KR20040020080A - 마커-프리 돌연변이화 표적 생물체를 제조하는 방법 및이를 위해 적합한 플라스미드 벡터 - Google Patents

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KR20040020080A KR10-2004-7001776A KR20047001776A KR20040020080A KR 20040020080 A KR20040020080 A KR 20040020080A KR 20047001776 A KR20047001776 A KR 20047001776A KR 20040020080 A KR20040020080 A KR 20040020080A
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Abstract

본 발명은 a) 표적 생물체와 상이한 숙주 생물체에 대한 복제 기점, b) 하나 이상의 유전자 마커, c) 경우에 따라, 접합을 통해 DNA 전이를 가능하게 하는 서열 부분 (mob 서열), d) 표적 생물체의 서열과 상동성이 있으며 표적 생물체에서 상동성 재조합을 가능하게 하는 서열 부분, e) 프로모터의 조절 하에 있는 갈락토키나아제 유전자를 포함하는, 표적 생물체에서 복제되지 않는 플라스미드 벡터에 관한 것이다.

Description

마커-프리 돌연변이화 표적 생물체를 제조하는 방법 및 이를 위해 적합한 플라스미드 벡터 {Method for Producing a Marker-free Mutated Target Organism and Plasmid Vectors Suitable for the Same}
본 발명은 그람-양성 박테리아의 게놈을 변형시키는 신규 방법, 이러한 박테리아 및 신규 벡터에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 박테리아에서 조건부 음성 우성 작용 (conditionally negatively dominant action)을 갖는 신규 마커 유전자의 도움을 받아 코리네박테리아 또는 브레비박테리아를 변형시키는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 (다른 코리네박테리아, 즉 코리네박테리움 종 및 브레비박테리움 종과 같이) 산업적으로 다수의 정밀 화학물질을 생산하는 데에 이용되고, 또한 탄화수소의 분해 및 터페노이드의 산화에도 이용되는 그람-양성의 호기성 박테리아이다 (이에 대한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer] 참조).
코리네박테리아에서 이용할 수 있는 클로닝 벡터와, 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum) 및 관련 코리네박테리움 종 및 브레비박테리움 종의 유전자 조작 기술 (예를 들어, 문헌 [Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597],[Katsumata et al., J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311] 및 [Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2237-2246] 참조)이 입수가능함에 따라, 예를 들어 이들 생물체를 1종 이상의 정밀 화학물질의 생산자로서 더 양호하고 더 효율적으로 만들기 위한 유전자 변형 (예를 들어, 유전자의 과발현)이 가능하다.
이와 관련하여 코리네박테리아에서 복제될 수 있는 플라스미드를 이용하는 것은 잘 정립된 기술로서 당업자에게 공지되어 있고, 널리 이용되며, 문헌에 자주 기록되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Deb, J. K et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 175, 11-20] 참조).
또한, 코리네박테리아 게놈의 DNA 서열을 변형시킴으로써 코리네박테리아의 유전자 변형을 발생시키는 것이 가능하다. DNA 서열을 게놈 내에 도입 (새로운 서열의 도입 및(또는) 기존 서열의 추가 카피를 도입)하는 것이 가능하고, 게놈으로부터 DNA 서열 부분 (예를 들어, 유전자 또는 유전자 일부)을 결실시키는 것도 가능하며, 게놈 내에서의 서열 교환 (예를 들어, 염기 교환)을 수행하는 것도 가능하다.
게놈의 변형은 바람직하게는 특정 세포 내에서 복제되지 않는 DNA를 그 세포 내로 도입시키고, 도입된 DNA를 숙주 게놈 DNA와 재조합시켜 게놈 DNA를 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌 [van der Rest, M.E. et al. (1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 541-545] 및 그의 참고문헌들에 기재되어 있다.
사용된 형질전환 마커 (예를 들어, 항생물질 내성 유전자)는 이후 추가의 형질전환 실험에서 재사용될 수 있기 때문에, 이 형질전환 마커를 결실시킬 수 있는 것이 유리하다. 이것을 수행할 수 있는 한가지 가능성은 조건부 음성 우성 작용을 가진 마커 유전자를 이용하는 것이다.
조건부 음성 우성 작용을 가진 마커 유전자는, 특정 조건 하에서는 숙주에게 불리 (예를 들어, 독성)하지만 다른 조건 하에서는 상기 유전자를 지닌 숙주에게 불리한 효과를 나타내지 않는 유전자를 의미한다. 문헌 상의 한 예에서, 효모 또는 진균의 URA3 유전자는 피리미딘 생합성에 필수적인 유전자이지만, 배지 중에 화학물질인 5-플루오로오로트산이 존재할 경우에는 숙주에게 불리하다 (예를 들어, DE19801120 및 문헌 [Rothstein, R. (1991) Methods in Enzymology 194, 281-301] 참조).
DNA 서열 (예를 들어, 사용된 형질전환 마커 및(또는) 벡터 서열 및 다른 서열 부분)을 결실 (또한, "팝-아웃 (pop-out)"으로도 불림)시키기 위해 조건부 음성 우성 작용을 가진 마커 유전자를 사용하는 것은, 예를 들어 문헌 [Schaefer et al. (1994) Gene 145, 69-73] 또는 [Rothstein, R. (1991) Methods in Enzymology 194, 281-301]에 기재되어 있다.
갈락토키나아제 (E.C.2.7.1.6)는 갈락토스의 인산화를 촉매하여 갈락토스 포스페이트를 생성한다. 상이한 생물체로부터 유래한 다수의 갈락토키나아제가 공지되어 있으며, 그 예로는 에셰리치아 콜라이 (Escherichia coli)galK유전자 (문헌 [Debouck et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 1841-1853]에 기재됨), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)galK유전자 (문헌 [Glaser et al. (1993) Mol.Microbiol. 10, 371-384]에 기재됨) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)GAL1유전자 (문헌 [Citron ＆ Donelson (1984) J. Bacteriol. 158, 269-278]에 기재됨)가 있고 이들은 각각 갈락토키나아제를 코딩한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 갈락토키나아제 유전자가 그람-양성 박테리아 (바람직하게는, 코리네박테리아)에서 조건부 음성 우성 작용을 갖는 유전자 마커로서 사용하기에 매우 적합함을 발견하였다. 갈락토키나아제 유전자는 영양 배지 (통상 배지 중 0.1 내지 4％ 농도 범위의 갈락토스)에서 갈락토스에 대한 코리네박테리아의 감수성을 유발한다.
본 발명은
a) 표적 생물체와 상이한 숙주 생물체에 대한 복제 기점,
b) 하나 이상의 유전자 마커,
c) 경우에 따라, 접합을 통해 DNA 전이를 가능하게 하는 서열 부분 (mob 서열),
d) 표적 생물체의 서열과 상동성이 있으며 표적 생물체에서 상동성 재조합을 가능하게 하는 서열 부분,
e) 프로모터의 조절 하에 있는 갈락토키나아제 유전자
를 포함하는, 표적 생물체에서 복제되지 않는 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
표적 생물체는 본 발명의 방법 및 플라스미드 벡터에 의해 유전자 변형될 생물체를 의미한다. 바람직한 생물체는 그람-양성 박테리아, 구체적으로는 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터 유래한 박테리아 균주이다.
프로모터 d)는 바람직하게는 사용된 갈락토키나아제 유전자와 이종성이다. 특히 적합한 프로모터는 이. 콜라이 (E. coli) 또는 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)으로부터 유래한 것이다. 특히 바람직한 것은 tac 프로모터이다.
복제 기점 a)가 기능적으로 활성인 숙주 생물체는 본질적으로 본 발명의 플라스미드 벡터를 작제하고 증식시키는 작용을 한다. 사용가능한 숙주 생물체로는 유전공학에 의해 용이하게 조작될 수 있는 모든 통상의 미생물이 있다. 바람직한 숙주 생물체로는 에셰리치아 콜라이 (Escherichia coli)와 같은 그람-음성 박테리아, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모가 있다. 숙주 생물체는 표적 생물체와 유전자적으로 상이해야 하는데, 이는 복제 기점 a)의 사용으로 인하여 플라스미드 벡터의 복제가 표적 생물체에서는 발생하지 않아야 하고 숙주 생물체에서는 발생해야 하기 때문이다.
표적 생물체에서 정밀 화학물질의 생산 증가와 관련된 서열을 교환하는 것이 바람직하다. 이러한 유전자의 예는 WO 01/0842, WO 01/0843, WO 01/0844, WO 01/0804, WO 01/0805 및 WO 01/2583에 기재되어 있다.
이러한 종류의 변형의 예로는 핵산 분자 (예를 들어, 완전한 유전자)의 게놈 통합, 붕괴 (예를 들어, 결실 또는 통합적 붕괴) 및 서열 변형 (예를 들어, 단일 또는 다중 점 돌연변이, 완전한 유전자 치환)이 있다. 바람직한 붕괴는 이로 인해 원하는 발효 산물의 부산물이 감소하는 것이며, 바람직한 통합은 이로 인해 발효 산물로의 바람직한 대사를 증진시키고(시키거나) 병목화를 감소 또는 제거 (탈-병목화)하는 것이다. 서열 변형의 경우에서는, 적절한 대사 개조가 바람직하다. 발효 산물은 바람직하게는 정밀 화학물질이다.
표적 생물체 내로 DNA를 전이시키는 것은 당업자에게 친숙한 방법에 의해, 바람직하게는 접합 또는 전기천공법 (electroporation)을 통해 수행한다.
접합을 통해 표적 생물체 내로 전이될 DNA는, 이러한 전이를 가능하게 하는 특별한 서열 부분 (이하, mob 서열이라 부름)을 포함한다. 이러한 mob 서열과 그의 이용은, 예를 들어 문헌 [Schaefer, A. et al. (1991) J. Bacteriol. 172, 1663-1666]에 기재되어 있다.
유전자 마커는 유전자에 의해 매개되는 선별가능성을 의미한다. 바람직한 의미는 발현에 의해 항생물질에 대한 내성, 구체적으로는 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 또는 앰피실린에 대한 내성을 유발하는 유전자이다.
구체적으로, 갈락토스-함유 배지는 0.1 중량％ 이상, 10 중량％ 이하의 갈락토스를 함유하는 배지를 의미한다.
본 발명의 목적상, 코리네박테리아는 코리네박테리움 종, 브레비박테리움 종 및 마이코박테리움 종 모두를 의미한다. 코리네박테리움 종 및 브레비박테리움 종이 바람직하다.
코리네박테리움 종 및 브레비박테리움 종의 예로는 브레비박테리움 브레비스 (Brevibacterium brevis), 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움 암모니아제네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 락토퍼멘툼(Corynebacterium lactofermentum)을 언급할 수 있다.
마이코박테리움 종의 예로는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프라 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis)가 있다.
특히 바람직한 표적 생물체는 하기 표에 기재된 균주들이다.
추가적으로, 본 발명은
a) 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 하나에 청구된 플라스미드 벡터를 표적 생물체 내로 전이시키는 단계,
b) 상기 플라스미드 벡터에 의해 도입된 하나 이상의 유전자 마커를 함유하는 표적 생물체를 선별하는 단계,
c) 단계 b)에서 수득된 상기 표적 생물체의 클론을 갈락토스-함유 배지에서 배양하여 갈락토스 감수성의 존재 여부에 대해 선별하는 단계
를 포함하는, 마커-프리 (marker-free) 돌연변이화 표적 생물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가적으로, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 제조된 돌연변이화 그람-양성 박테리아 (돌연변이체), 특히 돌연변이화 코리네박테리아에 관한 것이다.
그 후, 상기 방법으로 생성된 돌연변이체는 정밀 화학물질 등을 생산하거나, 또는 씨. 디프테리아 (C. diphtheriae)의 경우에는, 예를 들어 약독화된 백신 또는비병원성 생물체 백신을 제조하는 데에 이용될 수 있다.
정밀 화학물질은 유기산; 단백질성 및 비단백질성 아미노산; 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드; 지질 및 지방산; 디올류; 탄화수소류; 방향족 화합물; 비타민 및 보조인자; 및 효소를 의미한다.
용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 공지되어 있고, 생물체에 의해 생산되는 분자들을 포함하며, 예를 들어 제약 산업, 농업 및 화장품 산업 등을 비롯한 다양한 산업 부분에서 사용된다. 이러한 화합물은 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산; 단백질성 및 비단백질성 아미노산; 퓨린 및 피리미딘 염기; 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp.561-612, Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., editors VCH: Weinheim] 및 그의 참고문헌에 기재되어 있음); 지질; 포화 및 불포화 지방산 (예를 들어, 아라키돈산); 디올류 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올); 탄화수소류 (예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스); 방향족 화합물 (예를 들어, 방향족 아민류, 바닐린 (vanillin) 및 인디고 (indigo)); 비타민 및 보조인자 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins" pp.443-613 (1996) VCH: Weinheim]과 그의 참고문헌, 및 문헌 [Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held Sept. 1-3, 1994, in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기재되어 있음); 효소; 폴리케티드 (polyketide) (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68); 및 문헌 [Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086]과 그의 참고문헌에 기재되어 있는 다른 모든 화학물질을 포함한다. 특정 정밀 화학물질의 대사 및 용도를 아래에 더 설명하였다.
A. 아미노산의 대사 및 용도
아미노산은 모든 단백질의 기본적 구조 단위를 이루고 있으며, 따라서 세포의 정상 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 공지되어 있다. 20종의 단백질성 아미노산은 단백질의 구조 단위체로서 펩티드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 반면에, 비단백질성 아미노산 (수백종이 알려짐)은 일반적으로 단백질에서 발견되지 않는다 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp.57-97 VCH: Weinheim (1985)] 참조). 아미노산은 D형 또는 L형으로 존재할 수 있지만, 일반적으로 L-아미노산이 자연 발생의 단백질에서 발견되는 유일한 형태이다. 원핵 세포 및 진핵 세포에서 20종의 단백질성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로는 잘 밝혀져 있다 (예를 들어, 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3rdedition, pp.578-590 (1988)] 참조). "필수" 아미노산 (히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 그의 생합성이 복잡하여 식품으로부터 섭취되어야만 하기 때문에 이와 같이 불리우고, 이들은 간단한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린,세린 및 티로신)으로 전환된다. 고등 동물은 상기 아미노산들 중 일부를 합성할 수 있으나, 필수 아미노산은 정상적인 단백질 합성이 일어나도록 식품으로부터 섭취되어야만 한다.
단백질 생합성에서의 기능 이외에, 상기 아미노산들은 그 자체가 관심있는 화학물질이며, 이들은 인간 식품, 동물 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약산업에서 다양하게 응용되고 있다. 리신은 인간 영양에서 뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위 (monogastric) 가축에서도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미 첨가물 (모노소듐 글루타메이트, MSG) 및 식품 산업의 다른 부분에서 가장 흔하게 이용되며, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시스테인도 이와 유사하게 이용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에 이용된다. 글루타민, 발린, 루이신, 이소루이신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 산업 및 화장품 산업에 이용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 동물 사료 첨가물에 널리 이용된다 (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp.466-502, Rehm et al., (editors) Biotechnology Vol. 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim). 이러한 아미노산들은 또한 N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp.57-97, VCH, Weinheim, 1985]에 기재되어 있는 다른 물질들과 같은 합성 아미노산 및 단백질을 합성하는 데에 전구체로서 적합하다는 것이 밝혀져 있다.
박테리아와 같이 천연 아미노산을 생산할 수 있는 생물체에서의 이들 천연아미노산의 생합성은 잘 밝혀져 있다 (박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 고찰은 문헌 [Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606] 참조). 글루타메이트는 시트르산 회로에서의 중간 생성물인 α-케토글루타레이트의 환원성 아민화 반응에 의해 합성된다. 글루타민, 프롤린 및 아르기닌은 글루타메이트로부터 각각 연속적으로 생성된다. 세린의 생합성은 3단계 과정으로 발생하며, 3-포스포글리세레이트 (해당과정의 중간 생성물)를 출발 물질로 하여 산화, 트랜스아민화 반응 및 가수분해 단계 이후에 상기 아미노산이 생성된다. 시스테인 및 글리신은 각각 세린으로부터 생성되며, 구체적으로는 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합 반응에 의해 생성되고, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전이됨으로써 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 프레페네이트 합성 이후 단지 마지막 2단계에서만 분지되는 9-단계 생합성 경로에서, 해당과정 및 5탄당 인산 경로의 전구체, 및 에리트로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판은 상기 2개의 출발 분자로부터 유사하게 생성되지만, 이것은 11-단계 경로에 의해 합성된다. 또한, 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 제조될 수 있다. 알라닌, 발린 및 루이신은 각각 해당과정의 최종 생성물인 피루베이트로부터 유래한 생합성 생성물이다. 아스파르테이트는 시트레이트 회로의 중간 생성물인 옥살아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 리신은 각각 아스파르테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소루이신은 트레오닌으로부터 형성된다. 히스티딘은 복잡한 9-단계 경로에서 활성당인5-포스포리보실 1-피로포스페이트로부터 형성된다.
세포에서의 단백질 생합성에 필요한 아미노산 양을 초과하는 아미노산들의 양은 저장될 수 없고, 그 대신 세포의 주요 대사 경로에 중간 생성물이 제공되도록 분해된다 (이에 대한 고찰은 문헌 [Stryer, L., Biochemistry, 3rdedition, Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle" pp.495-516 (1988)] 참조). 비록 세포는 원치않는 아미노산을 유용한 대사 중간 생성물로 전환시킬 수는 있지만, 아미노산의 생산은 그의 합성에 필요한 에너지, 전구 분자 및 효소의 측면에서 손실이 크다. 따라서, 아미노산 생합성이 피드백 (feedback) 억제에 의해 조절된다는 것은 놀라운 것이 아니며, 이것에 의해 특정 아미노산의 존재는 자신의 생산을 둔화시키거나 또는 완전히 정지시킨다 (아미노산 생합성 경로에서의 피드백 기작에 대한 고찰은 문헌 [Stryer, L., Biochemistry, 3rdedition, Chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" pp.575-600 (1988)] 참조). 따라서, 특정 아미노산의 생성은 그 아미노산의 세포내 양에 의해 제한된다.
B. 비타민, 보조인자 및 식품의약 (nutraceutical)의 대사 및 용도
비타민, 보조인자 및 식품의약은 또 다른 분자들의 군을 구성한다. 이들은 박테리아와 같은 생물체에 의해 쉽게 합성되지만, 고등 동물은 이들을 합성할 수 있는 능력이 없기 때문에 이들을 섭취해야만 한다. 이러한 분자들은 그 자체가 생물활성 분자이거나, 또는 다수의 대사 경로에서의 전자 운반체 또는 중간 생성물로서 역할을 하는 생물활성 물질의 전구체이다. 이들의 영양학적 가치 이외에, 이들화합물은 착색제, 산화방지제 및 촉매로서, 또는 다른 가공 보조물로서 중요한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적 응용에 대한 고찰은 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp.443-613, VCH: Weinheim, 1996] 참조). 용어 "비타민"은 당업계에 공지되어 있으며, 생물체의 정상 기능에 필요하나 그 생물체 자체에서는 합성되지 않는 영양소를 포함한다. 비타민 군에는 보조인자 및 식품의약 화합물이 포함될 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성을 나타내기 위해 필수적인 비단백질성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물들은 유기물 또는 무기물일 수 있으며, 본 발명의 보조인자 분자는 바람직하게는 유기물이다. 용어 "식품의약"은 식물 및 동물, 특히 인간에서 건강을 증진시키는 식품 첨가물을 포함한다. 이러한 분자들의 예로는 비타민, 산화방지제 및 특정 지질 (예를 들어, 다중불포화 지방산)이 있다.
이러한 분자들을 생산할 수 있는 생물체 (예를 들어, 박테리아)에서의 이들 분자의 생합성은 포괄적으로 밝혀져 있다 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons; Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994, in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).
티아민 (비타민 B1)은 피리미딘과 티아졸 단위체의 화학적 커플링에 의해 형성된다. 리보플라빈 (비타민 B2)은 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스 5'-포스페이트로부터 합성된다. 리보플라빈은 다시 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)의 합성에 이용된다. "비타민 B6"으로 통칭되는 화합물들의 군 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독살 5'-포스페이트 및 상업적으로 이용되는 피리독신 염산염)은 모두 공통적 구조 단위체인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, R-(＋)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)는 화학적 합성에 의해 또는 발효에 의해 제조될 수 있다. 판토테네이트 생합성에서의 마지막 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합 반응으로 구성되어 있다. 판토산 및 β-알라닌으로 전환시키는 생합성 단계 및 판토텐산으로 축합시키는 생합성 단계에 관여하는 효소들은 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사적 활성 형태는 조효소 (coenzyme) A이며, 이것의 생합성은 5개의 효소적 단계에 의해 발생된다. 판토테네이트, 피리독살 5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할 뿐만 아니라, (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B5), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 조효소 A의 생성도 촉매한다.
미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터 바이오틴을 생합성하는 것은 상세히 연구되었으며, 이와 관련된 수개의 유전자들이 동정되었다. 이에 상응하는 다수의 단백질들이 Fe 클러스터 합성에 관여하며 nifS 단백질 군에 속한다는 것이밝혀졌다. 리폰산은 옥탄산으로부터 유래하며, 이것이 피루베이트 데히드로게나제 복합체 및 α-케토글루타레이트 데히드로게나제 복합체의 성분인 에너지 대사에서 조효소로서 작용한다.
폴레이트는 모두 엽산 (folic acid)으로부터 유래한 물질들의 군이며, 엽산은 L-글루탐산, p-아미노벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유래한다. 특정 미생물에서 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산의 대사 중간 생성물로부터 출발하여 엽산 및 그의 유도체들을 생합성하는 것은 상세히 연구되어 있다.
코리노이드 (corrinoid; 예컨대, 코발라민 (cobalamine) 및 특히 비타민 B12) 및 포르피린 (porphyrin)은 테트라피롤 고리계에 의해 구별되는 일군의 화학물질에 속한다. 비타민 B12의 생합성은 매우 복잡하여 현재까지 완전하게 밝혀지지 않았지만, 현재 이와 관련된 다수의 효소 및 기질들이 공지되어 있다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신 (niacin)"으로도 불리는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 및 NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트), 및 이들의 환원형에 대한 전구체이다.
리보플라빈, 비타민 B6, 판토테네이트 및 바이오틴과 같은 몇몇 화학물질은 대규모 미생물 배양에 의해 생산되기도 하지만, 산업적 규모로 상기 화합물들을 생산하는 것은 대부분 세포를 이용하지 않는 (cell-free) 화학 합성법에 기초하고 있다. 단지 비타민 B12만이, 그의 복잡한 합성법으로 인해 발효에 의해서만 생산된다. 시험관내 방법은 물질과 시간의 상당한 소비 및 종종 높은 비용을 필요로 한다.
C. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 대사 및 용도
퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 유전자 및 그의 상응하는 단백질은 종양증 및 바이러스 감염증에 대한 요법에서의 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오티드의 일부를 형성하는 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 핵산 분자의 기본적인 구조 단위체를 구성하며, 질소 함유 염기, 5탄당 (여기서 당은 RNA의 경우 리보스이고, DNA의 경우 D-데옥시리보스임) 및 인산을 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로서 작용하는 분자를 포함하지만, 뉴클레오티드와는 달리 인산 단위체를 가지고 있지 않다. 이들 분자의 생합성을 억제함으로써, 또는 핵산 분자를 형성하기 위한 이들의 이동을 억제함으로써 RNA 및 DNA 합성을 억제하는 것이 가능하며, 암세포에서의 상기 활성의 표적화된 억제는 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제시킨다.
또한, 핵산 분자를 형성하지는 않지만 에너지 저장소 (즉, AMP)로서, 또는 조효소 (즉, FAD 및 NAD)로서 작용하는 뉴클레오티드도 있다.
퓨린 및(또는) 피리미딘 대사의 영향을 받는 의학적 징후에 대해 상기 화학물질들을 이용하는 것이 여러 문헌에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novopyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents" Med. Res. Reviews 10: 505-548)] 참조). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소들의 연구는, 예를 들어 면역억제제 또는 증식억제제로서 이용될 수 있는 신규 의약의 개발에 집중되어 왔다 (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Simmonds, H.A., Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다양한 정밀 화학물질 (예를 들어, 티아민, S-아데노실메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에서 중간 생성물로서, 세포의 에너지 운반체로서 (예를 들어, ATP 또는 GTP), 그리고 화학물질 그 자체를 위한 다른 가능한 용도를 가지며, 통상적으로는 향미 증강제 (예를 들어, IMP 또는 GMP)로서, 또는 다양한 의학적 용도로 사용되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A., (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., editors VCH: Weinheim, pp.561-612] 참조). 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소는 점점 더 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯하여 농작물 보호를 위해 개발되고 있는 화학물질의 표적이 되고 있다.
박테리아에서 상기 화합물들의 대사는 밝혀져 있다 (이에 대한 고찰은 문헌 [Zalkin, H. and Dixon, J.E. (1992) " De novo purine nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Vol. 42, Academic Press, pp. 259-287] 및 [Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides" Chapter 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistryand Molecular Biology, Wiley, New York] 참조). 집중적인 연구 대상인 퓨린 대사는 세포의 정상 기능에 필수적이다. 고등 동물에서 퓨린 대사의 이상은, 예를 들어 통풍 (gout)과 같은 심각한 병을 유발할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 리보스 5-포스페이트로부터 중간 화합물인 이노신 5'-포스페이트 (IMP)를 통해 다수의 단계에 의해 합성되어, 구아노신 5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP)가 생성되며, 이로부터 뉴클레오티드로서 이용되는 트리포스페이트 형태가 용이하게 제조된다. 또한, 이들 화합물은 에너지 저장소로서 이용되어, 이들의 분해로 인해 세포내 다수의 생화학적 과정에 에너지가 공급된다. 피리미딘 생합성은 리보스 5-포스페이트로부터의 우리딘 5'-모노포스페이트 (UMP) 형성을 통해 발생한다. UMP는 다시 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 모든 뉴클레오티드의 데옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 1단계 환원 반응에 의해 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 전환되어 제조된다. 인산화 후, 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.
D. 트레할로스의 대사 및 용도
트레할로스는 α,α-1,1 결합에 의해 서로 연결된 2개의 글루코스 분자로 구성되어 있다. 통상적으로 이것은 감미료로서, 건조 또는 동결 식품의 첨가제로서 식품 산업에 사용되고 음료에도 사용된다. 그러나, 제약 산업 또는 화장품 산업 및 생물공학 산업에도 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제5,759,610호], [Singer, M.A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467], [Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996)293-314] 및 [Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102] 참조). 트레할로스는 다양한 미생물의 효소에 의해 생성되며, 자연적으로는 주변 배지로 분비되어 당업계에 공지된 방법에 의해 단리될 수 있다.
<실시예 1>
에셰리치아 콜라이 (Escherichia coli) C600으로부터 갈락토키나아제 유전자galK9의 PCR 클로닝
PCR을 통한 이. 콜라이 (E. coli) 갈락토키나아제 유전자의 클로닝에 사용될 수 있는 프라이머는 공개된 갈락토키나아제 서열 (예를 들어, 진뱅크 엔트리 (Genbank entry) X02306)에 기초하여 규정될 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. PCR 주형 (이. 콜라이 (E. coli) 게놈 DNA)을 제조할 수 있고, PCR은 당업자에게 잘 알려진 방법, 및 예를 들어 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley ＆ Sons]에 기재되어 있는 방법에 따라 수행할 수 있다. 단백질 코딩 서열과 이 코딩 서열의 5'에 위치한 30 bp의 서열 (리보솜 결합 부위)로 구성된 갈락토키나아제 유전자 (galK유전자)는 PCR 과정 동안 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EcoRI)에 대한 말단 절단 부위를 제공받을 수 있으며, 그 후에 PCR 생성물은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 적합한 절단 부위를 포함하는 적합한 벡터 (예를 들어, 플라스미드 pUC18 또는 pWST4B; 문헌 [Liebl et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 65, 299-304] 참조) 내로 클로닝될 수 있다. PCR을 통해 유전자를 클로닝하는 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley ＆ Sons]에 기재되어 있다. 공지 서열을 이용한 이. 콜라이 (E. coli)galK유전자의 클로닝은 서열 분석에 의해 검출할 수 있다.
<실시예 2>
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) R163에서의galK-매개 갈락토스 감수성 시험
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) R163은, 예를 들어 문헌 [Liebl et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 1854-1861]에 기재되어 있다. 먼저, (E. coli)galK유전자를 이종 프로모터의 조절 하에 두었다. 이를 위해, 이. 콜라이 (E. coli) tac 프로모터를 PCR 방법으로 클로닝하였다. 그 후, tac 프로모터 및galK유전자를, 이. 콜라이 (E. coli) 및 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum) 둘 다에서 복제될 수 있고 클로람페니콜 내성을 매개하는 셔틀 벡터인 플라스미드 pWST4B (Liebl et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 65, 299-304)에 클로닝하였다. DNA를 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum) 내로 전이시키고 (예를 들어, WO 01/02583 참조), 클로람페니콜-내성 콜로니를 선별한 후, 상기 콜로니를 갈락토스 감수성에 대해 시험하였다. 이를 위해, 클로람페니콜 (5 mg/ℓ)이 보충되거나 클로람페니콜 (5 mg/ℓ)과 갈락토스 (0.8％)가 보충된 LB 배지 (10 g/ℓ 펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, 12 g/ℓ 아가, pH 7.2)에 스트리킹(streaking)하였다.galK유전자를 발현하는 클론은 갈락토스가 없는 플레이트에서만 밤새 성장하였다.
<실시예 3>
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의ddh유전자 불활성화
공지의 PCR 방법을 이용하여, 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)ddh유전자의 5' 말단에서 임의의 적합한 서열 부분 (Ishino et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15, 3917) 및 상기ddh유전자의 3' 말단에서 임의의 적합한 서열 부분을 증폭시킬 수 있다. 상기 2종의 PCR 생성물을 공지의 방법에 의해 융합시켜, 결과의 생성물이 기능성ddh유전자를 갖지 않도록 할 수 있다. 불활성 형태의 상기ddh유전자 및 이. 콜라이 (E. coli)galK유전자를 pSL18 (Kim, Y. H. ＆ H.-S. Lee (1996) J. Microbiol. Biotechnol. 6, 315-320) 내로 클로닝하여, 벡터 pSL18galkΔddh를 제조할 수 있다. 이 방법은 당업자에게 친숙한 것이다. 상기 벡터를 코리네박테리움 내로 전이시키는 것은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 접합 또는 전기천공법에 의해 가능하다.
통합체 (integrant)의 선별은 카나마이신을 이용하여 수행될 수 있고, "팝-아웃"에 대한 선별은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기ddh유전자의 불활성화는, 예를 들어 Ddh 활성 결여에 의해 표시될 수 있다. Ddh 활성은 공지의 방법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Misono et al. (1986) Agric. Biol. Chem. 50, 1329-1330] 참조).

Claims (15)

  1. a) 표적 생물체와 상이한 숙주 생물체에 대한 복제 기점,
    b) 하나 이상의 유전자 마커,
    c) 경우에 따라, 접합을 통해 DNA 전이를 가능하게 하는 서열 부분 (mob 서열),
    d) 표적 생물체의 서열과 상동성이 있으며 표적 생물체에서 상동성 재조합을 가능하게 하는 서열 부분,
    e) 프로모터의 조절 하에 있는 갈락토키나아제 유전자
    를 포함하는, 표적 생물체에서 복제되지 않는 플라스미드 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 생물체 a)가 에셰리치아 콜라이 (Escherichia coli)인 플라스미드 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 갈락토키나아제 유전자가 에셰리치아 콜라이 (Escherichia coli)로부터 유래한 것인 플라스미드 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 유전자 마커 b)가 항생물질에 대한 내성을 부여하는 것인 플라스미드 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 프로모터 e)가 이종 프로모터인 플라스미드 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 서열 부분 c)를 함유하는 플라스미드 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 또는 앰피실린에 대한 내성을 부여하는 플라스미드 벡터.
  8. 제5항에 있어서, 이종 프로모터가 이. 콜라이 (E. coli) 또는 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)으로부터 유래한 것인 플라스미드 벡터.
  9. 제5항에 있어서, 이종 프로모터가 tac 프로모터인 플라스미드 벡터.
  10. a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 플라스미드 벡터를 표적 생물체 내로 전이시키는 단계,
    b) 상기 플라스미드 벡터에 의해 도입된 하나 이상의 유전자 마커를 함유하는 상기 표적 생물체를 선별하는 단계,
    c) 단계 b)에서 수득된 상기 표적 생물체의 클론을 갈락토스-함유 배지에서 배양하여 갈락토스 감수성의 존재 여부에 대해 선별하는 단계
    를 포함하는, 마커-프리 (marker-free) 돌연변이화 표적 생물체를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 표적 생물체가 그람-양성 박테리아 균주인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 표적 생물체가 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속의 박테리아 균주인 방법.
  13. 제10항에 있어서, DNA가 접합 또는 전기천공법 (electroporation)을 통해 전이되는 방법.
  14. 제11항에 청구된 방법에 따라 수득할 수 있는 돌연변이화 그람-양성 박테리아.
  15. 갈락토키나아제 유전자의 조건부 음성 우성 마커 유전자로서의 용도.
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