KR20040005539A

KR20040005539A - 이온수와 당을 이용한 계란 난황내의 수용성 특수면역단백질의 분리 및 제조

Info

Publication number: KR20040005539A
Application number: KR1020020040124A
Authority: KR
Inventors: 백반석; 선우선영
Original assignee: 백반석; 선우선영
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2004-01-16

Abstract

본 발명은 난황의 수용성 특수 면역단백질을 효율적인 방법으로 분리하는 것으로 pH11∼pH9의 알칼리성 이온수와 pH5∼pH3의 산성 이온수로 난황액을 4∼20배 희석하여 5℃와 저온실에 정치시켜 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질을 분리하는 것과 트레할로스 당이 첨가된 pH11∼pH9의 알칼리성 이온수와 pH5∼pH3의 산성 이온수로 난황액을 4∼20배 희석하여 5℃의 저온실에 정치시켜 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질을 분리에 관한 것이다.

상기의 방법으로 분리된 난황내의 수용성 특수 면역단백질은 계란고유의 냄새와 맛이 거의 없고, 난황분말을 물에 녹였을 때와는 달리 지방층이 분리되지 않기 때문에 유제품, 음료등 기타 식품소재로서 매우 유용하다. 유기용매나 기타 화학약품을 사용하지 않기 때문에 생산비용 및 시간의 감소와 환경오염을 최소한으로 줄일 수 있다.

또한 당이 첨가된 이온수로 난황내의 수용성 특수 면역단백질을 분리할 경우 일반 이온수로 분리했을 때와 달리 계란 난황내의 색소가 분리되고, 고순도로 정제되는 것이 특징이다. 이렇게 분리된 수용성 특수 면역단백질은 열 안전성에도 일반 이온수 분리로 분리된 것 보다 뛰어나고, 동결 후 해동 하였을 때에도 수용성 특수면역단백질의 역가의 손실이 거의 없는 장점이 있다.

일반이온수로 분리된 수용성 특수 면역단백질에 당을 첨가한 경우에도 열안정성이 매우 높은 것으로 나타났다.

Description

이온수와 당을 이용한 계란 난황내의 수용성 특수 면역단백질의 분리 및 제조{The method for separation and production of water-soluble specific protein(IgY) using electrolytic water and saccharide}

본 발명은 계란 난황의 수용성 특수면역단백질을 분리하는 것으로, 보다 상세하게는 첫째 이온수를 이용하여 난황액과 혼합하여 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질 분리, 둘째 트레할로스당이 첨가된 이온수를 난황액과 혼합하여 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질 분리, 및 일반 이온수로 분리된 수용성 특수 면역 단백질에 당을 첨가하는 것이다.

본 발명에 관련된 종래의 기술을 설명하면, 난황에는 a, β, v-livetin의 주성분인 단백질이 15∼17%를 차지하고 있으며, 특히 v-livetin은 수용성단백질로서 IgG계열의 면역단백질인(포슨 등 Poson, 1980) IgY의 주요 성분으로서 구강섭취가가능한 면역단백질이다. IgG의 분리는 면역동물의 혈청에서 분리하여 비용이나 생산성에 문제가 있어서 원료수급에 한계가 있다. 때문에 구강섭취가 가능한 IgY의 분리는 최근 관심의 대상이 되고 있다.

지금까지 IgY의 분리는 Polyethlene glycol(포슨 등 Poson, 1980) 이나 2-propanol과 aceton을 이용한 용매추출(베이드 등 Bade 1984), 염을 이용한 침전법(존슨너스 등 Jensenius, 1981), 크로마토그래피를 이용한 방법(피차타이 등 Fichtali, 1983), 유기 용매를 이용한 추출방법(포슨 등 Polson, 1980), 원심분리에 의한 리포프 로테인(lipoprotein) 제거 그리고 증점안정제로 식품에 사용되고 있는 carrageenan을 이용한 방법(한센 등 Hansen, 1998) 등 여러 종류의 방법들이 시도되었다. 그러나 원심분리법이나 carrageenan을 이용하는 방법은 생산비가 많이 들고, 수율이 매우 적으며, 유기용매나 화학물질을 사용하는 것은 식용에는 적합하지 않고, 유폐기물의 생산이 많아 환경적으로 문제가 많았다. 또한 이들 방법으로 분리 시 난황내의 색소가 완전히 제거되지 않아 이용분야에 제한이 많았다.

따라서 상기와 같은 방법은 난황으로부터 단백질과 지질을 분리하는데 보편적으로 널리 쓰이고 있으나, 대량생산을 위한 방법에 있어서 이러한 방법은 효율이 적고 비경제적이기 때문에 기존의 방법들보다 간단하고 효율적인 방법을 모색하게 되었다. 또한 수용성 특수 면역단백질에 당을 첨가함으로써 난항내의 색소를 완전히 제거하고, 열안전성을 높여 사용범위를 확대하고자 하였다.

본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하고, 유기 용매 및 침전제, 원심분리의 방법 등을 이용하지 않고 독성이 전혀 없는 이온수를 이용하여 특수 난황으로부터 단백질과 인지질을 분리하는 것과 트레할로스당이 첨가된 이온수를 이용하여, 특수 난황으로부터 단백질과 인지질을 분리함으로써 난황 고유의 색소가 없는 수용성특수 면역단백질을 분리 정제하는 것이다.

도 1은 난황중의 수용성 특수 면역단백질(IgY)을 분리하는 방법에 관한 도면이다.

도 2는 일반 이온수 및 당 첨가 이온수 처리를 이용한 난황 수용성 특수 면역단백질(IgY)과 불용성 단백질의 분리 상태도이다.

도 3은 당 첨가 농도 처리에 따른 수용성 특수 면역단백질(IgY)의 역가 변화이다.

도 4는 pH11 알칼리성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 5는 pH10 알칼리성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 6은 pH9 알칼리성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가변화이다.

도 7은 pH5 산성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 8은 pH4 산성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 9는 pH3 산성 이온수 분리에 따른 수용성 특수면역단백질(IgY) 역가 변화이다.

도 10은 일반 이온수로 분리된 수용성 특수면역단백질(IgY)과 당이 첨가된 이온수로 분리된 수용성 특수 면역단백질(IgY)의 열처리시 역가의 변화이다.

도 11은 일반 이온수로 분리된 수용성 특수면역단백질(IgY)과 당이 첨가된 이온수로 분리된 수용성 특수 면역단백질(IgY)의 -20℃에서 3일 동안 동결 후 해동시 역가의 변화이다.

pH11∼pH9의 알칼리성 이온수와 pH5∼pH3의 산성 이온수로 난황액을 희석하는 방법으로 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질을 분리하는 방법과 트레할 로스당이 첨가된 pH11∼pH9의 알칼리성 이온수와 pH5∼pH3의 산성 이온수로 난황액을 희석하는 하여 수용성 특수 면역단백질을 분리하는 방법, pH11∼pH9의 알칼리성 이온수와 pH5∼pH3의 산성 이온수로 분리된 수용성 특수 면역단백질에 트레할 로스당을 첨가하는 방법

본 발명은 유기용매나 화학약품, 원심분리 등을 사용하지 않고 순수한 이온수의 희석법으로만 난황내의 수용성 특수 면역단백질을 분리하는 것이기 때문에 난황내의 특수면역단백질을 대량으로 분리할 수 있어 비용 절감 및 식용에도 전혀 문제가 없다. 또한 난황 내 고유색소를 제거하고, 열 안전성을 높임으로써 수용성 특수 면역단백질의 이용범위를 확대할 수 있다.

[발명에 대한 상세한 설명]

방법 1. 이온수를 이용하여 난황내의 수용성 특수면역단백질 분리

난황내의 수용성 특수 면역단백질분리는 알칼리성 이온수로 분리하는 방법과산성 이온수로 분리하는 2가지 방법이 있다.

첫째 알칼리성 이온수를 이용하는 방법으로 pH11, pH10, pH9의 알칼리 이온수를 사용한다. pH11의 알칼리성 이온수와 난황을 각각 1대 1로 혼합한다. 이 2배로 희석된 난황액을 pH11의 알칼리성 이온수로 4배, 8배, 12배, 16배, 20배의 희석배율로 서서히 돌리면서 혼합한다. pH10, pH9도 같은 방법으로 난황액과 혼합한다. 완전히 혼합된 희석 난황액을 5℃의 저온실에 방치시켜 놓으면, 24시간 후 도 2에서와 같이 일반증류수는 분리가 전혀 일어나지 않았으나 이온수를 이용한 경우에는 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질이 각각 상층과 하층으로 분리되었다.

둘째 산성 이온수를 이용하는 방법으로 pH5, pH4, pH3의 산성 이온수를 사용한다. pH5의 산성 이온수와 난황을 각각 1대 1로 혼합한다. 이 2배로 희석된 난황액을 pH5의 산성 이온수로 4배, 8배, 12배, 16배, 20배의 희석배율로 서서히 돌리면서 혼합한다. pH4, pH3도 같은 방법으로 난황액과 혼합한다. 완전히 혼합된 희석 난황액을 5℃의 저온실에 방치시켜 놓으면, 24시간 후 도 2에서와 같이 일반증류수는 분리가 전혀 일어나지 않았으나 이온수를 이용한 경우에는 수용성 특수 면역단백질과 불용성 단백질이 각각 상층과 하층으로 분리되었다.

분리된 수용성 특수면역단백질은 저온 또는 동결상태를 유지하여야 변성되지 않고 단백질 고유의 기능을 유지할 수 있다. 때문에 상온이나 실온에서는 보관이 매우 어렵기 때문에 저온실이나, 동결된 상태로 보관하여야 한다. 또한 수용성 특수면역단백질을 해동하였을 때 역가가 감소되는 것을 확인할 수 있다.

수용성 특수면역단백질은 가늘고 긴 사슬같이 쭉 나열된 입체구조를 가지고있어 식품이나 기타 첨가에 의해 여러 가지 기능을 나타내며 동시에 그 이상의 주요한 역할을 담당하고 있다. 그래서 어떤 원인으로 이 입체구조가 붕괴되거나 변형이 되면 그 성징 및 기능이 변하게 되는 단백질 변성이 일어나게 된다. 단백질 변성의 주요한 요인으로는 가열이나 냉동에 따른 온도변화, 산 또는 알칼리에 의한 pH변화, 건조에 의한 가수변화, 염류의 농도나 알코올의 농도에 따른 농도변화, 물리적조작에 의한 변화로 크게 들 수 있다. 이처럼 수용성 특수면역단백질의 여러 가지 변성을 억제, 방지하는 것은 저장 유통에 있어서 매우 중요하다.

이러한 단백질의 변성을 억제하기 위해서는 단백질 입체구조가 외적 요인에의해 변형되는 것을 막아내는 것이 필요하고 이것에 트레할로스 (trehalose)비환원성 당질이 중요한 요인으로 작용한다. 트레할로스는 1832년 Wiggers에 의해, 호밀의 맥각에서 결정으로 분리되었고, Berthelot에 의해 트레할라만나(Trehalamanna)에서 분리되어 트레할로스라고 명명되었다. 트레할로스는 천연의 비환원성당으로서 자연계에서 동식물, 미생물에 걸쳐 광범위하게 유리상태로 존재하고 있으며 특히 버섯류, 빵이나 맥주 등의 효모류, 해조류, 새우 등에 함유되어 있어 각종의 식품을 통해 오랜 세월 동안 인간이 섭취해온 당질의 하나이다.

트레할로스는 단백질의 동결이나 보호작용, 가열에 의한 착색성이나 메일리드 반응을 반응을 일으키지 않는 특징을 포함, 수 많은 뛰어난 기능과 부드러운 감미를 가지고 있다. 또한 생명의 보존, 재생 등에 깊게 관여하는 당질이다.

트레할로스는 비환원성이며 더구나 이당류 중에서도 매우 안정한 당질로서 일반적인 가공 조건하에서는 거의 분해되지 않고 포도당 생성도 없기 때문에 갈변의 원잉인 되지 않는다. 특히 트레할로스는 아미노산이나 단백질과 함께 고온에서 가열하여도 착색이 되지 않기 때문에 가열처리나 고온보존을 필요로 하는 식품이나 음포 등에 널히 이용 가능하다. 두 번째는 결정성으로서 설탕과 달리 트레할로스는 2함수 결저이기 때문에 재결정에 의한 수분활성의 상승이 없어 제품의 안전화를 기대할 수 있다. 세 번째는 흡습성으로서 상대습도 95까지는 거의 흡방습을 하지 않는 안정한 당질이다. 네 번째는 저충치성으로 충치의 원인인 불용성 글루칸의 생성을 야기시키지 않으며 또 설탕에서의 불용성 글루칸의 부착을 약 60% 억제한다. 마지막으로 가장 중요한 단백질 변성방지이다. 단백질 소재를 사용한 제품은 가열이나, 냉동, 건조 등의 처리에 의해 이수나 조직의 경화, 변성을 일으킨다. 이러한 단백질 제품에 트레할로스를 가하며, 냉동 냉장시 또는 건조시의 단백질 변성방지에 뛰어난 효과를 발휘하며 식감이나 물성을 유지하는 것이 가능하다.

방법 2. 이온수에 트레할로스를 첨가하여 난황내의 수용성 특수면역단백질 분리

이온수에 트레할로스를 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%첨가하여 당이 첨가된 이온수 즉 당이온수로 만들었다. 이 당이온수로 도 1의 방법과 같이 난황내의 수용성 특수 면역단백질을 분리하였다. 분리된 수용성 특수면역단백질의 역가를 측정한 결과 당이온수로 분리한 수용성 특수면역단백질의 역가가 일반이온수로 분리된 수용성 특수면역단백질보다 역가가 높았다. 이것은 일반이온수로 분리시 난황내의 수용성 특수면역단백질의 파괴가 진행되었다는 것이며, 당이온수는 이러한 수용성 특수면역단백질의 파괴를 막을수 있는 것으로 나타났다. 그리고 대조구 및 각 처리구별로 -20℃에서 3일동안 동결한 후 20℃의 물에 해동 후 대조구 및각 처리구별 수용성 특수면역단백질의 역가를 측정하였다. 그 결과 대조구에 비해 모든 처리구에서 역가가 높게 나타났으며, 7%에서 10%까지는 역가의 차이가 거의 없어 7%에서 10% 농도에서 매우 안정한 것으로 나타났다. 그러나 1%에서 6% 또한 대조구보다 높은 역가를 나타내어 당의 첨가 후 동결하여 해동하였을 때 수용성 특수면 역단백질이 파괴되지 않고 보호되는 것으로 나타나, 장기간 보존시 매우 효과적인 것으로 나타났다.

방법 3. 이온수로 수용성 특수면역단백질을 분리 후 분리된 수용성 특수면역단백질에 트레할로스 첨가하는 방법

이온수로 분리되 수용성 특수면역단백질에 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%의 트레할로스를 첨가하여 당 수용성 특수면역단백질 복합물을 만들었다. 그리고 대조구 및 각 처리구별로 -20℃에서 3일동안 동결한 후 20℃의 물에 해동 후 대조구 및 각 처리구별 수용성 특수면역단백질의 역가를 측정하였다. 그 결과 대조구에 비해 모든 처리구에서 역가가 높게 나타났으며, 5%에서 10%까지는 역가의 차이가 거의 없어 5%에서 10% 농도에서 매우 안정한 것으로 나타났다. 그러나 1%에서 4% 또한 대조구보다 높은 역가를 나타내어 당의 첨가 후 동결하여 해동하였을 때 수용성 특수면역단백질이 파괴되지 않고 보호되는 것으로 나타나, 장기간 보존시 매우 효과적인 것으로 나타났다.

[산업상의 이용분야]

수동적으로 면역된 산란계에서 생산된 계란의 수용성 특수면역단백질(IgY)을 순수한 당과 이온수만으로 분리하기 때문에 유기용매나 화학약품의 사용과는 달리환경적으로 대량분리 할 수 있고 의약용 및 화장품공업이나 식품공업의 첨가물로 쉽게 사용할 수 있다.

[발명의 효과]

본 발명의 구성에 따른 효과는

첫째, 침전제와 원심분리 및 여러 가지 유기용매를 사용하여, 불용성 단백질과 수용성 단백질을 분리하는 방법보다 수용성 특수 면역단백질(IgY)의 수율이 많고, 순수한 이온수로 분리하기 때문에 시간 및 각종 경비를 줄일수 있고, 대량생산을 할수 있다는 장점이 있다.

둘째, 5℃에 순수한 이온수 희석만으로 24시간 이상 정치 시키면, 색소가 제거된 수용성 특수 면역단백질(IgY)를 생산할 수 있어, 유기용매 및 원심분리 등을 사용하지 않고도 완전히 분리할 수 있어 비용 절감에 큰 기여를 할 수 있다.

셋째, 색소가 제거된 난황 수용성 특수 면역단백질을 생산함으로써 다양한 용도에 응용할 수 있다.

넷째, 당을 첨가함으로써 열안전성을 증가시킴으로써 열 처리시 보다 많은 IgY를 확보할 수 있다.

Claims

알칼리성 이온수와 산성 이온수로 특이난황항체액을 적정 배수로 희석하여 5℃에서 수용성 특수 면역단백질층과 불용성 단백질층을 중력 강하법으로 분리하는 방법에 있어서,

상기 특이난황항체액의 수용성 특수면역단백질층과 불용성 단백질층을 분리하고자 알칼리성 이온수의 pH가 11, 9, 10,산성 이온수의 pH가 5, 4, 3인 것 중 어느하나인 것을 이용하는 단계,

상기 특이난황항체액의 수용성 특수면역단백질층과 불용성 단백질층을 분리하고자 산성 이온수 및 알칼리성 이온수로 난황을 희석할 때 희석배율이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 중 어느 하나인 것을 사용하는 단계
청구항 1항에 있어서.

특이난황항체액의 수용성 특수면역단백질층과 불용성 단백질층을 분리하고자 산성 이온수와 알칼리성 이온수에 당의 첨가 함량이 1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%중 어느 하나의 함량을 첨가하는 단계

상기 당이 첨가된 알칼리성 이온수와 산성 이온수로 특이난황항체액을 적정배수로 희석하여 5℃에서 수용성 특수 면역단백질층과 불용성 단백질층을 중력 강하법으로 분리하는 단계,

상기 특이난황항체액의 수용성 특수면역단백질층과 불용성 단백질층을 분리하고자 알칼리성 이온수의 pH가 11, 9, 10,산성 이온수의 pH가 5, 4, 3인 것 중 어느하나인 것을 이용하는 단계,

상기 특이난황항체액의 수용성 특수면역단백질층과 불용성 단백질층을 분리하고자 산성 이온수 및 알칼리성 이온수로 난황을 희석할 때 희석배율이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20배 중 어느 하나인 것을 사용하는 단계
청구항 1항에 있어서,

산성 이온수와 알칼리성 이온수로 분리된 수용성 특수면역단백질에 당의 함량이 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 중 어느 하나의 함량을 첨가하는 단계
청구항 1항과 2항에 있어서,

항-헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori) 난황, 항-대장균(K88, K99, ETEC(장관독소형 대장균), Enterotoxigenic E. coli, EPEC(장관병원성 대장균): Enteropathogenic E. coli, EHEC(장관출현성 대장균): Enterohemorrhageic E. coli, EAEC(장관부착성 대장균): Enteroadhesive E, coli) 난황, 항-유행성 설사 바이러스(PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 난황, 항-전염성 위장염바이러스(TGEV: Transmissible Gastroenteritis Virus) 난황, 항-프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 난황, 항-스타피로코커스에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 난황, 항-로타바이러스(Rotavirus) 난황, 항-살모넬라(Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis) 난황, 항-스트렙토 뮤탄스(Streptococcus mutans) 난황, 항-스트렙토 상기스(Streptococcus sanguis) 난황, 항-엑티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii) 난황, 항-에드워드 타다(Edwardsiella tarda) 난황, 항-스트렙토 이니에(Streptococcus iniae) 난황, 항-엔테로코커스 세리오리시다(Enterococcus seriorlicida) 난황, 항-카닌 파보바이러스(Canine parvovirus) 난황, 항-카닌 디스템퍼(Canine distemper) 난황에 대해 수용성 특수 면역단백질과 불용성단백질을 분리하는 것.
청구항 1항과 3항에 있어서,

항-헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori) 특이난황, 항-대장균(K88, K99, ETEC(장관독소형 대장균), Enterotoxigenic I. coli, EPEC(장관병원성 대장균): Enteropathogenic E. coli, EHEC(장관출현성 대장균): Enterohemorrhageic E. coli, EAEC(장관부착성 대장균): Enteroadhesive E. coli) 특이난황, 항-유행성 설사 바이러스(PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea Virus) 특이난황, 항-전염성 위장염바이러스(TGEV: Transmissible Gastroenteritis Virus) 특이난황, 항-프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 특이난황, 항-스타피로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 특이난황, 항-로타바이러스(Rotavirus) 특이난황, 항-살모넬라(Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis) 특이난황, 항--스트렙토 뮤탄스(Streptococcus mutans) 특이난황, 항-스트렙토상기스(Streptococcus sanguis) 특이난황, 항-엑티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii) 특이난황, 항-에드워드 타다(Edwardsiella tarda) 특이난황, 항-스트렙토 이니에(Streptococcus iniae) 특이난황, 항-엔테로코커스 세리오리시다(Enterococcus seriorlicida) 특이난황, 항-카닌파보바이러스(Canine parvovirus) 특이난황, 항-카닌 디스템퍼(Canine distemper) 특이난황으로 분리된 수용성 특수 면역단백질에 당의 함량이 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 중 어느 하나의 함량을 첨가하는 단계