KR20030082960A - Life attenuated strains of PRRS virus - Google Patents

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KR20030082960A
KR20030082960A KR10-2003-7011656A KR20037011656A KR20030082960A KR 20030082960 A KR20030082960 A KR 20030082960A KR 20037011656 A KR20037011656 A KR 20037011656A KR 20030082960 A KR20030082960 A KR 20030082960A
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Abstract

본 발명은 ORF 2, 3 및 5에 의해서 암호화되는 바이러스 단백질의 특정 부위 상의 핵산 돌연변이에 의해서 약독화되는 약독화된 유럽된 PRRS 생균 바이러스에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 바이러스의 생산 방법 및 상기 PRRS 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법 및 PRRSV 감염의 치료 및 예방용 백신의 제조에서 상기 PRRS 바이러스의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to attenuated European PRRS live virus that is attenuated by nucleic acid mutations on specific sites of viral proteins encoded by ORFs 2, 3 and 5. The present invention also relates to a nucleotide sequence encoding the virus, a method for producing the virus and a method for producing a pharmaceutical composition comprising the PRRS virus and the use of the PRRS virus in the manufacture of a vaccine for the treatment and prevention of PRRSV infection. .

Description

PRRS 바이러스의 약독화된 생균 균주{Life attenuated strains of PRRS virus}Attenuated strains of PRRS virus {Life attenuated strains of PRRS virus}

돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS ; Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)은, 아르테리비리대(arteriviridae) 과[참고 자료 : Snijder E.J., Meulenberg J.J.M., 1998, "The molecular biology of arteriviruses", Journal of General Virology 79(5) : 961-971]의 막이 있는 양성 가닥 RNA 바이러스(enveloped positive-stranded virus)에 의해서 유발된다. 대략 10 내지 15년 전에, 두 개의 다른 PRRS 바이러스 균주가 명백히 독립적으로 미국과 유럽에서 출현하였다. 지금 이 질병은 북미, 유럽 및 아시아의 많은 돼지 생산 국가에서 풍토병이다. 이는 돼지에서 생식능력 감소 및 호흡기 질환의 주요 원인으로 계속되고 있다. 미국에서 감염의 유행은 70%에 이르는 것으로 추정된다.Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) has been described in the Arteririridae and [Article: Snijder EJ, Meulenberg JJM, 1998, "The molecular biology of arteriviruses", Journal of General Virology 79 ( 5): 961-971] is caused by the enveloped positive-stranded virus. Approximately 10-15 years ago, two different PRRS virus strains emerged distinctly independently in the United States and Europe. Now the disease is endemic in many pig producing countries in North America, Europe and Asia. This continues to be a major cause of decreased fertility and respiratory disease in pigs. The prevalence of infection in the United States is estimated at 70%.

상기 바이러스는 호흡, 섭취, 성교, 물린 상처 또는 바늘에 의해서 감염된다. 이는 점막, 폐 또는 국소부위의 대식세포(macrophage)에서 번식한다. 준임상적으로, 상기 질병은 분해 또는 지속적인 감염으로 귀착된다. 지속적으로 감염된 동물은 경구의/인두의 체액, 혈액, 배설물, 소변 및 정액에서 바이러스를 방출한다. 암퇘지에서의 임상학적 증상은 유산, 또는 약하게 태어나는 돼지의 조산성 분만, 사산 돼지 및 자기 분해된 태아와 관련 있다. 감염된 신생아 돼지는 높은 사망률을 보이거나 폐렴에 걸린다. 돼지의 성장 및 이후의 보살핌은 폐렴, 동시적 박테리아 감염 및 증가하는 사망률로 뒤얽혀있다. 수퇘지는 열 및 정액에 형태학적 변형이 있는 경향이 있다.The virus is infected by breathing, ingestion, sexual intercourse, bite wounds or needles. It reproduces in macrophage in the mucous membranes, lungs or local areas. Subclinically, the disease results in degradation or persistent infection. Persistently infected animals release the virus from oral / pharyngeal fluids, blood, feces, urine and semen. Clinical symptoms in sows are associated with miscarriage or preterm delivery of weakly born pigs, stillbirth pigs, and autolyzed fetuses. Infected neonatal pigs have high mortality rates or develop pneumonia. Growth and subsequent care of pigs is intertwined with pneumonia, simultaneous bacterial infections and increasing mortality. Boars tend to have morphological changes in heat and semen.

모든 아르테리바이러스(arteriviruse)와 마찬가지로, PRRS 바이러스 게놈은 15 킬로베이스의 단일의 양성 가닥의 RNA 분자이다. OFR(개방 판독 프레임 : open reading frame)의 1a 및 1b는 레플리카제(replicase)를 암호화하고, OFR의 2 내지 5는 추정적인 당단백질(gp 1 내지 4)을, ORF 6는 막단백질(M)을, ORF 7은 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 암호화한다.Like all arteriviruses, the PRRS viral genome is a 15 kilobase single positive stranded RNA molecule. 1a and 1b of OFR (open reading frame) encode replicas, 2-5 of OFR are putative glycoproteins (gp 1-4), ORF 6 is membrane protein (M) ORF 7 encodes nucleocapsid protein (N).

미국[참고 자료 : WO 93/03760, 미국 메릴랜드 록크빌 소재의 American Type Culture Collection에 1991년 7월 18일자로 기탁된 ATCC VR-2322 분리물, NCBI GeneBank 수탁번호 U 87392 U00153] 및 유럽[참고 자료 : WO 92/21375, 파리의 Institute Pasteur에 1991년 6월 5일자로 기탁된 레리스타드 인자(CDI-NL-2.91) 분리물, 수탁번호 CNCM I-1102 ; NCBI GeneBank 수탁번호 M 96262 [gi : 11125727], NC 002533 [gi : 11138120]]에서 PRRS 감염에 대한 최초의 기재로 게놈 및 혈청학적 차이를 가진 바이러스를 동정했다. 두 바이러스가 임상학적 질병 전에 분기된 공통의 조상을 가지는 것을 설명하는 비교는 1980년대 후반에 기술되었다. 다수의 PRRS 바이러스에 대해 완전한 길이의 게놈 서열 및 이의 완전한 구조 단백질을 암호화하는 부위[참고 자료 : Snijder et al. 1998,supra; Meulenberg J. J. M., Hulst, M. M. et al., 1993. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrom..., Virology 192, 62-72 ; Conzelmann K. K., Visser N., Van Woensel P., Thiel H. J., 1993. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the the arterivirus group, Virology 103, 329-339 ; Murtaugh M. P., Elam M. R., Kakach L. T., 1995. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2322 and Lelystad virus strain of the PRRS virus, Archives of Virology 140, 1451-1460 ; Kapur V., Elam M. R., Pawtovich T. M., Murtaugh M. P., 1996. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States, Journal of General Virology 77, 1271-1276]가 보고되었다.United States [Reference: WO 93/03760, ATCC VR-2322 isolate, dated July 18, 1991, to the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, NCBI GeneBank Accession No. U 87392 U00153] and Europe [Reference] : WO 92/21375, Leistard Factor (CDI-NL-2.91) isolate deposited June 5, 1991 to Institute Pasteur, Paris, Accession No. CNCM I-1102; Viruses with genomic and serological differences were identified as the first description of PRRS infection in NCBI Gene Bank Accession No. M 96262 [gi: 11125727], NC 002533 [gi: 11138120]. Comparisons explaining that the two viruses have a common ancestor branched before clinical disease were described in the late 1980s. For many PRRS viruses, the full length genomic sequence and the site encoding its complete structural protein [Reference: Snijder et al. 1998, supra ; Meulenberg JJM, Hulst, MM et al., 1993. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrom ..., Virology 192, 62-72; Conzelmann KK, Visser N., Van Woensel P., Thiel HJ, 1993. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the the arterivirus group, Virology 103, 329-339; Murtaugh MP, Elam MR, Kakach LT, 1995. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2322 and Lelystad virus strain of the PRRS virus, Archives of Virology 140, 1451-1460; Kapur V., Elam MR, Pawtovich ™, Murtaugh MP, 1996. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States, Journal of General Virology 77, 1271-1276.

PRRS 바이러스는 돼지 폐 대식 세포, 단핵 세포(monocyte), 신경 아교 세포(glial cell), 및 CL-2621 및 MARC-145[참고 자료 : K. D. Rossow,Porcine reproductive and respiratory syndrome, Vet Pathol 35 : 1-20, 1998]로 알려진두 MA-104 세포 아집단(원숭이 신장 배아 세포)에서 시험관 내 증식할 수 있다. 감염성의 PRRS 클론의 생산에 대한 재조합 방법 역시 이용 가능하다(EP 0839912).The PRRS virus is composed of porcine lung macrophages, monocytes, glial cells, and CL-2621 and MARC-145. , 1998] can be propagated in vitro in two subpopulations of MA-104 cells (monkey kidney embryonic cells). Recombinant methods for the production of infectious PRRS clones are also available (EP 0839912).

돼지를 보호하기 위해서, 약독화된 PRRS 생균 백신이 상업적으로 이용 가능하다(RespPRRS/IngelvacRPRRS MLV, Boehringer Ingelheim). 사균 백신(불활성화된 전체 바이러스) 또는 특이항원 추출 백신(subunit vaccine ; 전통적으로 정제되거나 이종적으로 발현되어 정제된 바이러스 단백질)은 보제조가 있음에도 완벽히 보호되는 면역 반응을 생산하기 위한 효능 면에서 생균 백신보다 매우 자주 열등하다. PRRS의 경우에, 현재 이용 가능한 사균 백신과 비교해서, 약독화 백신이 상기 질병에 대항하여 오래 지속되고 더욱 효과적인 면역을 유도한다[참고 : Snijder et al., 상기 참고 자료]. 현재의 PRRS 생균 백신은 병원성을 상실할 때까지 바이러스를 적절한 숙주 세포에서 순차적으로 계대배양시킴으로써 통상적으로 약독화시킨다 [참고 ; 미국 균주 : EP 0529584 ; 유럽 균주 : EP 0676467 ; EP 0835930].To protect swine, attenuated PRRS live vaccines are commercially available (RespPRRS / Ingelvac R PRRS MLV, Boehringer Ingelheim). Bacillus vaccines (inactivated whole viruses) or subunit vaccines (traditionally purified or heterologously expressed and purified viral proteins) are viable in terms of efficacy for producing a fully protected immune response despite the presence of supplements. Very often inferior to vaccines. In the case of PRRS, attenuated vaccines induce longer lasting and more effective immunity against the disease compared to currently available bacteriophage vaccines (Snijder et al., Supra). Current PRRS live vaccines are typically attenuated by serial passage of the virus in appropriate host cells until pathogenicity is lost. US strain: EP 0529584; European strains: EP 0676467; EP 0835930].

현재의 PRRS 생균 백신은 여전히 개선의 여지가 남아 있다. 한 예로, 상기 백신은 재감염을 예방하지 못한다. 둘째로, 상기 백신은 예방 접종된 동물과 경작지 바이러스로 감염된 동물 사이에 혈청학적 차이를 허용하지 않는다. 게다가, 원칙적으로 생균 백신은 약독화되지 않은 표현형으로 전환될 이론적인 위험이 있다. 특히, PRRS 바이러스와 같은 RNA 바이러스는 RNA 복제 효소에 의한 교정(proofreading)의 부재에 기인하여 RNA 게놈의 부정확한 복제로 돌연 변이 빈도가 높다고 여겨진다. 통상적인 다수의 계대배양에 의해서 수득된 전형적으로 초래된 약독화된 바이러스에 대해서, 유전적 안정성뿐 아니라 분자적 기원까지도 알려지지 않고, 복귀 돌연 변이체의 특징은 예측 불가이다.Current PRRS live vaccines still have room for improvement. In one example, the vaccine does not prevent reinfection. Second, the vaccine does not allow serological differences between vaccinated animals and animals infected with cropland viruses. In addition, in principle, live vaccines have a theoretical risk of converting into an attenuated phenotype. In particular, RNA viruses such as the PRRS virus are believed to have a high frequency of mutations due to inaccurate replication of the RNA genome due to the absence of proofreading by RNA replication enzymes. For the typically attenuated virus obtained by conventional multiple passages, neither genetic stability nor molecular origin is known, and the nature of the back mutations is unpredictable.

그러므로, 본 발명의 기초가 된 문제는 선행 기술 분야의 단점을 극복하는 백신의 제조에 사용될 수 있는 개량된 PRRS 바이러스 균주를 제공하는 것이다.Therefore, a problem underlying the present invention is to provide an improved PRRS virus strain that can be used in the manufacture of a vaccine that overcomes the disadvantages of the prior art.

본 발명은 특정 부위 상의 핵산 돌연변이에 의해서 약독화된 유럽 PRRS 약독화 생균 바이러스에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 바이러스의 생산 방법 및 상기 PRRS 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법 및 PRRS 감염의 치료 및 예방을 위한 백신 제조에서 상기 PRRS 바이러스의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to European PRRS attenuated live virus attenuated by nucleic acid mutations on specific sites. The invention also relates to a nucleotide sequence encoding said virus, a method of producing said virus and a method of producing a pharmaceutical composition comprising said PRRS virus and the use of said PRRS virus in the manufacture of a vaccine for the treatment and prevention of a PRRS infection. .

도 1: 진뱅크에서 발표된, 야생형 레리스타드(Lelystad) 바이러스, 약독화된 바이러스 A(약자로 Vir. A) 및 약독화된 레리스타드 바이러스 B의 서열 비교 1 : Sequence comparisons of wild type Lelystad virus, attenuated virus A (abbreviated Vir. A) and attenuated Lelistard virus B, published by Genebank.

게놈 영역 : ORF 2Genomic Region: ORF 2

뉴클레오티드의 수 : 750Number of nucleotides: 750

굵은 글씨및 박스 처리된 부분은 본 발명에 따른(참조 : 청구항 2 및 3) 돌연 변이(동일하지 않은 뉴클레오티드 교환)을 나타낸다. Bold and boxed parts indicate mutations (not identical nucleotide exchanges) according to the invention (see claims 2 and 3).

도 2: 진뱅크에서 발표된, 야생형 레리스타드(Lelystad) 바이러스, 약독화된 바이러스 A(약자로 Vir. A) 및 약독화된 레리스타드 바이러스 B의 서열 비교 Figure 2 : Sequence comparison of wild type Lelystad virus, attenuated virus A (abbreviated Vir. A) and attenuated Lelistard virus B, published in Genebank

게놈 영역 : ORF 3Genomic Region: ORF 3

뉴클레오티드의 수 : 798Number of nucleotides: 798

굵은 글씨및 박스 처리된 부분은 본 발명에 따른(참조 : 청구항 2 및 3) 돌연 변이(동일하지 않은 뉴클레오티드 교환)을 나타낸다. Bold and boxed parts indicate mutations (not identical nucleotide exchanges) according to the invention (see claims 2 and 3).

도 3: 진뱅크에서 발표된, 야생형 레리스타드(Lelystad) 바이러스, 약독화된 바이러스 A(약자로 Vir. A) 및 약독화된 레리스타드 바이러스 B의 서열 비교 Figure 3 : Sequence comparison of wild type Lelystad virus, attenuated virus A (abbreviated Vir. A) and attenuated Lelistard virus B, published in Genebank.

게놈 영역 : ORF 4Genomic Region: ORF 4

뉴클레오티드의 수 : 552Number of nucleotides: 552

도 4: 진뱅크에서 발표된, 야생형 레리스타드(Lelystad) 바이러스, 약독화된 바이러스 A(약자로 Vir. A) 및 약독화된 레리스타드 바이러스 B의 서열 비교 Figure 4 : Sequence comparison of wild type Lelystad virus, attenuated virus A (abbreviated Vir. A) and attenuated Lelistard virus B, published in Genebank.

게놈 영역 : ORF 5Genomic Region: ORF 5

뉴클레오티드의 수 : 606Number of nucleotides: 606

굵은 글씨및 박스 처리된 부분은 본 발명에 따른(참조 : 청구항 2 및 3) 돌연 변이(동일하지 않은 뉴클레오티드 교환)을 나타낸다. Bold and boxed parts indicate mutations (not identical nucleotide exchanges) according to the invention (see claims 2 and 3).

본 발명의 양태 설명 전에, 명세서와 다음의 청구항에서 사용되는, 단수형은 본 명세서에서 명확히 다르게 표기하지 않는다면 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "PRRS 바이러스"에 대한 언급은 상기 PRRS 바이러스의 복수형을 포함하고, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 당업자에게 알려진 이의 동등물 등이다. 정의된 다른 뜻이 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 지닌다. 임의의 방법 및 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 여기서 기술된다. 여기서 언급된 모든 출판물은 본 발명과 관련 있게 사용될 수 있는 출판물에서 보고되는 세포주, 벡터 및 방법학을 기술하고 밝히기 위해서 여기서는 참고로써 인용되었다. 본 명세서에서 어떤 것도 본 발명이 이전 발명에 의한 명세서로 소급시키도록 하지 않는다는 승인으로 간주되지 않는다.Prior to describing aspects of the present invention, the singular forms "a", "an", and "the" include plural forms unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “PRRS virus” includes plural forms of the PRRS virus, reference to “cell” refers to one or more cells and their equivalents known to those skilled in the art, and the like. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, preferred methods, devices, and materials are described herein. All publications mentioned herein are incorporated herein by reference to describe and identify the cell lines, vectors and methodologies reported in the publications that may be used in connection with the present invention. Nothing herein is to be regarded as an admission that the present invention is intended to be retroactive to the specification of the prior invention.

본 발명은 하기와 같은 특징이 있는, ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 및 ORF7 및 ORF1a 및 ORF1b 또는 ORF2a 및 ORF2b와 같은 아형을 포함하는 핵산에 의해서 암호화된 약독화된(attenuated) 유럽 PRRS 바이러스를 제공한다 :The present invention provides attenuated European PRRS encoded by nucleic acids comprising subtypes such as ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 and ORF7 and ORF1a and ORF1b or ORF2a and ORF2b, which are characterized by: Provide the virus:

a) ORF2는 11915 내지 11935의 위치에서 표 1에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :a) ORF2 is one or more nucleotides described in Table 1 at positions 11915-11935:

AA TT GG AA CC CC AA GG AA AA CC GG AA AA GG AA GG TT CC TT CC CC CC AA CC TT TT CC AA CC CC AA AA CC CC AA CC AA CC AA CC AA GG GG TT GG AA AA GG TT GG GG GG TT GG GG TT GG TT GG TT GG TT

및 12037 내지 12057의 위치에서 표 2에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :And one or more nucleotides described in Table 2 at positions 12037 to 12057:

TT GG TT TT AA AA AA CC GG TT CC AA GG TT TT CC GG TT GG GG GG CC AA CC CC CC CC CC TT AA CC TT CC AA CC CC TT AA CC AA AA AA GG TT GG GG GG GG GG AA TT GG AA GG TT GG GG AA TT GG TT TT TT

및 12058 내지 12078의 위치에서 표 3에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :And one or more nucleotides described in Table 3 at positions 12058 to 12078:

TT AA AA CC CC CC AA TT AA CC AA AA AA AA CC CC GG TT GG TT AA CC CC CC TT TT TT CC CC CC TT CC CC CC CC TT TT AA CC AA CC CC GG GG GG AA AA AA GG GG GG AA GG GG GG GG AA AA TT GG TT GG GG

및/또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함하고/하거나,And / or a deletion at said location (s), and / or

b) ORF3은 12660 내지 12680의 위치에서 표 4에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :b) ORF3 is one or more nucleotides described in Table 4 at positions 12660-12680:

CC AA AA CC AA AA TT TT AA CC AA GG GG TT AA GG GG GG CC AA GG TT CC CC TT CC CC CC CC CC TT CC AA AA CC CC AA AA AA TT CC AA AA GG GG AA GG GG GG GG GG AA GG TT TT GG GG TT TT TT AA GG TT

및/또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함하고/하거나,And / or a deletion at said location (s), and / or

c) ORF5는 13684 내지 13704의 위치에서 표 5에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :c) ORF5 is one or more of the nucleotides described in Table 5 at positions 13684 to 13704:

CC TT GG GG AA AA AA CC AA CC GG AA AA AA TT GG GG GG CC CC AA TT CC AA AA CC CC CC TT CC TT AA CC CC CC CC AA AA AA TT TT CC AA GG TT TT GG GG GG AA GG AA TT GG GG GG GG TT TT TT AA AA GG

및/또는 상기 위치(들)에서 결실을 포함한다.And / or deletions in said location (s).

놀랍게도 PRRS 바이러스는 돌연변이되는 경우, 야생의 독성 균주와 비교하여 약독화된 표현형으로 유도하는 각각의 바이러스 단백질상의 특이 부분을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 지금부터 소위 "독성 특이 부분" 또는 간단히 "본 발명의 부분" 또는 단지 "부분"으로 언급되는 이 부분에 대한 진화적 압력은 거대하다. 이 부분은 백신 균주와 같은 유럽 PRRSV의 약독화를 이끄는 과정과 총괄적인 관련이 있는것으로 추정된다. 표 1 내지 5에서 밝혀진 이 부분은 유럽 균주(야생형 레리스타드 인자 CNCM Ⅰ-1102는 참고 형 균주로 간주된다)에서 특이하고 PRRS 바이러스의 US 균주와 공유하지 않는다.Surprisingly, the PRRS virus was found to contain a specific portion on each viral protein that, when mutated, leads to an attenuated phenotype compared to wild toxic strains. The evolutionary pressure on this part, hereafter referred to as the “toxic specific part” or simply “part of the invention” or just “part” is enormous. It is assumed that this part is collectively related to the process leading to the attenuation of European PRRSV such as vaccine strains. This portion found in Tables 1 to 5 is specific to the European strain (wild type Relistard factor CNCM I-1102 is considered a reference type strain) and is not shared with the US strain of PRRS virus.

추가적인 면에서, 본 발명은 약독화된 유럽 PRRS 바이러스의 서열 번호 25, 26, 27, 28, 또는 29에 상응하는 하나 이상의 서열 구획에서, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 위치에서 최고 10개까지 돌연 변이된다. 서열 번호 25, 26, 및 27의 부분은 ORF2 (도 1에서, 각각, 위치 130-150, 252-272, 및 273-293)에 위치하고, 서열 번호 28 부분은 ORF3 (도 3에서 위치 267-287)에 위치하며, 서열 번호 29 부분은 ORF5 (도 4에서 위치 201-221)에 위치한다. 상기 서열 구획은 본 발명에 따르면 독성 특이 부분을 나타낸다. PRRS 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스이므로, 서열 목록에서 주어진 DNA 서열 대신에 각각의 RNA 서열을 포함할 것이다. 즉, 서열 목록에서 티민(T)로 표기되는 위치에 우라실(U) 및 데옥시리보스 대신에 리보스를 포함한다.In a further aspect, the invention suddenly up to 10 at one, two, three or more positions in one or more sequence compartments corresponding to SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, or 29 of the attenuated European PRRS virus Is mutated. Portions of SEQ ID NOs: 25, 26, and 27 are located at ORF2 (FIG. 1, positions 130-150, 252-272, and 273-293, respectively), and SEQ ID NO: 28 portions are ORF3 (positions 267-287 in FIG. 3). ) And SEQ ID NO: 29 part is located at ORF5 (positions 201-221 in FIG. 4). Said sequence compartment represents a toxic specific part according to the invention. Since the PRRS virus is a positive strand RNA virus, it will include each RNA sequence instead of the DNA sequence given in the sequence listing. That is, ribose is included instead of uracil (U) and deoxyribose at the position indicated by thymine (T) in the sequence listing.

본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 서열 번호 25, 26, 27, 28, 또는 29에 대한 DNA 서열에 상응하나, 하나 이상의 돌연 변이로 상기의 서열과 다른 하나 이상의 서열 구획을 포함하는 게놈 RNA를 구성하는 것으로 이해되어진다. 본 명세서에서, "상응하는"은 본 발명의 바이러스가 BLAST[참고 자료 : Altschul, S. F., Gish, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215 : 403-410 ; Gish, W & States, D. J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search."Nature Genet. 3 : 266-272 ; Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266 : 131-141 ; Zhang, J. & Madden, T. L. (1997) "PowerBLAST : A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7 : 649-656 ; Altschul, Stephen F., Thomas, L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search program", Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402]와 같은 표준적인 정렬 알고리즘에 의해서 언급된 서열에 정렬시킬 수 있는 서열 구획을 포함한다는 것을 의미한다. 이 알고리즘에 의해서 서로 간에 비교되는 서열 위치는 각각 "상응한다".The attenuated European PRRS virus according to the present invention corresponds to the DNA sequence for SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, or 29, but comprises one or more mutations and genomic RNA comprising one or more sequence compartments different from the sequence above. It is understood to constitute a. In this specification, "corresponding" means that the virus of the present invention is BLAST [Reference: Altschul, S. F., Gish, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W & States, D. J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266: 131-141; Zhang, J. & Madden, T. L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7: 649-656; Altschul, Stephen F., Thomas, L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program ", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402] means that it includes a sequence partition that can be aligned to the sequence mentioned by a standard alignment algorithm. Sequence positions that are compared to each other by this algorithm each "correspond".

그리고 나서 상기 정렬에서, 바이러스의 각각의 돌연 변이된 서열 구획은 하나, 둘, 셋 또는 그 이상에서, 최대 열 개까지의 위치에서 상응하는 참고 서열("위치", 즉 서열 번호 25, 26, 27, 28, 또는 29 중의 하나)와 다르다. 바람직하게, 본 발명의 바이러스는 상기 언급된 서열 구획(부분)의 다섯 부분 모두에서 돌연변이된다. 바람직하게, 돌연 변이(들)는 치환(들) 및/또는 결실(들)이다. 바람직한 양태에서, 돌연 변이는 각각의 ORF에 의해 암호화되는 단백질(들)의 아미노산 서열(들)의 변화로 귀착된다.Then, in the alignment, each mutated sequence compartment of the virus has a corresponding reference sequence ("position", ie SEQ ID NOs: 25, 26, 27, at one, two, three or more, up to ten positions). , 28, or 29). Preferably, the virus of the invention is mutated in all five parts of the above-mentioned sequence partitions (parts). Preferably, the mutation (s) are substitution (s) and / or deletion (s). In a preferred embodiment, the mutation results in a change in the amino acid sequence (s) of the protein (s) encoded by each ORF.

추가적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호 25의 10 내지 12 위치에 상응하는 트리플랫이 돌연 변이된, 서열 번호 25에 상응하는 서열 구획을 포함하는 ORF2를 가진 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게 상기 트리플랫은 페닐알라닌을 암호화하지 않는다. 바람직하게는, 상기 트리플랫은 다른 아미노산을 암호화한다. 더 바람직한 양태에서, 상기 트리플랫은 세린을 암호화한다. 더 바람직하게, 서열 번호 25의 11위치에 상응하는 뉴클레오티드는 C이다. 그러므로 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 47 위치(또는 BLAST 정렬에서 상응하는 위치)에서 페닐알라닌을 포함하지 않은 단백질을 암호화하는 ORF2를 가진다. 바람직하게, 상기 단백질은 이 위치에서 대신 세린을 포함한다.In a further aspect, the invention relates to an attenuated European PRRS virus having an ORF2 comprising a sequence section corresponding to SEQ ID NO: 25, wherein the triplet corresponding to positions 10-12 of SEQ ID NO 25 is mutated. Preferably the triplet does not encode phenylalanine. Preferably, the triplet encodes other amino acids. In a more preferred embodiment, the triplet encodes serine. More preferably, the nucleotide corresponding to position 11 of SEQ ID NO: 25 is C. Therefore, in a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has an ORF2 encoding a protein that does not contain phenylalanine at position 47 (or the corresponding position in the BLAST alignment). Preferably, the protein comprises serine instead at this position.

추가적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호 26의 10 내지 12 위치에 상응하는 트리플랫이 돌연 변이된, 서열 번호 26에 상응하는 서열 구획을 포함하는 ORF2를 가진 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 발린을 암호화하지 않는다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 다른 아미노산을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 상기 트리플랫은 페닐알라닌을 암호화한다. 더욱 바람직하게, 서열 번호 26의 10 위치에 상응하는 뉴클레오티드는 T이다(또는 각기, RNA에서 U). 그러므로 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 위치 88(또는 BLAST정렬에서 상응하는 위치)에서 발린을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2를 가진다. 바람직하게, 상기 단백질은 이 위치에서 대신 페닐알라닌을 가진다.In a further aspect, the present invention relates to an attenuated European PRRS virus having an ORF2 comprising a sequence segment corresponding to SEQ ID NO: 26, wherein the triplet corresponding to positions 10-12 of SEQ ID NO 26 is mutated. Preferably, the triplet does not encode valine. Preferably, the triplet encodes other amino acids. In a preferred embodiment, the triplet encodes phenylalanine. More preferably, the nucleotide corresponding to position 10 of SEQ ID NO: 26 is T (or U in RNA, respectively). Therefore, in a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has an ORF2 encoding a protein that does not contain valine at position 88 (or the corresponding position in the BLAST alignment). Preferably, the protein has phenylalanine instead at this position.

추가적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호 27의 11 내지 13 위치에 상응하는 트리플랫이 돌연 변이된, 서열 번호 27에 상응하는 서열 구획을 포함하는 ORF2를 가진 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 페닌알라닌을 암호화하지 않는다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 다른 아미노산을암호화한다. 바람직한 양태에서, 상기 트리플랫은 류신을 암호화한다. 더욱 바람직하게, 서열 번호 27의 11 위치에 상응하는 뉴클레오티드는 C이다. 그러므로 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 위치 95(또는 BLAST정렬에서 상응하는 위치)에서 페닐알라닌을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2를 가진다. 바람직하게, 상기 단백질은 이 위치에서 대신 류신을 가진다.In a further aspect, the invention relates to an attenuated European PRRS virus having an ORF2 comprising a sequence segment corresponding to SEQ ID NO: 27, wherein the triplet corresponding to positions 11 to 13 of SEQ ID NO: 27 mutated. Preferably, the triplet does not encode phenalanine. Preferably, the triplet encodes other amino acids. In a preferred embodiment, the triplet encodes leucine. More preferably, the nucleotide corresponding to position 11 of SEQ ID NO: 27 is C. Therefore, in a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has an ORF2 encoding a protein that does not contain phenylalanine at position 95 (or the corresponding position in the BLAST alignment). Preferably, the protein has leucine instead at this position.

추가적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호 28의 11내지 13 위치에 상응하는 트리플랫이 돌연 변이된, 서열 번호 28에 상응하는 서열 구획을 포함하는 ORF3을 가진 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 세린을 암호화하지 않는다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 다른 아미노산을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 상기 트리플랫은 프롤린을 암호화한다. 더욱 바람직하게, 서열 번호 28의 11 위치에 상응하는 뉴클레오티드는 C이다. 그러므로 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 위치 93(또는 BLAST정렬에서 상응하는 위치)에서 세린을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2를 가진다. 바람직하게, 상기 단백질은 이 위치에서 대신 프롤린을 가진다.In a further aspect, the invention relates to an attenuated European PRRS virus having an ORF3 comprising a sequence segment corresponding to SEQ ID NO: 28, wherein the triplet corresponding to positions 11 to 13 of SEQ ID NO: 28 is mutated. Preferably, the triplet does not encode serine. Preferably, the triplet encodes other amino acids. In a preferred embodiment, the triplet encodes proline. More preferably, the nucleotide corresponding to position 11 of SEQ ID NO: 28 is C. Therefore, in a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has an ORF2 encoding a protein that does not contain serine at position 93 (or the corresponding position in the BLAST alignment). Preferably, the protein has proline at this position instead.

추가적인 측면에서, 본 발명은 서열 번호 29의 11 내지 13 위치에 상응하는 트리플랫이 돌연 변이된, 서열 번호 29에 상응하는 서열 구획을 포함하는 ORF2를 가진 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 류신을 암호화하지 않는다. 바람직하게, 상기 트리플랫은 다른 아미노산을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 상기 트리플랫은 페닐알라닌을 암호화한다. 더욱 바람직하게, 서열 번호 29의 11 위치에 상응하는 뉴클레오티드는 T이다(또는 각기, RNA에서 U). 그러므로 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 위치 71(또는 BLAST정렬에서 상응하는 위치)에서 류신을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2를 가진다. 바람직하게, 상기 단백질은 이 위치에서 대신 페닐알라닌을 가진다.In a further aspect, the invention relates to an attenuated European PRRS virus having an ORF2 comprising a sequence segment corresponding to SEQ ID NO: 29, wherein the triplet corresponding to positions 11 to 13 of SEQ ID NO: 29 is mutated. Preferably, the triplet does not encode leucine. Preferably, the triplet encodes other amino acids. In a preferred embodiment, the triplet encodes phenylalanine. More preferably, the nucleotide corresponding to position 11 of SEQ ID NO: 29 is T (or U in RNA, respectively). Therefore, in a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has an ORF2 encoding a protein that does not contain leucine at position 71 (or the corresponding position in the BLAST alignment). Preferably, the protein has phenylalanine instead at this position.

정의된 돌연 변이 및/또는 결실에 의해서 약독화된 유럽 균주에 기반을 둔 PRRS 생균 백신은 약독화 백신의 현재 생산의 단점을 피할 수 있도록 한다. 약독화된 균주가 정의되고 공지된 돌연 변이를 수반한다면, 품질 제어 및 유전적 안정성을 편리하게 분석할 수 있다. 정의된 결실 및/또는 치환, 특히 이중 또는 다중의 돌연 변이를 도입하는 가능성이 약독화되지 않거나 독성 있는 표현형으로 전환될 가망성을 감소시킨다. 상기 약독화시키는 돌연 변이의 추가적 장점은 야생의 PRRS 바이러스와 구별하기 위해서 약독화된 PRRS 바이러스에 대한 특이 마커로서 사용되는 것을 허용하는 공지의 분자적 유일성에 있다. 본 발명에서 동정된 부위에서, 안전하고 위치 특이적 약독화된 바이러스가 생산될 수 있다. 상기 바이러스는 PRRS 감염의 치료 및/또는 예방의 용도에서 안전한 생균 백신의 제조에서 유용하다.PRRS live vaccines based on European strains attenuated by defined mutations and / or deletions avoid the disadvantages of current production of attenuated vaccines. If attenuated strains are defined and involve known mutations, quality control and genetic stability can be conveniently analyzed. The possibility of introducing defined deletions and / or substitutions, in particular double or multiple mutations, reduces the likelihood of being converted into an attenuated or toxic phenotype. A further advantage of these attenuating mutations is the known molecular uniqueness that allows them to be used as specific markers for attenuated PRRS viruses to distinguish them from wild PRRS viruses. At the sites identified in the present invention, safe and location specific attenuated virus can be produced. The virus is useful in the preparation of live, live vaccines for use in the treatment and / or prevention of PRRS infections.

본 발명은 약독화된 유럽 PRRS 균주 및 이의 생산 방법에 대한 것이다. 본 명세서에서, "약독화된"의 의미는 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주거나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것이다. 특히, "약독화"는 바이러스가 숙주안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 의미한다. 바람직하게, 독성 또는 병원성은 바이러스가 백신용으로 투여을 허용할 수 있을 정도로 감소된다. 바람직한 양태에서, 바이러스를 숙주에서 여전히 복제할 수 있으면서 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지 약독화시킨다. 숙주에서의 복제 분열이 빠르고 우수한 면역 반응의 자극을 보증하기 때문에 상기 약독화된 균주는 예방 접종에 이상적인 인자이다. 바람직한 양태에서, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스는 레리스타드 인자보다 더 약한 독성을 가진다. 다른 양태에서, 약독화된 바이러스는 이것이 유도된 모균주보다 더 약한 독성을 가진다. "PRRS 바이러스 레리스타드 인자보다 더 약한 독성"(또는, 마찬가지로 이것이 유도된 모균주)의 용어는 레리스타드 인자(CDI-NL-2.91/CNCM Ⅰ-1102) 또는 모균주와 함께 관심있는 바이러스의 임상적 증상 비교의 측면에서 이해될 수 있다. PRRS 바이러스가 레리스타드 인자보다 독성이 더 약한지 여부 또는 마찬가지로 만일 본 발명에 따라 변형된 바이러스가 변형전의 모균주보다 독성이 더 약한지 여부를 결정하는 바람직한 절차는 실시예 1에서 밝혀진다. 독성 특이 부위에서 각각은 아니지만 모든 가능한 핵산 돌연변이는 독성 감소와 관련이 있다고 할 수 있다. 실시예 1의 절차는 본 발명의 교시에 따른 PRRS 생균 바이러스가 모균주 또는 레리스타드 인자와 같이 분리된 독성있는 야생주보다 독성이 약한지 여부를 결정하는 정확하고 직선적인 실험 설비를 제공한다.The present invention is directed to attenuated European PRRS strains and methods for their production. As used herein, "attenuated" means that the toxic strain is modified in such a way that it becomes a less toxic strain or a weaker pathogen than before the modification. In particular, "attenuation" means that the ability to cause clinical disease is significantly reduced while the virus can still divide in the host. Preferably the toxicity or pathogenicity is reduced to such an extent that the virus can tolerate administration for the vaccine. In a preferred embodiment, the virus is attenuated to the extent that the virus can still replicate in the host and cannot cause clinical disease. The attenuated strain is an ideal factor for vaccination because replication cleavage in the host ensures fast and stimulation of a good immune response. In a preferred embodiment, the attenuated European PRRS virus has a weaker toxicity than the Leistard factor. In other embodiments, the attenuated virus has a weaker toxicity than the parent strain from which it was induced. The term “weaker toxicity than the PRRS virus Lelistard factor” (or similarly the parent strain from which it was derived) is used to refer to the clinical manifestation of the virus of interest in combination with the Lelistard factor (CDI-NL-2.91 / CNCM I-1102) or the parent strain. It may be understood in terms of symptom comparison. A preferred procedure for determining whether the PRRS virus is less toxic than the Relistard factor or if the virus modified according to the invention is less toxic than the parent strain before modification is found in Example 1. Not all possible nucleic acid mutations at the specific sites of toxicity are associated with reduced toxicity. The procedure of Example 1 provides an accurate and straightforward experimental facility to determine whether PRRS live virus according to the teachings of the present invention is less toxic than isolated toxic wild strains, such as parent strains or Leistard factor.

본 발명은 다음과 같이 미국 균주와 구별되는 유럽 PRRS 균주에 대한 것이다. 바이러스가 발견된 후 곧, 웬스부트 등[참고 : Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest 4 : 134-138 (1992)]은 미국 및 유럽 분리물 사이의 항원 특징에 대한 차이점을 관찰했다. 그들은 여러 종류의 돼지에서 미국형 및 유럽형 모두에 대한 혈청을 야기하고, 세 가지 미국 바이러스 분리물 및 4 가지 유럽 분리물에서의항-유럽(LV) 및 항-미국(VR-2332) 혈청의 교차-반응성(cross-reactivity)을 비교했다. 유럽 혈청형의 PRRS 바이러스에 반응하는 혈청은 유럽 분리물보다 미국 분리물과 주목할 정도로 반응성이 덜하다. 더군다나, 미국 혈청형의 바이러스에 반응하여 수집된 혈청은 유럽 바이러스 분리물과 같이 덜 반응하거나, 또는 전혀 반응조차 하지 않는다. 또한 웬스부트 등은 두 개의 참고 바이러스 CNCM Ⅰ-1102(유럽) 및 ATCC VR-2332(미국)를 사용하여 유럽 및 미국 분리물에 대하여 야기된 혈청의 반응성을 보여줬다. 이 실험에서, 유럽 균주에 대하여 야기된 혈청은 미국 균주를 사용하여서는 전혀 반응하지 않았다. 그러므로, 바이러스의 두 개의 완전히 다른 혈청형, 즉 혈청학적 특성에 기초하여 구분되는 미국 및 유럽 혈청형이 존재한다.The present invention relates to a European PRRS strain that is distinguished from the US strain as follows. Shortly after the virus was discovered, Wensvoort et al., Wensvoort et al., J. Vet. Diagn. Invest 4: 134-138 (1992) observed differences in antigenic characteristics between US and European isolates. They result in sera for both American and European types in several types of pigs, and cross-over of anti-European (LV) and anti-US (VR-2332) sera in three US virus isolates and four European isolates. Cross-reactivity was compared. Serum that responds to the European serotype PRRS virus is significantly less reactive with US isolates than European isolates. Furthermore, serum collected in response to a virus of the US serotype is less responsive or even not at all like European virus isolates. Wensboot et al also used two reference viruses CNCM I-1102 (Europe) and ATCC VR-2332 (USA) to show the reactivity of the serum caused to European and US isolates. In this experiment, the serum raised against the European strains did not respond at all using the US strain. Therefore, there are two completely different serotypes of the virus, namely the US and European serotypes, which are distinguished based on their serological characteristics.

또한 이는 분자 수준에서 보여질 수 있다. 넬슨 등[참조 : Nelson et al., 74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993]은 다양한 분리물의 폴리머라제-암호화 유전자의 서열을 비교했다. 이들은 폴리머라제 유전자가 미국 그룹에서 87-95%의 상동성을 나타냄을 증명하였다. 그러나, 핵산에 기초한 64-67%만큼 낮은 상동성이 유럽 혈청형 및 미국 혈청형 사이에 나타났다. 마다시는 퀘벡 PRRS 참조 균주 및 유럽 분리물의 3'-말단 530개 핵산이 59%만큼 낮은 상동성만을 보였다는 것을 나타내며, 상기 총회에서 비교할 만한 결과를 발표했다. 상기 언급된 논문에서 결론으로 미국 및 유럽 혈청형은 오래 전에 분기되고, 이로 인해 유전적 차이점 및 혈청학적 비관련성도 쉽게 설명된다는 것이 가장 알맞다.It can also be seen at the molecular level. Nelson et al., 74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases, November 8-9, 1993, compared the sequences of polymerase-encoding genes of various isolates. They demonstrated that the polymerase gene showed 87-95% homology in the US group. However, homology as low as 64-67% based on nucleic acid appeared between European and US serotypes. Madashi indicated that the 3'-terminal 530 nucleic acids of the Quebec PRRS reference strain and the European isolates showed only as low as 59% homology, and the above general meeting presented comparable results. As a conclusion from the above-mentioned papers, it is most appropriate that US and European serotypes diverge long ago, which makes genetic differences and serological unrelated easier to explain.

그러므로, 미국 및 유럽 혈청형은 쉽게 구분될 수 있다. 유럽 혈청형의 바이러스는 미국 PRRS 바이러스(ATCC VR-2332)에 반응하는 일단의 항혈청과의 반응과 비교하여서 유럽 PRRS 바이러스 LV(CNCM Ⅰ-1102)에 반응하는 일단의 항혈청을 사용한 이뮤노페록시다제 모노레이어 검정에서 더 높은 역가로 반응한다는 점이 특징이다. 만일 일단의 혈청이 사용된다면, 감염 후 40일, 상이한 동물에서 획득한 임의의 바이러스가 미국 또는 유럽 혈청형 중 하나에 속하는지 여부를 쉽게 분류할 수 있다. 전형적으로, 다른 유럽 균주에 반응하는 일단의 항혈청과 유럽 균주의 반응성은 미국 균주에 반응하는 일단의 항혈청 보다 대략 400배 정도 높다. 유럽 균주를 기탁된 유럽 균주 Ⅰ-1102 및 기탁된 미국 균주 VR-2332에 반응하는 항혈청과 반응시키는 경우, 반응성에 있어서 대략 55배의 전형적 차이가 나타난다[참조 : Wensvoort et al., 상기 참조문].Therefore, US and European serotypes can be easily distinguished. The European serotype virus was immunoperoxidase mono using a group of antisera that responded to the European PRRS virus LV (CNCM I-1102) as compared to a group of antisera that responded to the US PRRS virus (ATCC VR-2332). It is characterized by a higher titer in the layer test. If a group of sera is used, one can easily classify whether 40 days after infection any virus obtained from different animals belongs to one of the US or European serotypes. Typically, the reactivity of a group of antisera to a different European strain and a European strain is approximately 400 times higher than a group of antisera to a US strain. When European strains are reacted with antisera that respond to deposited European strain I-1102 and deposited US strain VR-2332, there is a typical difference of approximately 55-fold in reactivity (Wensvoort et al., Supra). .

"돌연변이"는 주어진 뉴클레오티드의 위치 또는 아미노산 서열에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입을 의미한다. "치환"이란 다른 것에 의해서 (예를 들면, T 대신에 C) 뉴클레오티드 또는 아미노산을 대신하는 것이다. "결실"은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 제거를 의미한다. "삽입"은 주어진 위치에 뉴클레오티드나 또는 아미노산이 삽입되는 것을 의미한다."Mutations" means substitutions, deletions, or insertions of nucleotides or amino acids at the position or amino acid sequence of a given nucleotide. "Substituted" means replacing a nucleotide or amino acid by another (eg, C instead of T). "Deleted" means removal of a nucleotide or amino acid. "Insert" means that the nucleotide or amino acid is inserted at a given position.

추가적인 면에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 상기의 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 서열 번호 22의 130 내지 150 위치 및/또는 252 내지 272 위치 및/또는 273 내지 293 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF2의 위치에서 변형시키는 단계 ; 및a) by the site-directed mutagenesis of said virus, at least one ORF2 corresponding to positions 130-150 and / or 252-272 and / or 273-293 of SEQ ID NO: 22; Transforming in position; And

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법 또는 과정을 포함한다.b) a method or procedure for attenuating the European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

추가적인 면에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 상기의 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발에 의해 서열 번호 23의 267 내지 287 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF3의 위치에서 변형시키는 단계 ; 및a) modifying the nucleotide sequence of the virus at one or more ORF3 positions corresponding to positions 267 to 287 of SEQ ID NO: 23 by site mutagenesis; And

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법을 포함한다.b) attenuating the European PRRS virus, characterized by the step of testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

추가적인 면에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 상기의 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발에 의해 서열 번호 24의 201 내지 221 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF5의 위치에서 변형시키는 단계 ; 및a) modifying the nucleotide sequence of said virus at one or more positions of ORF5 corresponding to positions 201 to 221 of SEQ ID NO: 24 by site mutation; And

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법을 포함한다.b) attenuating the European PRRS virus, characterized by the step of testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

본 명세서에서, "상응하는"의 용어는 상기 개요와 같은, 즉 서로 상응하는 두 위치는 BLAST와 같은 서열 정렬에서 쌍으로 정렬될 수 있다는 의미를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 변형은 암호화된 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래한다. 바람직한 양태에서, 변형은 결실 및/또는 치환, 바람직하게 두 개 또는 그 이상의 돌연변이이다. 바람직한 양태에서, 둘 이상의 상기에서의 변형은 결합된다. 더 바람직한 양태에서, ORF2, ORF3, 및 ORF5 각각의 서열은 변형된다. 바람직하게, ORF2의 서열은 둘 이상의 위치에서, 바람직하게는 셋 이상의 위치에서 변형된다.As used herein, the term "corresponding" includes the meaning that two positions, such as the above outline, ie corresponding to each other, may be aligned in pairs in a sequence alignment, such as BLAST. Preferably, the modifications according to the invention result in a change in the amino acid sequence of the encoded protein. In a preferred embodiment, the modification is a deletion and / or substitution, preferably two or more mutations. In a preferred embodiment, two or more modifications above are combined. In a more preferred embodiment, the sequence of each of ORF2, ORF3, and ORF5 is modified. Preferably, the sequence of ORF2 is modified at two or more positions, preferably at three or more positions.

바람직하게, 상기 방법은 서열 번호 22의 47, 88 및/또는 95 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열에서 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF2 ; 서열 번호 23의 93 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF3 ; 및/또는 서열 번호 24의 71 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF5의 하나 이상의 특징을 초래하는 변형을 포함한다. 바람직하게, 상기 모든 위치가 돌연변이된다.Preferably, the method comprises an ORF2 encoding a protein having amino acid substitutions or deletions in at least one amino acid sequence corresponding to the 47, 88 and / or 95 positions of SEQ ID NO: 22; ORF3, which encodes a protein having an amino acid substituted or deleted at an amino acid sequence position corresponding to position 93 of SEQ ID NO: 23; And / or modifications resulting in one or more features of ORF5 encoding a protein having an amino acid substituted or deleted at an amino acid sequence position corresponding to position 71 of SEQ ID NO: 24. Preferably all of these positions are mutated.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 서열 번호 22의 47 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 페닐알라닌을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22의 88 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 발린을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22의 95 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 페닐알라닌을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 23의 93 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 세린을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24의 71 위치에 상응하는 아미노산 서열에서 류신을 포함하지 않는 단백질을 암호화하는 ORF5의 하나 이상의 특징을, 바람직하게는 모두를 초래하는 변형을 포함한다.Preferably, the method according to the invention does not comprise ORF2, which encodes a protein that does not contain phenylalanine at the amino acid sequence position corresponding to position 47 of SEQ ID NO: 22, valine at the amino acid sequence position corresponding to position 88 of SEQ ID NO: 22 ORF2, which encodes a protein which does not contain a protein, does not contain serine at an amino acid sequence, which corresponds to position 93 of SEQ ID NO: 23, ORF2, which encodes a protein which does not contain phenylalanine at an amino acid sequence position corresponding to position 95 of SEQ ID NO: 22 One or more features, preferably all of which encode an ORF3 that encodes a protein and / or a protein that does not comprise leucine in an amino acid sequence corresponding to position 71 of SEQ ID NO: 24.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 서열 번호 22의 47 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 세린을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22의 88 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22의 95 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 류신을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 23의 93 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 프롤린을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24의 71 위치에 상응하는 아미노산 서열 위치에서 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF5의 하나 이상의 특징을, 바람직하게 모두를 초래하는 변형을 포함한다.Preferably, the method according to the invention comprises an ORF2 encoding a protein comprising serine at an amino acid sequence position corresponding to position 47 of SEQ ID NO: 22, a protein comprising phenylalanine at an amino acid sequence position corresponding to position 88 of SEQ ID NO: 22 ORF2 encoding a protein, ORF2 encoding a protein comprising leucine at an amino acid sequence position corresponding to position 95 of SEQ ID NO: 22, ORF3 encoding a protein containing proline at an amino acid sequence position corresponding to position 93 of SEQ ID NO: 23 And / or modifications that result in, preferably all, one or more features of ORF5 encoding a protein comprising phenylalanine at an amino acid sequence position corresponding to position 71 of SEQ ID NO: 24.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 서열 번호 22의 140의 위치에 상응하는 위치에서 C를 갖는 ORF2, 서열 번호 22의 262의 위치에 상응하는 위치에서 T를 갖는 ORF2, 서열 번호 22의 283의 위치에 상응하는 위치에서 C를 갖는 ORF2, 서열 번호 23의 277의 위치에 상응하는 위치에서 C를 갖는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24의 211의 위치에 상응하는 위치에서 T를 갖는 ORF5의 특징을 하나 이상, 바람직하게 모두를 초래하는 변형을 포함한다.Preferably, the method according to the invention comprises an ORF2 having a C at a position corresponding to position 140 of SEQ ID NO: 22, an ORF2 having a T at a position corresponding to position 262 of SEQ ID NO: 22, a position of 283 of SEQ ID NO: 22 ORF2 with C at position corresponding to ORF3 with C at position corresponding to position 277 of SEQ ID NO: 23, and / or ORF5 with T at position corresponding to position 211 of SEQ ID NO: 24 As mentioned above, the deformation which brings about all is included.

더욱이, 본 발명은 상기 방법 중 임의의 하나에 의해서 수득할 수 있는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다.Moreover, the present invention relates to attenuated European PRRS virus obtainable by any one of the above methods.

추가적인 면에서, 본 발명은 상기에 언급된 것과 같은 약독화된 유럽 PRRS 바이러스의 암호 정보를 포함하는 핵산을 포함한다. 상기 개요에서처럼, 이는 리보핵산(RNA)일 수 있다. 게다가 상기 핵산은 상기 리보핵산에 상보적인 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid), 즉 cDNA, 또는 DNA의 임의의 다른 DNA 형태가 될 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 cDNA는 감염성이 있다. 이는 상기 cDNA가 적합한숙주 세포로 도입된다면, 상기 세포는 바이러스 부분들의 생산을 시작할 것이라는 것을 의미한다. 게다가 본 발명은 상기 개요에서의 임의의 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 RNA, cDNA, 또는 다른 DNA에 관한 것이다.In a further aspect, the present invention includes nucleic acids comprising the coding information of the attenuated European PRRS virus as mentioned above. As in the above summary, it may be ribonucleic acid (RNA). Furthermore, the nucleic acid can be deoxyribonucleic acid, ie cDNA, or any other DNA form of DNA that is complementary to the ribonucleic acid. In a preferred embodiment, the cDNA is infectious. This means that if the cDNA is introduced into a suitable host cell, the cell will start producing viral parts. Moreover, the present invention relates to RNA, cDNA, or other DNA comprising any one or more mutations in the above summary.

추가적인 면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용될 수 있는 담체와 결합되는 기술된 바와 같은 약독화된 유럽 PRRS 바이러스를 포함하는 백신을 포함한다.In a further aspect, the present invention includes a vaccine comprising the attenuated European PRRS virus as described in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

추가적인 면에서, 본 발명은 상기 언급된 백신의 유효량을 돼지에 투여하는 것을 특징으로 하는, PRRS에 대한 돼지의 예방 접종 방법을 포함한다.In a further aspect, the present invention includes a method of vaccination of pigs against PRRS, characterized in that the pigs are administered an effective amount of the aforementioned vaccine.

추가적인 면에서, 본 발명은 PRRS에 대비한 백신의 제조를 위한 기술된 바와 같은 약독화된 유럽 PRRS 바이러스의 용도와 관련이 있다.In a further aspect, the present invention relates to the use of the attenuated European PRRS virus as described for the manufacture of a vaccine against PRRS.

본 발명에 따르면, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 위치 번호는 상기에서 밝혀진 공공연히 이용 가능한 레리스타드 인자에 따른다. 그러나, 도 1 내지 4에서 밝혀진 것처럼, ORF (개방 판독 프레임=ORF)은 이들의 일부가 중복되기 때문에 떨어져서 따로따로 번호를 매긴다.According to the present invention, the position number of the nucleotide or amino acid depends on the publicly available Lelistard factor found above. However, as found in Figures 1 to 4, ORFs (open reading frames = ORFs) are numbered separately because some of them overlap.

약독화된 유럽 바이러스가 독성 있는 야생형과 상이한 특정 부위에서의 뉴클레오티는 11915 내지 11935(도 1에서 130 내지 150 번에 상응하는 표 1), 12037 내지 12057(도 1에서 252 내지 272 번에 상응하는 표 2), 12058 내지 12078(도 1에서 273 내지 293 번에 상응하는 표 3)의 ORF2의 뉴클레오티드 ; 12660 내지 12680(표 4 : 도 3에서 267 내지 287 번)의 ORF3의 뉴클레오티드 , 및/또는 13684 내지 13704(표 5 :도 4에서 201 내지 221 번)의 ORF5의 뉴클레오티드이다. 하나 또는 다수의 상기 위치에서 레리스타드 인자를 상기 표에서 나타내는 하나 이상의 뉴클레오티드로 돌연변이시킴으로써 / 및 상기 위치에서 상기 뉴클레오티드를 제거함으로써, 당업자는 PRRS 바이러스의 약독화된 유럽된 생균 백신을 획득할 것이다. 상기 위치에서 교환 또는 결실과 같은 돌연변이는 바이러스가 여전히 복제될 수 있는 상태, 즉 여전히 생균 바이러스여야만 하는 상태에 의해서만 제한된다. 이는 과도한 실험 없이 결정될 수 있다. 공공연히 이용 가능한 레리스타드 인자 및 본 발명에 따른 교시에 근거하여서, 당업자는 예를 들어 하나의 돌연변이를 제공된 표에 기초하여 밝혀진 모든 위치에 도입시키거나, 예를 들어 A, C 또는 G를 11915위치에 도입시키거나 또는 그 위치에서(T인 경우) 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 비제한적 실시예는 도 1 내지 3(레리스타드 B 및 약독화된 바이러스 A에서 ORF2, ORF3 및 ORF5 ) 및 실시예 1에서 보여진다.Nucleotides at specific sites where the attenuated European virus differs from the toxic wild type correspond to 11915-11935 (Table 1 corresponding to 130-150 in FIG. 1), 12037-12057 (252-272 in FIG. 1). Table 2), nucleotides of ORF2 of 12058 to 12078 (Table 3 corresponding to No. 273 to 293 in Figure 1); Nucleotides of ORF3 at 12660-12680 (Table 4: 267-287 in FIG. 3), and / or nucleotides of ORF5 at 13684-13704 (Table 5: 201-221 in FIG. 4). By mutating a Relistard factor at one or more of these positions with one or more nucleotides shown in the table above and / or removing the nucleotides at that position, one skilled in the art will obtain an attenuated European live vaccine of the PRRS virus. Mutations such as exchanges or deletions at this position are limited only by the state in which the virus can still replicate, ie, still be a live virus. This can be determined without undue experimentation. Based on the publicly available Lelistard factor and the teachings according to the invention, one of ordinary skill in the art would, for example, introduce one mutation at all positions identified based on the table provided, or for example at A, C or G at position 11915. The nucleotides can be introduced or removed at that position (if T). Non-limiting examples are shown in FIGS. 1-3 (ORF2, ORF3 and ORF5 in Leistid B and Attenuated Virus A) and Example 1. FIG.

본 발명은 오직 하나의 뉴클레오티드만, 또한 다수의 뉴클레오티드만, 또는 모든 뉴클레오티드에서 예를 들면 상기 위치에서 하나 또는 다수의 아미노산을 암호화하는 하나 또는 다수의 트리플랫이 돌연변이된 바이러스를 포함한다. 그러나, 서열은 바이러스가 더 이상 복제할 수 없을 정도로 돌연변이되어서는 안되는데, 즉 본 발명에 따르면, 생균 바이러스가 암호화되어야 한다.The present invention encompasses viruses in which only one nucleotide, also a plurality of nucleotides, or all or one nucleotide, for example one or a plurality of triplets, which encodes one or a plurality of amino acids at said position. However, the sequence should not be mutated to the extent that the virus can no longer replicate, ie, according to the invention, the live virus must be encoded.

상기 범위이외의 부가적인 아미노산은 역시 돌연변이시킬 수 있으나, 본 발명에서는 필수적이지 않다(도 1에서, 예를 들면 T 대신에 C인 레리스타드-B의 ORF2의 426 위치).Additional amino acids outside this range may also be mutated, but are not essential in the present invention (in Figure 1, for example, position 426 of ORF2 of Relistad-B, which is C instead of T).

상기 돌연 변이는 공지된 표준적인 유전공학 방법에 의해서, 특히 지정부위 돌연변이 유발에 의해서 수행될 수 있다. 본 발명의 명세서에서, "지정부위 돌연변이 유발"은 핵산의 미리 선택된 부위에서의 지정된 돌연변이를 허용하는 유전공학 기술을 의미한다. 일반적으로, 상기 기술은 적어도 상기 핵산 서열의 부분적인 지식을 요구한다. 순차적 계대 배양에 의한 전형적인 약독화 방법은 미리 선택된 부위의 돌연변이를 허용하지 않는다. 상기 유전공학 방법은 당업계[참조 문헌 : Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nded.., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ; Chapter 15 ; Wu(ed.) (1993), Method in Enzymology Vol 217, p. 173-285]에서 공지되었다.The mutation can be carried out by known standard genetic engineering methods, in particular by site mutagenesis. In the context of the present invention, "directed mutagenesis" means genetic engineering techniques that allow for designated mutations at preselected sites of nucleic acids. In general, the technique requires at least partial knowledge of the nucleic acid sequence. Typical attenuation methods by sequential passaging do not allow mutation of preselected sites. Such genetic engineering methods are known in the art [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed .., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Chapter 15; Wu (ed.) (1993), Method in Enzymology Vol 217, p. 173-285.

돌연변이의 도입을 위한 출발 물질로서, 독성있는 PRRSV 균주의 cDNA 클론, 예를 들면 레리스타드 인자(CNCM Ⅰ-1102)는 당업계[참조 문헌 : Boyer et Haenni. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology (1994) 198 : 415-426]에서 공지된 과정에 따라서 생산될 수 있다. 예를 들면, 감염성 PRRSV 복제물은 기술된 것[참조 문헌 : WO00/53787 ; Meulenberg. et al, Ad. Exp. Biol (1998) 440 : 199-206 ; Meulenberg et al., J. Viol. (1998) 72(1) : 380-387]처럼 제조한 후, 본 발명에 따라서 돌연변이될 수 있다. 언급된 참조 문헌은 감염성 PRRSV의 cDNA 클론을 획득하는 방법 및 이로부터의 돌연변이를 만드는 방법의 상세한 과정을 제공한다. 그리고 나서 돌연변이된 클론 또는 시험관 내에서 생산된 이의 감염성 전사물은 약독화된 바이러스를 생산하는 적절한 숙주 세포로 형질감염시킬 수 있다.As a starting material for the introduction of mutations, cDNA clones of toxic PRRSV strains, such as Relistard factor (CNCM I-1102), have been described in the art by Boyer et Haenni. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology (1994) 198: 415-426. For example, infectious PRRSV clones are described in WO00 / 53787; Meulenberg. et al, Ad. Exp. Biol (1998) 440: 199-206; Meulenberg et al., J. Viol. (1998) 72 (1): 380-387], and can be mutated according to the present invention. The referenced references provide detailed procedures for obtaining cDNA clones of infectious PRRSV and making mutations therefrom. The mutated clones or their infectious transcripts produced in vitro can then be transfected with appropriate host cells producing the attenuated virus.

특히, ORF2(도 1)의 11925, 12047, 및 12068 ; ORF3(도 2)의 12670 및/또는ORF5(도 4)의 13694 부위는 레리스타드 인자의 독성있는 야생 균주와 비교해서 일관적으로 변한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 다른 바람직한 양태는In particular, 11925, 12047, and 12068 of ORF2 (FIG. 1); It was surprisingly found that the 12670 and / or 13694 sites of ORF3 (FIG. 2) of ORF3 (FIG. 2) consistently change compared to the toxic wild strains of Lelistard factor. Therefore, another preferred embodiment of the present invention

a) ORF2가 11925 위치에서 C, A 또는 G 및/또는 12047 위치에서 C, T 또는 A 및/또는 12068 위치에서 A, C 또는 G 또는 상기 위치(들)에서 결실을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises a deletion at position C, A or G and / or 12047 at position C, T or A and / or 12068 at position A, C or G or at said position (s), and / or

b) ORF3이 12670 위치에서 A, C 또는 G 또는 상기 위치에서 결실을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises A, C or G at position 12670 or a deletion at said position,

c) ORF5가 13694 위치에서 G, A 또는 T 또는 상기 위치에서 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스이다.c) an attenuated European PRRS virus according to the invention, characterized in that ORF5 comprises a G, A or T at position 13694 or a deletion at said position.

더욱 특별하게, 레리스타드 인자의 독성있는 야생 균주와 비교하여서 ORF2의 11925 위치는 C로 일관적으로 변하고, ORF2의 12047 위치는 T로 일관적으로 변하고, ORF2의 12068 위치는 C로 일관적으로 변한다(도 1) ; ORF3의 12670 위치는 C로 일관적으로 변하고(도 2)/변하거나 ORF5의 13694 위치는 T로 일관적으로 변한다(도 4)는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 다른 더 바람직한 발명은 상기 핵산이 :More specifically, the 11925 position of ORF2 is consistently changed to C, the 12047 position of ORF2 is consistently changed to T and the 12068 position of ORF2 is consistently C compared to the toxic wild strain of Leistard factor. (FIG. 1); It was found that the 12670 position of ORF3 consistently changed to C (FIG. 2) and / or the 13694 position of ORF5 consistently changed to T (FIG. 4). Therefore, another more preferred invention of the present invention is that the nucleic acid is:

a) 상기 ORF2가 11925 위치에 C 및/또는 12047 위치에 T 및/또는 12608 위치에 C 및 상기 위치(들)에서 결실을 포함 및/또는a) the ORF2 comprises a deletion at position C and / or position 12047 and position T and / or position 12608 at position C and / or deletion at position (s)

b) 상기 ORF3이 12670 위치에서 C 또는 상기 위치에서 결실을 포함하고/하거나,b) said ORF3 comprises a C at position 12670 or a deletion at said position, and / or

c) 상기 ORF5가 13694 위치에서 T 또는 상기 위치에서 결실을 포함하는 것을추가적 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스이다.c) an attenuated European PRRS virus according to the invention, further characterized in that said ORF5 comprises a T at position 13694 or a deletion at said position.

본 발명의 다른 더욱 바람직한 양태는 상기 핵산이 :Another more preferred aspect of the invention is that the nucleic acid is:

a) 상기 ORF2가 서열 번호 1로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,a) said ORF2 comprises a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 1

b) 상기 ORF3이 서열 번호 2로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,b) said ORF3 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 2, and / or

c) 상기 ORF4가 서열 번호 3으로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,c) the ORF4 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 3, and / or

d) 상기 ORF5가 서열 번호 4로 정의된 핵산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 추가적 특징으로 하는, 도면에서 약독화된 바이러스 A로 명시된 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스이다.d) attenuated in the figures further characterized by the fact that ORF5 comprises a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 4, or a fragment, allelic variant, functional variant, variant, fusion molecule or chemical derivative thereof based on the degenerate nucleic acid code An attenuated European PRRS virus according to the invention, designated virus A.

본 발명에서의 "단편"은 PRRS 바이러스 또는 본 발명에서의 ORF의 임의의 면역원성의 단위, 즉 상기에서 밝혀진 것보다 더 짧은 핵산 분자에 의해서 암호화되나, 여전히 활성은 남겨진 점을 특징으로 하는 임의의 폴리펩티드 단위이다."Fragments" in the present invention are any of those characterized by a PRRS virus or any immunogenic unit of the ORF in the present invention, i.e., a nucleic acid molecule that is shorter than that found above, but still having activity. Polypeptide unit.

PRRS 바이러스 또는 본 발명에서의 ORF의 "기능적 변이체"는 PRRS 바이러스 또는 본 발명에서의 ORF와 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적이든 구조적이든)을 갖춘 PRRS 바이러스 또는 ORF이다. 또한 "기능적 변이체"의 용어는 "단편", "대립 형질 변이체", "기능적 변이체", "축퇴성 핵산 코드에 기초한 변이체" 또는 "화학적 유도체"를 포함한다. 예를 들어 상기 "기능적 변이체"는 하나 또는 다수의 점 돌연변이, 하나 또는 다수의 핵산 교환, 결실 또는 삽입 또는 하나 또는 다수의 아미노산 교환, 결실 또는 삽입을 가지고 있을 수 있다. 상기 기능적 변이체는 여전히 생물학적 활성, 예를 들면 백신 균주와 같은 기능을 보유하고 있고, 상기 생물학적 활성을 적어도 어느 정도 또는 완전히 향상시키고 있다.A “functional variant” of a PRRS virus or ORF in the present invention is a PRRS virus or ORF having a biological activity (either functional or structural) substantially similar to the PRRS virus or ORF in the present invention. The term "functional variant" also includes "fragments", "allelic variants", "functional variants", "variants based on degenerate nucleic acid codes" or "chemical derivatives". For example, the "functional variant" may have one or multiple point mutations, one or multiple nucleic acid exchanges, deletions or insertions or one or multiple amino acid exchanges, deletions or insertions. The functional variant still retains biological activity, such as a vaccine strain, and at least to some extent or fully improves the biological activity.

"유전 암호의 축퇴성에 기초한 변이체"는 임의의 아미노산이 각기 다른 뉴클레오티드 트리플랫에 의해 암호화된다는 사실에 기인한 변이체이다. 상기 변이체는 여전히 생물학적 활성을 보유하고 있고, 적어도 어느 정도 또는 완전히 상기 생물학적 활성을 향상시키고 있다."Variants based on the degeneracy of the genetic code" are variants due to the fact that any amino acid is encoded by a different nucleotide triplet. The variant still retains biological activity and at least to some extent or fully enhances the biological activity.

본 발명에 따르면 "융합 분자"는 예를 들어 방사선마커와 같은 리포터, 형광 마커와 같은 화학적 분자 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 다른 분자가 융합된 PRRS 바이러스 또는 ORF가 될 수 있다.According to the present invention a “fusion molecule” can be a PRRS virus or ORF fused with a reporter such as, for example, a radiation marker, a chemical molecule such as a fluorescent marker, or any other molecule known in the art.

명세서에서 사용된 것처럼, 본 발명에서의 "화학적 유도체"는 본 발명에 따라서 화학적으로 변형되거나 또는 일반적으로 분자의 부분이 아닌 부가적인 화학적 잔기를 포함하는 PRRS 바이러스 또는 ORF이다. 상기 잔기는 분자의 용해성, 흡수, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다.As used herein, a "chemical derivative" in the present invention is a PRRS virus or ORF that contains additional chemical moieties that are chemically modified or generally not part of a molecule in accordance with the present invention. Such moieties may enhance solubility, absorption, biological half-life, etc. of the molecule.

분자는 만일 두 분자가 구조 또는 생물학적 활성이 대체적으로 유사하다면 다른 분자에 대해서 "실질적으로 유사"하다. 그러므로, 두 분자가 유사한 활성을 가지고 있다면, 이들은 만일 한 분자의 구조가 다른 분자에서 발견되지 않거나 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않다면 명세서에서 사용되는 용어로서 변이체로 여겨진다.A molecule is "substantially similar" to another molecule if the two molecules are largely similar in structure or biological activity. Therefore, if two molecules have similar activity, they are considered variants as terms used in the specification if the structure of one molecule is not found in another molecule or the sequence of amino acid residues is not identical.

본 발명의 다른 가장 바람직한 양태는 상기 핵산이 :Another most preferred aspect of the invention is that the nucleic acid is:

a) 상기 ORF2가 서열 번호 1로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,a) the ORF2 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 1, and / or

b) 상기 ORF3이 서열 번호 2로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,b) said ORF3 consists of a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 2, and / or

c) 상기 ORF4가 서열 번호 3로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,c) the ORF4 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 3, and / or

d) 상기 ORF5가 서열 번호 4로 정의된 핵산으로 이루어짐을 추가적 특징으로 하는, 본 발명에 따라서 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도에서 약독화된 바이러스 A로 명시됨)이다.d) an attenuated European PRRS virus according to the invention (specified as attenuated virus A in the figure), further characterized by said ORF5 consisting of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 4.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 상기 핵산이 서열 번호 5로 정의되는 핵산 또는 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽된 PRRS 바이러스(도면에서 약독화된 바이러스 A로 명시됨)이다.Another preferred aspect of the invention is characterized in that the nucleic acid comprises a nucleic acid or fragment thereof, an allelic variant, a functional variant, a variant based on a degenerate nucleic acid code, a fusion molecule or a chemical derivative as defined in SEQ ID NO: 5. Attenuated European PRRS virus according to the invention (designated as attenuated virus A in the figure).

본 발명의 또다른 가장 바람직한 양태는 상기 핵산이 서열 번호 5로 정의된 핵산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 약독화된 바이러스 A로 명시됨)이다.Another most preferred embodiment of the invention is the attenuated European PRRS virus according to the invention (designated as attenuated virus A in the figure), characterized in that the nucleic acid consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 5.

본 발명의 또다른 바람직한 양태는 상기 핵산이 :Another preferred embodiment of the invention is that the nucleic acid is:

a) 상기 ORF2가 서열 번호 6로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,a) said ORF2 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 6, and / or

b) 상기 ORF3이 서열 번호 7로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,b) the ORF3 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 7, and / or

c) 상기 ORF4가 서열 번호 8로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,c) the ORF4 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 8, and / or

d) 상기 ORF5가 서열 번호 9로 정의된 핵산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 추가적 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 레리스타드-B)이다.d) attenuation according to the invention, further characterized in that said ORF5 comprises a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 9, or a fragment, allelic variant, functional variant, variant, fusion molecule or chemical derivative thereof based on the degenerate nucleic acid code European PRRS virus (Leistard-B in the figure).

본 발명의 또다른 가장 바람직한 양태는 상기 핵산이 :Another most preferred aspect of the invention is that the nucleic acid is:

a) 상기 ORF2가 서열 번호 6로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,a) the ORF2 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 6, and / or

b) 상기 ORF3이 서열 번호 7로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,b) said ORF3 consists of a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 7, and / or

c) 상기 ORF4가 서열 번호 8로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,c) the ORF4 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 8, and / or

d) 상기 ORF5가 서열 번호 9로 정의된 핵산으로 이루어짐을 추가적 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 레리스타드-B)이다.d) an attenuated European PRRS virus according to the present invention (Leistard-B in the figure), further characterized by said ORF5 consisting of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 9.

본 발명의 다른 중요한 양태는 상기 PRRS 바이러스가 :Another important aspect of the invention is the PRRS virus:

a) ORF1a가 서열 번호 10으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,a) ORF1a comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 10, and / or

b) ORF1b가 서열 번호 11으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,b) ORF1b comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 11, and / or

c) ORF2가 서열 번호 12으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,c) ORF2 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 12, and / or

d) ORF3이 서열 번호 13으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,d) ORF3 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 13, and / or

e) ORF4가 서열 번호 14으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,e) ORF4 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 14, and / or

f) ORF5가 서열 번호 15으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,f) ORF5 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 15, and / or

g) ORF6이 서열 번호 16으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,g) ORF6 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 16, and / or

h) ORF7이 서열 번호 17으로 정의된 아미노산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 당화된 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 약독화된 바이러스 A)이다.h) Attenuated European PRRS virus (attenuated in figure), characterized in that ORF7 comprises an amino acid as defined in SEQ ID NO: 17, or is a fragment, allelic variant, functional variant, glycated variant, fusion molecule or chemical derivative thereof Virus A).

본 발명에 따른 또다른 더욱 바람직안 양태는 상기 PRRS 바이러스가 :Another more preferred embodiment according to the invention is that said PRRS virus comprises:

a) ORF1a가 서열 번호 10으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,a) ORF1a consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 10, and / or

b) ORF1b가 서열 번호 11으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,b) ORF1b consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 11, and / or

c) ORF2가 서열 번호 12으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,c) ORF2 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 12, and / or

d) ORF3이 서열 번호 13으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,d) ORF3 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 13, and / or

e) ORF4가 서열 번호 14으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,e) ORF4 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 14, and / or

f) ORF5가 서열 번호 15으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,f) ORF5 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 15, and / or

g) ORF6이 서열 번호 16으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,g) ORF6 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 16, and / or

h) ORF7이 서열 번호 17으로 정의된 아미노산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 약독화된 바이러스 A)이다.h) an attenuated European PRRS virus (attenuated virus A in the drawing) according to the invention, characterized in that ORF7 consists of the amino acids defined in SEQ ID NO: 17.

본 발명의 다른 매우 중요한 양태는 상기 PRRS 바이러스가 :Another very important aspect of the invention is the PRRS virus:

a) ORF2가 서열 번호 18로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 18, and / or

b) ORF3이 서열 번호 19로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 19, and / or

c) ORF4가 서열 번호 20로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,c) ORF4 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 20, and / or

d) ORF5가 서열 번호 21로 정의된 아미노산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 당화된 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 레리스타드-B)이다.d) an attenuated European PRRS virus (Relist) in which the ORF5 comprises an amino acid as defined in SEQ ID NO: 21, or is a fragment, allelic variant, functional variant, glycated variant, fusion molecule or chemical derivative thereof -B).

본 발명의 또다른 더 바람직한 양태는 상기 PRRS 바이러스가 :Another more preferred aspect of the invention is that the PRRS virus is:

a) ORF2가 서열 번호 18로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나 ,a) ORF2 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 18, and / or

b) ORF3이 서열 번호 19로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,b) ORF3 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 19, and / or

c) ORF4가 서열 번호 20로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,c) ORF4 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 20, and / or

d) ORF5가 서열 번호 21로 정의된 아미노산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스(도면에서 레리스타드-B)이다.d) an attenuated European PRRS virus (Leistard-B in the figure), characterized in that ORF5 consists of the amino acids defined in SEQ ID NO: 21.

게다가 본 발명의 다른 중요한 양태는 상기에서 기술한 것처럼 본 발명에 따라 바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 밝혀진 서열(예를 들면, (<400>이하로 주어진) 동정 번호 1 내지 9 = 서열번호)을 포함한다. 본 발명은 추가적으로 서열 번호 10 내지 21로 밝혀진 단백질에 관한 것이다.Moreover, another important aspect of the present invention is the nucleotide sequence encoding the virus according to the present invention as described above. The nucleotide sequence comprises a sequence identified in the sequence listing (eg, identification numbers 1 to 9 = SEQ ID NO) (given below <400>). The present invention further relates to proteins identified as SEQ ID NOs: 10-21.

더욱이 본 발명의 다른 바람직한 양태는 뉴클레오티드 서열이 독성 마커 및/또는 혈청학적 마커를 암호화하도록 변형된, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이다. 도입부에서 언급한 것과 같이, 돼지의 건강 관리는 약제학적 조성의 독성이 약한 생균 백신 균주와 독성이 있는 야생형 바이러스 감염 사이를 구별할 수 있는 것이 중요하다. 이는 흔히 어려운데, 현장 감염의 임상적 증상이 그렇게 특이하지 않거나 다른 감염이 첨가되거나 관찰 및 평가에 대한 기간이 짧은 경우에 특히 어렵다. 관심 있는 바이러스의 재조합 생산은 혈청학적 마커 및/또는 독성 마커를 확립한 유전 암호에서 변형의 도입을 허용한다. 혈청학적 마커는 감염된 세포나 인후두액 또는 비액 또는 소변으로 제한되지 않는 체액으로부터 분리될 수 있는 펩티드, 단백질, 당단백질과 같은 항원적으로 검출할 수 있는 분자를 언급한다. 독성 마커는 PCR이나 전통적인 서열 분석으로 제한되지 않는 재조합 분석 방법으로 동정될 수 있는 유전 암호에서 마커로 이해된다. 그러므로, 바람직한 양태로서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열이 독성 마커 및/또는 혈청학적 마커를 암호화하도록 변형된, 본발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 돌연변이 또는 결실은 독성 또는 혈청학적 마커로서 유용한 비루사레(virusare)를 약독화시킬 목적으로 도입된다. 밝혀진 독성 특이 부위에서 돌연변이를 감시함으로써 초기 단계에서 가능한 독성 있는 복귀돌연변이체의 출현을 예상하는 것이 가능하다.Moreover, another preferred embodiment of the invention is the nucleotide sequence according to the invention, wherein the nucleotide sequence has been modified to encode toxic markers and / or serological markers. As mentioned in the introduction, it is important that pig health care be able to distinguish between virulent vaccine strains with weak pharmaceutical compositions and toxic wild type virus infections. This is often difficult, especially if the clinical symptoms of the field infection are not so specific or if other infections are added or the time period for observation and evaluation is short. Recombinant production of the virus of interest allows introduction of modifications in the genetic code that established serological and / or virulence markers. Serological markers refer to antigenically detectable molecules such as peptides, proteins, glycoproteins that can be isolated from infected cells or throat fluids or body fluids that are not limited to nasal or urine. Toxic markers are understood as markers in genetic code that can be identified by recombinant or analytical methods that are not limited to PCR or conventional sequencing. Therefore, in a preferred embodiment, the present invention relates to a nucleotide sequence according to the invention, wherein the nucleotide sequence has been modified to encode toxic markers and / or serological markers. In particular, mutations or deletions are introduced for the purpose of attenuating virusareas useful as toxic or serological markers. By monitoring mutations at the specific sites of toxicity identified, it is possible to anticipate the emergence of possible toxic backmutants at an early stage.

게다가 본 발명의 다른 바람직한 양태는 상기 마커를 암호화하는 핵산이 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임의 임의의 부위에 위치하는, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이다.Furthermore, another preferred embodiment of the invention is the nucleotide sequence according to the invention, wherein the nucleic acid encoding the marker is located at any site in an open reading frame encoding the viral structural protein.

또다른 면에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열인, 완전한 길이의 DNA 복제물 또는 시험관내-전사된 RNA 복제물 또는 상기 상기 DNA 또는 RNA중 하나의 유도체 중 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산을 생산하는 방법을 포함하는, 감염성있는 약독화된 PRRS 생균 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 상기 방법은 위에서 기술된 PRRS 바이러스에 이른다. 당업자는 상기에서 밝혀진 것과 같은 PRRS 바이러스를 획득하기 위해서 지정부위 돌연변이 유발[참고 자료 : Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cod Spring Harbor, New York ; Chapter 15 ; Wu(ed.) (1993), Methods in Enzymology Vol 217, p. 173-285] 또는 돌연변이(들)를 특이하게 삽입하기 위한 돌연변이(들)를 삽입하는 임의의 다른 방법을 사용할 수 있다.In another aspect, the invention provides a recombinant nucleic acid comprising at least one of a full length DNA copy or an in vitro-transcribed RNA copy or a derivative of one of said DNA or RNA, wherein the nucleotide sequence is a nucleotide sequence according to the invention. It relates to a method for producing an infectious attenuated PRRS probiotic virus, including the method of producing the same. Therefore, according to the invention, the method leads to the PRRS virus described above. Those skilled in the art will recognize site mutagenesis to obtain a PRRS virus as identified above. [Reference: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cod Spring Harbor, New York; Chapter 15; Wu (ed.) (1993), Methods in Enzymology Vol 217, p. 173-285 or any other method of inserting a mutation (s) to specifically insert a mutation (s) can be used.

다음의 바람직한 면에서 나타나는 방법은 위에서 기술한 것처럼 본 발명에따른 (유전자 수준에서) PRRS 바이러스에 이른다. 그러므로, 다른 바람직한 면에서, 본 발명은 :In the following preferred aspect the method leads to the PRRS virus (at the gene level) according to the invention as described above. Therefore, in another preferred aspect, the invention is:

a) 본 발명에 따른 PRRS 바이러스를 적합한 세포주를 감염시키는데 사용하는 단계, 및a) using the PRRS virus according to the invention to infect a suitable cell line, and

b) 상기 PRRS 바이러스를 세포 계대 배양을 통해서 추가로 약독화시키는 단계를 특징으로 하는, 감염성있는 약독화된 PRRS 생균 바이러스를 생산하기 위해 기술된 방법에 관한 것이다.b) the method described for producing an infectious attenuated PRRS live virus, characterized by further attenuating said PRRS virus through cell passage culture.

다른 바람직한 면에서, 본 발명은 상기 세포주가 원숭이 배아 신장 세포 또는 바람직하게 마르크(Marc) 세포 또는 이의 유도체(하기 참조)인, 상기 기술된 방법에 관한 것이다.In another preferred aspect, the invention relates to the method described above, wherein said cell line is a monkey embryonic kidney cell or preferably a Mark cell or a derivative thereof (see below).

또다른 바람직한 면에서, 본 발명은 상기 PRRS 바이러스가 상기에서 기술된 것처럼 본 발명에 따른 바이러스인, 상기 방법에 관한 것이다.In another preferred aspect, the invention relates to the above method, wherein said PRRS virus is a virus according to the invention as described above.

추가적인 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 PRRS 바이러스를 포함하는 세포주에 관한 것이다. 이 세포주에 대한 실시예는 당업자에게 알려진 영구 세포주, 바람직하게 배아 신장(HEK)293, BHK, GH3, H4, U373, NT2, PC12, COS, CHO, Ltk-, 섬유모세포, 골수암세포, 신경모세포, 하이브리도마, 난모세포, 배아 줄기세포와 같은, 돼지, 원숭이 또는 사람 세포주, 곤충 세포주(예를 들면, pPbac 또는 pMbac[참고 : Stratagene, La Jolla, USA]와 같은 배큘로바이러스 벡터 사용), 효모(예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 pYESHIS[참고 : Invitrogen, SanDiego, USA]와 같은 효모 발현 벡터 사용), 및 곰팡이를 포함한다.In a further aspect, the invention relates to a cell line comprising the PRRS virus according to the invention. Examples for this cell line is known to those skilled in the art permanent cell line, preferably embryonic kidney (HEK) 293, BHK, GH3, H4, U373, NT2, PC12, COS, CHO, Ltk -, fibroblasts, bone marrow cancer cells, neural stem cells, Pig, monkey or human cell lines, such as hybridomas, oocytes, embryonic stem cells, insect cell lines (for example, using baculovirus vectors such as pPbac or pMbac [Stratagene, La Jolla, USA]), yeast (Eg, using yeast expression vectors such as Pichia pastoris or pYESHIS (Invitrogen, San Diego, USA)), and fungi.

추가의 바람직한 면에서, 본 발명은 상기 세포주가 원숭이 배아 신장 세포 또는 바람직하게 마르크 세포 또는 이의 유도체인, 본 발명에 따른 세포주에 관한 것이다.In a further preferred aspect, the invention relates to a cell line according to the invention, wherein said cell line is a monkey embryo kidney cell or preferably a mark cell or a derivative thereof.

추가적인 면에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 유럽 PRRS 바이러스의 뉴클레오티드 서열이 지정부위 돌연변이 유발에 의해서 서열 번호 22의 130 내지 150 위치 및/또는 252 내지 272 위치 및/또는 273 내지 293 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF2의 위치에서 변형되는 단계 ;a) the nucleotide sequence of the European PRRS virus is modified at the position of at least one ORF2 corresponding to positions 130 to 150 and / or 252 to 272 and / or 273 to 293 of SEQ ID NO: 22 by site mutagenesis;

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부를 실험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법 또는 과정을 포함한다.b) attenuating the method or procedure for attenuating the European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

본 명세서에서, 다른 서열의 위치에 "상응하는" 핵산 또는 아미노산 서열 내에서 위치는 만일 두 서열이 BLAST[참고 자료 : Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215 : 403-410 ; Gish, W. & States, D. J. (1993) "Identification of protein coding regions by databases similarity search." Nature Genet. 3 : 266-272 ; Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Madden, T. l. (1997) "Power BLAST : A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7 : 649-656 ; Altschul, Stephen F., Thomas, L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Grapped BLASTand PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs", Nucleic acids Res. 25 : 3389-3402]와 같은 표준적인 정렬 알고리즘으로 정렬될 수 있는 충분한 구조적 유사함을 가지고, 상기 정렬이 된다면, 두 위치는 쌍으로 정렬될 수 있다는 것을 의미한다.As used herein, a position within a nucleic acid or amino acid sequence that "corresponds to" the position of another sequence is such that if both sequences are BLAST [Reference: Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. & States, D. J. (1993) "Identification of protein coding regions by databases similarity search." Nature Genet. 3: 266-272; Madden, T. L., Tatusov, R. L. & Madden, T. l. (1997) "Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7: 649-656; Altschul, Stephen F., Thomas, L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Grapped BLASTand PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs ", Nucleic acids Res. 25: 3389-3402], with sufficient structural similarity that can be aligned with a standard alignment algorithm, such that if the alignment is made, the two positions can be aligned in pairs.

추가적인 양태에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 유럽 PRRS 바이러스의 뉴클레오티드 서열이 지정부위 돌연변이 유발에 의해서서열 번호 23의 267 내지 287 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF3 위치에서 변형되는 단계 : 및a) the nucleotide sequence of the European PRRS virus is modified at one or more ORF3 positions corresponding to positions 267 to 287 of SEQ ID NO: 23 by site mutagenesis: and

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부를 실험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법에 관한 것이다.b) a method for attenuating a European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

추가적인 양태에서, 본 발명은In a further aspect, the present invention

a) 유럽 PRRS 바이러스의 뉴클레오티드 서열이 지정부위 돌연변이 유발에 의해서 서열 번호 24의 201 내지 221 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF5 위치에서 변형되는 단계 : 및a) the nucleotide sequence of the European PRRS virus is modified at one or more ORF5 positions corresponding to positions 201 to 221 of SEQ ID NO: 24 by site mutagenesis: and

b) 수득된 PRRS 바이러스가 약독화되었는지 여부를 실험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법에 관한 것이다.b) a method for attenuating a European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus has been attenuated.

바람직하게, 상기 기술된 변형은 암호화된 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래한다. 바람직하게, 상기 변형은 결실 또는 치환이다. 바람직한 양태에서, ORF2, ORF3, 및 ORF5의 각각의 서열은 변형된다. 다른 바람직한 양태에서, ORF2의 서열은 두 개 이상, 바람직하게 세 개 이상의 위치에서 변형된다. 바람직하게, 변형은 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 47, 88 및/또는 95 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 위치에서 아미노산이 치화되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF2 ; 서열 번호 23에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 93 위치에 상응하는 아미노산이 치화되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF3 ; 및/또는 서열 번호 24에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 71 위치에 상응하는 아미노산이 치화되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF5의 특성 중의 하나 이상을 초래한다.Preferably, the modifications described above result in a change in the amino acid sequence of the encoded protein. Preferably, the modification is deletion or substitution. In a preferred embodiment, each sequence of ORF2, ORF3, and ORF5 is modified. In another preferred embodiment, the sequence of ORF2 is modified at two or more, preferably three or more positions. Preferably, the modification comprises an ORF2 encoding a protein in which the amino acid is substituted or deleted at one or more amino acid sequence positions corresponding to the 47, 88 and / or 95 positions of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22; ORF3, which encodes a protein in which the amino acid corresponding to position 93 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 23 is substituted or deleted; And / or the amino acid corresponding to position 71 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 24 results in one or more of the properties of ORF5 encoding a protein that is substituted or deleted.

더욱 바람직하게, 상기 방법에 의해 만들어진 변형은 : 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 47 위치에 상응하는 위치에 세린을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 88 위치에 상응하는 위치에 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 95 위치에 상응하는 위치에 류신을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 23에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 93 위치에 상응하는 위치에 프롤린을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 71 위치에 상응하는 위치에 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 암호화하는 ORF5의 특성 중의 하나 이상, 바람직하게 모두를 초래한다.More preferably, the modifications made by the method include: ORF2, which encodes a protein comprising serine at a position corresponding to position 47 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22, 88 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22 ORF2, which encodes a protein comprising phenylalanine at a position corresponding to the position, ORF2, which encodes a protein comprising leucine at a position corresponding to position 95 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22, encoded by SEQ ID NO: 23 ORF3, which encodes a protein comprising proline at a position corresponding to position 93 of the amino acid sequence, and / or ORF5, which encodes a protein comprising phenylalanine at a position corresponding to position 71 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 24. Results in one or more, preferably all, of the properties.

바람직한 양태에서, 변형은 : 서열 번호 22의 140 위치에 상응하는 위치에 C를 포함하는 ORF2, 서열 번호 22의 262 위치에 상응하는 위치에 T를 포함하는 ORF2, 서열 번호 22의 283 위치에 상응하는 위치에 C를 포함하는 ORF2, 서열 번호 23의 277 위치에 상응하는 위치에 C를 포함하는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24의 211위치에 상응하는 위치에 T를 포함하는 ORF5의 특성 중의 하나 이상, 바람직하게 모두를 초래한다.In a preferred embodiment, the modification is: ORF2 comprising a C at a position corresponding to position 140 of SEQ ID NO: 22, an ORF2 comprising a T at a position corresponding to position 262 of SEQ ID NO: 22, corresponding to position 283 of SEQ ID NO: 22 At least one of the properties of ORF2 comprising C at position, ORF3 comprising C at position 277 of SEQ ID NO: 23, and / or ORF5 comprising T at position corresponding to position 211 of SEQ ID NO: 24, Preferably results in all.

추가적 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 획득할 수 있는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다.In a further aspect, the invention relates to attenuated European PRRS virus obtainable by the method described above.

추가적 양태에서, 본발명은 130 내지 150의 하나 이상의 위치에서, 및/또는 252 내지 272의 하나 이상의 위치에서, 및/또는 273 내지 293의 하나 이상의 위치에서 서열 번호 22와 상이한 ORF2를 포함하는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다.In a further aspect, the invention comprises an attenuation comprising ORF2 different from SEQ ID NO: 22 at one or more positions from 130 to 150, and / or at one or more positions from 252 to 272, and / or at one or more positions from 273 to 293 European PRRS virus.

추가적 양태에서, 본 발명은 267 내지 287의 하나 이상의 위치에서 서열 번호 23과 상이한 ORF3을 포함하는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다.In a further aspect, the invention relates to an attenuated European PRRS virus comprising ORF3 different from SEQ ID NO: 23 at one or more positions of 267 to 287.

추가적 양태에서, 본 발명은 201 내지 221의 하나 이상의 위치에서 서열 번호 24와 상이한 ORF5를 포함하는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스에 관한 것이다.In a further aspect, the present invention relates to an attenuated European PRRS virus comprising ORF5 different from SEQ ID NO: 24 at one or more positions 201 to 221.

추가적 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용될 수 있는 담체와의 조합으로 상기 기술된 약독화된 유럽 PRRS 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다. 추가적 양태에서, 본 발명은 상기 백신의 유효량을 돼지에게 투여하는 것을 특징으로 하는, PRRS에 대한 돼지의 예방 접종 방법에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 PRRS에 대한 백신의 제조를 위한 기술된 바와 같은 약독화된 유럽 PRRS 바이러스의 용도에 관한 것이다.In a further aspect, the invention relates to a vaccine comprising the attenuated European PRRS virus described above in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. In a further aspect, the present invention relates to a method of vaccination of pigs with PRRS, characterized in that an effective amount of said vaccine is administered to the pigs. Alternatively, the present invention relates to the use of the attenuated European PRRS virus as described for the manufacture of a vaccine against PRRS.

바람직하게, 약독화된 PRRS 생균 바이러스는 야생형의 PRRS 바이러스에 의해 유발된 질병의 치료, 예방 또는 진단에 사용될 수 있다. 상기 질병 및 용도는 실시예 1에서 예시된다, 본 발명의 추가적인 면은 본 발명의 바이러스의 용도에 관한 것이다. 약독화의 상기에서 정의된 분자적 기초로 당업계에 공지된 바이러스보다 훨씬 우월하다. 특히 독성 특이 부위에서 결실을 포함하는 본 발명에 따른 바이러스의 용도는 결실이 복귀하는 경향이 덜하기 때문에 선호된다.Preferably, the attenuated PRRS live virus can be used for the treatment, prevention or diagnosis of diseases caused by wild-type PRRS virus. The disease and use are illustrated in Example 1, a further aspect of the invention relates to the use of the virus of the invention. The molecular basis defined above for attenuation is much superior to viruses known in the art. The use of the virus according to the invention, particularly including deletions at toxic specific sites, is preferred because the deletions are less prone to return.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 본 발명에 따른 하나 또는 여럿의 PRRS 바이러스 및 약제학적으로 허용 되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 바람직한 면은 본 발명에 따른 상기 약독화된 유럽 PRRS 바이러스뿐 아니라, 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)에서, RespPRRS/IngelvacRPRRS MLV라는 상표하에 약제학적 조성물로 판매되는 바이러스와 같은 약독화된 US PRRS 바이러스까지도 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 본 발명에 의한 PRRS 바이러스의 서방출 제형의 일부를 형성하거나 이의 흡수를 증가시키거나 안정화시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용 가능한 화합물을 함유할 수 있다. 상기 생리학적으로 허용되는 화합물은, 예를 들면, 글루코스, 수크로즈 또는 덱스트란 같은 탄수화물, 아스코브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이팅제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정제 또는 부형제[참고 자료 : Remington's Pharmaceutical Sciences (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton]를 포함한다. 당업자는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은, 예를 들면, 조성물의 투여 경로에 좌우되다는 것을 알 수 있다. 가장 바람직하게, 조성물은 감염된 세포 배양액의 바이러스를 함유한 상층액(조직 배양액)을 수득하고 선택적으로 안정제를 부가한 후, 상기 상층액을 동결 건조함으로써 제형화된다. 동결 건조된 조성물은 투여 전에 물로 재구성할 수 있다. 다른 실시예에서, 적절한 담체는 생리 식염수일 수 있다. 바람직하게, 약제학적 혼합물은 근육 내로 또는 진피 내로 주사된다. 본 발명에 의한 백신은 1, 3, 6 또는 10주된 암퇘지의 예방 접종 기록에 따라 암돼지에게, 짝짓기 전 및/또는 분만 전 6주까지 (추가 예방 접종), 또는 수퇘지에게 반년마다 (추가 접종) 투여할 수 있다.Another preferred embodiment of the invention is a pharmaceutical composition comprising one or more PRRS viruses according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferred aspects are the attenuated US PRRS virus, such as the attenuated European PRRS virus according to the invention, as well as the virus sold in the pharmaceutical composition under the trademark RespPRRS / Ingelvac R PRRS MLV in Boehringer Ingelheim. It is a pharmaceutical composition comprising even. Pharmaceutically acceptable carriers may contain, for example, physiologically acceptable compounds which act to form part of, increase or stabilize the absorption of the sustained release formulation of the PRRS virus according to the invention. Such physiologically acceptable compounds include, for example, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers or excipients [Remington's Pharmaceutical Sciences (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton. Those skilled in the art will appreciate that the choice of pharmaceutically acceptable carrier, including physiologically acceptable compounds, depends, for example, on the route of administration of the composition. Most preferably, the composition is formulated by obtaining a supernatant (tissue culture) containing the virus of infected cell culture and optionally adding a stabilizer, followed by freeze drying of the supernatant. Lyophilized compositions can be reconstituted with water prior to administration. In other embodiments, a suitable carrier may be physiological saline. Preferably, the pharmaceutical mixture is injected into the muscle or into the dermis. The vaccine according to the present invention can be applied to sows, up to 6 weeks before mating and / or before delivery (additional vaccination), or to boars every half year (additional vaccination) according to the vaccination records of 1, 3, 6 or 10 week old sows. May be administered.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 PRRS 감염의 예방 및 치료를 위한 백신의 재조에서 본 발명에 의한 PRRS 바이러스의 용도이다.Another preferred aspect of the invention is the use of a PRRS virus according to the invention in the manufacture of a vaccine for the prevention and treatment of PRRS infection.

다음의 실시예는 본 발명의 추가적인 설명을 제공한다 ; 그러나 동시에 명세서에서 기재된 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석할 수 없다.The following examples provide further explanation of the invention; At the same time, however, it cannot be interpreted as limiting the scope of the invention described in the specification.

실시예 1Example 1 약독화의 확립Establishment of attenuation

본 실시예는 PRRS 바이러스의 두 가지 다른 균주의 독성 비교에 대한 명확한 지침을 제공한다. 전형적인 독성있는 유럽 균주에 대한 참고 균주는 레리스타드 인자(CDI-NL-2.91)의 적은 횟수의 세포 계대 배양(5회 이하)을 수행할 수 있다.This example provides clear guidance for comparing the toxicity of two different strains of PRRS virus. Reference strains to typical toxic European strains can be performed with a small number of cell passages (up to 5) of the Leistard factor (CDI-NL-2.91).

PRRS 바이러스에 노출되지 않은 농장에서, 그룹당 10마리 이상의 어린 암퇘지를 각각의 실험에 포함한다. 동물을 PRRS 바이러스 특이 혈청 항체가 없고 PRRSV 음성인지를 실험한다. 실험에 포함된 모든 동물은 동일한 기원이고 임의의 PRRSV감염에 병력상 자유로운 농장에서 사육된다. 그룹당 동물 할당은 무작위적이다. 챌린지는 콧구멍당 105TDCID50(세 번째 계대 배양)의 1 ml PRRSV를 비내 적용하여 임신한지 85 내지 90일째 동물에게 수행한다. 각 실험 설비당 세 그룹 이상이 있다 :On farms not exposed to the PRRS virus, at least 10 young sows per group are included in each experiment. Animals are tested for no PRRS virus specific serum antibodies and PRRSV negative. All animals involved in the experiments are raised on farms of the same origin and medically free of any PRRSV infection. Animal allocation per group is random. Challenges are performed on animals 85 to 90 days of gestation by intranasally applying 1 ml PRRSV of 10 5 TDCID 50 per third nostril (third passage culture). There are more than three groups for each experimental facility:

레리스타드 인자(CDI-NL-2.91) 챌린지에 대한 첫 번째 그룹 ; 가능한 약독화된 바이러스로 챌린지한 하나의 실험군 ; 및 하나의 절대적 대조군.First group for the Leistard factor (CDI-NL-2.91) challenge; One experimental group challenged with a possible attenuated virus; And one absolute control.

본 연구에 대한 타당성은 절대적 대조군이 연구 시간 경과동안 PRRS가 없는 상태를 유지하고, 절대적 대조군과 비교하여서 최대 25% 이하의 건강한 새끼 돼지가 레리스타드 인자로 챌린지된 실험군에서 태어났을 때 얻는다.Feasibility for this study is obtained when the absolute control remains free of PRRS over the course of the study, and up to 25% of the healthy piglets, as compared to the absolute control, were born in the experimental group challenged with the Leistard factor.

약독화, 즉 독성이 약함은 출산능을 결정하는 하나 이상의 변수의 통계학상 유의적 변화로 정의된다 :Attenuation, or weak toxicity, is defined as a statistically significant change in one or more variables that determine fertility:

실험군에서 다음의 변수 중 하나 이상에서 유의적인 감소가 바람직하다 :Significant decreases in one or more of the following variables in the experimental group are desirable:

·사산빈도Stillbirth frequency

·임신 112일 또는 그 전의 유산· 112 days before pregnancy

·미이라화된 새끼 돼지의 수Number of mummified piglets

·살아있고 약한 새끼 돼지의 수Number of live and weak piglets

·젖 떼기 전의 사망률Mortality before weaning

또는 더우기 실험군에서 다음의 변수 중 하나에서 유의적 증가가 바람직하다 :Or moreover, a significant increase in one of the following variables in the experimental group is desirable:

·암퇘지당 젖 떼는 새끼 돼지의 수Number of piglets weaning per sow

·암퇘지당 살아있는 건강한 새끼 돼지의 수Number of live healthy piglets per sow

·레리스타드 인자 감염 그룹과의 비교Comparison with the Leistid factor infection group

실시예에서 다음의 결과는 레리스타드 인자의 147th세포 계대 배양과 함께 제시된 설명에 따라 임상적 실험으로 얻을 수 있다.The following results in the Examples can be obtained in clinical experiments according to the instructions presented with 147 th cell passage culture of Leistard factor.

계대 배양 수준Passage culture level 생존/건강Survival / Health 생존/약함Survival / Weak 사산stillbirth 미이라화됨Mummified 암퇘지당 출산 한 배 새끼의 평균Average of litters given per sow 55 30.5%30.5% 45.5%45.5% 17.9%17.9% 6.2%6.2% 1111 147147 71.9%71.9% 10.5%10.5% 17.54%17.54% 00 11.411.4

상기에 기술된 것과 같이 레리스타드 인자의 세포 계대 배양 5 (그룹 1) 및 상기의 레리스타드 인자의 세포 계대 배양 147(그룹 2)로 접종한 암퇘지로부터 각각의 암퇘지 출산 데이타가 제시된다. 부가적으로 그룹 3 동물은 절대적 대조군으로 제공되고 PRRSV가 없는 세포 배양 상층액으로만 접종되었다.Respective sow birth data are shown from sows inoculated with cell passage culture 5 of the Leristard factor (group 1) and cell passage culture 147 of the Leristard factor (group 2) as described above. In addition, Group 3 animals served as absolute controls and were inoculated only with cell culture supernatants without PRRSV.

그룹group 접종물의 계대 배양 수준Passage level of inoculum 임신 기간일수Pregnancy Days 태어난 새끼 돼지의 총 수Total number of piglets born 생존/건강Survival / Health 생존/약한Survival / Weak 사산stillbirth 미아라화됨Missed 1One 55 115115 1515 55 77 22 1One 1One 55 111111 77 55 1One 1One 00 1One 55 113113 66 22 22 1One 1One 1One 55 110110 1414 22 1010 22 00 1One 55 115115 1313 00 88 44 1One 그룹 1 평균Group 1 average 1111 2.82.8 5.65.6 2.02.0 0.60.6 %% 100100 30.530.5 45.545.5 17.917.9 6.26.2 22 147147 115115 1313 1111 1One 1One 00 22 147147 113113 1212 1212 00 00 00 22 147147 115115 1010 00 44 66 00 22 147147 115115 88 88 00 00 00 22 147147 115115 1414 1010 1One 33 00 그룹 2 평균Group 2 Average 11.411.4 8.28.2 1.21.2 22 00 %% 100100 71.9371.93 10.5310.53 17.5417.54 00 33 -- 117117 1212 1111 1One 00 00 33 -- 115115 99 88 1One 00 00 33 -- 116116 1414 99 55 00 00 33 -- 115115 66 66 00 00 00 33 -- 115115 1414 1111 33 00 00 33 -- 116116 1515 1414 1One 00 00 그룹 3 평균Group 3 Average 11.711.7 9.89.8 1.81.8 00 00 %% 100100 86.186.1 13.913.9 00 00

Claims (42)

하기와 같은 특징이 있는, ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 및 ORF7을 포함하는 핵산에 의해서 암호화된 약독화된(attenuated) 유럽 PRRS 바이러스 :Attenuated European PRRS virus encoded by nucleic acids, including ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 and ORF7, having the following characteristics: a) ORF2는 11915 내지 11935의 위치에서 표 1에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :a) ORF2 is one or more nucleotides described in Table 1 at positions 11915-11935: 표 1Table 1 AA TT GG AA CC CC AA GG AA AA CC GG AA AA GG AA GG TT CC TT CC CC CC AA CC TT TT CC AA CC CC AA AA CC CC AA CC AA CC AA CC AA GG GG TT GG AA AA GG TT GG GG GG TT GG GG TT GG TT GG TT GG TT
및 12037 내지 12057의 위치에서 표 2에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :And one or more nucleotides described in Table 2 at positions 12037 to 12057: 표 2TABLE 2 TT GG TT TT AA AA AA CC GG TT CC AA GG TT TT CC GG TT GG GG GG CC AA CC CC CC CC CC TT AA CC TT CC AA CC CC TT AA CC AA AA AA GG TT GG GG GG GG GG AA TT GG AA GG TT GG GG AA TT GG TT TT TT
및 12058 내지 12078의 위치에서 표 3에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :And one or more nucleotides described in Table 3 at positions 12058 to 12078: 표 3TABLE 3 TT AA AA CC CC CC AA TT AA CC AA AA AA AA CC CC GG TT GG TT AA CC CC CC TT TT TT CC CC CC TT CC CC CC CC TT TT AA CC AA CC CC GG GG GG AA AA AA GG GG GG AA GG GG GG GG AA AA TT GG TT GG GG
및/또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함하고/하거나,And / or a deletion at said location (s), and / or b) ORF3은 12660 내지 12680의 위치에서 표 4에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :b) ORF3 is one or more nucleotides described in Table 4 at positions 12660-12680: 표 4Table 4 CC AA AA CC AA AA TT TT AA CC AA GG GG TT AA GG GG GG CC AA GG TT CC CC TT CC CC CC CC CC TT CC AA AA CC CC AA AA AA TT CC AA AA GG GG AA GG GG GG GG GG AA GG TT TT GG GG TT TT TT AA GG TT
및/또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함하고/하거나,And / or a deletion at said location (s), and / or c) ORF5는 13684 내지 13704의 위치에서 표 5에서 설명하는 하나 이상의 뉴클레오티드 :c) ORF5 is one or more of the nucleotides described in Table 5 at positions 13684 to 13704: 표 5Table 5 CC TT GG GG AA AA AA CC AA CC GG AA AA AA TT GG GG GG CC CC AA TT CC AA AA CC CC CC TT CC TT AA CC CC CC CC AA AA AA TT TT CC AA GG TT TT GG GG GG AA GG AA TT GG GG GG GG TT TT TT AA AA GG
및/또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함한다.And / or deletions in said location (s).
제1항에 있어서,The method of claim 1, a) ORF2는 11925 위치에서 C,A 또는 G 및/또는 12047 위치에서 C, T 또는 Aa) ORF2 is C, A or G at position 11925 and / or C, T or A at position 12047 및/또는 12068 위치에서 A, C 또는 G 또는 상기 위치(들)에서의 결실을 포함하고/하거나,And / or a deletion at A, C or G at position 12068 or at said position (s), and / or b) ORF3은 12670 위치에서 A, C 또는 G 또는 상기 위치에서의 결실을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises A, C or G at a position 12670 or a deletion at that position, and / or c) ORF5는 13694 위치에서 G, A 또는 T 또는 상기 위치에서의 결실을 포함함을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.c) An attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF5 comprises G, A or T or a deletion at said 13694 position. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산이,The nucleic acid according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid is a) ORF2는 11925 위치에서 C 및/또는 12047 위치에서 T 및/또는 12068 위치에서 C 또는 상기 위치(들)에서 결실을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises a deletion at position C and / or 12047 at position T and / or 12068 at position C and / or deletion at position (s), or b) ORF3은 12670 위치에서 C 또는 상기 위치에서 결실을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises C at position 12670 or a deletion at said position, and / or c) ORF5는 13694 위치에서 T 또는 상기 위치에서 결실을 포함함을 추가로 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.c) Attenuated European PRRS virus, further characterized by OR at position 13694 or T at the position 13694. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이,The nucleic acid according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleic acid is a) ORF2는 서열 번호 1로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 1, and / or b) ORF3은 서열 번호 2로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 2, and / or c) ORF4는 서열 번호 3으로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,c) ORF4 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 3, and / or d) ORF5는 서열 번호 4로 정의된 핵산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 근거한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 추가로 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) Attenuated European PRRS, further characterized as ORF5 comprising a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 4, or a fragment, allelic variant, functional variant, variant, fusion molecule or chemical derivative based on a degenerate nucleic acid code virus. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이,The nucleic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleic acid is a) ORF2는 서열 번호 1로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,a) ORF2 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 1 and / or b) ORF3은 서열 번호 2로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,b) ORF3 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 2, and / or c) ORF4는 서열 번호 3으로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,c) ORF4 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 3, and / or d) ORF5는 서열 번호 4로 정의된 핵산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) An attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF5 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 4. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호 5로 정의된 핵산 또는 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 근거한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체를 포함함을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.The nucleic acid according to any one of claims 1 to 5, wherein the nucleic acid comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 5 or a fragment thereof, an allelic variant, a functional variant, a variant based on a degenerate nucleic acid code, a fusion molecule or a chemical derivative. Attenuated European PRRS virus, characterized in. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열 번호 5로 정의된 핵산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.The attenuated European PRRS virus according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the nucleic acid consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이,The nucleic acid according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleic acid is a) ORF2는 서열 번호 6으로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 6, and / or b) ORF3는 서열 번호 7로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 7, and / or c) ORF4는 서열 번호 8로 정의된 핵산을 포함하고/하거나,c) ORF4 comprises a nucleic acid defined by SEQ ID NO: 8, and / or d) ORF5는 서열 번호 9로 정의된 핵산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 축퇴성 핵산 코드에 근거한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 추가로 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) Attenuated European PRRS, further characterized as ORF5 comprising a nucleic acid as defined in SEQ ID NO: 9, or a fragment, allelic variant, functional variant, variant, fusion molecule or chemical derivative based on a degenerate nucleic acid code virus. 제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이,The nucleic acid according to any one of claims 1 to 3 and 8, wherein the nucleic acid is a) ORF2는 서열 번호 6으로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,a) ORF2 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 6, and / or b) ORF3은 서열 번호 7로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,b) ORF3 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 7, and / or c) ORF4는 서열 번호 8로 정의된 핵산으로 이루어지고/지거나,c) ORF4 consists of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 8, and / or d) ORF5는 서열 번호 9로 정의된 핵산으로 이루어짐을 추가로 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) Attenuated European PRRS virus, further characterized as consisting of the nucleic acid defined by SEQ ID NO: 9. PRRS 바이러스가,PRRS virus, a) ORF1a는 서열 번호 10으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,a) ORF1a comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 10, and / or b) ORF1b는 서열 번호 11로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,b) ORF1b comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 11, and / or c) ORF2는 서열 번호 12로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,c) ORF2 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 12, and / or d) ORF3은 서열 번호 13으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,d) ORF3 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 13, and / or e) ORF4는 서열 번호 14로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,e) ORF4 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 14, and / or f) ORF5는 서열 번호 15로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,f) ORF5 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 15, and / or g) ORF6은 서열 번호 16으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,g) ORF6 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 16, and / or h) ORF7은 서열 번호 17로 정의된 아미노산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 당화된 변이체, 융합 분자 또는 화학적 변이체임을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.h) An attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF7 comprises an amino acid as defined by SEQ ID NO: 17, or is a fragment, allelic variant, functional variant, glycated variant, fusion molecule or chemical variant thereof. 제10항에 있어서, PRRS 바이러스가,The method of claim 10 wherein the PRRS virus, a) ORF1a는 서열 번호 10으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,a) ORF1a consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 10, and / or b) ORF1b는 서열 번호 11로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,b) ORF1b consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 11, and / or c) ORF2는 서열 번호 12로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,c) ORF2 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 12, and / or d) ORF3은 서열 번호 13으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,d) ORF3 consists of the amino acids defined in SEQ ID NO: 13, and / or e) ORF4는 서열 번호 14로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,e) ORF4 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 14, and / or f) ORF5는 서열 번호 15로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,f) ORF5 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 15, and / or g) ORF6은 서열 번호 16으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,g) ORF6 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 16, and / or h) ORF7은 서열 번호 17로 정의된 아미노산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.h) Attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF7 consists of the amino acids defined in SEQ ID NO: 17. PRRS 바이러스가,PRRS virus, a) ORF2는 서열 번호 18로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,a) ORF2 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 18, and / or b) ORF3은 서열 번호 19로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,b) ORF3 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 19, and / or c) ORF4는 서열 번호 20으로 정의된 아미노산을 포함하고/하거나,c) ORF4 comprises the amino acid defined by SEQ ID NO: 20, and / or d) ORF5는 서열 번호 21로 정의된 아미노산을 포함하거나, 이의 단편, 대립 형질 변이체, 기능적 변이체, 당화된 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체임을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) An attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF5 comprises an amino acid as defined in SEQ ID NO: 21, or is a fragment, allelic variant, functional variant, glycated variant, fusion molecule or chemical derivative thereof. 제12항에 있어서, PRRS 바이러스가,The method of claim 12, wherein the PRRS virus, a) ORF2는 서열 번호 18로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,a) ORF2 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 18, and / or b) ORF3은 서열 번호 19로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,b) ORF3 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 19, and / or c) ORF4는 서열 번호 20으로 정의된 아미노산으로 이루어지고/지거나,c) ORF4 consists of the amino acid defined by SEQ ID NO: 20, and / or d) ORF5는 서열 번호 21로 정의된 아미노산으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.d) An attenuated European PRRS virus, characterized in that ORF5 consists of the amino acids defined in SEQ ID NO: 21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 바이러스를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.A nucleotide sequence encoding a virus according to any one of claims 1 to 13. 제14항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 독성 마커(virulence marker) 및/또는 혈청학적 마커를 암호화하도록 변형되는, 뉴클레오티드 서열.The nucleotide sequence of claim 14, wherein the nucleotide sequence is modified to encode a virulence marker and / or a serological marker. 제14항 또는 제15항에 있어서, 마커를 암호화하는 핵산이 바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 임의의 개방 판독 프레임(open reading frame)내에 위치하는, 뉴클레오티드 서열.The nucleotide sequence of claim 14 or 15, wherein the nucleic acid encoding the marker is located within any open reading frame encoding the structural protein of the virus. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열인, 완전한 길이의 DNA 복제물 또는 시험관내 전사된 RNA 복제물 또는 이의 유도체 중 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산의 생산을 포함하는, 감염성의 약독화된 PRRS 생균 바이러스의 생산 방법.Infectious attenuation, comprising the production of a recombinant nucleic acid comprising at least one of a full-length DNA copy or an in vitro transcribed RNA copy or a derivative thereof, which is the nucleotide sequence according to claim 14. Method of producing PRRS probiotic virus. a)제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PRRS 바이러스를 사용하여 적당한 세포주를 감염시키는 단계, 및a) infecting a suitable cell line using the PRRS virus according to any one of claims 1 to 13, and b)상기 PRRS 바이러스를 세포 계대 배양에 의해 약독화시키는 단계를 특징으로 하는, 감염성의 약독화된 PRRS 생균 바이러스의 생산 방법.b) attenuating said PRRS virus by cell passage culture. 제18항에 있어서, 세포주가 마르크 세포(Marc cell) 또는 이의 유도체인 방법.The method of claim 18, wherein the cell line is a Marc cell or derivative thereof. 제18항 또는 제19항에 있어서, PRRS 바이러스가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 바이러스인 방법.The method according to claim 18 or 19, wherein the PRRS virus is the virus according to any one of claims 1 to 13. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PRRS바이러스가 제5항, 제9항,제11항 또는 제13항 중 어느 한 항에 따른 바이러스인 방법.The method according to any one of claims 18 to 20, wherein the PRRS virus is a virus according to any one of claims 5, 9, 11 or 13. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PRRS 바이러스를 포함하는 세포주.A cell line comprising the PRRS virus according to any one of claims 1 to 13. 제22항에 있어서, 세포주가 마르크 세포 또는 이의 유도체인 세포주.The cell line of claim 22, wherein the cell line is a mark cell or derivative thereof. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PRRS 바이러스 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising the PRRS virus according to any one of claims 1 to 13 and a pharmaceutically acceptable carrier. PRRS 감염의 치료 및 예방에 대한 백신의 제조에서 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 PRRS 바이러스의 용도.Use of a PRRS virus according to any one of claims 1 to 13 in the manufacture of a vaccine for the treatment and prevention of a PRRS infection. a) 유럽 PRRS 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 서열 번호 22의 130 내지 150 위치 및/또는 252 내지 272 위치 및/또는 273 내지 293 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF2 위치에서 변형시키는 단계; 및a) one or more ORF2 positions corresponding to 130-150 and / or 252-272 and / or 273-293 positions of SEQ ID NO: 22 by site-directed mutagenesis by the site-directed mutagenesis Transforming in; And b) 수득한 PRRS 바이러스가 약독화되었는지의 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법.b) Attenuating method of European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus is attenuated. a) 유럽 PRRS바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발에 의해 서열 번호 23의 267 내지 287 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF3 위치를 변형시키는 단계; 및a) modifying at least one ORF3 position corresponding to positions 267 to 287 of SEQ ID NO: 23 by site mutagenesis of the nucleotide sequence of the European PRRS virus; And b) 수득한 PRRS 바이러스가 약독화되었는지의 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법.b) Attenuating method of European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus is attenuated. a) 유럽 PRRS 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 지정부위 돌연변이 유발에 의해 서열 번호 24의 201 내지 221 위치에 상응하는 하나 이상의 ORF5 위치를 변형시키는 단계 ;a) modifying at least one ORF5 position corresponding to positions 201 to 221 of SEQ ID NO: 24 by site mutagenesis of the nucleotide sequence of the European PRRS virus; b) 수득한 PRRS 바이러스가 약독화되었는지의 여부에 대해 시험하는 단계를 특징으로 하는, 유럽 PRRS 바이러스의 약독화 방법.b) Attenuating method of European PRRS virus, characterized by testing whether the obtained PRRS virus is attenuated. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 변형으로 암호화된 단백질의 아미노산 서열의 변화가 초래되는 방법.29. The method of any one of claims 26-28, wherein the modification results in a change in the amino acid sequence of the encoded protein. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 결실 또는 치환인 방법.30. The method of any one of claims 26-29, wherein the modification is deletion or substitution. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ORF2, ORF3 및 ORF5의 각각의 서열이 변형되는 방법.31. The method of any one of claims 26-30, wherein each sequence of ORF2, ORF3, and ORF5 is modified. 제31항에 있어서, ORF2의 서열이 두 곳 이상, 바람직하게는 세 곳 이상의 위치에서 변형되는 방법.The method of claim 31, wherein the sequence of ORF2 is modified at two or more, preferably three or more positions. 제26항 내지 제32항 중 어느 항에 있어서, 변형이, 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 47, 88 및/또는 95 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 위치에서 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF2 ; 서열번호 23에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 93 위치에 상응하는 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF3 ; 및/또는 서열 번호 24에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 71 위치에 상응하는 아미노산이 치환되거나 결실된 단백질을 암호화하는 ORF5 중의 하나 이상을 초래하는 방법.33. The protein of any one of claims 26-32, wherein the modification is substituted or deleted at one or more amino acid sequence positions corresponding to the 47, 88 and / or 95 positions of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22. ORF2 to encrypt; ORF3, which encodes a protein having a substituted or deleted amino acid corresponding to position 93 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 23; And / or an amino acid corresponding to position 71 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 24 results in one or more of ORF5 encoding a protein that is substituted or deleted. 제33항에 있어서, 변형이, 서열 번호 22에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 47 위치에 상응하는 위치에 세린을 가지는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22에 의해서 암호화되는 아미노산 서열의 88 위치에 상응하는 위치에 페닐알라닌을 가지는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 22에 의해서 암호화되는 아미노산 서열의 95 위치에 상응하는 위치에 류신을 가지는 단백질을 암호화하는 ORF2, 서열 번호 23에 의해서 암호화되는 아미노산 서열의 93 위치에 상응하는 위치에 프롤린을 가지는 단백질을 암호화하는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24에 의해서 암호화되는 아미노산 서열의 71 위치에 상응하는 위치에 페닐알라닌을 가지는 단백질을 암호화하는 ORF5 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 초래하는 방법.34. The ORF2 of claim 33, wherein the modification corresponds to an ORF2 encoding a protein having a serine at a position corresponding to position 47 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22, corresponding to the 88 position of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22 ORF2, which encodes a protein having phenylalanine at the position, ORF2, which encodes a protein having leucine at the position corresponding to position 95 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 22, at position 93 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 23 One or more, preferably all of, ORF3, which encodes a protein having proline at the corresponding position, and / or ORF5, which encodes a protein having phenylalanine at the position corresponding to position 71 of the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 24. How to bring about. 제34항에 있어서, 변형이, 서열 번호 22의 140 위치에 상응하는 위치에서 C를 가지는 ORF2, 서열 번호 22의 262 위치에 상응하는 위치에서 T를 가지는 ORF2, 서열 번호 22의 283 위치에 상응하는 위치에서 C를 가지는 ORF2, 서열 번호 23의 277 위치에 상응하는 위치에서 C를 가지는 ORF3, 및/또는 서열 번호 24의 211 위치에 상응하는 위치에서 T를 가지는 ORF5 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 초래하는 방법.The method of claim 34, wherein the modification corresponds to an ORF2 having a C at a position corresponding to position 140 of SEQ ID NO: 22, an ORF2 having a T at a position corresponding to position 262 of SEQ ID NO: 22, corresponding to a position 283 of SEQ ID NO: 22 At least one, preferably all, ORF2 having C at position, ORF3 having C at position 277 of SEQ ID NO: 23, and / or ORF5 having T at position corresponding to position 211 of SEQ ID NO: 24 How to bring about. 제26항 내지 제35항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 수득할 수 있는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.Attenuated European PRRS virus obtainable by the method according to any of claims 26-35. 130 내지 150 위치의 하나 이상, 및/또는 252 내지 272 위치의 하나 이상, 및/또는 273 내지 293 위치의 하나 이상에서 서열 번호 22와 상이한 ORF2를 가지는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.An attenuated European PRRS virus having an ORF2 different from SEQ ID NO: 22 in at least one of positions 130-150, and / or in one or more positions 252-272, and / or in one or more positions 273-293. 267 내지 287 위치의 하나 이상에서 서열 번호 23과 상이한 ORF3을 가지는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.An attenuated European PRRS virus having an ORF3 different from SEQ ID NO: 23 at one or more of positions 267 to 287. 201 내지 221 위치의 하나 이상에서 서열 번호 24와 상이한 ORF5를 가지는 약독화된 유럽 PRRS 바이러스.An attenuated European PRRS virus having an ORF5 different from SEQ ID NO: 24 at one or more of positions 201 to 221. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스를 포함하는 백신.40. A vaccine comprising the attenuated European PRRS virus according to any one of claims 36 to 39 together with a pharmaceutically acceptable carrier. 제40항의 백신의 유효량을 돼지에게 투여함을 특징으로 하는, PRRS에 대한 돼지의 예방접종 방법.A pig vaccination method for PRRS, characterized in that an effective amount of the vaccine of claim 40 is administered to the pig. PRRS에 대한 백신의 제조에 있어서, 상기 항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 유럽 PRRS 바이러스의 용도.Use of the attenuated European PRRS virus according to any one of the preceding claims in the manufacture of a vaccine against PRRS.
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