, 65, 58%의 증가를 나타내었다(도9). 다른 항산화 효소 활성과 마찬가지로 GPX 활성도 시료의 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 농도 의존성이 관찰되었다. 시료를 처리하지 않은 대조 세포의 GPX 활성은 11.7 ±1.3 U/㎎ 단백질이었다.

실시예 2. 감인의 추출물 및 분획물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

본 발명에 따른 감인의 추출물 및 분획물을 사용한 일예로서, 실시예 1에서 제조한 감인의 추출물 및 분획물을 화장료와 배합하여 화장품 분야의 통상의 제조 방법에 따라 제조한다. 배합비율에 관한 것은, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(로션), 영양크림, 맛사지 크림, 팩, 및 유화형 파운데이션등에 대하여 한국 공개특허특2001-0058419에 일예로서 예시되어 있다. 한국 공개특허특2001-0058419는 본 명세서의 일부로써 참조된다. 배합비율은 화장품의 종류에 따라서, 당업자가 적절히 조절할 수 있을 것이다.

본 발명은 그 정신 또는 주요한 특징으로부터 일탈하는 일 없이, 다른 여러가지 형태로 실시할 수 있다. 그 때문에, 전술한 실시예는 모든 점에서 단순한 예시에 지나지 않으며, 한정적으로 해석해서는 안된다. 본 발명의 범위는 특허청구의 범위에 의해서 나타나는 것으로써, 명세서 본문에 의해서는 아무런 구속도 되지 않는다. 특허청구범위의 균등 범위에 속하는 변형이나 변경은, 모두 본 발명의 범위내의 것이다.

본 발명에 따른 감인 추출물 및 분획물은, 라디칼 소거 활성, 과산화지질 억제 활성, 라디칼에 의한 세포 사멸체의 형성을 저해하는 활성, 및 세포내의 항산화 물질의 활성을 촉진하는 활성을 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 감인 추출물 및 분획물은, 세포 손상의 주요 원인이 되는 활성산소종과 같은 라디칼을 제거하여 세포 손상을 방지 또는 치료하는 약물에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 및 분획물은, 세포내의 항산화 효소와 같은 항산화 물질의 활성을 증가시키는 약물에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 피부에 대한 산화적 스트레스를 제거하여 피부 노화를 방지 또는 지연할 수 있도록 안전하면서 활성산소종 소거 효과가 높은 화장료 조성물로써 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 감인의 분획물들 중에서 에틸 아세테이트와 부탄올 분획물은, 특히 높은 항산화 활성을 가지고 있으므로, 두 분획물의 구성성분을 분리하여 보다 효과적인 항산화제로서 사용될 수 있다.

<참고문헌>

한국 공개특허특2001-0058419, 출원일:1999년 12월 11일, 출원인: 주식회사 코리아나 화장품

Banskota AH, Tezuka Y, Adnyana IK, Message D, Kadota S. Cytotoxic, hepatoprotective and free radical scavenging effects of propolis from Brazil, Peru, the Netherlands and China. J Ethnopharmacol 2000; 72; 239-246

Beauchamp C, Fridovich I. Assays of superoxide dismutase. Anal Biochem 1971;44; 276-287

Blosi MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 1958; 181; 1199-1200

Borek C. Free radical processes in multistage carcinogenesis. Free Radic Res Commu 1991; 12; 745-750

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72; 248-254

Brown JE, Rice-Evans CA. Luteolin-rich artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro. Free Radic Res 1998; 29; 247-255

Cao G, Sofic E, Prior RL. Antioxidant and prooxidant behaviour of flavonoids: Structure-activity relationships. Free Radic Biol Med 1996; 22; 749-760

Carrillo MC, Kanai S, Nokubo M, Kitani K. Deprenyl induces activities of both superoxide dismutase and catalase but not glutathione peroxidase in the striatum of young male rats. Life Sci 1991; 48; 517-521

Choi JW, Han YN, Lee KT, Park KY, Kwak TS, Kwon SH, Park HJ. Anti-lipid peroxidative principles from stem bark ofKalopanax pictusNakai. Exp Mol Med 2001; 24; 536-540

Clement MV, Hirpara JL, Chawdhury S, and Pervaiz S(1998) Chemopreventive agent resveratrol, a natural product derived from grapes, triggers CD95 signaling-dependent apoptosis in human tumor cells,Blood, 92(3), 996-1002

Deiana M, Aruoma OI, Bianchi M, Halliwell B, Aeschbach R, Corongiu FP. Inhibition of peroxinitride-dependent DNA base modification and tyrosine nitration by the extra virgin olive oil-derived antioxidant hydroxytyrosol. Free Radic Biol Med 1999; 26; 762-769

Finkel T, Holbrook NJ. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature 2000; 408; 239-247

Frlich I, Riederer P. Free radical mechanisms in dementia of Alzheimer type and the potential for antioxidative treatment. Drug Res 1995; 45; 443-449

Gohil K, Moy RK, Farzin S, Maguire JJ, Packer L. mRNA expressionprofile of a human cancer cell line in response to Ginkgo biloba extract: induction of antioxidant response and the Golgi system. Free Radic Res 2000; 33; 831-849

Halliwell B, Gutteridge JMC. Free Radicals in Biology and Medicine. 3rd Ed., 1998, Oxford University

Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods 1989; 119; 203-210

Keum YS, Park KK, Lee JM, Chun YS, Surh YJ. Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng. Cancer Lett 2000; 150; 41-48

Kim JS, Oh JH, Lee DW, Park HJ, Park DK. Effect of ginsenoside Rb₁on lipid peroxidation and neurotoxicity induced by MPTP in liver and brain of mouse. Exp Mol Med 1996;28:199-205

Kitts DD, Yuan YV, Wijewickreme AN, Hu C. Antioxidant properties of a North American gingseng extract. Mol Cell Biochem 2000; 203; 1-10

Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxide in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979; 95; 351-358

Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitativecharacterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70; 158-164

Puri A, Sahai R, Kiran L, Singh RP, Saxena KC. Immunostimulant activity of dry fruits and plant materials used in Indian traditional medical system for mothers after child birth and invalids. J Ethnopharmacol 2000; 71; 89-92

Roedig-Penman A, Gordon MH. Antioxidant properties of catechins and green tea extracts in model food emulsions. J Agric Food Chem 1997; 45; 4267-4270

Wang H, Cao G, Prior RL. Total oxidant capacity of fruits. J Agric Food Chem 1996; 44; 701-705

Witztum JL. The role of oxidized lox density lipoproteins in atherogenesis. Br. Heart J 1993; 69; 12-14

Zhao H, Zhao S. New Cerebrosides fromEuryale Ferox. J Nat products 1994; 57; 138-141

Zhao H, Zhao S, Sun C, Guillaume D. Glucosylsterols in extracts ofEuryale feroxidentified by high resolution NMR and mass spectrometry. J Lipid Res 1989; 30; 1633-1637

Claims (22)

1. 항산화 활성을 나타내는, 극성 용매로 추출된 감인 추출물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 극성 용매는 70％ 메탄올인 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 감인 추출물은 라디칼을 소거하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 감인 추출물은 라디칼에 의한 세포 사멸체의 형성을 억제하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
5. 제 3항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 라디칼은 활성산소종인 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 감인 추출물은 과산화지질의 형성을 억제하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 감인 추출물은 항산화 물질의 활성을 촉진하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 감인 추출물은 세포내에서(in vivo) 항산화 물질의 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 감인 추출물
9. 제 7 항에 있어서, 상기 항산화 물질은 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 카탈라아제(CAT), 또는 글루타치온 페록시라아제(GPX)인 것을 특징으로 하는 감인 추출물.
10. 항산화 활성을 나타내는 감인 분획물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 에틸아세테이트, 부탄올, 핵산, 디클로로메탄, 또는 물에 의해 추출된 감인 분획물.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 라디칼을 소거하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 라디칼에 의한 세포 사멸체의 형성을 억제하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 라디칼은 활성산소종인 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
15. 제 11 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 과산화지질의 형성을 억제하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
16. 제 11 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 항산화 물질의 활성을 촉진하는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 감인 분획물은 세포내에서(in vivo) 항산화 물질의 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 감인 분획물
18. 제 16 항에 있어서, 상기 항산화 물질은 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 카탈라아제(CAT), 또는 글루타치온 페록시라아제(GPX)인 것을 특징으로 하는 감인 분획물.
19. 화장료 조성물에 있어서, 제 1 항 내지 제 4 항, 또는 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 따른 감인 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
20. 화장료 조성물에 있어서, 제 5 항에 따른 감인 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
21. 화장료 조성물에 있어서, 제 10 항 내지 제 13 항, 또는 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 하나의 항에 따른 감인 분획물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
22. 화장료 조성물에 있어서, 제 14 항에 따른 감인 분획물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.