KR20040018731A

KR20040018731A - 마과 추출물을 함유한 바이러스성 간질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20040018731A
Application number: KR1020020050689A
Authority: KR
Inventors: 이기수; 김영호; 이진호; 안치영
Original assignee: 주식회사 바이오원; 이기수; 김영호; 이진호; 안치영
Priority date: 2002-08-27
Filing date: 2002-08-27
Publication date: 2004-03-04

Abstract

본 발명은 마과(Cucumis melonLinn. var. ma-gua) 추출물을 이용한 바이러스성 간질환 예방 및 치료 활성을 갖는, B형 간염바이러스에 의한 간염, 간경화의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 마과 추출물은 HBV 바이러스 DNA 증식을 억제시킴으로써 항바이러스 작용을 나타내어, 바이러스성 간염 및 간경화에 대한 예방 및 치료에 안전하고 효과적인 의약품 및 건강보조식품을 제공한다.

Description

마과 추출물을 함유한 바이러스성 간질환 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Cucumis melon Linn. var. ma-gua for therapy against chronic viral hepatitis disease}

본 발명은 바이러스성 간질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마과 추출물의 B형 간염 바이러스 복제효소 활성 억제 효과를 이용한, 간염 및 간경화 등의 바이러스성 간질환 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강보조식품에 관한 것이다.

세계적으로 약 3억명 이상이 B형 간염바이러스에 감염되어 만성적인 보균자인 것으로 추산되고 있으며, C형 간염바이러스 보균자도 1억명 정도로 추산되고 있으며, 그들의 숫자는 계속해서 증가하고 있는 실정이다. 이들 중 매년 약 200만 명 이상이 만성적인 바이러스 감염으로 간염증세를 보이다가 간경화 및 간암으로 발전하여 사망하고 있다. 바이러스성 간염 유발 바이러스 종류로는 A형, B형, C형, 델타형, GBV 등이 알려져 있으나, B형과 C형이 가장 위험성이 많은 것으로 밝혀져 있으며, 이들의 병리기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

간염을 일으키는 대표적인 바이러스인 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus, 이하 'HBV' 라 함)는 DNA 바이러스임에도 불구하고, 변이되기 쉬운 바이러스이다. HBV 유전자는 약 3.2Kb의 완전하지 않은 이중사슬의 환상 (double strand cyclic) DNA이고, 극히 압축된 구조로 되어 있다. 지금까지 알려진 바에 의하면, HBV DNA에서 복제효소 유전자(pol), 바이러스 껍질 유전자(capsid), 바이러스 표면항원 유전자(HBsAg), 그리고 여러 기능과 암 유발에 관련된 X 유전자 등이 있다. HBV는 DNA 사슬을 그대로 복제하는 보통의 DNA 바이러스와는 달리, 먼저 숙주의 전사효소에 의해 DNA 사슬에서 3.5 Kb 의 프리제노믹(pregenomic) RNA 사슬이 전사되고, 바이러스 고유의 역전사효소(pol)에 의해 이중사슬 DNA가 복제된다. 이러한 복제 과정은 숙주 염색체와는 독립적으로 일어난다. 그러나 바이러스 DNA의 일부는 숙주의 염색체에 끼어들어가는 것이 밝혀졌는데, HBV DNA가 숙주의 염색체로 끼어 들어가게 되면 유전자가 불안정해지고 거기에서 발현되는 X 단백질에 의해 숙주세포의 전사가 촉진되며 p53 유전자 기능이 저해될 가능성이 높다. 이런 상황이 지속적으로 진행되면 간세포암(HCC)으로 발전하게 된다.

기술한 바와 같이 HBV는 DNA 바이러스이면서도 RNA 바이러스에 유사한 복제양식 때문에, 일반 RNA 바이러스에 필적하는 높은 변이성을 나타낸다. HBV 유전자 변이는 임의로 일어나지만 그 빈도는 일정한 것으로 알려지고 있다. HBV 유전자 변이는 HBV 외피에 있는 표면항원의 구조 변화로 나타난다. 다양한 표면 항원 구조의 변화는 숙주의 액성 및 세포성 면역반응을 벗어날 수 있게 만드는 요인이며, 병의 진전이나 지속감염을 결정하는 중요한 인자가 되고 있다.

B형 간염은 잠복기가 1-4개월 정도로서 경구적으로 감염되기보다 혈액을 통해 감염되기 쉽고, 감염 후 쉽게 피로감을 느끼고 입맛이 없어지며 우측 상복부의불쾌감이나 소화장애 등 급성 간염 증세를 나타낸다. 급성 간염은 바이러스에 대한 숙주의 면역반응이 부적절하거나 T 세포의 기능 결여, 스테로이드와 같은 내분비 기능, 약물 등의 요인에 의해 만성형으로 발전하게 된다.

현재 간염치료에 대해 예방 백신만 개발되었을 뿐, 만족할 만한 치료제의 개발이 이루어지지 않았으나, 최근 라미부딘이라는 뉴클레오사이드 유사체가 미국 FDA의 승인하에 임상처방되고 있으며, 이와 함께 알파-인터페론이 라미부딘과 복합처방되고 있다. 한편 C형 간염에 대해서는 리바비린, 알파-인터페론 등이 복합처방되고 있어서 어느 정도 효과를 보이고 있다. 그러나, 이들 합성의약품 및 재조합 의약품 등은 신체적 부작용이나 장기복용에 따른 내성바이러스에 의한 재발 및 고비용 문제 등을 갖고 있기 때문에 여전히 새로운 신약개발이 요구되고 있는 실정이다.

만성간염바이러스는 궁극적으로 간염에서 간경변으로 진행되는 원인바이러스이며, 이로 인해 간기능 저하 또는 간암발생이 빈번하다. 혈청학적 데이터를 분석해보면 감염자의 10-15%가 B형과 C형 간염바이러스에 동시에 감염되었음을 보인다. 이러한 이중감염자들은 훨씬 심각한 간질환을 일으킨다. 미국에서만 보더라도 바이러스성 만성 간질환으로 매년 1만명 이상이 사망하고 있으며, 그 감염자 숫자도 해마다 증가하고 있다. B형 간염바이러스 보균자는 중국인의 경우 전체 인구의 10 - 12% 인구에 해당하는 1억명 이상이며, 특히 우리나라도 급성 간염환자 뿐 아니라 만성적인 바이러스 보균자가 약 300 만명을 넘어서고 있는 실정이다. 더구나 우리나라의 경우 만성간염, 간경변증 및 간암 등의 심각한 간질환에 대해 초기B형 간염바이러스성 간염바이러스 보균자 비율이 월등히 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 만성 바이러스성 간염환자를 치유할 수 있는 라미부딘 등보다 저가이면서 부작용이 낮은 치료제 개발이 긴급히 필요한 상황이다.

현재 바이러스성 간염 및 간경화 치료제로 사용되고 있는 약물은 면역활성제 및 항-바이러스제로 알려져 있는 알파-인터페론, 라미부딘 등으로, 이들은 임상적 처방을 받는 항바이러스 치료제로서 상용화되고 있으나 한편으로는 단점이 많다. 유기합성된 뉴클레오사이드 유사체인 라미부딘은 장기복용시 약제 내성 바이러스가 출현하는 현상이 가장 큰 문제가 되고 있으며, HBV 복제효소 단백질의 역전사활성을 가진 부위의 YMDD 모티브(motif)에 변이가 생겨도 복제효소의 활성에 억제력을 보이는 또 다른 뉴클레오사이드 유사체인 아데포비르는 장기복용하면 내성 바이러스의 출현 및 신장부전을 가져오며, 만성 C형 감염자에게는 유전자 재조합 방법으로 발현시킨 단백질인 알파-인터페론이 많이 쓰이지만 환자 30% 정도만 유의적인 반응을 보이고 다른 부작용도 나타난다. 더욱이, 알파-인터페론의 장기투여로 이 약제에 대한 내성 C형 바이러스 출현이 빈번하여 문제가 되고 있다.

최근, 복합처방이 약제 내성 변이 바이러스의 출현을 억제하는데 최선이 되고 있어서 리바비린과 알파-인터페론의 복합투여가 일반화되고 있다. 그런데도 새로운 형식의 보다 완벽한 치료제가 출시되어야할 필요가 있으며, 이러한 새로운 치료제는 식물 유래 천연물에서 찾아지는 것이 유기합성 항바이러스 제제보다 나을 수 있다. 그러나, 간염바이러스의 만성적 감염에 의한 간질환 치료제로서 기존 항바이러스 제제를 대체할 치료제 개발이 필요하지만, 이들 식물성 천연물로부터의신약개발이 임상적용하기까지 너무 시간적 간극이 크다고 본다.

따라서, 간염의 예방이나 치료목표는 백신처방 등으로 바이러스 증식을 사전 예방하거나, 바이러스 증식을 억제시키는 약제를 사용하여 간염의 진행을 중단시키고 간경변과 간부전 등의 이행을 방지하여 궁극적으로 간암과 전염성을 막고자 하는데 있다. 따라서, 재조합 백신의 개발과 합성신약인 라미부딘, 아시클로비어 등의 새로운 항-바이러스 제제들이 개발되고 있으나 간염에 대한 완전 치료제로서는 아직 의문시되고 있으며, 그 부작용과 고비용 등으로 사용이 극히 제한적일 수 밖에 없는 실정이다.

따라서 독성 및 부작용이 적은 새로운 치료제를 민간요법 혹은 옛부터 적용되어 온 천연물, 특히 생약으로부터 창출하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 예로 마타리와 황백피의 혼합추출물로 구성된 조성물이 B형 간염 및 간경화 치료제로 시도되고 있으며(한국특허출원 제2000-23564호), 탄시놀 B, 탄시논IIB, 프로체바퀴논A, 단삼추출물 및 단삼분획물로 구성된 조성물이 B형 간염 치료에 효과적임이 제시되었다(한국특허출원 제2000-27306호).

본 발명에 사용되는 마과(Cucumis melonLinn. var. ma-gua)는 중국 흑룡강 지역에 많이 분포하는 식물로, 멜론의 잡종이다. 우리나라의 참외도 멜론의 변종으로 종자가 내려왔고, 이 마과도 잡종으로 중국 북쪽지방에서 재배되고 있다. 맛은 단맛이 나고 약간 무른 감촉을 가지며, 성숙된 과일은 표면이 푸른색을 띄고, 짙은 청색의 무늬가 있으며 대개 무게는 1kg 내외이며, 크기는 30-40cm 정도로 우리나라의 노각과 비슷한 크기와 감촉을 보인다. 대개 8-9월 경에 중간정도 숙성되었을 때수확하며 씨를 받아 다음해에 심으면 잘 자라지 않는 특징이 있어, 제 1세대 잡종의 씨를 받아 매번 종자로 써야 한다. 마과의 효능을 보면 간기능에 좋은 것으로 알려져 있으며 오래전부터 중국동북부지방에서 과일로서 식용되어 왔다.

그러나 실제로 상기한 문헌들 및 연구보고들에서 마과의 추출물을 이용한 생약의 바이러스성 간질환에 대한 생리활성은 현재까지 보고된 바 없다.

본 발명은 마과의 추출물을 함유하는 특별히 B형 간염바이러스에 의한 간염, 간경화의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 마과 추출물 및 이를 포함한 복합생약의 바이러스성 간염, 간경화에 대한 치료효과를 약리학적으로 관찰하여, 전통적으로 많은 임상자료가 축적되어 있는 생약에 대하여 간염, 간경화의 예방 및 치료에 가능성이 있는지를 중점적으로 연구하였다.

연구 결과, 본 발명에 따른 마과 추출물이 B형 간염바이러스 복제효소의 활성을 저해함으로써 바이러스 증식을 억제하여 바이러스성 간질환의 예방 및 치료 활성을 갖는다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 B형 간염바이러스 복제효소의 활성 저해 효과를 갖는 마과 추출물을 유효성분으로 함유한 바이러스성 간질환의 예방 및 치료 효과를 나타내는 약학조성물 및 건강보조식품을 제공하는 것이다.

도 1 은 본 발명에 사용된 마과의 종자의 구입처 및 설명서이고,

도 2 는 곤충세포주에서 활성화된 HBV 복제효소 발현시 마과 추출물 및 5 종류 생약추출물을 처리한 다음, 프라이밍반응을 통해 HBV 복제효소 활성억제효과를 관찰한 사진이고,

도 3 은 곤충세포주에서 활성화된 HBV 복제효소 발현시 마과를 함유한 복합생약을 농도별로 처리한 다음, 프라이밍반응을 통해 복합생약의 HBV 복제효소 활성억제효과를 관찰한 사진이고,

도 4a 는 마과를 함유한 복합생약의 바이러스 복제 활성 억제를 관찰하기 위하여, 우드척 B형 간염바이러스(WHBV)에 감염된 세포주에 0.15%의 복합생약 추출물을 처리한 후 4일째, 8일째에 세포 내의 프리제노믹 RNA 및 WHBV 표면항원 mRNA 양을 비교한 표이고,

도 4b 는 마과를 함유한 복합생약 추출물의 바이러스 복제 활성 억제를 관찰하기 위하여 우드척 B형 간염바이러스에 감염된 세포주에 0.15% 복합생약을 처리하여, 핵내 바이러스 DNA, 세포질내 비리온 DNA 및 DNA 복제 중간체를 관찰한 서던블롯분석 결과 사진이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 B형 간염 바이러스 증식 억제에 효과적인 마과(Cucumis melonLinn. var. ma-gua)의 조추출물을 제공한다.

상기 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등의 저급 알콜, 이들의 혼합용매 및 완충액에 가용한 추출물을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 B형 간염 바이러스 증식 억제에 효과적인 마과의 조추출물을 제조하기 위해서,

상기 생약 조추출물은, 마과를 세척 또는 거피한 후 세절하여, 10 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 30℃ 온도에서 약 1일 내지 50일, 바람직하게는 약 15일 내지 25일 동안 자연 건조하여 분말화한 다음, 물, 저급알콜, 완충액 등의 추출용매에 1 내지 70 %, 바람직하게는 40 내지 60%의 농도로 용해시켜, 50 내지 100℃, 바람직하게는 70 내지 80℃에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 약 1시간 내지 5시간 중탕한 후, 원심분리하여 상층액인 추출물을 수득할 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 인산염 완충액을 사용하여 마과 분말을 중탕하여 조추출물을 얻는다.

본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 마과 추출물을 함유하는 바이러스성 간질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 바이러스성 간질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 ~ 50 중량%로 포함한다.

상기와 같은 방법으로 얻은 마과를 함유하는 복합생약을 HBV 복제유전자를 발현시킨 곤충세포주에 농도별로 처리시, HBV 복제효소의 활성이 현저히 감소됨을 확인하였다.

본 발명의 마과 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구, 비경구(경피, 피내, 근육내 및 정맥내 포함), 직장 및 흡입 중에서 선택되어지는 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인에게 1일에 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을, 바람직하게는 10내지 100 mg/㎏의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 마과 추출물을 함유한 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 마과 추출물을 포함하는 조성물은 바이러스성 간질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 마과 추출물을 포함하는 복합생약을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 마과 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 바이러스성 간질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 30 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 3 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 생약 조추출물 제조

마과의 종자(경량 양종개발 유한공사, 중국, 도 1 참조)를 수입하여 본 수원대 연구실에서 재배하였다. 마과 열매를 세척하여 꼭지부분에서 2.5㎝와 껍질을 제거하고 세절한 다음 25℃의 온도에서 약 20일간 자연건조하여 믹서기로 분말화하였다.

실시예 2. 마과를 함유한 복합생약 추출물 제조 1

상기 실시예 1의 마과 분말 45 g (약 53.6%)을 함유한 복합생약 분말 84 g 을 인산염 완충액(Phosphate buffered saline)에 10%의 농도로 제조한 다음, 80℃ 에서 2시간 중탕한 후, 10,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 취하여 세포실험에 시료로 사용하였다.

실시예 3. 마과를 함유한 복합생약 추출물 제조 2

상기 실시예 1의 마과 분말 53.6 g 을 함유한 복합생약 분말 100 g 을 80% 에탄올 수용액 1ℓ를 넣고 50 ℃에서 1시간 동안 4회 환류 추출한 후에 이를 모두 합하여 여과지(와트만사, 미국)로 여과한 다음에 이를 감압농축기(Eyela사, N-1000, 일본)로 감압농축하여 25g 추출물을 얻고 이를 시료로 사용하였다.

참고예. B형 간염바이러스 복제효소 발현

B형 간염바이러스 복제효소(pol) 단백질을 곤충세포주에서 발현시키기 위하여, 배큘로바이러스(Baculovirus)에 HBV 복제유전자(Invitrogen사)를 클로닝(FLAG-pol-stem-loop: FPL-pol)하여 곤충세포주 Sf9 세포주에 감염시켜 형질전환시켰다. 형질전환된 FPL-pol 곤충세포주는 T-75 플라스크에서 배양되었고, 이 때 TNM-FH 배지에 5% FCS(fetal calf serum, Gibco사), 0.1% 플루로닉 F-68(pluronic F-68) 및50㎍/㎖ 젠타마이신(gentamicin)을 포함하는 그레이스 배지(Grace's medium, Gibco사)를 사용하였으며, 26℃에서 48시간 배양하였다.

실험예 1. 마과 추출물의 HBV DNA 복제 억제능력 측정

본 발명의 마과 추출물이 갖는 바이러스성 간염을 일으키는 B형 간염바이러스(HBV) 증식억제 효과를 실험하기 위하여, B형 간염바이러스의 DNA 복제효소 활성 억제정도를 측정하였다.

참고예의 B형 간염바이러스 복제효소를 발현시킬 때, 배양초기부터 실시예 2의 마과를 포함한 10% 복합생약 추출액(상층액)을 각각 최종농도 500㎍/㎖으로 Sf9 세포배양 배지에 첨가하여, 48시간 후에 복제효소 활성을 측정하였다.

제1군: 생리식염수만을 첨가한 대조군

제2군: 10% 마과 추출액 첨가군 (최종농도 500㎍/㎖)

제3군: 10% 씀바귀 추출액 첨가군 (최종농도 500㎍/㎖)

제4군: 10% 고들빼기 추출액 첨가군(최종농도 500㎍/㎖)

제5군: 10% 다시마 추출액 첨가군(최종농도 500㎍/㎖)

제6군: 10% 칡 추출액 첨가군(최종농도 500㎍/㎖)

제7군: 10% 왕고들빼기 추출액 첨가군(최종농도 500㎍/㎖)

제8군: 알파-인터페론 첨가군(10⁶I.U., Roche사)

FPL-pol 재조합 배큘로바이러스에 감염된 Sf9 세포주에서 발현된 HBV 복제효소 단백질 활성을 프라이밍반응(Priming Reaction) 방법(Lanford et al.,J. Virology,69, 4331, 1995)으로 측정하였다. 발현된 복제효소 단백질을 항-FLAG 단일클론항체(monoclonal Antibody)가 결합된 M2 Bead(Sigma사)에 결합시켜 면역친화크로마토그래피(immunoaffinity chromatography) 방법으로 순수 정제한 후, HBV 복제효소가 결합된 프리제노믹 RNA(pregenomic RNA) 상에서 HBV 복제효소-프라이머 복합체가 형성되도록 하였다. 프라이머 반응시³²P-TTP(3,000Ci/m㏖, NEN사)가 끼어들어간 정도로 HBV 복제효소의 활성을 측정하였으며, SDS-PAGE 젤 상에서³²P-TTP가 표지된 복제효소 단백질의 량을 방사선 필름으로 확인하였다. 이 때 생약조성물이 프라이머 합성을 억제하여 복제효소 단백질의 기능이 억제되면, 생약조성물의 HBV DNA 합성능력을 억제하는 효능이 있는 것으로 판단하였다.

도 2 의 결과는 마과 추출물을 첨가한 경우, 대조군과 비교하여 확실히 바이러스 복제효소를 억제함을 나타내며, 알파-인터페론 처리시와 같은 정도의 억제를 보여, B형 간염바이러스의 증식을 억제함에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 마과를 함유한 복합생약 추출물의 HBV DNA 복제 억제능력 측정

본 발명의 마과를 53.6% 함유한 복합생약 추출물이 갖는 바이러스성 간염을 일으키는 B형 간염바이러스(HBV) 증식억제 효과를 실험하기 위하여, B형 간염바이러스의 DNA 복제효소 활성 억제정도를 측정하였다.

실시예 3의 B형 간염바이러스 복제효소 발현시킬 때, 배양초기부터 실시예 2의 10% 복합생약추출액(상층액)을 각각 50 ㎕, 100 ㎕, 500 ㎕의 양으로 10㎖의 세포배양 배지에 첨가하여, 48시간 후에 복제효소 활성을 상기 실험예 1의 방법에 따라 측정하였다.

제1군: 생리식염수만을 첨가한 대조군.

제2군: 10% 복합생약 추출액 50 ㎕ 첨가군(최종농도 50㎍/㎖).

제3군: 10% 복합생약 추출액 100 ㎕ 첨가군(최종농도 100㎍/㎖).

제4군: 10% 복합생약 추출액 500 ㎕ 첨가군(최종농도 500㎍/㎖).

도 3의 결과를 보면, 레인 1은 식염수만을 처리한 대조군으로 기본적인 복제효소의 활성정도를 관찰할 수 있으며, 이에 대하여 레인 2, 3 및 4는 10% 복합생약 추출액을 농도별로 처리한 것으로, 처리농도가 높아질수록 B형 간염 바이러스의 복제효소 활성이 억제되고 레인 4의 농도 500㎍/㎖로 처리시 현저히 복제효소 활성이 감소됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 마과를 함유한 복합생약 조성물은 농도 차이에 따라 곤충세포주에서 발현되는 HBV 바이러스 복제효소 단백질의 활성을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. HepG2.2.15 세포주에서 발현되는 B형 간염바이러스에 대한 마과를 함유한 복합생약의 항-바이러스 활성 측정.

HepG2.2.15 세포주(Georgetown 대학, Korba 박사, 미국)는 간암세포주 HepG2가 HBV DNA로 형질전환되어 HBV가 증식되는 세포주로, 이 세포주를 사용하여 마과를 함유한 복합생약의 HBV에 대한 증식 억제효과를 관찰하였다.

마과를 함유한 복합생약의 세포내 HBV DNA 복제 중간체 생산에 대한 효율적인 억제농도(EC₅₀)와 세포주 배양액으로 분비되는 HBV 비리온(virion) DNA에 대한 억제농도(EC₉₀)를 결정하였다. 복합생약 분말과 중탕액에 의한 각각의 HBV 생산 억제력을 양성대조군으로 사용한 라미부딘(3TC, Glaxo Wellcome사)과 함께 비교하여 측정하였다.

T-96 웰 플레이트를 사용하여 각각에 세포주를 배양하고, 여기에 일정비율로 마과를 함유한 복합생약을 첨가하며, 대조군으로 라미부딘 용액을 각각 희석하여 첨가하였다. 7일간 배양하면서 각 세포주가 만들어내는 HBV 바이러스 입자, HBV DNA 생성량을 측정하였고, 세포특성을 나타내는 희석액에서는 세포 사멸량을 측정하였다.

표 1의 결과에서 보듯이, 같은 정도의 EC₅₀과 EC₉₀의 활성을 나타내는 농도는 중탕액에 비하여 복합생약 분말인 경우 약 1/3 수준의 농도에서 관찰되었다. 복합생약 분말의 EC₅₀과 EC₉₀은 복합생약의 중탕액의 활성보다 2.8배 정도 높음을 확인할 수 있었다. 그리고 이 복합생약에 의한 세포독성은 거의 없는 것으로 나타났으며, 시험 처리된 복합생약 및 약물의 최고 농도를 사용하여 선택 지표(selectivity index; S.I.)를 계산하였다(S.I.=CC₅₀/EC₉₀).

	EC₅₀	EC₉₀	CC₅₀	S.I.
복합생약 분말	90㎍/㎖	254㎍/㎖	>3700㎍/㎖	14.6
복합생약 열 중탕액	259㎍/㎖	697㎍/㎖	>1000㎍/㎖	1.4
라미부딘(3TC)	0.06μM	0.166μM	2165μM	13042

실험예 4. WHBV 바이러스 증식세포주에서의 마과를 함유한 복합생약 효과 측정

사람 HBV 바이러스와 유전적인 기능이 비슷한 우드척(Woodchuck) HBV 바이러스(WHBV)에 감염되어 간염증세를 가지고 있는 우드척 실험동물에서 선별한 일차 간세포주(Cornell대학 제이콥박사연구실, 미국)에서 마과를 함유한 복합생약 분말에 의한 항-바이러스 활성을 RNA양을 비교하여 측정하였다. 알파-인터페론은 현재 간염 바이러스 증식을 억제하는데 사용되는 약물로, 복합생약의 효능을 보기 위한 양성대조군으로 사용하였다.

실시예 2의 마과를 함유한 복합생약 분말을 0.15% 농도로 배양액에 처리한 간세포주 및 대조군으로 10⁶I.U 단위의 알파-인터페론(Roche사)을 처리한 간세포주를 2주일간 배양하였다. 4일 배양 후 세포주내에서 바이러스 관련 DNA 및 RNA 생성물을 추출하였고, 8일 후 다시 한번 같은 량의 DNA 및 RNA 추출물을 획득하여 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg) DNA 프로브(probe)로 서던블롯하이브리디제이션 (Southern Blot Hybridization)을 시행하여 포스포이미지 분석(Phosphorimage analysis)을 통해 DNA와 RNA 양을 측정하였다.

하이브리디제이션시 간세포주의 18S 리보솜 RNA 양을 기준으로 맞추어 시료를 사용하였으며, 분석결과는 18S RNA에 대한 백분율로 나타내었다.

도 4a의 결과를 보면, 마과를 함유한 복합생약 분말을 4일 처리한 세포주에서 WHBV RNA가 20% 정도 감소하였고, 이것은 계속되는 복제주기에서 감염 바이러스 입자의 감소를 의미한다. 복합생약 분말을 8일 처리한 세포주에서 WHBV 프리제노믹 RNA가 무처리군에 비하여 25% 정도 감소되었으며 WHBV 표면항원에 해당하는 RNA 량도 감소하였다(도 4a 참조).

복합생약 분말을 처리하지 않은 세포주 배양에서 생성된 핵내 WHBV DNA, 밖으로 분비된 비리온(virion) DNA 및 복제중간체 DNA의 량에 비해, 마과를 함유한 복합생약 분말과 알파-인터페론을 각각 처리한 세포주에서 그 DNA 량이 크게 감소하였고, 특히 복합생약 분말을 처리한 세포주에서는 핵내 바이러스 DNA는 거의 다 사라졌고 복제중간체 DNA와 비리온 DNA의 양도 크게 감소하였다(도 4b 참조). 이 결과를 통해, 마과를 함유한 복합생약 분말이 우드척 B형 간염 바이러스의 복제를 억제함에도 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

임상예 1. 간염 증세 및 간경화 증세의 간질환을 가진 환자(자원자)에게 마과를 함유한 복합생약의 투여에 의한 치료효과 검증.

바이러스성 간염 및 간경화와 관련된 사람의 생화학적 수치 변화와 분자생물학적 수치 변화(체내 HBV DNA 존재 검사)를 검사하였다.

실시예 2의 마과를 함유한 복합생약을 각각 성인 1인당 하루에 1.0 - 1.5g 씩 25일이상 구강투여하여 효과를 알아보았다. 이들 지표로는 혈액내 GPT, GOT 수치 변화와 HBs항원 및 항-HBs항원 항체 및 HBe항원, 항-HBe항원 항체 등의 지표검사를 통하여 간질환 관련 징후 변화 측정하며, 혈청내 HBV DNA의 존재 유무를 PCR 방법으로 측정하였다. GOT 및 GPT는 각각 아스파라긴산 분해 효소와 알라닌 분해효소의 수치를 의미하며, 간에 문제가 생겨 간세포가 파괴되면 이 성분이 혈액 속으로 많이 유입되어 검출됨으로써 간세포 괴사를 민감하게 반영해 주며, 정상 범위가 0-40 UI 이다.

표 2에서 마과를 함유한 복합생약 투여에 의한 임상 치료 결과를 나타내었다. 간염 환자에게 있어서 남아있는 HBV DNA가 재발에 문제가 될 수 있는데, 표 2의 결과를 보면, 복합생약 투여 후, 투여환자 6명 중 5명에서 HBV DNA가 사라져 검출되지 않음을 볼 수 있어, 복합생약이 HBV DNA 복제효소 활성을 억제하여 HBV DNA 증식이 억제됨으로 B형 간염 치료 및 예방에 효과적으로 쓰일 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히 복합생약을 60일간 투여한 B형 간염 환자에 있어서는 현저하게 GOT, GPT 수치가 감소되어 효과적으로 B형 간염 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.

증상	치료기간(일)	진 단
증상	치료기간(일)	전 후	GOT	GPT	HBV DNA	HBsAg	항HBsAg	HBeAg	항-HBeAg
간경변 및 복수	35	전	×	×	×	+	-	+	-
간경변 및 복수	35	후	28	15	-	-	+	-	+
간염 및 간경변	90	전	52	44	×	+	-	×	-
간염 및 간경변	90	후	62	85	+	+	-	-	+
B형간염	25	전	×	×	+	+	-	+	-
B형간염	25	후	23	31	-	+	-	-	+
지방간, 신결석	25	전	81	97	+	+	-	-	-
지방간, 신결석	25	후	37	67	-	+	-	-	+
B형간염	155	전	34	51	+	+	-	-	+
B형간염	155	후	35	53	-	+	-	-	-
B형간염	60	전	213	290	+	+	-	+	-
B형간염	60	후	32	34	-	+	+	+	+

하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1 건조 추출물 .............................. 100 ㎎

소디움 메타비설파이트 ............................. 3.0 ㎎

메틸파라벤 ....................................... 0.8 ㎎

프로필파라벤 ...................................... 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수 ................................ 적 량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖용량의 앰플에충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1 건조 추출물............................... 200 ㎎

유당 .............................................. 100 ㎎

전분............................................... 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 ............................... 적 량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1 건조 추출물 ............................ 100 ㎎

유당 ............................................ 50 ㎎

전분 ............................................ 50 ㎎

탈크 ............................................ 2 ㎎

스테아린산 마그네슘 ............................ 적 량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1 건조 추출물 ............................ 1000 ㎎

설탕 ........................................... 20 g

이성화당 ....................................... 20 g

레몬향 ......................................... 적량

정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 맞추었다.

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100 ㎖ 의 갈색병에 충전하고 멸균시켜서 액제를 제조하였다.

또한 하기와 같은 방법으로 건강식품 및 건강음료를 제조하였다.

제제예 5. 건강식품의 제조

실시예 1 건조분말 ............................... 1000 ㎎

비타민 혼합물 ...................................... 20 g

비타민 A 아세테이트......................... 70 ㎍

비타민 E ................................... 1 ㎎

비타민 B₁.................................. 0.13 ㎎

비타민 B₂.................................. 0.15 ㎎

비타민 B₆.................................. 0.5 ㎎

비타민 B₁₂................................. 0.2 ㎍

비타민 C .................................. 10 ㎎

비오틴 .................................... 10 ㎍

니코틴산아미드 ............................ 1.7 ㎎

엽산 ...................................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘 .............................. 0.5 ㎎

무기질 혼합물 .......................................... 적량

황산제1철 ................................ 1.75 ㎎

산화아연 .................................. 0.82㎎

탄산마그네슘 ............................. 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ............................... 15 ㎎

제2인산칼슘 ............................... 55 ㎎

구연산칼륨 ................................ 90 ㎎

탄산칼슘 .................................. 100 ㎎

염화마그네슘 .............................. 24.8 ㎎

상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6. 건강음료의 제조

실시예 1 건조분말 ............................... 1000 ㎎

구연산...................................... 100 ㎎

올리고당 ................................... 100 g

매실농축액 ................................. 2 g

타우린 ..................................... 1g

정제수를 가하여 전체 ....................... 900㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 마과 추출물은 B형 간염바이러스의 복제효소 활성을 저해하여 결과적으로 바이러스 증식을 억제하는 효능이 우수하므로, 간염 및 간경화 등의 바이러스성 간질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

B형 간염 바이러스 증식 억제에 효과적인 마과(Cucumis melonLinn. var. ma-gua)의 조추출물.
마과의 조추출물을 함유하는 바이러스성 간질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올 등의 저급 알콜, 이들의 혼합용매 및 완충액으로부터 선택된 하나 이상의 극성용매로 추출된 조성물.
제 3항에 있어서, 극성용매는 완충액인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 투여량은 성인 체중 1㎏당 10 내지 100㎎의양으로 투여되는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 ~ 50%로 포함하는 조성물.
바이러스성 간질환에 예방 및 치료효과를 나타내는 마과의 조추출물과 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품.
제 7항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강보조식품.