KR20030096237A - 레피노탄 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염을 함유하는 제약 조성물 및 체액 중의 레피노탄 또는 그의 대사물의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염을 함유하는 신규 제약 조성물 및 상기 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

레피노탄 키트 {Repinotan Kit}

본 발명은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염을 함유하는 제약 조성물 및 체액 중의 레피노탄 또는 그의 대사물의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 키트 및 레피노탄 또는 생리학적으로 허용가능한 레피노탄의 염을 함유하는 신규 제약 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

발작 및 두개뇌 외상과 같은 신경퇴행성 질환 환자들에게서 신경계 및 기능성 장기 결손이 빈번하게 유도되는데, 이러한 질환의 신속한 치료를 위해 널리 수용되는 효과적인 치료 원칙이 현재까지는 존재하지 않는다. 허혈성 발작 발생 후 초기 3 시간 내에 혈전용해제 (예컨데 t-PA)의 사용 및 외상성 지주막하 출혈을 나타내는 환자에게의 니모디핀의 사용 외에는, 병리생리학적 연속단계를 적절히 고려하는 의약적 벙법이 아직 없다.

유럽 특허 공개 제 0 352 613호에는 중추 신경계 질환, 특히 발작 치료를 위한 2-[4-({[(2R)-크로만-2-일]메틸}아미노)부틸]-1,2-벤즈이소티아졸-3(2H)-온 1,1-디옥시드 (일반명: 레피노탄) 및 레피노탄 염이 개시되어 있다.

독일 특허 출원 제 195 43 476호에는 두개뇌 외상의 치료에 대한 레피노탄 및 그의 염의 적합성이 기재되어 있다.

수 많은 임상 연구에서, 레피노탄이 건강한 대상체 및 발작 또는 두개뇌 외상 후의 환자들에게서 양호한 내성을 나타내었다. 추가적으로, 현재의 임상 데이타로부터 신경계 및 기능적 결손 (징후에 따라 각각 3 내지 6 개월 후)을 호전시키는 것이 가능하다는 사실이 나타났다. 특히 혈장 농도가 약 5-20 ㎍/l의 범위에 도달한 환자들의 경우, 위약을 투여한 환자들에서보다 치료 결과가 현저히 양호하였다.

본 발명에 따른 키트, 즉 레피노탄 또는 생리학적으로 허용가능한 레피노탄의 염을 포함하는 제약 조성물 및 체액 중의 레피노탄 및 그의 대사물 농도를 측정하는 수단을 포함하는 키트를 사용하여 특히 양호한 치료 결과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 키트의 사용으로, 활성 화합물로서 유리 염기 또는 산 부가 염 형태의 레피노탄을 포함하는 의약을 투여하는 것이 가능하고, 단 시간 내에 치료받은 환자의 체액 중의 레피노탄 및 그 대사물의 실제 농도를 측정하는 것이 가능하다. 따라서 임의로는 최적 요법을 위해 필요한 투여량 조절을 시간 지연 없이 인력과 장치에 관하여 적은 비용으로 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 키트는 신경퇴행성 질환, 특히 발작 및 두개뇌 외상의 신속한 치료에 있어서 현저한 진보성을 나타낸다.

본 발명에 따른 키트에 포함되는 제약 조성물의 예에는 정제, 코팅된 정제, 환제, 과립제, 에어로졸, 시럽, 유액, 현탁액, 용액 또는 재구성되어 용액을 제공할 수 있는 동결건조물이 존재할 수 있다. 활성 화합물로서, 제약 조성물은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염을 함유한다. 활성 화합물은 총 혼합물의 대략 0.05 내지 95 중량％, 바람직하게는 약 0.5 내지 90 중량％의 농도,즉 지시된 투여량 범위를 달성하기에 충분한 양으로 제약 조성물에 존재할 것이다. 활성 화합물에 추가적으로, 제약 조성물은 추가로 불활성이고 무독성인 제약학적으로 적합한 부형제를 함유한다.

레피노탄은 하기 화학식을 갖는다.

생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염은 광물산, 카르복실산 또는 술폰산 염일 수 있다. 바람직한 레피노탄의 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 나프탈렌디술폰산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 또는 벤조산과의 레피노탄의 염이 있다. 특히 레피노탄 히드로클로라이드가 바람직하다.

부형제의 선택은 제형화 수단에 따른다. 예를 들어, 언급될 수 있는 부형제에는 물, 무독성 유기 용매, 예컨데 파라핀 (예를 들어, 페트롤륨 분획), 식물성 오일 (예를 들어, 땅콩/참깨 오일), 알콜 (예를 들어, 에틸 알콜, 글리세롤), 담체, 예컨데 분말화시킨 천연 광물 (예를 들어, 카올린, 점토질 토양, 활석, 백악), 분말화시킨 합성 광물 (예를 들어, 고도로 분산된 규산, 규산염), 당 (예를 들어, 수크로스, 락토스 및 덱스트로스), 유화제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 알콜 에테르), 분산제 (예를 들어, 리그닌 술피트 폐액, 메틸셀룰로스, 전분 및 폴리비닐피롤리돈), 및 윤활제 (예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 활석, 스테아르산 및 황산 나트륨)가 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 키트는 제약 조성물로서 활성 화합물을 함유하는 주입 용액을 포함하거나, 또는 물이나 등장성 전해질 용액의 첨가로 상기 주입 용액을 제조해낼 수 있는 고체 제약 조성물을 포함한다.

바람직한 고체 제약 조성물의 예에는 물이나 등장성 전해질 용액을 첨가하여, 예컨데 주입 용액으로 재구성될 수 있는 동결건조물이 있다. 동결건조물에서 활성 화합물은 증가된 저장 안정성을 갖고, 예컨데 주입 용액과 같이 환자에게 직접 사용하기 적합한 입자-무함유 용액을 동결건조물로부터 멸균 조건 하에 제조하는 것이 쉽고 신속하게 가능하다. 활성 화합물에 추가적으로, 동결건조물은 유리하게는 제약학적으로 허용되는 부형제, 특히 매질 형성제를 추가로 함유한다.

본 발명의 의미 내에서매질 형성제는 글리신, 알라닌 또는 아스파르트산과 같은 아미노산; 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민과 같은 펩티드; 글루코스 또는 락토스와 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로스 또는 트레할로스와 같은 디사카라이드; 시클로덱스트린 또는 말토덱스트린과 같은 올리고사카라이드; 전분, 전분 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체와 같은 폴리사카라이드; 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체성 매질 형성제; 염화 나트륨 또는 탄산 칼슘과의 염; 만니톨, 소르비톨 또는 자일리톨과 같은 당 알콜이 있다. 만니톨, 염화 나트륨, 글리신, 수크로스, 말토스 및 락토스가 바람직하다. 만니톨이 매우 특히 바람직하다.

동결건조물이 재구성되어 주입 용액을 형성하는 경우, 유리하게는 이 주입용액은 등장성이다. 이미 충분한 양의 전해질, 예컨데 염화 나트륨, 만니톨 또는 글루코스를 함유하는 동결건조물, 또는 용액의 재구성 및 희석에 사용되는 등장성 전해질 용액에 의해 달성할 수 있다.

예를 들어,등장성 전해질 용액에는 0.9 중량％ 염화 나트륨 수용액 또는 5 중량％ 글루코스 수용액이 있다.

주입 용액 중 활성 화합물의 양은 대략 0.1 ㎍/ml 내지 1 mg/ml 이고, 바람직하게는 약 0.5 내지 5 ㎍/ml일 것이다.

레피노탄 및 레피노탄 염의 제조는 유럽 특허 공개 제 0 352 613호에 기술되어 있다. 레피노탄 히드로클로라이드는 상기 문헌의 실시예 92H와 일치한다.

추가적으로, 본 발명에 따른 레피노탄 염은 유리 염기 레피노탄을 적합한 용매 중에서 화학양론적 양 또는 화학양론적 양 이상의 산과 반응시켜 산 기재의 염을 0℃ 내지 용매의 비점까지의 온도 범위 내에서 수득할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용매에는 물; 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올과 같은 지방족 알콜; 디에틸 에테르, tert-부틸 메틸 에테르, 디옥산, 테트라히드로푸란과 같은 지방족 개방 쇄 또는 시클릭 에테르; 2-프로파논, 2-부타논과 같은 지방족 케톤; 또는 그의 혼합물이 있다. 레피노탄 염은 이러한 혼합물로부터 고체로서 직접적으로, 임의로는 부분적으로 또는 완전히 용매를 증발시킨 후에 수득되고; 예를 들어, 재결정화, 또는 상기 언급된 용매 중 또는 그의 혼합물 중의 재침전으로 레피노탄 염을 정제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트의 제약 조성물이 레피노탄과 그 염의 혼합물 또는 다양한 레피노탄 염의 혼합물을 함유할 수 있다.

레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 그의 염을 공지된 방법으로 통상적인 제형, 예컨데 정제, 코팅된 정제, 환제, 과립제, 에어로졸, 시럽, 유액, 현탁액 및 용액으로 불활성이고 무독성인 제약학적으로 적합한 비히클 또는 용매를 사용하여 전환시킬 수 있다. 바람직한 활성 화합물 용액 또는 고체 제약 조성물은 예를 들어 동결건조물과 같은 용액으로 전환될 수 있는 것들이다. 각각의 경우에, 치료학적 활성 화합물은 총 혼합물의 대략 0.05 내지 95 중량％의 농도, 바람직하게는 대략 0.5 내지 90 중량％의 농도, 즉 지시된 투여량 범위를 달성하기에 충분한 양으로 존재할 것이다.

예를 들어, 활성 화합물을 용매 및(또는) 부형제로 확장하여 적절할 경우 현탁제 및(또는) 분산제를 사용하여 제형을 제조하는데, 여기서 예를 들어, 희석제로서 물을 사용하는 경우에 보조 용매로서 유기 용매를 임의로 사용하는 것이 가능하다.

추가적으로, 본 발명에 따른 키트는 체액 중의 레피노탄 또는 그의 대사물 농도를 측정하는 수단을 포함한다.

분석물로서, 사용되는 활성 화합물 대신 레피노탄의 대사물을 측정하는 것이 유리할 수 있다. 레피노탄의 대사물이 기재되어 있다.

본 발명의 의미 내에서체액의 예에는 요, 혈액 및 혈액으로부터 얻어지는 분획, 예컨데 혈청 또는 혈장이 있다. 혈액 및 혈액으로부터 얻어지는 분획이 바람직하며, 혈장이 특히 바람직하다.

혈중 또는 혈액으로부터 얻어진 분획, 바람직하게는 혈장 중 레피노탄의 농도를 측정한다.

농도 측정을 위한 적합한 수단의 예에는 임의로 질량 분석기 (LC-MS 또는 GC-MS)와 커플링될 수 있는 크로마토그래피성 장치, 예컨데 액체 또는 기체 크로마토그래피가 있다. 또한, 예를 들어 면역학적 방법, 예컨데 ELISA (효소-결합 면역흡착 검사)에 따라 작용하는 수단이 적합하다. 상기 유형의 수단은 공지되어 있다.

특히 적합한 수단은 치료 부위 (임상 또는 치료 지점 검사)에 사용될 수 있는 방법인데, 이 방법으로 임의로는 최적 요법을 위해 필요한 투여량 조절을 시간 지연 없이 수행할 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 키트에서 바람직한 수단은 국제 공개 번호 99/46591에 개시된 분석물 농도 측정을 위한 장치이다. 상기 장치는 상기 문헌에 기재된 방법에 따라 제작하고 사용할 수 있고, 임의로는 최적 요법을 위해 필요한 투여량 조절을 시간 지연 없이 인력 및 장치에 관하여 적은 비용으로 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 신경퇴행성 질환, 특히 발작 또는 두개뇌 외상의 신속한 치료에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 제약 조성물을 종래의 방식으로 투여하는데, 바람직하게는 경구 또는 비경구적으로 투여하고, 특히 설하 또는 정맥 내에 투여한다. 경구 투여의 경우, 언급된 부형제와 별도로 첨가제, 예컨데 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘 및 인산 디칼슘과 다양한 추가 물질, 예컨데 전분, 바람직하게는 감자 전분, 젤라틴 등이 함께 정제에 함유될 수 있다. 윤활제, 예컨데 스테아르산 마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석이 추가적으로 정제화에 사용될 수 있다. 수현탁액의 경우에는 상기 언급된 부형제와 별도로 다양한 향미 증진제 또는 착색제로 활성 화합물을 처리할 수 있다. 비경구 투여의 경우, 활성 화합물 용액을 적합한 액상 담체 물질을 사용하여 이용할 수 있다.

일반적으로, 정맥내 투여의 경우 효과적인 결과를 달성하기 위하여 대략 0.01 ㎍/kg/h 내지 10 ㎍/kg/h (시간 당 체중 kg당 ㎍ 또는 mg)의 양, 바람직하게는 대략 0.05 ㎍/kg/h 내지 2 ㎍/kg/h의 양으로 활성 화합물을 투여하는 것이 유리하다고 증명되었다. 각각의 경우, 투여는 개별 투여량의 형태로 수행될 수 있다.

경구 투여의 경우에서 활성 화합물의 일일 투여량은 0.001 내지 0,2 mg/체중kg이고, 바람직하게는 10 내지 100 ㎍/체중kg이다.

상기와 같음에도 불구하고, 적절할 경우, 즉 체중 또는 투여 경로 유형, 약품에 대한 개별적 반응, 제형화 방식 및 투여하는 횟수 또는 간격에 따라서 언급된 양에서 벗어나는 것이 필요할 것이다. 따라서, 몇몇 경우에 있어서 상기 언급된 최소량 이하로 처리하는 것이 적절할 반면, 다른 경우에 있어서는 언급된 상한선을 초과해야만 할 것이다. 상대적으로 다량을 투여하는 경우에 있어서는, 하루에 걸쳐서 수 회의 개별 투여량으로 나누는 것이 현명할 것이다.

치료학상으로 가장 바람직한 레피노탄의 농도로 환자를 안정시키기 위해, 정의된 초기 레피노탄 투여량을 환자에게 투여하고, 고정되고 미리 결정된 시간 후에 본 발명에 따른 수단을 사용하여 레피노탄 농도를 체크하고 이어서 추가 투여량을임의로 조절한다.

예를 들어, 레피노탄 히드로클로라이드를 함유하는 용액을 환자에게 레피노탄 1.25 mg/일의 비율로 주입하였다. 6 시간 후에, 본 발명에 따른 수단을 사용하여 레피노탄 혈장 농도가 약 17 ㎍/l 이상 또는 이하인가를 측정할 수 있다. 레피노탄 혈장 농도가 지시된 역치 농도 이하이면, 지시된 비율로 계속해서 주입한다. 그러나, 레피노탄 혈장 농도가 지시된 역치 농도를 초과하면, 주입 비율을 레피노탄 0.5 mg/일로 감소시킨다. 주입 개시 12 시간 후에, 레피노탄 혈장 농도를 추가 횟수로 체크한다. 레피노탄 혈장 농도가 약 17 ㎍/l 이하이면 다시 주입 비율을 유지하고, 레피노탄 혈장 농도가 약 17 ㎍/l를 초과하면 레피노탄 0.625 내지 0.25 mg/일로 주입 비율을 감소시킨다. 이러한 방식으로, 최대 수의 환자에게 레피노탄 혈장 농도를 약 5 내지 20 ㎍/l의 바람직한 치료학상 투여량 범위로 유지하는 것이 가능하다.

추가 관점에서, 본 발명은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 그의 염 및 생리학적으로 허용되는 산을 함유하는 고체 제약 조성물에 관한 것이다.

놀랍게도 생리학적으로 허용되는 산의 첨가로 레피노탄 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염을 함유하는 고체 제약 조성물의 저장 안정성이 증가한다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 의미 내에서생리학적으로 허용되는 산에는 예를 들어 말산, 아스파르트산, 아스코르브산, 벤조산, 숙신산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 글루탐산, 글리콜산, 히푸르산, 말레산, 락트산, 황산, 소르브산, 타르타르산 또는 신남산이 있다. 말산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 락트산 및 타르타르산이 바람직하다. 시트르산 및 타르타르산이 특히 바람직하다.

특히 활성 화합물, 즉 레피노탄 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염이 조성물 총량의 0.01-15 중량％를 구성하고, 생리학적으로 허용되는 산이 조성물 총량의 0.5-15 중량％를 구성하는 고체 제약 조성물로 본 발명에 따른 작용이 달성된다.

레피노탄 히드로클로라이드 및 시트르산이나 타르타르산을 함유하는 고체 제약 조성물이 본원에서 매우 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 고체 제약 조성물을 종래의 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 추가 관점은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 그의 염, 및 생리학적으로 허용되는 산을 함유하는 동결건조물에 관한 것인데, 바람직한 활성 화합물은 레피노탄 히드로클로라이드이고, 산은 말산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 락트산 및 타르타르산, 특히 시트르산 및 타르타르산이다. 추가적으로는, 동결건조물이 유리하게는 제약학적 부형제, 예컨데 상기 언급된 매질 형성제를 함유할 수 있다.

동결건조물을 제조하기 위해, 예를 들어 레피노탄 또는 레피노탄 염, 생리학적으로 허용되는 산 및 임의로 추가 제약학적 부형제의 상기 언급된 양을 물 및(또는) 다른 적합한 용매에 용해시키고 멸균시키고 적합한 용기에 채우고 동결-건조시킨다.

본 발명의 의미 내에서 적합한 용매의 예에는 빙초산 또는 tert-부탄올이 있다.

통상적으로 5 내지 35℃의 온도, 바람직하게는 20 내지 25℃의 온도에서 용액을 제조할 수 있다. 본 발명의 의미 내에서 용액을 멸균 시키는 것은 용액을 멸균 상태로 전환하는 것을 의미하고, 예를 들어 적합한 필터제, 예컨데 폴리에테르 술폰 또는 나일론 6.6으로 제작된 최대 동공 폭 0.2 ㎛의 필터를 통하여 멸균 여과하는 것을 의미한다.

동결 건조를 위한 적합한 용기의 예에는 취입 성형된 유리용기 또는 관유리병이 있다. 용액의 분배 부피는 0.2 ml 내지 20 ml이고, 바람직하게는 0.5 ml 내지 5 ml이고, 특히 바람직하게는 0.7 ml 내지 3.0 ml이다.

용액을 용기 내에서 동결-건조시킨다. 이것을 위하여, 용액을 포함한 용기를 예비냉각되거나 또는 예비냉각되지 않은 선반 플레이트에 놓고 동결시킨다. 그 후 주요 건조를 진공 하에 챔버 압력 0.05 mbar 내지 1.8 mbar에서 선반 플레이트 온도 -40℃ 내지 +60℃에서 수행한다. 이 후의 건조를 챔버 압력 1 μbar 내지 1.8 mbar에서 선반 플레이트 온도 -20℃ 내지 +70℃에서 수행한다.

별법으로, 동결-건조 방법을 국제 출원 PCT/EP00/07034에 기재된 방법으로 수행할 수 있다. 상기 언급된 조성물의 저장-안정성 동결건조물을 동결 건조 방법으로 형성한다.

추가적으로 본 발명은 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염, 및 말산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 락트산 및 타르타르산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산, 바람직하게는 시트르산 또는 타르타르산을 함유하는 주입 용액에 관한 것이다.

본 발명에 따른주입 용액은 예상외로 높은 저장 안정성을 나타낸다.

본 발명의 의미 내에서 주입 용액은 용매로서 주로 물을 함유하고, 일반적으로 250 내지 500 mOsmol/kg 범위의 삼투 몰농도, 바람직하게는 280 내지 350 mOsmol/kg 범위의 삼투 몰농도를 갖는 용액이다. 예를 들어, 염화 나트륨, 만니톨 또는 글루코스의 필요량이 이미 고체 제약 조성물의 일부이고 그것을 물로 재구성하고(하거나) 희석하거나 상기 물질의 필요량을 재구성/희석 매질과 함께 첨가하여 상기 언급된 주입 용액의 삼투 몰농도를 달성할 수 있다. 일반적으로, 주입 용액 중 레피노탄 농도는 용액 중 레피노탄의 0.1 내지 500 ㎍/ml이고, 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎍/ml이다. 주입 용액은 충분한 산을 함유하여 20℃에서 pH가 3.5 내지 5이고, 바람직하게는 대략 4이다.

일반적으로, 상기 용액을 실온에서 가한다.

작용 실시예

실시예 1 : 레피노탄 히드로클로라이드 함유 조성물의 동결건조물

레피노탄 히드로클로라이드 55 mg (레피노탄 50 mg에 상응함), 만니톨 20 g 및 시트르산 3.7 g의 혼합물을 물 1000 ml를 사용하여 제조하였다. 이 수용액을 폴리에테르 술폰으로 제작된 최대 동공 폭 0.2 ㎛의 필터를 통하여 멸균-여과하고 관유리병 내에 분배시켰다. 용액의 분배 부피는 1 ml이었다.

상기 용액을 관유리병에서 동결-건조시켰다. 이것을 위하여, 실온에서 용액을 함유하는 관유리병을 동결 건조기의 선반 플레이트에 놓고 -40℃로 동결하였다.그 후 주요 동결을 진공 하에 챔버 압력 0.2 mbar 하에 선반 플레이트 온도 0℃에서 수행하였다. 이 후 동결을 챔버 압력 10 μbar에서 선반 플레이트 온도 40℃에서 수행하였다. 저장-안정성의 최종 생성물을 동결 건조로 형성하였다.

별법으로, 동결 건조를 국체 출원 PCT/EP00/07034에 기재된 방법으로 수행할 수 있다.

실시예 1에 기재된 방법과 유사하게, 각각 0.25 g, 0.625 g, 1.25 g 및 2.5 g의 레피노탄에 상응하는 0.27 g, 0.681 g, 1.36 g 및 2.73 g의 레피노탄 히드로클로라이드를 함유하는 동결건조물을 실시예 1에 사용된 만니톨, 시트르산의 양으로 제조하였다.

실시예 2 : 레피노탄 히드로클로라이드 함유 주입 용액

실시예 1에 따른 동결-건조 생성물을 0.9 중량％ NaCl 용액의 도움으로 재구성한 후에 이 용액을 총 부피 500 ml로 희석하여 동결건조물로부터 즉시-사용 가능한 주입 용액을 제조하였다. 즉시-사용 가능한 용액은 30 시간 이상 실온에서 저장할 때 화학적으로 안정하였는데, 즉 그 후에 용액은 90％ 이상 불변 레피노탄을 여전히 함유하였다.

실시예 3 : 미세적정 (microtitre) 플레이트 상의 ELISA로 레티노탄 측정

이 검사를 경쟁적 ELISA에 근거하여 수행하였다. 특히 레피노탄의 화학적 구조에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 Fab 또는 Fab2 단편의 일정량 및 레피노탄-함유 샘플의 일정 부피와 레피노탄과 유사한 합텐의 단백질 접합체를 반응시켰다. 이어서, 유리 단백질 접합체에 결합되는 비율로부터, 조사하고자 하는 샘플 중 공지된 레피노탄 농도를 이용하여 평행하게 플롯팅된 검정 곡선으로 레피노탄의 농도를 측정하는 것이 가능하다.

염소 IgG를 하기 언급되는 레피노탄 유사체에 1:7.5의 몰비로 화학적으로 연결시켰다. 이 접합체를 미세적정 플레이트 (예를 들어, 디넥스 이뮬론 (Dynex Immulon) 2HB) 중 0.1M 탄산 나트륨 완충액 pH = 9.6 중에서 37℃ 하에 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후에 인산염-완충 카세인-함유 (1％) 식염수를 사용하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 멈췄다. 이 후에, 트윈-함유 (0.05％) 인산염-완충 식염수로 3회 세척하였다.

이제, 상기 방법으로 제조된 플레이트 상에서 경쟁적 검사를 수행할 수 있다. 이것을 위하여, 샘플 100 ㎕를 미세적정 웰에 도입하고, 항체 용액 (인산염-완충 식염수 중의 마우스 항-레피노탄 항체 10 ng/ml) 100㎕로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액 (상기 참조)으로 3회 세척한 후에, 추가 2차 반응에서, 홍당무과 퍼록시다제에 커플링된 항체 (1:1; 효소적 염소-항-마우스 IgG; 1:1000로 희석됨)를 미세적정 웰에 피펫팅하였다. 이것은 레피노탄-특이적 마우스 항체가 레피노탄-유사 합텐 접합체에 결합한 것에 결합한다. 상기 방법으로 결합하는 레피노탄-특이적 마우스 항체의 양은 샘플 중 유리 레피노탄의 양에 간접적으로 비례한다. 3회 세척하여 과량의 항체-효소 접합체를 씻어내고, 효소 기질 (TMB)을 첨가한 후에, 결합된 잔량을 속도학적 측정 방법으로 광학적으로 측정한다. 나타낸 프로토콜을 이용하여, 1 내지 100 ng/ml의 레피노탄 농도를 적절한 검정기를 이용하여 측정할 수 있다.

실시예 4 : 치료 지점 레피노탄 검사

이 레피노탄 검사는 집중 치료의 범주 및 다른 병원의 범주에서 전혈, 혈청 또는 혈장 중 대략 17 ng/ml의 정의된 역치 농도 이상 및 이하의 레피노탄 농도 측정을 위하여 사용되기 위한 것이다. 이것은 시각적 해독을 하는 일회성 검사이다.

장치의 정의

상기 검사는 상기 정의된 소 분자를 측정하기 위한 경쟁적 면역학적 방법에 근거한다. 밝혀진 메카니즘에 따라서, 효소 분광학적 방법 대신 콜로이드성 금 입자로부터 반사되는 신호를 사용하였다. 종래의 면역검사법을 수행하기 위해 필수적인 모든 필요한 검사 성분 및 기계적 조작을 플라스틱 소자로 통합하였다. 이것은 혈청으로부터 혈액 세포를 분리하는 메카니즘 및 이러한 방법으로 분리된 혈장의 특정량을 정획히 측정하는 메카니즘을 포함한다. 완충액 저장 용기에는 반응에 필요한 액체가 포함되는데, 이 액체는 시스템 내에서 모세관 작동을 가능하게 만든다. 항-레피노탄 항체 및 합텐-염소 IgG-금 접합체를 플라스틱 소자의 반응 셀에서 동결건조시켰다. 모세관 말단의 혼합 챔버 및 면역색분석 검사 스트립으로 시스템을 완성한다. 고정된 반응 구역을 검사 스트립: 당나귀 항-마우스 항체 및 토끼 항-염소 항체에 적용하였다.

레피노탄의 부재 하에서, 당나귀 항-마우스 항체는 금 접합체의 현저한 부분에 트랩되어 적색 구역을 형성한다. 조사하고자 하는 샘플 중 레피노탄 농도를 증가시키면, 항-레피노탄 항체에 비례적으로 대체된 금 접합체가 토끼 항-염소 반응에서 트랩된다.

면역색분석 검사 스트립의 말단은 수용성 염료를 적용하는 흡수 구역의 시작이다. 이 염료는 액체 정면으로 이동하고 흡수 구역 말단으로 이동한다. 이것은 검사 반응 말기에 나타난다.

검사 지속 시간은 샘플을 적용하는 것으로부터 결과를 읽는 것까지 약 15분이다. 상기 검사를 전혈 100-150 ㎕로 수행하는데, 이것은 혈청 약 15 ㎕ 생성을 보장한다.

하기 반응 성분이 상기 검사 소자의 제작에 필요하다.

a) 모노클로날 항-레피노탄

b) 금-레피노탄 유사체-염소 IgG 접합체

c) 콜로이드성 금, 20 nm

d) 니트로셀룰로스 막

e) 염소 항-마우스

f) 토끼 항-염소

g) 레피노탄 기준물

h) 인산염-완충 식염수 분석 완충액 중 0.2％ 트리톤 X 305

i) 인산염-완충 동결건조 완충액 중 0.4％ 노니데트 (Nonidet) P-40, 2％ BSA, 2.5％ 수크로스, 1.25％ 트레할로스

j) 2.5 cm 침강제

k) 플라스틱 백킹, 5.3 cm 폭 8 mil. 두께

l) 인간 혈청

검사 절차

전혈, 혈청 또는 혈장 약 150 ㎕ (5 방울)를 샘플 플레이트에 놓는다. 이 소자를 수평 위치에 약 3분 동안 보관한다. 그 후에, 첨가 플라스크의 손잡이를 플라스크가 소자의 바닥에 평평하게 놓일 때까지 90도 회전시킨다. 그 후 소자를 실온에서 수평 위치에 약 15분 동안 보관한다. 청색점이 지시 창에 나타나면, 상기 분석을 마치고 그 결과를 읽을 수 있다.

샘플 적용 및 첨가 플라스크의 조작과 별도로, 샘플 또는 소자의 추가 조작은 분석 전체를 수행하는 동안 필요하지 않다. 따라서, 비전문 인력도 이 검사를 수행할 수 있다.

결과 해석

국제 공개 번호 99/46591에 기재된 바와 같이, 창 A 및 B에 2개 밴드의 강도를 비교하여 레피노탄 농도의 간단한 반-정량적 측정이 가능하다. 창 A에서의 신호가 창 B에서의 신호보다 강하면, 레피노탄 농도는 특정 역치 값 이상이고, 반대 강도 분포의 경우에는 특정 역치 값 이하이다. 동결건조물 중의 항-레피노탄 항체 농도 및 금-레피노탄 유사체-염소 IgG 농도의 비로 역치 값을 측정할 수 있다.

금-레피노탄 유사체-염소 IgG 접합체 중 레피노탄 유사체는 하기 화학식의화합물이다.

상기 화합물은 신규하고 유럽 특허 출원 제 0 352 613호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있고, 예를 들어 레피노탄과 tert-부틸 6-브로모-헥산카르복실레이트를 염기의 존재 하에 적합한 용매 중에 반응시킨 후에 산성 에스테르 절단으로 제조할 수 있다.

Claims (19)

1. a) 레피노탄 및(또는) 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염을 함유하는 제약 조성물, 및

   b) 체액 중의 레피노탄 또는 그의 대사물 농도 측정을 위한 수단을 포함하는 키트.
2. 제1항에 있어서, 제약 조성물이 레피노탄 히드로클로라이드를 함유하는 키트.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈액 중 또는 혈액으로부터 얻은 분획 중의 분석물 농도 측정을 위한 수단을 포함하는 키트.
4. 제3항에 있어서, 혈장 중의 분석물 농도 측정을 위한 수단을 포함하는 키트.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수단이 면역학적 방법에 따라 작용하는 키트.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수단이 치료 부위에 사용될 수 있는 키트.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환의 신속한 치료를 위한 것인 키트.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발작 또는 두개뇌 외상의 신속한 치료를 위한 것인 키트.
9. 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염, 및 생리학적으로 허용되는 산을 함유하는 고체 제약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 활성 화합물의 중량 비율이 0.01 내지 15 중량％이고, 산의 중량 비율이 0.5 내지 15 중량％인 고체 제약 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 활성 화합물로서 레피노탄 히드로클로라이드를 함유하고 산으로서 시트르산 또는 타르타르산을 함유하는 고체 제약 조성물.
12. 활성 화합물, 산 및 추가 제약학적 부형제를 물 및(또는) 다른 적합한 용매에 용해시키고, 생성된 용액을 임의로 멸균시킨 후에 용액을 동결건조시키는 것을 포함하는, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 고체 제약 조성물의 제조 방법.
13. 제12항 기재의 방법으로 수득할 수 있는 고체 제약 조성물.
14. 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염, 및 말산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 락트산 및 타르타르산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산을 함유하는 주입 용액.
15. 제14항에 있어서, 산이 시트르산 또는 타르타르산인 주입 용액.
16. 제13항 기재의 고체 제약 조성물에 물 또는 등장성 전해질 용액을 첨가하는 것을 포함하는, 레피노탄 또는 생리학적으로 허용되는 레피노탄의 염, 및 말산, 피루브산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 락트산 및 타르타르산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산을 함유하는 주입 용액의 제조 방법.
17. 제16항 기재의 방법에 따라 수득할 수 있는 주입 용액.
18. 주입 용액의 제조를 위한 제13항에 따른 고체 제약 조성물의 용도.
19. 화학식의 화합물.