KR20030086779A - 테나신 타입ⅲ 3 절편을 이용한 신경세포 부착능 향상 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 이용한 신경세포 부착능 향상 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법 또는 신경세포를 재생하는 방법 및 상기 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관에 관한 것이다. 본 발명의 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 이용한 신경세포 부착방법은 신경세포의 증식 또는 재생에 응용할 수 있고, 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관은 신경세포 부착능이 향상되어 신경세포 재생능을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 이용한 신경세포 부착능 향상 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법 또는 신경세포를 재생하는 방법 및 상기 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관에 관한 것이다.
테나신(tenascin)은 ECM(extracellular matrix) 단백질의 하나로 초기 배 발생 시기에 상피-간엽(epithelial-mesenchymal) 전환 및 세포 이동과 함께 발현된다(Crossin et al., Tenascin and other counteradhesive molecules of the ECM, 1996, 23-46). 테나신은 이차 신경세포형성 지역 및 세포 이동 지역을 제외하고는 발현이 차츰 줄어든다(Miragall, et al.,J. Neurocytol.1990, 19, 899-914; Gates et al.,J. Comp. Neurol. 1995, 361, 249-266; Faissner, Tenascin and other counteradhesive molecules of the ECM, 1996, 47-87). 테나신 단백질은 CNS 발생동안에 성상세포에서 합성되고(Bourdon et al.,Cancer Res. 1983, 43, 2796-2805; Prieto et al.,J. Cell. Biol. 1990, 111, 663-678; Grierson et al.,Dev. Brain Res. 1990, 55, 11-19). 이들의 발현은 반응성 성상세포에서 증가한다(Laywell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89, 2634-2638).
테나신은 EGF(epidermal growth factor), 피브로넥틴 타입Ⅲ 반복(repeat) 및 피브로노젠(fibronogen)과 상동성 있는 도메인으로 구성되어 있다(Jones et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1990, 87, 6497-6501). 피브로넥틴 타입Ⅲ 3 반복은 RGD 트리펩타이드 서열을 포함하고 있고, αvβ3, αvβ6, α2β1 및 α9β1을 포함하는 여러 인테그린(integrin)을 통하여 세포들과 상호작용한다(Prieto et al.,J. Cell. Biol. 1992, 119:663-678; Prieto et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1993, 90:10154-10158; Joshi et al.,J. Cell. Sci.1993, 106:389-400; Sriramaro et al.,J. Cell. Sci.1993, 105:1001-1012; Yokosaki et al.,J. Biol. Chem. 1994, 269:26691-26696; Phillips et al.,CellAdhes. Commun. 1995, 3:257-271; Gotz et al.,J. Cell. Biol. 1996, 132:681-699; Dorries et al.,J. Neurosci. Res.1996, 43:420-438). 피브로넥틴 타입Ⅲ 6 반복은 β1 인테그린과 상호작용하고(Phillips et al.,Cell Adhes. Commun. 1995, 3:257-271), 중추 또는 말초 신경의 일차 배양으로부터 뉴라이트(neurites)의 연장을 촉진한다(Phillips et al.,Cell Adhes. Commun. 1995, 3:257-271; Gotz et al.,J. Cell Biol. 1996, 132:681-699; Dorries et al.,J. Neurosci. Res. 1996, 43:420-438). 피브로넥틴은 면역글로블린 수퍼패밀리인 컨택틴(contactin), 세포 표면 아넥신Ⅱ, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 세포 표면 형태 및 피브로넥틴, 콜라젠, 프로테오글리칸과 같은 ECM 단백질과 결합한다(Zisch et al.,J. Cell Biol. 1992, 119:203-213; Weber et al.,J. Biol. Chem.1995, 270:4619-4623; Chung and Erickson,J. Cell. Biol. 1994, 126:539-548; Grumet et al.,J. Biol. Chem.1994, 269:12142-12146; Crossin et al., Tenascin and other counteradhesive molecules of the ECM, 1996, 23-46).
신경결손이 있는 경우 그 기능의 회복을 위해서는 우선 신경조직의 연속성이 복원되어야 하는데, 이러한 목적의 신경재건술은 수술현미경의 발전과 함께 현저히 발전되었고, 신경이식술이 소개되면서 활기를 띠게 되었다. 결손된 신경의 수복 물질로는 자가신경이식이 많이 사용되지만, 그 기능의 회복에 있어서는 임상적으로 그 결과가 매우 다양하여 아직도 완전하다고 할 수 없다. 이러한 자가 신경 대체물질로서 요즈음은 인공신경을 이용한 신경재건이 시도되고 있는데, 여기에는 결손된 신경조직을 연결하고 신경섬유를 재생하는 통로 역할을 하는 생체재료학적 방법, 신경의 재생을 촉진하고 그 환경을 양호하게 하고자 겔이나 향신경성인자를 사용하는 방법 또는 세포의 이용 등 조직공학(tissue-engineering)적인 접근 방법이 시도되고 있다.
또한, 자가 신경을 대신할 이러한 인조신경을 만드는 데 있어서 생체재료학적 방법 및 조직기법을 혼용하여 다공성의 흡수성 재료를 말초신경의 포관 형태로 만들고 여기에 엑손(axon)의 재생을 촉진하는 신경재생관을 사용할 수 있으나, 인위적으로 만든 신경도관에 신경세포가 잘 부착하지 않는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 신경도관에 신경세포가 잘 부착할 수 있도록 하는 폴리펩타이드를 찾아내고, 상기 폴리펩타이드를 신경재생에 유리한 도관에 코팅하였을 때 신경세포의 부착능이 향상됨을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다
본 발명의 목적은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법, 신경세포를 재생하는 방법 및 상기 폴리펩타이드가 코팅된 신경도관을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에서 제조한 발현벡터에서 테나신 타입Ⅲ 3(레인 2), 테나신 타입Ⅲ 5(레인 3) 및 타입Ⅲ 3-5(레인 4) 단백질이 발현되는 것을 쿠마지 블루로 확인한 사진이고,
도 2는 테나신 타입Ⅲ 3 절편, 테나신 타입Ⅲ 5 절편 또는 타입Ⅲ 3-5 절편의 신경세포 부착능을 분석한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 재생하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법 및 신경세포를 재생하는 방법을 제공한다.
본 발명의 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드는서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 상기 아미노산 서열의 수식(modification)된 형태를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 상기서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 전체 또는 일부를 사용할 수 있고, 상기 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드도 가능하다. 또한,서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 반복하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서, 테나신 타입Ⅲ 3 절편의 신경세포 부착능은 테나신 타입Ⅲ 5 절편의 신경세포 부착능보다 높고, 또한, 테나신 타입Ⅲ 3 절편만을 사용했을 때의 신경세포 부착능이 테나신 타입Ⅲ 3-5 절편을 사용했을 때의 신경세포 부착능 보다 높은 것을 알 수 있다(도 2참조). 따라서 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드는 신경세포의 부착능을 향상시키고, 신경세포의 부착능이향상됨에 따라 신경세포의 재생이 촉진된다.
또한, 본 발명은 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관을 제공한다.
본 발명의 신경도관은 콜라겐, 알긴산, 키토산, 치아인회석 및 PHBV 등의 생체 흡수성 물질들의 혼합물을 이용하여 제조될 수 있고, 상기와 같은 재료로 제조된 신경도관에 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 코팅하여 신경세포의 부착능을 향상시켰다. 본 발명의 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드가 코팅된 신경도관은 신경세포의 재생을 촉진하여 신경세포 재생을 위한 재료로 유용하게 사용된다.
본 발명의 테나신 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드는서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 상기 아미노산 서열의 수식(modification)된 형태를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 상기서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 전체 또는 일부를 사용할 수 있고, 상기 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드도 가능하다. 또한,서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 반복하여 사용할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 발현벡터의 제조
본 발명자들은 테나신 cDNA를 얻기 위하여 성인 인간 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 cDNA를 증폭하였다. PCR 프라이머는 타입 III 모듈을 인식하도록 디자인하여서열번호 1,서열번호 2및서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 합성하였다. PCR은 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 100 ㎍/㎖ 젤라틴, 0.2 mM dNTPs, 1.25 유니트 Taq 중합효소(Perkin-Elmer) 및 50 pmol 프라이머를 포함는 50 ㎕ 반응용액에서 수행하였다. PCR 수행조건은 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 94℃에서 1분으로 하여 30회 반복 수행한 후, 증폭된 cDNA 산물은 Kpn I 및 Hind III로 분해하고, PCR 정제 킷트(QIAGEN, Chatsworth, CA). 뉴클레오타이드 서열은 자동서열분석기(dideoxy terminator cycle sequencing; Applied Biosystems)을 사용하여 삽입된 부분을 확인하였고, NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)의 BLAST 프로그램을 사용하여 GenBank 데이터베이스의 서열과 비교하였다.
PCR 산물은 C-말단에 6X His 태그가 있는 pBAD/His A(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하였다. 폴리-His 태그를 포함하는 TNⅢ3 또는 TNⅢ3-5 융합 단백질을 발현시키고, Ni2+친화 컬럼(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 변성 조건에서 제조회사의 지침에 따라 정제하였다. 세포 분쇄액 및 정제된 융합 단백질은SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis)로 분리하고, 쿠마지 블루(Coomassie Blue) 염색으로 관찰하였다.
그 결과, 테나신 타입Ⅲ 3(레인 2), 테나신 타입Ⅲ 5(레인 3) 및 타입Ⅲ 3-5(레인 4) 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 1).
<실시예 2> 세포 부착 분석
본 발명자들은 대장균에서 발현된 재조합 테나신 단편들을 신경세포의 일종인 PC12세포를 이용하여 테나신 단편들의 부착능을 분석하였다.
PC12 세포주를 24시간 동안 혈청이 고갈된 상태에서 배양한 후, 0.02% 트립신 및 1 mM EDTA가 포함된 DMEM에서 배양하고, 100 g/㎖ 대두 트립신 저해제 및 1% BSA가 포함된 DMEM으로 3회 세척하고, DMEM에 5X104세포/웰로 플레이트하였다. 24 웰 플레이트는 테나신 타입Ⅲ 단백질로 4℃에서 하룻밤 동안 주어진 농도로 코팅하고, 1% BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS로 30분 동안 블록킹한 후, PBS로 세척하였다. 대조군 세포의 현탁은 주어진 시간 동안 BSA 코팅된 플레이트에서 유지하였다. 30분 후에, 37℃에서 부착된 세포는 PBS로 2회 세척하고, 3% 파라포름알데히드(Sigma)로 고정하고, 0.25%(w/v) 크리스탈 바이올렛(Sigma)이 포함된 2%(v/v) 에탄올/물로 염색하였다. 증류수로 세척한 후, 플레이트를 건조시켰다. 흡광도는 570 nm에서 측정하였고, 비특이 부착은 1% BSA를 음성 대조군으로 사용하여 결정하였다.
그 결과, 테나신 타입Ⅲ 3 절편의 신경세포 부착능이 가장 높고, 테나신 타입Ⅲ 5 절편의 신경세포 부착능이 가장 낮았다. 또한, 테나신 타입Ⅲ 3 절편만을 사용했을 때의 신경세포 부착능은 테나신 타입Ⅲ 3-5 절편의 신경세포 부착능 보다 높았다(도 2).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 테나신 타입Ⅲ 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법은 신경세포의 재생 또는 증식에 유용하게 사용될 수 있고, 신경세포 재생을 위한 신경도관에 테나신 타입Ⅲ 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 코팅하여 신경세포의 부착능을 향상시켜 신경세포의 재생을 촉진하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (6)
- 테나신(tenascin) 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 부착하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 수식(modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 테나신(tenascin) 타입Ⅲ 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 신경세포를 재생하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 수식(modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 테나신 타입III 3 절편을 포함하는 폴리펩타이드로 코팅된 신경도관.
- 제 5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 수식(modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관.
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