KR20040008012A - 단백질 지령부위내 단반복 염기서열을 갖는 신규 유전자 - Google Patents

단백질 지령부위내 단반복 염기서열을 갖는 신규 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 지령부위내 10개이상의 단반복 염기서열 (cMNR, coding mononucleotide repeats)을 포함하는 22개의 신규 유전자에 관한 것이다. 이들 유전자는 고빈도 현미부수체 불안전형 종양에서 체이동 돌연변이가 빈번하게 일어나며 이때 발생한 돌연변이 산물은 종양특이 항원의 개발에 유용하다.

Description

단백질 지령부위내 단반복 염기서열을 갖는 신규 유전자{Novel Genes Containing Coding Mononucleotide Repeats}
본 발명은 단백질 지령부위내 단반복 염기서열 (cMNR, coding mononucleotide repeats)을 포함한 신규 유전자 및 이의 체이동 돌연변이체(frameshift mutation)에 관한 것이다.
DNA 복제오류교정계 (mismatch repair, MMR)는 돌연변이 발생을 낮추고, 게놈의 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. MMR 유전자들 중 한 개가 불활성화된 종양에서는 반복 염기서열에서의 복제오류를 통해 나타나는 미끄러짐 (slippage) 현상을 교정하지 못하여 이형 DNA (heteroduplex)가 형성되어, 그 다음의 복제과정 중에 반복 단위에서의 삽입과 결손이 발생하게 된다 (Strand M. et al., Nature, 365, 274-276, 1993). 이러한 변이는 전체 게놈내에 분산되어 나타나는 염기서열 반복이 일렬로 나타나는 현미부수체 (microsatellites)에서 주로 발생한다. 이러한 현미부수체 DNA 염기서열의 길이의 변이를 현미부수체 불안정성 (microsatellite instability, MSI)이라고 하며, 유전성 비용종 대장암 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome, HNPCC)과 일부 산발성 대장암에서 발견된다(Perucho, 1996; Eshleman 등, 1996).
MSI가 대부분 유전자의 비암호 부위에 나타나는 것으로 알려졌지만, 최근 일부 암관련 유전자와 DNA 수선 유전자의 단백질 지령부위에도 존재함이 밝혀졌다 (Markowitz S. et al., Science, 268, 1336-1338, 1995; 및 Malkhosyan S. et al.,Nature, 382, 499-500, 1996). 이들 유전자의 단백질 지령부위내에 발생한 MSI는 절단형 단백질의 축적과 함께 유전자의 기능상실을 일으킬 수 있다.
단백질 지령부위내 단반복 염기서열 (cMNR, coding mononucleotide repeats)을 포함하는 유전자가 동정되었으며, cMNR에서의 돌연변이도 보고되었다 (Souza R. F., Nat. Genet., 14, 255-257, 1996; Rampino N., et al. Science, 275, 967-969, 1997; Yamamoto H. et al., Cancer Res., 57, 4420-4426, 1997; Duval A. et al., Oncogene, 18, 6806-6809, 1999; Kim N. G. et al., Cancer Res., 61, 36-38, 2001; Bader S. et al., Oncogene, 18, 8044-8047, 1999; Schwartz S. Jr. et al., Cancer Res., 59, 2995-3002, 1999). 돌연변이율이 높고, 동형돌연변이가 있으며 종양억제 유전자의 기능을 하는 유전자들이 고빈도 현미부수체 불안정형 (MSI-H, high microsatellite instability) 종양의 예상 표적 유전자로 제안되었다 (Boland C. R. et al., Cancer Res., 58, 5248-5257, 1998). cMNR을 포함하고 있으나 낮은 돌연변이율을 나타내는 유전자들은 표적 유전자로 간주되지 않았다. 표적 유전자들의 돌연변이는 MSI-H 종양의 종양 진행과정 동안 선택되고 축적되는 것으로 생각된다. MSI-H 선종보다 MSI-H 암종에서 빈번한 돌연변이가 발견되며,TGF-β RII(transforming growth factor beta type II receptor)와TCF-4유전자는 자궁내막암보다는 위장관계암에서 선택적으로 발생한다 (Duval A. et al., Oncogene, 18, 6806-6809, 1999; Kim J. J. et al., Lab. Invest., 79, 1113-1120, 1999).
MSI-H 종양에서 예상 표적 유전자가 계속 많이 보고되고 있지만, cMNR 염기서열을 포함하며 높은 돌연변이율을 나타내는 새로운 유전자들이 사람 유전체 전반에 걸친 체계적인 데이터베이스 탐색과 돌연변이 분석을 통해 발견될 수 있을 것이다. 현재까지, 세 연구가 시도되었으며 이러한 연구를 통해 여러 예상 표적 유전자들을 발굴하였다 (Woerner S. M. et al., Int. J. Cancer, 93, 12-19, 2001; Mori Y. et al., Cancer Res., 61, 6046-6049, 2001; Park J. et al., Cancer Res., 62, 1284-1288, 2002).
본 발명자들은 생물정보학을 이용한 체계적인 데이터베이스 분석을 통해 10개이상의 단반복 염기서열을 지닌 cMNR을 포함하는 22개의 신규 유전자를 동정하였다. 또한, 본 발명자들은 이들 유전자들의 반복 염기서열의 체이동 돌연변이를 39예의 MSI-H 대장암과 8예의 MMR-결함 세포주를 대상으로 조사하였고 그 결과 cMNR을 포함하는MARCKS,FLJ11383및TAF1B가 높은 돌연변이율과 동형 돌연변이를 나타내기 때문에 MSI-H 종양에서의 추가 표적 유전자임을 밝혔다.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43으로 이루어진 cDNA 유전자 그룹중에서 선택되는, 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 cDNA 유전자를 제공한다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44로 이루어진 게놈 DNA 유전자 그룹중에서 선택되는, 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 게놈 DNA유전자를 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43으로 이루어진 cDNA 유전자 그룹중에서 선택되는 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 cDNA 유전자로부터 단반복 염기서열에서 한 개 이상의 염기가 결실 또는 삽입된 체이동 돌연변이 유전자를 제공한다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44로 이루어진 게놈 DNA 유전자 그룹중에서 선택되는 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 게놈 DNA 유전자로부터 단반복 염기서열에서 한 개 이상의 염기가 결실 또는 삽입된 체이동 돌연변이 유전자를 제공한다.
도 1은 MSI-H 종양에서 공지 유전자 TGFβ-RII의 체이동 돌연변이 결과에 의한 비정상적인 아미노산 서열의 형성을 보여준다.
도 2는 MSI-H 종양에서MARCKS,FLJ11383및TAF1B유전자의 cMNR 개수의 변화. N. 정상점막 조직에서 추출한 DNA; T, 종양조직에서 추출한 DNA. 1-20 레인은 MSI-H 대장암의 PCR 결과이다. 21-31 레인은 세포주의 PCR 결과이다. LS-174T, HCT-8, NCI-H747, SNU-C2A, SNU-C4, DLD-1, HCT-116 및 LOVO 세포주는 복제오류교정 결함 세포주이며 나머지 3 세포주는 복제오류교정 정상 세포주이다.
도 3은 MSI-H 대장암에서MARCKS,FLJ11383및TAF1B유전자의 염기서열 분석 결과. 화살촉의 위아래는 폴리디옥시아데노신 반복부위에 한 개의 염기서열의 삽입이나 결실을 나타낸다. WT는 정상형을 나타낸다.
도 4는 39예의 MSI-H 대장암 (검정 막대)과 8예의 MMR-결함 세포주 (흰 막대)에서 체이동 돌연변이 빈도.TGF- RII,TAF1B,FLJ11383및MARCKS유전자의 돌연변이율은 MSI-H 대장암에서 70% 이상이다.
단백질 지령부위내 단반복 염기서열 (cMNR)에 발생하는 체이동 돌연변이는 고빈도 현미부수체 종양 (MSI-H, high microsatellite instability)에서 잘 알려진 특징이다. MSI-H 종양에서 예상 표적 유전자가 많이 보고되고 있으며 이들 유전자는 새로운 항원성 펩타이드를 개발하는데 유용될 수 있다. 대표적인 예로서 MSI 종양에서 높은 돌연변이율을 보이는 TGFβ-RII 유전자를 들 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 천연형의 TGFβ-RII 유전자는 단백질 지령부위내에 10개의 아데닌 염기 반복서열을 갖는다. 만일 아데닌 염기 한 개 또는 두 개가 결실되어 체이동 돌연변이가 발생한 경우 단반복 염기 서열 이후로부터 비정상적인 아미노산 서열이 형성된다. 도 1에서 적색 문자는 돌연변이된 추정 아미노산 서열을 보여준다. 아데닌 염기 한 개가 결실된 경우는 34개의 아미노산이 변이되고, 아데닌 염기 두 개가 결실된 경우는 2개의 아미노산이 변이됨을 알 수 있다. 이렇게 형성된 비정상적인 아미노산 서열 또는 이의 단편들은 종양에 대한 항원으로서 작용할 수 있으며 이에 따라 cMNR을 포함하는 유전자 또는 이의 체이동 돌연변이체는 항원성 펩타이드의 개발에 유용하게 사용되는 것이다.
아래 표 1은 공지된 유전자 11개와 본 발명에 따른 22개의 신규 유전자에서 1개 및 2개의 염기가 결실되어 체이동 돌연변이가 발생한 경우 생산되는 돌연변이 아미노산 서열을 보여준다.
표 1
체이동 돌연변이에 의한 형성된 비정상적인 아미노산 서열
이하, 본 발명에 따른 신규 유전자의 동정에 대하여 자세히 설명될 것이다.
데이터베이스에서 단백질 지령부위내 단반복 염기서열을 포함하는 유전자의 탐색과 확인
본 발명에 따라 데이터베이스 분석을 통해 단백질 지령부위내에 7개이상의 단반복 염기서열을 포함하는 4071개의 유전자를 동정하였다 (A 반복 2248개, T 반복 690개, G 반복 369개, C 반복 764개). 이중 102개의 유전자는 10개 이상의 단반복 염기서열을 포함하고 있었다 (A반복 56개, T반복 38개, G반복 5개, C반복 3개).
단백질 지령부위내에 단반복 염기서열을 포함하는 유전자의 재확인 및 선별
본 발명에서는 탐색된 유전자군들 중에서 (a) 유전체 데이터베이스와 EST 데이터베이스 모두에서 단백질 지령부위임이 확인된 유전자와 (b) 체이동 돌연변이가 정상 점막 조직, MSS 종양, 복제오류교정 정상 세포주에서는 발생하지 않는 유전자들만을 이용하였다. 본 연구의 예비 실험과 기존에 보고된 타 연구에서는 돌연변이율은 단반복 염기서열의 길이가 길수록 증가하였기 때문에 (Parsons R. et al., Cancer Res., 55, 5548-5550, 1995), 우선 10개이상의 단반복 염기서열을 포함하는 102개의 유전자를 대상으로 하였다. 여러 사람 유전체 염기서열 정보와 다른 염기서열 분석 결과들을 취합하여 면밀히 검토한 후 10개이상의 단반복 염기서열을 포함하는 cMNR을 가지는 33개의 유전자만을 최종적으로 선별하였다.
최종적으로 선별된 33개의 유전자 중에서 5개의 유전자 (TAF1B, MARCKS, FLJ11186, KIAA1052, FLJ13615)는 11개의 아데노신 반복, 27개의 유전자는 10개의 아데노신 반복을, 1개의 유전자는 10 개의 싸이미딘 반복을 단백질 지령부위내에 포함하고 있었다 (아래 Table 2 참조). 이중 11개의 유전자는 이전의 연구에서 MSI-H 종양에서의 표적 유전자 후보로 알려진 유전자였으나 (TGF-β RII, AIM2, SEC63, Caspase 5, OGT, ATR, MBD4, SYCP1, GART, PRKDC, MAC30) (Markowitz S. et al., Science, 268, 1336-1338, 1995; Bader S. et al., Oncogene, 18, 8044-8047, 1999; Schwartz S. Jr. et al., Cancer Res., 59, 2995-3002, 1999; Woerner S. M. et al., Int. J. Cancer, 93, 12-19, 2001; Mori Y. et al., Cancer Res., 61, 6046-6049, 2001), 나머지 22개의 유전자는 현재까지 밝혀진 바 없는 신규한 유전자로 동정되었다.
cMNR을 포함하는 유전자들의 체이동 돌연변이율
39예의 MSI-H 대장암과 8예의 복제오류교정 결함 대장암 세포주를 대상으로 선별된 33개의 유전자들의 체이동 돌연변이를 조사하였다. MSI-H 대장암 환자의 정상 점막조직과, MSS 대장암환자의 정상 및 암조직, 3예의 복제오류교정 정상 세포주를 대조군으로 이용하였다. 39예의 MSI-H 대장암 환자중 1예를 제외한 나머지 예는 1개 이상의 유전자에서 돌연변이를 나타냈지만, MSS 대장암에서는 돌연변이가 발견되지 않았다. 도 2와 도 3에 체이동 돌연변이의 예를 나타냈으며, MSI-H 대장암의 돌연변이율은 도 4에 나타나 있다. 조사된 33개의 유전자 중에서 11개 유전자는 MSI-H 대장암에서 빈번한 체이동 돌연변이 (>40%)를 나타냈다 (도 4). 이 11개의 유전자 중 5개 유전자는 (TGF-β RII,AIM2,SEC63,Caspase 5,OGT) 이전에 MIS-H 대장암에서 높은 돌연변이율을 나타내는 것으로 보고된 것들이지만 (Markowitz S. et al., Science, 268, 1336-1338, 1995; Schwartz S. Jr. et al., Cancer Res., 59, 2995-3002, 1999; Woerner S. M. et al., Int. J. Cancer, 93, 12-19, 2001; 및 Mori Y. et al., Cancer Res., 61, 6046-6049, 2001), 나머지 6개는 현재까지 보고되지 않은 새로운 유전자들이다. 본 발명에 이용된 MSI-H 대장암에서 알려진 5개의 유전자들의 돌연변이율은TGF-β RII가 85%,AIM2가 67%,SEC63가 56%,Caspase 5가 49%,OGT가 41%였다. 이러한 돌연변이율은 기존에 보고된 결과와 매우 유사하였다. MSI-H 종양의 표적유전자로 기존에 보고되지 않은 6개의 유전자들 중MARCKS(72%),FLJ11383(74%) 및TAF1B(82%)은 MSI-H 대장암에서 높은 돌연변이율을 나타냈다. 복제오류교정 결함 대장암 세포주 8예에서의 돌연변이율은 MSI-H 대장암과 대개 유사하였다.
정상형과 비정상형 (위치변동된) 밴드의 명암도를 비교하여 이형과 동형 돌연변이를 구분하였다. 동결절편 절단법을 실시한 다음 조직학적 표본 검색을 통해 종양세포의 비율이 대략 70-90% 정도가 됨을 확인하였다. 동형 돌연변이는 종양세포의 비율을 감안한 다음 평가하였다. 33예의 조사된 유전자중 23예가 MSI-H 대장암 또는 복제오류교정 결함 세포주에서 동형 돌연변이를 나타냈다. 70%이상의 돌연변이를 나타내는 4개의 유전자중MARCKS(25.6%),FLJ11383(30.8%),TGF-βRII(51.3%)는 MSI-H 대장암에서 높은 동형 돌연변이를 나타냈지만,TAF1B(2.6%)는 낮은 동형 돌연변이를 나타냈다.
본 발명에서는 MMR-결함 종양에서 예상 표적 유전자를 탐색하기 위한 체계적인 시도를 통해 기존에 알려지지 않았던 많은 새로운 예상 표적 유전자를 동정하였다. 그 결과로서, 단백질 지령부위내에 cMNR 염기서열을 포함하는 여러 유전자가 발견되었으며 이중MARCKS,FLJ11383및TAF1B에서 상당히 빈번한 체이동 돌연변이가 나타남을 확인하였다.
MMR-결함 종양의 경우 MNR내에서 염기서열의 삽입 혹은 결실이 빈번하게 발생함이 잘 알려져 있다. MNR내에서의 돌연변이는 단백질 지령부위와 비암호화부위 모두에서 다양한 빈도로 발생한다고 보고되었다 (Mori Y. et al., Cancer Res., 61, 6046-6049, 2001; Parsons R. et al., Cancer Res., 55, 5548-5550, 1995; 및 Zhang L. et al., Cancer Res., 61, 3801-3805, 2001). 본 발명에서는 MNR내의 염기서열의 개수와 돌연변이율이 상관관계가 있음이 보고되었기 때문에, 10개이상의 염기서열을 포함하는 cMNR을 지니는 예상 유전자들을 선별하였다. 본 발명자들은 11개의 염기서열이 cMNR에서 나타난 5개의 유전자에서는 평균 55%의 돌연변이가 발생하며, 10개의 염기서열을 cMNR에 포함하는 유전자에서는 평균 31%의 돌연변이가 발생함을 발견하였다. 이러한 돌연변이율은 기존에 보고된 표적 유전자의 돌연변이율과 비교하였을 때 매우 높기 때문에, 이들중 일부는 잠재적으로 중요한 표적유전자임을 시사한다. 이들 중 기존에 MSI-H 종양에서 가장 잘 알려진 중요한 표적 유전자인TGF-β RII와 유사한 돌연변이율을 나타내는MARCKS,FLJ11383및TAF1B가 가장 주목할 만하다.
cMNR의 체이동 돌연변이의 가장 중요한 의미 중 하나는 유전자의 기능적 불활성화이다. 한 대립유전자 (allele)의 cMNR에서의 돌연변이와 다른 기전 (MNR이 아닌 부위의 돌연변이, 결실 혹은 메틸화)에 의한 나머지 대립유전자의 불활성화를 통해 완전한 기능적 불활성화가 발생할 수 있다.TGF-β RII유전자에서 MNR 혹은 비MNR 부위에서의 동형 불활성화가 보고되었다 (Markowitz S. et al., Science, 268, 1336-1338, 1995; 및 Parsons R. et al., Cancer Res., 55, 5548-5550, 1995). 본 발명자들은 MSI-H 대장암에서 33개의 유전자중 17개의 유전자에서 cMNR의 동형돌연변이를 발견하였는데, 이중TGF-β RII,FLJ11383그리고MARCKS유전자에서의 동형돌연변이가 매우 빈번하였다. 이러한 발견은 이들 세 유전자의 체이동 돌연변이가 기능적 불활성화와 직접적으로 연관이 있으며 MSI-H 대장암의 발암기전과 연관이 있음을 암시한다.
MSI-H 종양에서 새로 발굴된 예상 표적 유전자들에 관한 문헌 조사결과,MARCKS가 세포의 증식과 분화에 잠재적으로 중요한 역할을 할 것으로 추정되었다.MARCKSPKC에 대한 세포내에서 가장 중요한 기질이며, 조사된 거의 모든 종류의 세포에서 광범위하게 발현한다 (Blackshear, P. J. et al., J. Biol. Chem., 268, 1501-1504, 1993). 세포의 증식 조절 기능에 관한MARCKS의 기능이 제안된 바 있다. MARCKS의 농도가 여러 종양 세포주에서 낮아져 있으며 (Brooks G. et al., Carcinogenesis, 17, 683-689, 1996; 및 Manenti S. et al., Cancer Res., 58, 1429-1434, 1998), 이러한 MARCKS 발현억제는 PKC 의존적, 비의존적 경로를 통해나타났다 (Brooks S. F. et al., J. Biol. Chem., 267, 14212-14218, 1992). MARCKS 단백질의 양은 세포가 활동적으로 생장할 때는 감소하지만, 분열을 중지하면 급격히 늘어난다 (Herget T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 2945-2949, 1993). 또한 MARCKS를 과발현시키면 사람의 종양에서 유래된 맹락막 흑색종 (choroidal melanoma) 세포의 생장을 억제시키는 역할을 한다 (Manenti S. et al., Cancer Res., 58, 1429-1434, 1998).MARCKS의 (A)11 반복부위는 2번째 엑손에 위치하고 있으며 (A)11 cMNR에 영향을 주는 체이동 돌연변이는 작동 (effector) 도메인의 절단을 일으켜 기능적 상실을 초래할 것이다. 따라서,MARCKS의 불활성화는 발암기전과 연관이 있을 것으로 추측할 수 있다.
체이동 돌연변이율은 높지만,TAF1B와FLJ11383의 발암기전에서의 기능은MARCKS에 비해 명확하지 않다. 이는 기본적으로 이들 두 유전자가 발암기전에 관여하는지에 대한 기능연구가 보고되지 않았기 때문이다. TAF1B (TAFI63)은 TATA 결합 단백질 (TBP)를 포함하는 프로모터 선택인자인 TIF-1B/SL1의 두 번째로 큰 소단위체이다 (Comai L. et al., Science, 266, 1966-1972, 1994).TAF1B는 리보솜 전사와 알려져 있으나, 세포의 증식과 분화에 관한 명확한 기능은 밝혀지지 않았다.TAF1B의 (A)11 반복은 3번 엑손에 존재하고 있으며 1개의 염기가 결실되거나 2개의 염기가 결실되었을 때 Mr 60,873Da인 정상형의 TAF1B 단백질에 비해 대략 Mr 10,235Da 과 Mr 7,793Da의 절단된 단백질이 각각 나타날 것으로 예측된다. 따라서, 절단형 단백질은 불활성화형일 것으로 추정된다. 대부분의TAF1B에서는 동형 돌연변이가 나타나지 않기 때문에TAF1B의 불활성화는 완전한 결함이라기 보다는 반수체기능부전(haploinsufficiency)의 형태로 작용할 것으로 추정된다. MSI-H 종양에서 표적 유전자에서 반수체기능부전의 중요성이 이전에 제안되었다 (Schwartz S. Jr., Cancer Res., 59, 2995-3002, 1999; 및 Ohmiya N. et al., Gene, 272, 301-313, 2001).FLJ11383유전자는 아직까지 기능이 밝혀지지 않았다. 현재까지 2,205 염기 길이를 가지는 긴 전사체 (GeneBank accession No. BC008300)와 1,833 염기 길이를 가지는 짧은 전사체인 (GeneBank accession No. NM_024938) 두 가지 형태의FLJ11383전사체가 존재한다고 보고되었다. (A)10 반복은 짧은 형태에만 존재하며, 이 반복부위는 카르복실기 말단에 인접하여 존재한다 (전체 286개 아미노산중 코돈 267-270). 본 발명자들은 MSI-H 대장암과 정상 점막 조직에서FLJ11383의 정상형과 돌연변이형 전사체의 발현을 RT-PCR 방법을 통해 확인하였다 (데이타 제시되지 않음). 발암기전에서FLJ11383유전자 돌연변이의 기능을 알기 어렵지만, MSI-H 종양에서 높은 체이동 돌연변이율 및 동형돌연변이율은FLJ11383이 MSI-H 대장암에서 잠재적으로 중요한 표적유전자임을 암시한다.
본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
<실시예 1>
cMNR동정
유전체 내에 분포한 cMNR을 동정하기 위하여 NCBI의 사람 UniGene 데이터베이스 중 (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/UniGene) 각 유전자에서 대표 염기서열만을 취합한 Hs.seq.uniq 파일을 분석에 이용하였다. 암호화 서열이라고 명기되어있는 cMNR을 가지는 염기서열을 NCBI 홈페이지내의 LocusLink (http://ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink)에 있는 사람 유전체 염기서열 데이터와 비교하였다. 최초로 선택한 cMNR 포함 유전자가 타 데이터 베이스에서 비암호화 서열부위로 지칭되거나, 미확인 게놈 DNA 염기서열, 반복부위에 다형성이 나타난 경우, 게놈 DNA 염기서열과 불일치를 나타내는 경우, 그리고 슈도유전자 (pseudogene)로 등록된 유전자의 경우는 본 실시예에서 제외하였다.
여러 차례에 걸친 체계적인 분석을 통해 최종적으로 10개 이상의 염기서열을 지닌 cMNR을 포함하는 유전자 33예를 선별하여 돌연변이를 조사하였다. GeneBank 승인번호, 설명 및 유전자 이름은 표2에 예시되어있다. 33예의 유전자중에서 20예의 유전자는 기능을 알고 있으나, 나머지 13예의 유전자의 기능은 현재까지 밝혀지지 않았다.
표 2 분석된 유전자의 목록 및 설명
GenBank accession no. Gene description Gene name Type of repeat Chromosomallocation
D50683 Transforming growth factor, beta receptor II TGF-b RII A(10) 3p22
L39061 TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase I, B, 63kD TAF1B A(11) 2p25
NM_024938 FLJ11383 A(10) 1
NM_002356 Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MACS, 80K-L) MARCKS A(11) 6q22.2
NM_004833 Absent in melanoma 2 AIM2 A(10) 1q22
NM_018353 FLJ11186 A(11) 14q13.1-14q21.3
NM_007214 Endoplasmic reticulum translocon component (S. cerevisiae) like SEC63 A(10) 6q16-22
NM_004347 Apoptosis-related cysteine protease Caspase 5 A(10) 11q22.2-q22.3
NM_003201 Transcription factor 6-like 1 (mitochondrial transcription factor 1-like) TCF6L1 A(10) 7pter-cen
AB040903 KIAA1470 A(10) 1
NM_003605 O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase (UDP-N-acetylglucosamine: polypeptide-N-acetylglucosaminyl transferase) OGT T(10) X
NM_003369 UV radiation resistance associated gene UVRAG A(10) 11q13.5
NM_014956 KIAA1052 protein A(11) 11
NM_006846 Serine protease inhibitor Kazal type 5 SPINK5 A(10) 5q32
NM_017685 FLJ20139 A(10) 1
NM_001184 Ataxia telangiectasia and Rad3 related ATR A(10) 3q22-24
NM_018365 FLJ11222 A(10) 15q11.2
NM_025114 FLJ13615 A(11) 12
NM_003925 Methyl-CpG binding domain protein 4 MBD4 A(10) 3q21-22
NM_003176 Synaptonemal complex protein 1 SYCP1 A(10) 1p13-12
NM_001090 ATP-binding cassette, sub-family F (GCN20), member 1 ABCF1 A(10) 6p21.33
NM_018979 Protein kinase; lysine deficient 1 PRKWNK1 A(10) 12p13.3
AB033094 KIAA1268 A(10) 3
NM_002915 Replication factor C (activator 1) 3 (38kD) RFC3 A(10) 13q12.3-q13
NM_000819 Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, phosphoribosylglycinamide synthetase, phosphoribosylaminoimidazole synthetase GART A(10) 21q22.11
AB037754 FLJ20333 (KIAA1333) A(10) 14
AL136680 DKFZp564C2478 A(10) 1
U47077 Protein kinase, DNA-activated,catalytic polypeptide PRKDC A(10) 8q11
NM_024570 FLJ11712 A(10) 13
NM_001271 Chromodomain helicase DNAbinding protein 2 CHD2 A(10) 15q26
AL096857 KIAA1096 A(10) 1
L19183 Differentially expressed inneuroblastoma (MAC30) A(10) 17q11.2
AL008635 High-mobility group protein2-like 1 HMG2L1 A(10) 22q13.1
<실시예 2>
조직 선별 및 세포주
본 실시예에서는 39예의 MSI-H 대장암과 24예의 현미부수체 안정형 (MSS) 대장암을 이용하였다. 대부분의 예에 대한 MSI 상태는 기존의 연구에서 보고된 바 있다 (Kim N. G., et al., Cancer Res., 61, 36-38, 2001). 모든 예에 대해, 종양인접부위의 정상 점막조직을 대조군으로 이용하였다. 모든 조직들은 1996년 12월부터 1999년 11월까지 연세대학교 부속 세브란스병원 (서울, 대한민국) 위장관계 종양 연구회 조직은행에서 일관되게 수집된 것들이다. DNA는 신선 동결조직에서 추출하였다. 종양 시료는 종양세포의 비율을 높이기 위하여 동결 절단법을 이용하여 미세절단하여 분리하였다.
11예의 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection)와 한국 세포주은행 (KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 기존에 보고된 MSI 상태에 의거하여 (Ku J. L. et al., Eur. J. Cancer, 35, 1724-1729, 1999; Lengauer C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2545-2550, 1997; Park J. G. et al., Cancer Res.,47, 6710-6718, 1987), 8예 (LS-174T, HCT-8, NCI-H747, SNU-C2A, SNU-C4, DLD-1, HCT-116 및 LOVO)는 복제오류 교정 결함 세포주이며, 3예 (NCI-H508, SW-480 및 HT-29)는 복제오류 교정 정상형이었다. 세포주의 MSI는BAT26과BAT25표지자를 이용하여 확인하였다. 세포주들은 10% 우태아혈청 (Life technologies, Grand Island, NY, USA)과 페니실린, 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지로 5% CO2를 포함하는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
<실시예 3>
체이동돌연변이 분석과 염기서열 분석
cMNR 내의 체이동 돌연변이는 아래 표3에 기술된 프라이머를 이용하여 PCR-방법을 통해 분석하였다.
표 3
단백질 지령부위내 단반복 염기서열 길이의 검출을 위해 사용된 프라이머
PCR 반응은 총 20㎕가 되도록 1.5mM MgCl2, 20 pmol 프라이머, 0.2mM dATP, dGTP, dTTP, 5μM dCTP, 1 μCi [α-32P] dCTP (3,000 Ci/mmol; NEN DuPont, Boston, MA), 50 ng의 게놈 DNA, 1x PCR 완충액과 1.25U Taq 폴리머라제 (Life technologies, Inc.)를 첨가하였으며 DNA 변성을 위하여 95℃에서 5분간 가열한 다음, 95℃에서 30초간의 변성과정, 55℃~60℃에서 30초간의 재결합과정, 그리고 72℃에서 15초간의 신장과정 등 3과정을 20회에서 30회 반복 시행하였다. PCR 산물은 5.6M의 요소를 포함하는 6% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전개하였다. cMNR 염기서열의 체이동 돌연변이는 PCR 산물의 이동 변화로 판독하였다. 이동 변화가 발생한 밴드가 체이동 돌연변이를 나타내는 지를 확인하기 위하여MARCKS,FLJ11383및TAF1B에서 이동변화를 나타내는 유전체 DNA 단편을 폴리아크릴아마이드 젤에서 잘라낸 다음 pT7Blue 벡터에 클로닝하였다 (Novagen, Madison, WI). 플라스미드는 T7 서열분석 키트 (USB, Cleveland, OH)와 8% 변성 폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 염기서열을 분석하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에서 동정된 유전자는 MSI-H 종양에 대한 항원을 개발하는데 유용하다.

Claims (4)

  1. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43으로 이루어진 cDNA 유전자 그룹중에서 선택되는, 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 cDNA 유전자.
  2. 단반복 염기서열에서 한 개 이상의 염기가 결실 또는 삽입에 의해 체이동 돌연변이된 제1항의 cDNA 유전자.
  3. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 및 44로 이루어진 게놈 DNA 유전자 그룹중에서 선택되는, 10개 이상의 염기 서열을 지닌 cMNR을 포함하는 게놈 DNA 유전자.
  4. 단반복 염기서열에서 한 개 이상의 염기가 결실 또는 삽입에 의해 체이동 돌연변이된 제3항의 게놈 DNA 유전자.
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