KR20030074604A - 칼륨 채널 상호작용물질 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20030074604A
KR20030074604A KR10-2003-7004460A KR20037004460A KR20030074604A KR 20030074604 A KR20030074604 A KR 20030074604A KR 20037004460 A KR20037004460 A KR 20037004460A KR 20030074604 A KR20030074604 A KR 20030074604A
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마리아 베티
후아이-핑 링
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Abstract

본 발명은 칼륨 채널과 결합하여 칼륨 채널 매개된 활성을 조절하는 단백질을 엔코딩하는, PCIP 핵산 분자로 일컬어지는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 안티센스 핵산 분자, PCIP 핵산 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터, 발현 벡터가 도입된 숙주 세포, 및 PCIP 유전자가 도입되거나 붕괴된 인간 이외의 유전자이식 동물을 제공한다. 또한, 본 발명은 단리된 PCIP 단백질, 융합 단백질, 항원성 펩티드 및 항-PCIP 항체를 제공한다. 본 발명의 조성물을 사용한 진단법이 또한 제공된다.

Description

칼륨 채널 상호작용물질 및 이의 용도 {POTASSIUM CHANNEL INTERACTORS AND USES THEREFOR}
포유류의 세포막은 많은 세포 및 조직의 구조 유지 및 활성에 중요하다. 다양한 약리학적 작용, 생리학적 작용 및 세포 작용을 직접 조절하는 역할을 하는 막통과 이온 채널에 대한 연구가 막 생리학에 있어서 특히 관심의 대상이다. 칼슘, 나트륨 및 칼륨 채널을 포함하는 많은 이온 채널이 규명되었고, 이들 각각의 채널은 척추동물 세포 및 곤충 세포에서의 그 역할을 결정하기 위하여 조사되었다.
정상 세포의 항상성을 유지하는 데에 관여하기 때문에, 칼륨 채널에 많은 관심에 주어졌다. 상당한 수의 이러한 칼륨 채널은 세포막 전위의 변화에 반응하여 개방된다. 많은 전압 개폐 칼륨 채널이 규명되었고 전기생리학적 및 약리학적 성질에 의해 특징화되었다. 칼륨 전류는 나트륨 및 칼슘 전류 보다 더욱 다양하고, 외부 자극에 대한 세포의 반응을 결정하는 데에 추가로 관여한다. 칼륨 채널의 다양성 및 그들의 중요한 생리학적 역할은 다양한 질병에 대한 치료제를 개발하기 위한 표적으로서의 그들의 잠재성을 부각시킨다.
하나의 가장 특징적인 부류의 칼륨 채널은 전압 개폐 칼륨 채널이다. 이 부류의 원형적 구성원은 초파리의 쉐이커(Shaker) 유전자에 의해 엔코딩된 단백질이다. 쉘(Shal) 또는 Kv4 패밀리의 단백질은 상이한 제 1 세포로부터 기록된 다수의천연 A 타입 전류의 기초가 되는 전압 개폐 칼륨 채널의 하나의 타입이다. Kv4 채널은 심장 활동 전위의 재분극에서 주요한 역할을 한다. 뉴런에서, Kv4 채널 및 이들 채널이 포함할 수 있는 A 전류는 점화율 (firing rate)의 조절, 활동 전위 개시 및 시냅스 입력에 대한 수상돌기 반응의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다.
뉴런의 기본 기능은 신호를 수용하고, 처리하고, 전달하는 것이다. 상이한 부류의 뉴런에 의해 운반되는 다양한 목적의 신호에 불구하고, 신호의 형태는 항상 동일하고, 뉴런의 원형질막을 횡단하는 전위의 변화로 구성된다. 뉴런의 원형질막은 전압 개폐 양이온 채널을 함유하며, 이는 이러한 전위 (또한, 활동 전위 또는 신경 충동으로 명명됨)를 원형질막을 가로질러 원형질막을 따라 전파하는 것을 담당한다.
Kv 패밀리의 채널은 무엇보다도 (1) 각각의 활동 전위 이후에 막을 재분극시킴으로써 세포가 다시 점화하도록 준비시키는 지연 정류기 칼륨 채널, 및 (2) 역치하 (subthreshold) 전압에서 우세하게 활동적이고 흥분가능한 세포가 점화 역치에 도달하는 속도를 감소시키는 작용을 하는 신속 비활성화 (A 타입) 칼륨 채널을 포함한다. 활동 전위 전도에 중요하다는 것 이외에, Kv 채널은 또한 탈분극, 예를 들어 시냅스 입력에 대한 반응을 조절하고 신경전달물질을 방출하는 데에 있어서 어떠한 역할을 한다. 이러한 활성의 결과로써, 전압 개폐 칼륨 채널은 뉴런 흥분성의 주된 조절자이다[참고문헌: Hille B., Ionic Channels of Excitable Membranes, Second Edition, Sunderland, MA: Sinauer, (1992)].
Kv 칼륨 채널 수퍼패밀리 내에는 매우 많은 구조적 및 기능적 다양성이 존재한다. 이러한 다양성은 다유전자의 존재 및 동일한 유전자로부터 생산된 RNA 전사체의 교대 스플라이싱 둘 모두에 의해 발생한다. 그럼에도 불구하고, 알려진 Kv 칼륨 채널의 아미노산 서열은 높은 유사성을 나타낸다. 모든 채널은 4개의 기공 형성 α-서브유닛으로 구성되어 있는 것으로 여겨지며, 일부는 4개의 세포질 (β-서브유닛) 폴리펩티드를 갖는 것으로 알려져 있다[참고문헌: Jan L. Y. et al. (1990) Trends Neurosci 13:415-419, 및 Pongs, O. et al. (1995) Sem Neurosci. 7:137-146). 알려진 Kv 채널(α-서브유닛은 초파리로부터 최초 단리된 채널에 대한 이들의 상동성으로 인해 명명되어진 4개의 서브패밀리에 속한다: Kv1, 또는 쉐이커 (Shaker) 관련 서브패밀리; Kv2, 또는 쉐브 (Shab) 관련 서브패밀리; Kv3, 또는 쇼 (Shaw) 관련 서브패밀리; 및 Kv4, 또는 쉘 (Shal) 관련 서브패밀리.
Kv4.2 및 Kv4.3은 쉘 관련 서브패밀리의 Kv 채널(α-서브유닛의 예이다. Kv4.3은 그것의 mRNA가 간뇌 모노아민성 뉴런 및 전뇌 콜린성 뉴런에서 고도로 발현된다는 점에서 독특한 신경해부적 분포를 갖고, 여기에서 신경전달물질인 도파민, 노르에피네프린, 세로토닌 및 아세틸콜린의 방출에 관여한다.
또한, 이러한 채널은 피질의 피라미드형 세포 및 중간뉴런 내에서 고도로 발현된다[참고문헌: Serdio P. et al. (1996) J. Neurophys 75:2174-2179]. 흥미롭게도, Kv4.3 폴리펩티드는 상응하는 mRNA를 발현하는 뉴런 내에서 고도로 발현된다. Kv4.3 폴리펩티드는 이러한 세포의 세포체가지돌기 막내에서 발현되고, 여기에서 K+전도를 신속하게 불활성시키는 데 기여하는 것으로 생각된다. Kv4.2 mRNA는 뇌에서 폭넓게 발현되고, 상응하는 폴리펩티드는 또한 세포체가지돌기 막내에 농축되는 것으로 여겨지며, 여기에서 이는 K+전도를 신속하게 불활성화시키는 데 기여한다[참고문헌: Sheng et al. (1992) Neuron 9:271-284]. Kv4.2 및 Kv4.3과 같은 이러한 세포체가지돌기 A-타입 Kv 채널은 역치하 시냅스 반응의 유지 및 역전파 활동 전위의 전도와 같은 학습 및 기억의 기반이 되는 작용에 관여하는 것 같다[참고문헌: Hoffman D.A. et al. (1997) Nature 387:869-875].
따라서, 칼륨 채널 단백질, 예를 들어 Kv4.2 또는 Kv4.3 서브유닛을 갖는 칼륨 채널의 활성과 상호작용하고 이를 조절하는 단백질은 이러한 채널을 발현시키는 세포내에서 뉴런 또는 심장 흥분성, 예를 들어 활동 전위 전도, 세포체가지돌기 흥분성 및 신경전달물질 방출을 조절하기 위한 신규한 분자 표적을 제공한다. 또한, 이러한 단백질을 엔코딩하는 유전자내의 유전자 손상의 검출은 중추신경계 질환, 예를 들어 간질, 척수소뇌성 실조증, 불안, 우울증, 노화성 기억 상실, 편두통, 비만증, 파킨슨병 또는 알츠하이머병; 또는 심혈관 질환, 예를 들어 심부전, 고혈압, 심방세동, 확장형심근병증, 특발성 심근병증, 또는 협심증의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 칼륨 채널 단백질과 상호작용하는 유전자 생성물 또는 칼륨 채널 단백질과 상호작용하는 본 발명의 유전자 생성물에 대해 상당한 상동성을 갖는 유전자 생성물 (파라로그(paralog))을 엔코딩하는 신규한 핵산 분자의 발견을 적어도부분적으로 기초로 한다. 칼륨 채널 단백질은 예를 들어, Kv4.2 또는 Kv4.3 서브유닛을 갖는 칼륨 채널이다. 본 발명의 핵산 분자 및 이들의 유전자 생성물은 본원에서 "칼륨 채널 상호작용 단백질", "PCIP", 또는 "KChIP" 핵산 및 단백질 분자로서 명명된다. 본 발명의 PCIP 단백질은 칼륨 채널 단백질과 상호작용, 예를 들어 결합하고, 칼륨 채널 단백질의 작용을 조절하고/하거나 세포, 예를 들어 뉴런 세포 또는 심장 세포내에서의 칼륨 채널 매개된 활성을 조절한다. 본 발명의 PCIP 분자는 다양한 세포 작용, 예를 들어 뉴런 세포 또는 심장 세포 작용을 조절하기 위한 조절제로서 유용하다. 따라서, 한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 PCIP 단백질을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 그들의 생물학적 활성 부분 뿐만 아니라 PCIP 엔코딩 핵산의 검출을 위한 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 적합한 핵산 단편을 제공한다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 PCIP 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102에 제시된 누클레오티드 서열(예컨대, 전장 누클레오티드 서열), 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열 또는 이들의 상보서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상 동일하다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102에 제시된 누클레오티드 서열 또는 이들의 상보서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 이들의 상보서열의 300개, 350개, 400개, 426개, 471개, 또는 583개 이상의 누클레오티드의 단편을 포함한다.
또 다른 구체예에서, PCIP 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 아미노산 서열과 충분히 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, PCIP 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 1v, 9q, p19, W28559, KChIP4a, KChIP4b, 33b07, 1p, 및 래트 7s 단백질의 아미노산 서열을 엔코딩한다. 또한, 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ IDNO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 길이가 426개, 471개 또는 583개 누클레오티드 이상이고 PCIP 활성을 가진 단백질을 엔코딩한다(본 명세서에 기술된 바와 같이).
본 발명의 또 다른 구체예는 비PCIP 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자에 대하여 PCIP 핵산 분자를 특이적으로 검출하는 핵산 분자, 바람직하게는 PCIP 핵산 분자를 특징으로 한다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 이러한 핵산 분자는 길이가 적어도 426개, 400개 내지 450개, 471개, 450개 내지 500개, 500개 내지 550개, 583개, 550개 내지 600개, 600개 내지 650개, 650개 내지 700개, 700개 내지 750개, 750개 내지 800개 이상의 누클레오티드이고, 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ IDNO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102에 제시된 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열, 또는 이들의 상보서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된다. 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 길이가 15개 이상의 누클레오티드(예를 들어, 연속하여)이고, 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:7의 누클레오티드 93-126, 360-462, 732-825, 1028-1054, 또는 1517-1534에 하이브리드화된다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7의 누클레오티드 93-126, 360-462, 732-825, 1028-1054, 또는 1517-1534를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 길이가 15개 이상의 누클레오티드(예를 들어, 연속하여)이고, 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:13의 누클레오티드 1-14, 49-116, 137-311, 345-410, 430-482, 503-518, 662-693, 1406-1421, 1441-1457,1478-1494, 또는 1882-1959에 하이브리드화된다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:13의 누클레오티드 1-14, 49-116, 137-311, 345-410, 430-482, 503-518, 662-693, 1406-1421, 1441-1457, 1478-1494, 또는 1882-1959를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 길이가 15개 이상의 누클레오티드 (예를 들어, 연속하여)이고, 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:35의 누클레오티드 932-1527, 1548-1765, 1786-1871, 1908-2091, 2259-2265, 또는 2630-2654에 하이브리드화된다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:35의 누클레오티드 932-1527, 1548-1765, 1786-1871, 1908-2091, 2259-2265, 또는 2630-2654를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이체를 엔코딩하며, 여기서 핵산 분자는 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102를 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 PCIP 핵산 분자, 예를 들어 PCIP 핵산 분자의 코딩 가닥에 대해 안티센스인 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 PCIP 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서, 벡터는 재조합 발현 벡터이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질을 생성시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 적당한 배지내에서 숙주 세포, 바람직하게는 인간 이외의 포유류 세포와 같은 본 발명의 포유류 숙주 세포를 배양하여 상기 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 단리된 또는 재조합 PCIP 단백질 및 폴리펩티드를특징으로 한다. 하나의 구체예에서, 단리된 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인을 포함한다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인을 포함하며, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인을 포함하고, 칼륨 채널 매개된 활성을 조절한다. 또한, 또 다른 바람직한 구체예에서, 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인을 포함하며, 엄격한 하이브리드화조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 엔코딩된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편을 특징으로 하고, 여기서, 단편은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 15개 이상의 아미노산(예를 들어, 연속 아미노산)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ IDNO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 이들의 상보서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 엔코딩된, 단리된 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질을 특징으로 한다.
본 발명의 단백질 또는 이들의 생물학적 활성 부분은 비PCIP 폴리펩티드(예를 들어, 이종 아미노산 서열)에 작동적으로 결합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 단백질, 바람직하게는 PCIP 단백질과 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 같은 항체를 추가로 특징으로 한다. 또한, PCIP 단백질 또는 이들의 생물학적 활성 부분은 약제학적으로 허용되는 캐리어를 임의로 포함할 수 있는 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플을 PCIP 핵산 분자, 단백질 또는 폴리펩티드를 검출할 수 있는 작용제와 접촉시켜서 PCIP 핵산 분자, 단백질 또는 폴리펩티드의 존재가 생물학적 샘플내에서 검출되도록 함으로써 생물학적 샘플 중의 PCIP 핵산 분자, 단백질 또는 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플을 PCIP 활성의 인디케이터 (indicator)를 검출할 수 있는 작용제와 접촉시켜서 PCIP 활성의 존재가 생물학적 샘플내에서 검출되도록 함으로써 생물학적 샘플 중의 PCIP 활성의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 PCIP를 발현시킬 수 있는 세포를 PCIP 활성을 조절하는 작용제와 접촉시켜서 세포내의 PCIP 활성이 조절되게 하는 것을 포함하여, PCIP 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 작용제는 PCIP 활성을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 PCIP 활성을 자극한다. 하나의 구체예에서, 작용제는 PCIP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 PCIP 유전자의 전사 또는 PCIP mRNA의 번역을 조절함으로써 PCIP의 발현을 조절한다. 또한, 또 다른 구체예에서, 작용제는 PCIP mRNA 또는 PCIP 유전자의 코딩 가닥에 안티센스인 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 피검자에게 PCIP 조절자인 작용제를 투여함으로써 비정상 PCIP 단백질 또는 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환에 걸린 피검자를 치료하는 데에 사용된다. 하나의 구체예에서, PCIP 조절자는 PCIP 단백질이다. 또 다른 구체예에서, PCIP 조절자는 PCIP 핵산 분자이다. 또한, 또 다른 구체예에서, PCIP 조절자는 펩티드, 펩티도모사체 또는 기타 소분자이다. 바람직한 구체예에서, 비정상 PCIP 단백질 또는 핵산 발현을 특징으로 하는 질환은 CNS 질환 또는 심혈관 질환이다.
또한, 본 발명은 하기 사항 중 하나 이상을 특징으로 하는 유전자 변화의 존재 여부를 확인하기 위한 진단 검정을 제공한다: (ⅰ) PCIP 단백질을 엔코딩하는 유전자의 비정상적 변형 또는 돌연변이, (ii) 유전자의 오조절 (mis-regulation) (iii) PCIP 단백질의 비정상적 번역후 변형 (여기에서, 유전자의 야생형 형태는 PCIP 활성을 갖는 단백질을 엔코딩한다).
또 다른 양태에서, 본 발명은 PCIP 활성을 갖는 PCIP 단백질을 포함하는 인디케이터 조성물을 제공하고, 이러한 인디케이터 조성물을 시험 화합물과 접촉시키고, 인디케이터 조성물 내의 PCIP 활성에 미치는 시험 화합물의 효과를 측정하여 PCIP 단백질의 활성을 조절하는 화합물을 동정함으로써, PCIP 단백질과 결합하거나 이의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명확해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 1v의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 핵산 1 내지 1463에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 216에 상응한다.
도 2는 래트 1v의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3의 핵산 1 내지 1856에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4의 아미노산 1 내지 245에 상응한다.
도 3는 마우스 1v의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5의 핵산 1 내지 1907에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6의 아미노산 1 내지 216에 상응한다.
도 4는 래트 1vl의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:7의 핵산 1 내지 1534에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:8의 아미노산 1 내지 227에 상응한다.
도 5는 마우스 1vl의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9의 핵산 1 내지 1540에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10의 아미노산 1 내지 227에 상응한다.
도 6은 부분적 래트 1vn의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:11의 핵산 1 내지 955에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12의 아미노산 1 내지 203에 상응한다. (전장 래트 1vn 서열은 도 63에 제시되어 있다)
도 7은 인간 9ql의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13의 핵산 1 내지 2009에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:14의 아미노산 1 내지 270에 상응한다.
도 8은 래트 9ql의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:15의 핵산 1 내지 1247에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQID NO:16의 아미노산 1 내지 257에 상응한다.
도 9는 마우스 9ql의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:17의 핵산 1 내지 2343에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:18의 아미노산 1 내지 270에 상응한다.
도 10은 인간 9qm의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:19의 핵산 1 내지 1955에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:20의 아미노산 1 내지 252에 상응한다.
도 11은 래트 9qm의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:21의 핵산 1 내지 2300에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22의 아미노산 1 내지 252에 상응한다.
도 12는 인간 9qs의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:23의 핵산 1 내지 1859에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:24의 아미노산 1 내지 220에 상응한다.
도 13은 원숭이 9qs의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:25의 핵산 1 내지 2191에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:26의 아미노산 1 내지 220에 상응한다.
도 14는 래트 9qc의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:27의 핵산 1 내지 2057에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:28의 아미노산 1 내지 252에 상응한다.
도 15는 래트 8t의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29의 핵산 1 내지 1904에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30의 아미노산 1 내지 225에 상응한다.
도 16은 인간 p19의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:31의 핵산 1 내지 619에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:32의 아미노산 1 내지 200에 상응한다.
도 17은 래트 p19의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:33의 핵산 1 내지 442에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:34의 아미노산 1 내지 109에 상응한다.
도 18은 마우스 p19의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:35의 핵산 1 내지 2644에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36의 아미노산 1 내지 256에 상응한다.
도 19는 인간 W28559의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:37의 핵산 1 내지 380에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:38의 아미노산 1 내지 126에 상응한다.
도 20은 인간 P193의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:39의 핵산 1 내지 2176에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:40의 아미노산 1 내지 41에 상응한다.
도 21은 래트 1v, 래트 9qm 및 마우스 P19 단백질의 개략적 표현으로서 이들 단백질 사이의 보존된 도메인을 나타내도록 정렬되어 있다.
도 22는 인간 9q의 게놈 DNA 서열을 나타낸다. 도 22a는 엑손 1 및 이의 플랭킹 인트론 서열(SEQ ID NO:46)을 나타낸다. 도 22b는 엑손 2 내지 11 및 플랭킹 인트론 서열(SEQ ID NO:47)을 나타낸다.
도 23은 원숭이 KChIP4a의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:48의 핵산 1 내지 2413에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:49의 아미노산 1 내지 233에 상응한다.
도 24는 원숭이 KChIP4b의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:50의 핵산 1 내지 1591에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:51의 아미노산 1 내지 233에 상응한다.
도 25는 KChIP4a, KChIP4b, 9q1, 1v, p19, 및 관련 인간 파라로그(hsncspara) W28559의 정렬을 나타낸다. 컨센서스(consensus)와 동일한 아미노산은 검은색으로 음영처리되어 있고, 보존된 아미노산은 회색으로 음영처리되어 있다.
도 26은 래트 33b07의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:52의 핵산 1 내지 2051에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:53의 아미노산 1 내지 407에 상응한다.
도 27은 인간 33b07의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:54의 핵산 1 내지 4148에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55의 아미노산 1 내지 414에 상응한다.
도 28은 래트 1p의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:56의 핵산 1 내지 2643에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQID NO:57의 아미노산 1 내지 267에 상응한다.
도 29는 래트 7s의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:58의 핵산 1 내지 2929에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:59의 아미노산 1 내지 270에 상응한다.
도 30은 래트 29x의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:60의 핵산 1 내지 1489에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:61의 아미노산 1 내지 351에 상응한다.
도 31은 래트 25r의 cDNA 서열 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:62의 핵산 1 내지 1194에 상응한다.
도 32는 래트 5p의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:63의 핵산 1 내지 600에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:64의 아미노산 1 내지 95에 상응한다.
도 33은 래트 7q의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:65의 핵산 1 내지 639에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:66의 아미노산 1 내지 212에 상응한다.
도 34는 래트 19r의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:67의 핵산 1 내지 816에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:68의 아미노산 1 내지 271에 상응한다.
도 35는 원숭이 KChIP4c의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:69의 핵산 1 내지 2263에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:70의 아미노산 1 내지 229에 상응한다.
도 36은 원숭이 KChIP4d의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:71의 핵산 1 내지 2259에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:72의 아미노산 1 내지 250에 상응한다.
도 37은 KChIP4a, KChIP4b, KChIP4c, 및 KChIP4d의 정렬을 나타낸다.
도 38은 KChIP2(9ql)의 존재 또는 부재하에서 Kv4.2를 발현하는 CHO 세포로부터의 전류 기록을 보여주는 그래프를 나타낸다. 세포는 -80 mV에서 전압 클램핑되고, 200ms 동안 -60 mV에서 +50 mV로 단계적으로 증가한다. 다양한 시험 전압에서의 피크 전류 진폭이 우측 패널에 나타나 있다. 도 38은 Kv4.2상에서의 KChIP2(9ql)의 진폭 및 속도론적 효과를 보여주는 표를 추가로 도시한다. KchIP2 발현은 피크 전류 진폭, 비활성화 및 비활성화 시간 상수로부터의 회복, 및 활성화 V1/2를 변화시킨다.
도 39는 KChIP3(p19)의 존재 또는 부재하에서 Kv4.2를 발현하는 CHO 세포로부터의 전류 기록을 보여주는 그래프를 나타낸다. 세포는 -80 mV에서 전압 클램핑되고 200 ms 동안에 -60 mV에서 +50 mV로 단계적으로 증가한다. 다양한 시험 전압에서의 피크 전류 진폭이 우측 패널에 나타나 있다. 도 39는 Kv4.2에 대한 KChIP3(p19)의 진폭 및 속도론적 효과를 보여주는 표를 추가로 나타낸다. KchIP3는 피크 전류 및 비활성화 및 비활성화 시간 상수로부터의 회복의 변화를 초래한다.
도 40은 KchIP1의 동시발현이 CHO 세포내에서 발현된 Kv4.2 채널의 전류 밀도 및 동력학을 극적으로 변경시키는 것을 입증하는 전기생리학적 실험의 결과를 나타낸다.
도 40A는 Kv4.2 트랜스펙션된 CHO 세포로부터의 전류 기록을 나타낸다. 전류는 세포를 -80 mv의 유지 전위에서 -60 내지 50 mV의 시험 전위로 순차적으로 탈분극시킴으로써 환기된다. 전류 기록은 p/5 프로토콜을 사용하여 리크 서브트랙션 (leak subtraction)시킨다. 전류 축은 전류 진폭의 변화를 강조하기 위하여 (b)에서와 동일한 크기로 도시된다. 확장된 전류 축에서의 50 mV에서의 인셋-싱글 (Inset-Single) 전류 기록이 전류 활성화 및 비활성화의 동력학을 나타낸다.
도 40B는 (a)에서의 전류 기록을 나타내지만, 동일한 양의 Kv4.2 및 KChIP1에 대한 DNA로 트랜스펙션된 세포로부터 얻은 것이다.
도 40C는 Kv4.2 단독 (n=11)으로 트랜스펙션된 세포 또는 KChIP1(n=9)로 코트랜스펙션된 세포로부터 얻어진 모든 전압에서의 피크 전류 진폭을 나타낸다.
도 40D 및 40E는 2개의 펄스 프로토콜을 사용하는 비활성화로부터의 회복을 나타낸다. Kv4.2 단독(D) 또는 KChIP1과 동시발현되는 Kv4.2 (E)는 50 mV로의 제 1 펄스를 사용하여 비활성 상태로 유도되고, 그 후 50 mV로의 제 2 펄스가 제 1 펄스 후에 다양한 시점에서 인가된다. 모든 펄스의 전 및 후의 유지 전위는 -80 mV이다.
도 40F는 Kv4.2(n=8) 트랜스펙션된 세포 및 Kv4.2와 KChIP1(n=5)로 트랜스펙션된 세포에 대한 펄스 사이의 피크 전류가 회복하는 비율의 요약을 나타낸다. 비활성화로부터의 회복의 시간 상수는 1원 지수함수에 맞추어진다.
도 41은 인간 KChIP 패밀리 구성원과 Ca2+감응 단백질의 리커버린 (recoverin) 패밀리의 밀접하게 관련된 구성원의 정렬을 나타낸다. (HIP: 인간 히포칼신(hippocalcin), NCS1: 래트 신경 칼슘 센서 1). 정렬은 PAM250 잔기 중량표 및 디폴트 매개변수와 함께 클러스탈 (Clustal) 방법을 사용하는 매킨토시용 메그얼라인(MegAlign) 프로그램 (DNASTAR사의 version 4.00)을 사용하여 수행하였고, 복스쉐이즈(BOXSHADES)를 사용하여 음영처리하였다. 컨센서스와 동일한 잔기를 검게 음영처리하였고, 보존적 치환은 회색으로 음영처리하였다. X, Y, Z 및 -X, -Y, -Z는 EF 핸드 (hand)에서 칼슘에 결합하는 것을 담당하는 잔기의 위치를 표시한다.
도 42는 IOSCA 영역의 물리적 맵을 나타낸다.
도 43은 h9q의 위치 및 IOSCA 및 간질과 관련된 공지의 마커의 위치를 나타내는 연관 맵을 도시한다.
도 44는 인간 1vl (KChIP11)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:79의 핵산 1 내지 1477에 상응한다. 대문자 및 소문자의 교대는 개개의 엑손을 나타낸다. KChIP11 (KChIP1long) 특이적 엑손은 나타난 서열에서 두 번째 엑손이다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:109의 아미노산 1 내지 227에 상응한다.
도 45는 인간 KChIP1N의 N-말단 스플라이스 변이체의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:80의 핵산 1 내지 1639에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:81의 아미노산 1 내지 232에 상응한다.
도 46은 래트 및 인간 KChIP1N의 N-말단 도메인의 정렬을 도시하며, 이는 이러한 N-말단 도메인이 두 개의 서열 사이에서 보존됨을 나타낸다.
도 47은 인간 KChIP2 (KChIP2 l, m, s 및 N을 포함함)의 게놈 DNA 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:74의 핵산 1 내지 17,803에 상응한다. 대문자는 엑손을 나타내고, 소문자는 인트론을 나타낸다.
도 48은 래트 KChIP2L의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:75의 핵산 1 내지 1285에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:76의 아미노산 1 내지 270에 상응한다.
도 49는 인간 8t (KChIP2N)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:77의 핵산 1 내지 2076에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:78의 아미노산 1 내지 225에 상응한다.
도 50은 래트 및 인간 KChIP2N (8t) 단백질의 N-말단 도메인의 정렬을 도시하며, 이는 이들 단백질이 96.5% 동일성을 나타냄을 보여준다.
도 51은 전장 인간 KChIP3의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:82의 핵산 1 내지 2835에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:83의 아미노산 1 내지 256에 상응한다. 대문자 및 소문자의 교대는 개개의 엑손을 나타낸다.
도 52는 래트 KChIP3의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:84의 핵산 1 내지 2414에 상응한다. 아미노산 서열은SEQ ID NO:85의 아미노산 1 내지 178에 상응한다. 대문자는 코딩 영역을 나타내고, 소문자는 3' UTR을 나타낸다.
도 53은 원숭이 KChIP4XC (KChIP4b)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:86의 핵산 1 내지 1005에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:87의 아미노산 1 내지 127에 상응한다.
도 54는 마우스 KChIP4N2 (KChIP4c)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:88의 핵산 1 내지 2181에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:89의 아미노산 1 내지 229에 상응한다.
도 55는 래트 KChIP4의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:90의 핵산 1 내지 2022에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:91의 아미노산 1 내지 198에 상응한다.
도 56은 인간 KChIP4aS (KChIP4N1S) (이는 KChIP4N1의 더 짧은 스플라이스 변이체임)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:92의 핵산 1 내지 2366에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:93의 아미노산 1 내지 188에 상응한다.
도 57은 인간 KChIP4a (KChIP4N1)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:94의 핵산 1 내지 2431에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:95의 아미노산 1 내지 233에 상응한다.
도 58은 인간 KChIP4c (KChIPN2)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:96의 핵산 1 내지 2261에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:97의 아미노산 1 내지 229에 상응한다.
도 59는 인간 KChIP4d (KChIP4N3)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:98의 핵산 1 내지 2299에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:99의 아미노산 1 내지 250에 상응한다.
도 60은 래트 KChIP4N1x (KChIP4N2의 스플라이스 변이체)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:100의 핵산 1 내지 2246에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:101의 아미노산 1 내지 272에 상응한다.
도 61은 KChIP4N2 및 KChIP1에 의한 Kv4.3 비활성화 시간 상수의 경쟁적 조절을 도시하는 한 세트의 그래프이다. 주입된 cRNA 종은 cRNA 섹션에 기입되어 있으며, 4.3은 Kv4.3을 나타내고, 1은 KChIP1을 나타내고, 4는 KChIP4를 나타낸다. 괄호안의 숫자는 주입된 cRNA의 희석 인자를 나타내며, 1x는 원액이다. 막대 그래프의 위에 있는 삼각형은 각각 KChIP4N2 또는 KChIP1의 고정량과 KChIP1 또는 KChIP4N2의 증가량을 합쳐놓은 것을 도해한다.
도 62는 단백질 정렬을 도시하며, 이는 인간 KChIP1N과 원숭이 KChIP4N2의 N-말단 도메인이 상동이고 인간/래트 KChIP4N2와 원숭이 KChIP4N2의 N-말단 도메인이 상이함을 나타낸다.
도 63은 래트 KChIP1N (1vn)의 cDNA 서열 및 추정 아미노산 서열을 도시한다. 누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:102의 핵산 1 내지 1856에 상응한다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO:103의 아미노산 1 내지 232에 상응한다.
도 64는 아라키돈산에 의한 제노푸스 (Xenopus) 난모세포에서의 Kv4.3 및 Kv4.3/KChIP1 전류의 농도 의존적 조절을 도시하는 그래프이다. -80mV의 유지 전위에서 +40mV로의 탈분극 펄스 (지속기간 = 500 ms). 1 내지 10μM의 아라키돈산은 Kv4.3 cRNA 자체가 주입된 난모세포 (실선) 및 Kv4.3과 KChIP1 cRNA 둘 모두가 동시 주입된 난모세포 (점선)에서 피크 진폭 (A)를 억제하였고 비활성화 시간 상수 (τinact) (B)를 감소시켰다. 각각의 데이터 지점에 대하여 n은 5개의 난모세포이다.
도 65는 아라키돈산에 의한 Kv4.3 및 Kv4.3/KChIP1 전류의 조절이 가역적임을 도시하는 그래프이다. 제노푸스 난모세포 내의 전류는 -80mV의 유지 전위로부터 +40mV로의 탈분극 펄스 (지속기간 = 500 ms)를 사용한 경우 7초 마다 환기되었다. 피크 진폭 (A) 및 비활성화 시간 상수 (τinact) (B)에 대한 효과는 10μM 아라키돈산의 적용을 나타내는 음영진 막대 및 0.5 ㎎/㎖ BSA가 보충된 ND96 배지를 사용한 세척을 나타내는 비어있는 막대로 도시된다 (각각의 데이터 지점에 대하여 n은 5임).
도 66은 지방산에 의한 Kv4.3 및 Kv4.3/KChIP1의 조절을 도시하는 그래프이다. (A) 제노푸스 난모세포에서의 10μM 리놀렐라이드산 (Kv4.3, Kv4.3/KChIP1에 대해 각각 n = 9, 8임), γ-리놀렌산 (n = 9, 8), ETI (n = 4, 6), ETYA (n = 4, 6), 및 아라키돈산 (n = 8,9)에 의한 Kv4 (비어있는 막대) 및 Kv4.3/KChIP (음영처리된 막대)의 차단율. 리놀렐라이드산/Kv4.3 단독의 값을 제외한 모든 값은 비지방산 대조표준과 비교하여 통계적으로 유의할 정도였다. 모든 지방산에 대한 Kv4.3과 Kv4.3+KChIP1 사이의 모든 값의 차는 통계적으로 유의할 정도였다. (B) 동일 조건 하의 패널 A에서 전류의 비활성 시간 상수(τinact)의 억제율. 값은 평균 ±SEM으로 제시된다. 리놀렐라이드산의 값을 제외한 Kv4.3 + KChIP에 대한 모든 값은 지방산 비함유 대조표준과 비교하여 통계학적으로 두드러졌다. 리놀렐라이드산을 제외한 모든 지방산 처리내에서 Kv4.3과 Kv4.3+KChIP1 사이의 값의 차이는 현저하였다.
도 67은 아라키돈산이 KChIP1과 Kv4.3의 N-말단 도메인 사이의 결합을 방해하지 않음을 나타내는 그래프이다. (A) 중첩된 센소그램(sensogram)은 Kv4.3의 세포내 N-말단 도메인과 KChIP1 간의 상호작용에 대한 결합 단계 뿐만 아니라 분해 단계도 바이오센서 검정에서 10μM 아라키돈 산에 의해 정량적으로 변화된 바 없음을 보여준다. (B) 선택적 SC-WLH 배지 중에서의 Kv4.3의 N-말단 도메인 및 KChIP1 상호작용 의존적 성장은 10μM의 ETYA에 의해 변경되지 않았다. 균주가 Kv4.3의 N-말단 도메인과 KChIP1 간의 상호작용에 독립적으로 성장하도록 하는 비선택적 배지 SC-WL이 균주의 성장에 대한 ETYA의 비특이적 효과를 조절하는데 사용되었다. 값은 평균 ±SEM으로서 제시된다. 각각의 데이터 지점에 대해 n은 4이다.
도 68은 래트 KChIP1N 조직 발현의 태크만 분석으로부터의 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 칼륨 채널 단백질과 상호작용하는 유전자 생성물 또는 칼륨 채널 단백질과 상호작용하는 본 발명의 유전자 생성물과 상당한 상동성을 지닌 유전자 생성물 (파라로그)을 엔코딩하는 신규한 핵산 분자의 발견을 적어도 부분적으로 기초로 한다. 칼륨 채널 단백질은 예를 들어 Kv 4.2 또는 Kv 4.3 서브유닛을 갖는 칼륨 채널이다. 본원에서 본 발명의 핵산 분자 및 이들의 유전자 생성물은 "칼륨 채널 상호작용 단백질 (Potassium Channel Interacting Proteins)", "PCIP" 또는 "KChIP" 핵산 및 단백질 분자로서 언급된다. 바람직하게, 본 발명의 PCIP 단백질은 칼륨 채널 단백질과 상호작용, 예를 들어 결합하고, 칼륨 채널 단백질의 활성을 조정하고/하거나, 세포, 예를 들어 뉴런 또는 심장 세포중의 칼륨 채널 매개된 활성을 조정한다.
본원에서 사용된 용어 "PCIP 패밀리"는 본 발명의 단백질 및 핵산 분자에 관련된 경우에, 본원에서 정의된 "PCIP" 활성을 갖는 2 이상의 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 PCIP 패밀리 구성원들은 천연 또는 비천연일 수 있으며 동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, PCIP 패밀리는 인간 기원의 제 1 단백질 및 다른 것을 함유할 수 있으며, 대안적으로 인간 기원의 다른 단백질은 비인간 기원의 상동체를 함유할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어인 "PCIP 활성", "PCIP의 생물학적 활성" 또는 "PCIP의 작용성 활성"은 표준 기술에 따라 생체내 또는 생체외에서 측정되는, PCIP 반응성 세포 또는 PCIP 단백질 기질상의 PCIP 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 나타나는 활성을 의미한다. 하나의 구체예에서, PCIP 활성은직접적인 활성, 예컨대 PCIP-표적 분자와의 결합이다. 본원에서 사용되는 용어 "표적 분자" 또는 "결합 파트너"는 PCIP 매개된 기능이 달성되도록, PCIP 단백질이 천연으로 결합하거나 상호작용하는 분자이다. PCIP 표적 분자는 본 발명의 비-PCIP 분자 또는 PCIP 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 예시적인 구체예에서, PCIP 표적 분자는 PCIP 리간드이다. 대안적으로, PCIP 활성은 PCIP 단백질과 PCIP 리간드와의 상호작용에 의해 매개되는 세포 시그널링 활성과 같은 간접적인 활성이다. PCIP의 생물학적 활성은 본원에 기술되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 PCIP 단백질은 하기 활성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: (1) PCIP 단백질은 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분과 상호작용(예를 들어, 결합)할 수 있다; (2) PCIP 단백질은 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 인산화 상태를 조절할 수 있다; (3) PCIP 단백질은 칼슘과 관련(예를 들어, 결합)할 수 있으며, 예컨대 칼슘 의존성 키나제로서 작용, 예를 들어 칼슘 의존성 방식으로 칼륨 채널 또는 G 단백질 커플링된 수용체를 인산화시킬 수 있다; (4) PCIP 단백질은 칼슘과 관련(예를 들어, 결합)할 수 있으며, 예를 들어 세포 공정에서 칼슘 의존성 방식으로 작용, 예를 들어 칼슘 의존성 전사 인자로서 작용할 수 있다; (5) PCIP 단백질은 세포(예를 들어 감각 뉴런 세포 또는 운동 뉴런 세포와 같은 뉴런 세포 또는 심장 세포)중에서 칼륨 채널 매개된 활성을 조절하여 세포에 유익하게 영향을 줄 수 있다; (6) PCIP 단백질은 세포, 예를 들어 뉴런 또는 심장 세포중에서 염색질 형성을 조절할 수 있다; (7) PCIP 단백질은 세포, 예를 들어 뉴런 또는 심장 세포중에서 소포 교환 및 단백질 수송을 조절할 수 있다; (8) PCIP 단백질은세포, 예를 들어 뉴런 또는 심장 세포중에서 사이토카인 시그널링을 조절할 수 있다; (9) PCIP 단백질은 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부와 세포 구조와의 관계를 조절할 수 있다; (10) PCIP 단백질은 세포 증식을 조절할 수 있다; (11) PCIP 단백질은 신경전달물질의 방출을 조절할 수 있다; (12) PCIP 단백질은 막 자극성을 조절할 수 있다; (13) PCIP 단백질은 막의 잔여 전위에 영향을 미칠 수 있다; (14) PCIP 단백질은 작용 전위의 파형 및 진동수를 조절할 수 있다; (15) PCIP 단백질은 자극의 역치를 조절할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "칼륨 채널"은 자극성 세포에서 신호를 수용하고, 유도하고, 전달하는데 관여하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 칼륨 채널은 전기적으로 자극가능한 세포, 예를 들어 신경, 심장, 골격근, 평활근, 신장, 내분비선 및 난모세포에서 보편적으로 발현되며, 예를 들어 포어 형성 및 세포질 서브유닛으로 이루어진 헤테로 다중결합 구조를 형성할 수 있다. 칼륨 채널의 예는 (1) 전압 개폐 칼륨 채널, (2) 리간드 개폐 칼륨 채널, 및 (3) 기계적 개폐 칼륨 채널을 포함한다. 칼륨 채널의 상세한 설명을 위해서 본원에 참고문헌으로서 인용된 하기 문헌을 참조하라[참조 : Kandel E.R. et al., Principles of Neural Science, second edition, (Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1985))]. 본 발명의 PCIP 단백질은 예를 들어 Kv4.3 서브유닛 또는 Kv4.2 서브유닛을 갖는 칼륨과 상호작용하는 것으로 보인다.
본원에 사용된 용어 "칼륨 채널 매개된 활성"은 칼륨 채널, 예를 들어 신경계 또는 심장계에서 신호를 수용하고, 유도하고, 전달하는 것과 관련된 칼륨 채널,예를 들어 뉴런 세포 또는 심장 세포중의 칼륨 채널과 관련된 활성을 포함한다. 칼륨 채널 매개된 활성은 세포, 예를 들어 뉴런 또는 심장 세포로부터 신경전달물질, 예를 들어 도파민 또는 노르에피네프린의 방출; 막의 휴지 전위, 활동 전위의 파형 및 빈도, 및 자극의 역치의 조절; 및 예를 들어 뉴런 세포 또는 심장 세포중의 작용 전위를 역으로 전파시키는 전도성 및 역치하 시냅스 반응의 통합과 같은 공정의 조절을 포함한다.
본 발명의 PCIP 단백질이 칼륨 채널 매개된 활성을 조절함에 따라, 이 단백질은 칼륨 채널과 관련된 질환 및/또는 신경계 관련 질환에 대한 신규한 진단 및 치료 제제로서 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 PCIP 단백질은 포유류 심장에서, 전압 개폐 K+ 전류(Ito(일시적인 외부 전류)로서 공지됨)를 기초로 하는 Kv4 칼륨 채널, 예를 들어 Kv4.2 또는 Kv4.3 서브유닛을 갖는 칼륨 채널을 조절한다 [참조: Kaab S. et al.(1998) Circulation 98(14):1383-93; Dixon, J.E. et al., (1996) Circulation Research 79(4):659-68; Nerbonne JM (1998) Journal of Neurobiology 37(1):37-59; Barry D.M. et al. (1998) Circulation Research 83(5):560-7; Barry D.M. et al. (1996) Annual Review of Physiology 58:363-94]. 상기 전류는 작용 전위 동안의 심근세포의 빠른 재극성화를 기초로 한다. 또한, 이 전류는 심근세포가 수반되는 작용 전위를 일으키기 위한 역치에 도달하는 속도를 조절함으로써 비트 사이 간격에 관여한다.
이러한 전류는 또한 환자에게서 심장 비대로 조절되어, 심장 작용 전위를 연장시키는 것으로 공지되어 있다. 이러한 환자에게서, 작용 전위 연장은 심근 내부에서 이루어지는 칼슘 부하 및 칼슘 처리의 변화를 일으켜, 비대에서 심장 장애에 이르는 심장 질환의 진행에 기여하는 것으로 고려된다 [참조: Wickendenet al., (1998) Cardiovascular Research 37:312]. 놀랍게도, 본 발명의 수개의 PCIP (예를 들어, SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25에 제시된 9ql, 9qm, 9qs)은 Kv4.2 또는 Kv4.3 서브 유닛을 함유하는 칼륨 채널에 결합하고, 이 칼륨 채널을 조정하며, 칼슘 결합 EF 핸드 도메인을 함유한다. 이들 PCIP 유전자중의 돌연변이로 인해, 이들 칼슘 결합 PCIP 단백질 자체의 발현에서의 결함 또는 이들 PCIP와 Kv4.2 또는 Kv4.3 채널 사이의 상호작용에서의 결함은 심근에서 Kv4.3 또는 Kv4.3(Im) 전류의 감소를 유도하는 것으로 예상되며, PCIP 발현을 변경시키거나 PCIP와 Kv4.2 또는 Kv4.3 채널 사이의 상호작용을 조절하는 치료제는 비대에서 심장 장애에 이르는 질환의 진행을 느리게 하거나 억제하는 매우 중요한 치료제일 수 있다.
본원에 사용된 "칼륨 채널 관련 질환"은 칼륨 채널 매개된 활성의 오조절에 의해 특징지어지는 질환, 질병 또는 증상들을 포함한다. 칼륨 채널 관련된 질환은 말초에서 뇌에 이르는 감각 임펄스의 전달 및/또는 뇌에서 말초까지의 운동 임펄스의 유도; 반사작용의 통합; 감각 임펄스의 해석; 및 감정, 지적 (예를 들어, 학습 및 기억), 또는 운동 과정에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 칼륨 채널 관련된 질환은 또한 접촉하려는 심장근 섬유를 자극하는 전기 임펄스에 나쁜 영향을 미칠 수 있다. 칼륨 채널 관련된 질환의 예로는 신경계 관련 질환 및 심혈관 질환이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "신경계 관련 질환"은 신경계에 영향을 미치는 질환, 질병 또는 증상을 포함한다. 칼륨 채널 관련 질환 및 신경계 관련 질환의 예로는 인식 질환, 예를 들어 기억 및 학습 질환, 예컨대 기억력 상실, 운동 신경 장애, 인지 불능, 건망성 명의실어증, 건망성 공간적 지남력상실, 클루버-버시(Kluver-Bucy) 증후군, 알츠하이머 관련 기억력 상실(Eglen R.M. (1996) Pharmacol. and Toxicol. 78(2): 59-68; Perry E.K. (1995) Brain and Cognition 28(3); 240-58) 및 학습 불능; 자각에 영향을 미치는 질환, 예를 들어 환시, 지각 장애, 또는 루이소체 치매와 관련된 델러륨(delerium); 분열정동형 질환(Dean B. (1996) Mol. Psychiatry 1(1):54-8), 감정 기복이 있는 정신분열증(Bymaster F.P. (1997) J. Clin. Psychiatry 58 (suppl.10):28-36; Yeomans J.S. (1995) Neuropharmacol. 12(1):3-16; Reimann D. (1994) J. Psychiatric Res. 28(3):195-210), 우울증(1차 또는 2차); 정감성 장애(Janowsky D.S. (1994) Am. J. Med. Genetics 54(4):335-44); 수면 장애(Kimura F. (1997) J. Neurophysiol. 77(2):709-16), 예를 들어, 우울증으로 고생하는 환자에게서의 REM 수면 이상(Rieman D. (1994) J. Psychosomatic Res. 38 Suppl. 1:15-25; Bourgin P. (1995) Neuroreport 6(3): 532-6), 역설 수면 이상(Sakai K. (1997) Eur. J. Neuroscience 9(3):415-23), 불면증 및 수면 동안의 체온 또는 호흡 저하 이상(Shuman S.L. (1995) Am. J. Physiol. 269(2 Pt 2):R308-17; Mallick B.N. (1997) Brain Res. 750(1-2):311-7)이 포함된다. 신경계 관련 질환의 다른 예로는 고통 발생 메커니즘에 영향을 미치는 질환, 예를 들어 자극성 장 증후관과 관련된 고통(Mitch C.H. (1997) J. Med. Chem. 40(4):538-46; Shannon H.E. (1997) J. Pharmac. and Exp. Therapeutics 281(2):884-94; Bouaziz H. (1995) Anesthesia and Analgesia 80(6):1140-4; or Guimaraes A.P. (1994) Brain Res. 647(2):220-30) 또는 가슴 고통; 운동 질환(Monassi C.R. (1997) Physiol. and Behav. 62(1):53-9), 예를 들어, 파킨슨병 관련 운동 질환(Finn M. (1997) Pharmacol. Biochem & Behavior 56(2):273-9); 음식 질환, 예를 들어 인슐린과분비 관련 비만(Maccario M. (1997) J. Endocrinol. Invest. 20(1):8-12; Premawardhana L.D. (1994) Clin. Endocrinol. 40(5):617-21); 음주 질환, 예를 들어 당료병 조갈증(Murzi E. (1997) Brain Res. 752(1-2):184-8; Yang X. (1994) Pharmacol. Biochem & Behavior 49(1):1-6; 신경변성 질환, 예를 들어 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환과 관련된 치매(예컨대 픽 질환), 파킨슨 및 기타 미만성 루이 소체 질환, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 핵상마비, 간질, 척수소뇌변성, 간질 증후군 및 크로이츠펠트야곱병; 정신병, 예를 들어, 우울증, 정신분열증, 코르사코프씨병, 조병, 불안증, 양극 감정 질환, 또는 공포증, 신경질환, 예를 들어 편두통; 척수 손상; 발작 및 두부 외상이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "간질"은 뇌의 정상적인 전기적 기능의 장애에 의해 유발된 일반적인 신경 질환을 포함한다. 정상적인 뇌 기능에서, 수많은 미소 전기 전하는 뇌의 뉴런 세포에서 몸의 모든 부분으로 통과한다. 간질에 걸린 환자에서,이러한 정상적인 패턴은 전기 에너지의 갑작스럽고 보기드문 강한 발작에 의해 중단되며, 이는 간단히 말해 인간의 지각, 신체 운동 또는 감각에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 물리적인 변화는 간질성 발작으로 명명된다. 발작에는 2가지 범주가 있는데, 그 하나는 뇌의 한 도메인에서 발생하는 부분적인 발작이며, 다른 하나는 뇌 전체를 통해 뉴런 세포에 영향을 미치는 통합된 발작이다. 간질은 출생 전, 출생 동안 또는 출생 후의 뇌 손상; 두부 외상; 영양 결핍; 일부 감염성 질환; 뇌종양; 및 일부 독극물로부터 일어날 수 있다. 그러나, 많은 경우에 그 원인이 알려지지 않고 있다. 간질의 발명은 발작의 시작을 나타내는 전조라고 하는 불안 또는 감정적인 불편함의 느낌에 의해 발생될 수 있다. 환자마다 다양한 임박한 간질 발작의 신호는 불안정한 빛 또는 "강렬한 햇살"과 같은 시각적인 현상을 포함할 수 있다. 최근에, 간질에 대한 유전적 결합은 염색체 10q, 이웃한 마커 D10S192:10q22-q24 상에서 발견되었다 [참조: Ottman et al. (1995) Nature Genetics 10:56-60]. 간질의 다양한 형태로는 대발작, 잭슨형, 근간대성 전파성 가족형, 소발작, 레녹스-가스타우트 증후군, 열성 발작, 정신운동성 및 일시적인 로브(lobe)가 포함된다. 본원에 기술된 것들은 부분적인 가질에 대한 치료법을 개발하는데 특히 유용하다.
본원에 사용된 용어 "운동 실조증"은 뇌의 정상적인 전기 기능의 장애에 의해 유발되는 일반적인 신경 질환이다. 척수소뇌성 실조증 유형 1(SCA 1)은 인간 주요 조직적합 복합체(HLA)에의 결합을 기초로 하는 6번 염색체의 짧은 아암에 유전적으로 결합된 상염색체 우성 유전질환이다 [참조: H. Yakura et al. (1974) N.Engl. J. Med., 291, 154-155; and J.F. Jackson et al. (1997) N. Engl. J. Med 296, 1138-1141]. SCA1은 HLA에 에 대한 6번 염색체의 짧은 아암상의 마커 D6S89에 단단하게 결합된 것으로 보여진다 [참조: L. P. W. Ranum et al., Am. J. Hum. Genet., 49, 31-41 (1991); and H. Y. Zoghbi et al., Am. J. Hum. Genet., 49, 23-30 (1991)]. 본원에 기술된 것들은 유아기 발병 척수소뇌성 실조증 (IOSCA: infantile onset spinocerebellar ataxia)에 대한 치료법을 개발하는데 특히 유용하다.
본원에 사용된 용어 "심혈관 질환"은 심혈관계, 예를 들어 심장에 영향을 미치는 질환을 포함한다. 심혈관 질환의 예로는 동맥경화증, 국소빈혈 재관류 손상, 재협착증, 동맥 염증, 혈관벽 개형, 심실 개형, 급성 심실 조율(pacing), 관상 미소색전증, 심박 급속증, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 굴곡, 관상 대동맥 결찰, 혈관 심장 질환, 심방세동, 긴-QT 증후군, 충혈성 심장 손상, 동결절 장애, 후두염, 심장 손상, 고혈압, 심방세동, 심방조동, 확장형 심근병증, 특발성 심근병증, 심근경색증, 관상 대동맥 질환, 관상 대동맥 경련, 또는 부정맥이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 심혈관 질환은 비정상 Ito전류와 관련된다.
본원에 정의된 바와 같이, PCIP 패밀리의 일부 성분들은 또한 공통적인 구조적 특징, 예컨대 공통적인 구조 도메인 또는 모티프, 또는 충분한 아미노산 또는 누클레오티드 서열 상동체를 가질 수 있다. 이러한 PCIP 패밀리 구성원들은 천연 또는 비천연일 수 있으며 동일하거나 상이한 종을 함유할 수 있다. 예를 들어,PCIP 패밀리는 인간 기원의 제 1 단백질 및 다른 것을 함유할 수 있으며, 대안적으로 인간 기원의 다른 단백질은 비인간 기원의 상동체를 함유할 수 있다.
예를 들어, 공통적인 구조적 특징들을 갖는 PCIP 패밀리의 구성원들은 하나 이상의 "칼슘 결합 도메인"을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "칼슘 결합 도메인"은 칼슘 결합에 관여하는 아미노산 도메인, 예를 들어 EF 핸드(Baimbridge K.G. et al. (1992) TINS 15(8): 303-308)을 포함한다. 바람직하게, 칼슘 결합 도메인은 컨센서스 서열과 실질적으로 동일한 서열을 갖는다:
EO‥OO‥ODKDGDG·O…EF‥OO(SEQ ID NO: 41)
O는 I, L, V 또는 M 이며, "·"는 강하게 우선되는 잔기를 전혀 갖지 않는 위치를 나타낸다. 기록된 각각의 잔기는 서열의 25% 초과하여 존재하며, 밑줄친 잔기들은 서열의 80%를 초과하여 존재한다. 인간 lv 단백질의 아미노산 잔기 126-154 및 174-202, 래트 lv 단백질의 아미노산 잔기 126-154 및 174-202, 래트 1vl 단백질의 아미노산 잔기 137-165 및 185-213, 래트 1vn 단백질의 아미노산 잔기 142-170, 마우스 1v 단백질의 아미노산 잔기 126-154 및 174-202, 마우스 1vl 단백질의 아미노산 잔기 137-165 및 185-213, 인간 9ql 단백질의 아미노산 잔기 144-172, 180-208 및 228-256, 인간 9qm 단백질의 아미노산 잔기 126-154, 162-190 및 210-238, 인간 9qs 단백질의 아미노산 잔기 94-122, 130-158 및 178-206, 래트 9qm 단백질의 아미노산 잔기 126-154, 162-190 및 210-238, 래트 9ql 단백질의 아미노산 잔기 131-159, 167-195 및 215-243, 래트 9qc 단백질의 아미노산 잔기 126-154, 162-190 및 210-238, 래트 8t 단백질의 아미노산 잔기 99-127, 135-163 및 183-211, 마우스 9ql 단백질의 아미노산 잔기 144-172, 180-208 및 228-256, 원숭이 9qs 단백질의 아미노산 잔기 94-122, 130-158 및 178-206, 인간 p19 단백질의 아미노산 잔기 94-122, 130-158 및 178-206, 래트 p19 단백질의 아미노산 잔기 19-47 및 67-95, 마우스 p19 단백질의 아미노산 잔기 130-158, 166-194 및 214-242는 칼슘 결합 도메인(EF 핸드)을 포함한다(도 1 참조). 원숭이 KChIP4a 및 KChIP4b 단백질의 아미노산 잔기 116-127 및 152-163은 칼슘 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 PCIP 단백질은 약 100-200 아미노산 잔기 길이, 바람직하게는 150-200 아미노산 서열 길이, 더욱 바람직하게는 185 아미노산 잔기 서열 길이의 아미노산 서열을 포함하며, 3개의 EF 핸드를 포함하는 하나 이상의 보존된 카복실 말단 도메인의 존재를 기초로 하여 확인된다. 본 발명의 PCIP 단백질은 래트 1v, 래트 9q 또는 마우스 p19의 카복실 말단 185 아미노산 잔기에 최소한 약 70%, 71%, 74%, 75%, 76%, 80% 또는 그 이상 동일한 카복실 말단 도메인을 함유하는 것이 바람직하다(도 21, 25 및 41 참조).
또한 공통적인 구조적 특징들을 갖는 PCIP 패밀리의 구성원들은 표 I에 기재되어 있으며 하기에 설명되어 있다. 공통적인 구조적 특징을 갖지 않는 PCIP 패밀리의 다른 성분들, 예를 들어 PCIP 패밀리의 구성원들이 표 II에 기재되어 있으며, 하기에 설명되어 있다. 본 발명은 전장 인간 및 부분적 길이 래트 33b07 클론을 제공하며, 이들 cDNA에 의해 단백질은 엔코딩된다. 본 발명은 추가로 부분적 길이 래트 1p 클론을 제공하며 이 cDNA에 의해 단백질은 엔코딩된다. 부가적으로, 본 발명은 부분적 길이 래트 7s 클론이 제공되며 이 cDNA에 의해 단백질은 엔코딩된다.
본 발명은 추가로 이전에 확인된 cDNA(29x, 25r, 5p, 7q 및 19r)을 나타내는 PCIP 패밀리 구성원들을 제공한다. 이전에 확인된 이들 cDNA는 PCIP 패밀리 구성원, 즉 본원에 기술된 바와 같이, PCIP 활성을 갖는 분자로서 확인된다. 따라서, 본 발명은 이전에 확인된 이들 cDNA를 사용하는 방법, 예를 들어 스크리닝 검정, 진단 검정, 예후 검정에서 이들 cDNA를 사용하는 방법, 및 본원에 기술된 처리 방법을 제공한다.
본 발명의 PCIP 분자는 효모 2-하이브리드 검정(실시예 1에 상세하게 기술되어 있음)을 사용하여 결정된 바와 같이, 래트 Kv4.3 서브유닛의 아미노 말단 180개의 아미노산과 상호작용하는 능력을 기초로 하여 초기에 확인된다. 다른 칼륨 서브유닛을 이용한 추가의 결합 연구를 수행하여 Kv4.3 및 Kv4.2에 대한 PCIP의 특이성을 증명하였다. 그런 다음 동일계내 국소화, 면역 조직화학 방법, 공동면역침전 및 패치 클램핑 방법을 사용하여 본 발명의 PCIP가 칼륨 채널, 특히 4.3 또는 4.2 서브유닛을 포함하는 것들과 상호작용하고, 이들의 활성을 조절함을 증명하였다.
수개의 신규한 인간, 마우스, 원숭이 및 래트 PCIP 패밀리 구성원들을 본원에서 1v, 9q, p19, W28559, KChIP4, 33b07, 1p 및 래트 7s 단백질 및 핵산 분자로서 확인하였다. 1v 폴리펩티드를 엔코딩하는 인간, 래트 및 마우스 cDNA는 SEQ ID NO 1, 3 및 5에 의해 표현되며, 각각 도 1, 2 및 3에 도시되어 있다. 뇌에서, 1v mRNA는 신피질 및 해마 중간뉴런중에서, 시상 그물모양 핵 및 내측 고삐중에서, 바닥 전뇌 및 선조 콜린성 뉴런중에서, 상부의 소구중에서, 및 소뇌 과립 세포중에서높게 발현된다. 1v 폴리펩티드는 1v mRNA를 발현시키는 세포의 축삭 및 축삭 말단, 수지상 돌기 및 체중에서 높게 발현된다. 1v 유전자의 스플라이싱 변이체는 래트 및 마우스에서 확인되며, SEQ ID NO:7, 9 및 11로 표현되고, 각각 도 4, 5 및 6에 도시되어 있다. 1v 폴리펩티드는 Kv4.3 또는 kv4.2 서브유닛을 포함하고, Kv1.1 서브유닛은 포함하지 않는 칼륨 채널과 상호작용한다. 노던 블롯에 의해 결정되는 바와 같이, 1v 전사체(mRNA)는 뇌에서 우세하게 발현된다.
8t cDNA(SEQ ID NO: 29)는 SEQ ID NO:30(도 15 참조)에 상응하는 약 26kD의 분자량을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 8t 폴리펩티드는 Kv4.3 또는 Kv4.2 서브유닛을 포함하지만, Kv1.1 서브유닛을 포함하지 않는 칼륨 채널과 반응한다. 노던 블롯 및 현장 데이터에 의해 증명되는 바와 같이, 8t mRNA는 심장 및 뇌에서 지배적으로 발현된다. 8tcDNA는 9q의 스플라이싱 변이체이다.
인간, 래트, 원숭이 및 마우스 9q cDNA가 또한 단리된다. 스플라이싱 변이체는 인간 9ql(SEQ ID NO:13; 도 7), 래트 9ql(SEQ ID NO:15; 도 8), 마우스 9ql(SEQ ID NO:17; 도 9), 인간 9qm(SEQ ID NO:19; 도 10), 래트 9qm(SEQ ID NO:21; 도 11), 인간 9qs(SEQ ID NO:23; 도 12), 원숭이 9qs(SEQ ID NO:25; 도 13), 및 래트 9qc(SEQ ID NO:27; 도 14)를 포함한다. 9q의 게놈 DNA 서열이 또한 결정되었다. 엑손 1 및 이의 플랭킹 인트론 서열(SEQ ID NO:46)이 도 22A에 도시되어 있다. 엑손 2-11 및 이의 플랭킹 인트론 서열(SEQ ID NO:47)이 도 22B에 도시되어 있다. 9q 폴리펩티드는 Kv4.3 또는 Kv4.2 서브유닛을 포함하지만, Kv1.1 서브유닛을 포함하지 않는 칼륨 채널과 반응한다. 노던 블롯 및 동일계내 데이터에 의해 증명되는 바와 같이, 9q 단백질은 심장 및 뇌에서 지배적으로 발현된다. 뇌에서, 9q mRNA는 신선조체, 해마 형성, 신피질 피라미드형 세포 및 인터뉴런, 시상, 상부의 소구 및 소뇌중에서 높게 발현된다.
인간, 래트 및 마우스 P19 cDNA가 또한 단리된다. 인간 P19는 SEQ ID NO:31 및 도 16; 및 SEQ ID NO:39 및 도 20(3' 서열)에 도시되어 있다. 래트 P19는 SEQ ID NO:33 및 도 17에 도시되어 있으며, 마우스 P19는 SEQ ID NO:35 및 도 18에 도시되어 있다. P19 폴리펩티드는 Kv4.3 또는 Kv4.2 서브유닛을 포함하지만, Kv1.1 서브유닛을 포함하지 않는 칼륨 채널과 반응한다. 노던 블롯 및 동일계내 데이터에 의해 증명되는 바와 같이, P19 전사체(mRNA)는 뇌에서 지배적으로 발현된다.
PCIP 분자의 부분적 인간 파랄로그(paralog)가 또한 확인되었다. 이러한 파랄로그는 W28559로서 언급되며, SEQ ID NO:37 및 도 19에 도시되어 있다.
원숭이 KChIP4a 및 이의 스플라이싱 변이체 KChIP4b, KChIP4c 및 KChIP4d가 또한 확인되었다. 원숭이 KChIP4a는 SEQ ID NO:48 및 도 23에 도시되어 있다. 원숭이 KChIP4b는 SEQ ID NO:50 및 도 24에 도시되어 있다. 원숭이 KChIP4c는 SEQ ID NO:69 및 도 35에 도시되어 있다. 원숭이 KChIP4d는 SEQ ID NO:71 및 도 36에 도시되어 있다.
전장 래트 33b07 cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 33b07 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도 26 및 SEQ ID NO:52 및 53에 각각 도시되어 있다. 래트 33b07 cDNA는 약 44.7kD 분자량을 가지며 407개의 아미노산 잔기 길이인 단백질을 엔코딩한다. 래트 33b07는 rKv4.3N 및 rKv4.2N을 결합시키며 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.2N에 있어서 약간 우세하였다.
전장 인간 33b07 cDNA의 누클레오티드 서열 및 인간 33b07 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 도 27 및 SEQ ID NO 54 및 55에 각각 도시되어 있다.
부분적 길이 래트 1p cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 1p 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 도 28 및 SEQ ID NO 56 및 57에 각각 도시되어 있다. 래트 1p cDNA는 약 28.6kD 분자량이며 267개의 아미노산 잔기 길이인 단백질을 엔코딩한다. 래트 1p는 rKv4.3N 및 rKv4.2N을 결합시키며 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 있어서 약간 우세하였다.
부분적 길이 래트 7s cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 7s 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 도 29 및 SEQ ID NO 58 및 59에 각각 도시되어 있다. 래트 7s cDNA는 약 28.6kD 분자량이며 270개의 아미노산 잔기 길이인 단백질을 엔코딩한다. 래트 7s는 rKv4.3N 및 rKv4.2N을 결합시키며 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 있어서 약간 우세하였다.
본 발명의 서열은 하기 표 I 및 II에 요약되어 있다.
표 I
본 발명의 신규 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 (제시된 것을 제외하고는 전장)
PCIP 핵산 분자형 공급원 SEQ ID NO:DNA SEQ ID NO:단백질 ATCC
1v 또는KChIP1 1v 인간 (225-875)* 1 2 98994
KChIP1N(1vN)N-말단 스플라이싱 변이체 인간 (353-461) 80 81
1v 래트 (210-860) 3 4 98946
1v 마우스 (477-1127) 5 6 98945
1v1 인간 79 109
1vl 래트 (31-714) 7 8 98942
1vl 마우스 (77-760) 9 10 98943
1vn 래트 (345-955)(339-1037) 11(부분적)102(전장) 12(부분적)103(전장) 98944
9q 또는KChIP2 게놈 DNA 서열 인간 74
게놈 DNA 서열(엑손 1 및 플랭킹 인트론 서열) 인간 46
게놈 DNA 서열(엑손 2-11 및 플랭킹 인트론 서열) 인간 47
9ql 인간 (207-1019) 13 14 9899398991
9ql 래트 (2-775)(1-813) 15(부분적)75(전장) 16(부분적)76(전장) 98948
9ql 마우스 (181-993) 17 18 98937
9qm 인간 (207-965) 19 20 9899398991
9qm 래트 (214-972) 21 22 98941
9qs 인간 (207-869) 23 24 98951
9qs 원숭이 (133-795) 25 26 98950
9qc 래트 (208-966) 27 28 98947
8t 인간 (1-678) 77(부분적) 78(부분적)
래트 (1-678) 29(부분적) 30(부분적) 98939
p19 또는KChIP3 KChIP3(전장) 인간(16-786) 82 83
p19 인간 (1-771) 31 32 PTA-316
p19 래트 (1-330)(1-579) 33(부분적)84(부분적) 34(부분적)85(부분적) 98936
p19 마우스 (49-819) 35 36 98940
p193 (부분적) 인간 (2-127) 39 40 98949
W28559 W28559(부분적) 인간 (1-339) 37 38
KChIP4 KChIP4a(KChIP4N1) 인간 (248-949) 94 95
KChIP4aS(KChIP4N1S)KChIP4N1의 보다 짧은 스플라이싱 변이체 인간 (319-885) 9269 9370
KChIP4c(KChIP4N2) 인간 (90-779) 69 70
KChIP4d(KChIP4N3) 인간 (65-817) 98 99
KChIP4a(KChIP4N1) 원숭이 (265-966) 48 49
KChIP4bC-말단 스플라이싱 변이체 원숭이 (265-966) 50(부분적) 51(부분적)
KChIP4b(KChIP4XC) 원숭이 (1-385) 86(부분적) 87(부분적)
KChIP4c(KChIP4N2)스플라이싱 변이체 원숭이 (122-811) 69 70
KChIP4d(KChIP4N3)스플라이싱 변이체 원숭이 (64-816) 71 72
KChIP4c(KChIP4N2) 마우스 (56-745) 88 89
KChIP4 래트 (1-597) 90(부분적) 91(부분적)
XKChIP4aX(KChIP4N1x)KChIP4N1의스플라이싱 변이체 래트(1-821) 100(부분적) 101(부분적)
* 코딩 서열의 좌표를 괄호안에 제시하였다. 제 1 컬럼은 확인된 PCIP를 나타내며, 컬럼 2는 각각의 패밀리에 대해서 확인된 다양한 핵산 형을 나타낸다.
표 II
본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 (제시된 것을 제외하고는 전장)
PCIP 핵산분자형 공급원 SEQ ID NO:DNA SEQ ID NO:단백질 ATCC
33b07신규 33b07 인간(88-1332) 52 53 PTA-316
33b07 래트(85-1308) 54 55
1p신규 1p(부분적) 래트(1-804) 56 57
7s신규 7s(부분적) 래트(1-813) 58 59
29x 29x 래트(433-1071) 60 61
25r29x의 스플라이싱 변이체 래트(130-768) 62
5p 5p 래트(52-339) 63 64
7q 7q 래트(1-639) 65 66
19r 19r 래트(1-816) 67 68
* 코딩 서열의 좌표를 괄호안에 제시하였다. 제 1 컬럼은 확인된 PCIP의 4개의 패밀리를 나타내며, 컬럼 2는 각각의 패밀리에 대해서 확인된 다양한 핵산 형을 나타낸다. 또한, 신규한 분자가 제시되어 있다.
인간, 래트 및 원숭이의 PCIP를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 1998년 11월 17일에 기탁되었으며, 상기 기술된 수탁 번호로 지정되었다. 이들 기탁물은 특허 절차 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 조약인 부다페스트 조약하에 유지될 것이다. 이들 기탁물은 단지 당업자들이 편리하게 하기 위한 것으로, 기탁이 35 U.S.C. §112 하에서 요구되는 허가 사항은 아니다.
인간 p19(클론 EphP19) 및 인간 33b07(클론 Eph33b07)을 엔코딩하는 cDNA 분자를 함유하는 클론이 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassa, VA)에 수탁 번호 제 PTA-316호로서 1998년 7월 8일에 기탁되었으며, 2가지 균주의 혼합물을 나타내는 복합적 기탁물의 일부로서, 각각의 특정의 cDNA 클론을 포함하는 하나의 재조합 플라스미드를 가지고 있다(hP19 및 h33b07의 혼합물에 대한 ATCC 균주 지정은 EphP19h33b07mix 이다).
특정 cDNA 클론을 함유하고 있는 균주를 구별하고 단리하기 위해, 혼합물의일부를 100ug/ml 암피실린이 보충된 LB 플레이트상에 단일 콜로니가 형성되도록 스트리킹하여, 단일 콜로니를 성장시킨 다음, 표준 미니제조방법(minipreparation)을 사용하여 추출할 수 있다. 다음, DNA 미니제조의 샘플이 NotI으로 효소분해될 수 있으며, 생성된 생성물은 표준 DNA 전기영동 조건을 사용하여 0.8% 아가로스 겔상에서 해상된다. 효소분해물은 다음의 밴드 패턴을 제공한다: EphP19: 7kb 9 (단일 밴드), Eph33b07: 5.8kb (단일 밴드).
본 발명의 다양한 양태가 이하 단락에서 상세하게 기술되어 있다:
I. 단리된 핵산 분자
본 발명의 한 가지 양태는 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분, PCIP 엔코딩 핵산 분자(예를 들어, PCIP mRNA)를 확인하기 위해 하이브리드화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 단편 및 PCIP 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이화를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기 위한 단편을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 누클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 핵산 분자는 단일 또는 이중 가닥화될 수 있으며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원중에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 바람직하게, "단리된" 핵산은 핵산이 유도되는 생물체의 게놈 DNA중에서 핵산을 천연적으로 플랭킹시키는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 정위된 서열)을 함유하지 않는다. 예를 들어, 여러가지 구체예에서, 단리된 PCIP 핵산 분자는 핵산이 유도되는 세포의 게놈 DNA중에서 핵산 분자를 천연적으로 플랭킹시키는 누클레오티드 서열의 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만을 함유할 수 있다. 또한, "단리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 배양 배지 또는 다른 세포성 물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있거나, 화학적으로 합성되는 경우에 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않을 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 예컨대 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열 또는 이들의 일부의 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자는 본원에 제공된 서열 정보와 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 분리될 수 있다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 일부 또는 전체를 사용하여, 하이브리드화 프로브로서 PCIP 핵산 분자가 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술을 사용하여 분리될 수 있다(예컨대, Sambrook, J., Fritsh. E. F., 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY. 1989).
더욱이, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 일부 또는 전체를 포함하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열에 기초하여 디자인된 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산은 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 대안으로 게놈 DNA 및 표준 PCR 증폭 기술에 따라 적당한 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적당한 벡터로 클로닝될 수 있으며 DNA 서열 분석에 의해 특징될 수 있다. 또한, PCIP 핵산 서열에 해당하는 올리고누클레오티드는 예컨대 자동화 DNA 합성기를 사용하는 표준 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열 또는 이러한 서열중 임의 서열의 일부를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호,제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 상보서열 또는 이들중 임의 서열의 일부분을 포함한다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호,제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입물의 누클레오티드 서열에 대해 충분히 상보적인 핵산분자이므로, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열에 하이브리드화되어 안정한 듀플렉스를 형성한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ IDNO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열의 전장 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 전장 또는 이들 누클레오티드 서열중 임의 서열의 일부와 약 50% 이상, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 단지 일부, 예컨대 PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분을 엔코딩하는 단편, 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 단편을 포함할 수 있다. PICP 유전자의 클로닝으로부터 결정된 누클레오티드 서열은 다른 PCIP 패밀리 구성원뿐만 아니라, 다른 종으로부터의 PCIP 유사체를 동정하고/하거나 클로닝하는데 사용하도록 디자인된 프로브와 프라이머의 발생을 가능하게 한다.
프로브/프라이머는 전형적으로 실질적으로 정제된 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 전형적으로 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 센스 서열, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 안티 센스 서열 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 천연 대립형질 변이체 또는 돌연변이체의 약 12 또는 15 이상, 바람직하게는 약 20 내지 25, 보다 바람직하게는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 75 연속 누클레오티드에 하이브리드화하는 누클레오티드 서열 영역을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 949, 950-1000인 누클레오티드 서열 또는 보다 길이가 긴 누클레오티드를 포함하고, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69 또는 SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 핵산 분자에 하이브리드화된다.
PCIP 누클레오티드 서열 기재의 프로브는 동일하거나 상동성인 단백질을 엔코딩하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로브는 부착된 표지 그룹을 추가로 포함하며, 예컨대 표지 그룹은 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소, 또는 효소 보인자가 될 수 있다. 이러한 프로브는, 예컨대 게놈성 PCIP 유전자가 돌연변이되거나 결실될 수 있는 지를 검출하거나, PCIP mRNA 레벨을 검출하는 것과 같이, 개체로부터 세포 샘플중의 PCIP 엔코딩 핵산의 레벨을 측정함으로써, PCIP 단백질을 오발현하는 세포 또는 조직을 동정하기 위한 진단 시험 키트의 일부로서 사용될 수 있다.
"PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분"을 엔코딩하는 핵산 단편은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 일부를 단리하여 제조할 수 있으며, 이것은 (예컨대, 시험관내 재조합 발현에 의해) PCIP 단백질의 엔코딩된 부분을 발현하고, PCIP 단백질의 엔코딩 부분의 활성을 측정하면서 PICP 생물학적 활성(PCIP 단백질의 생물학적 활성은 본원에 설명되어 있다)을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩한다.
본 발명은, 유전자 코드의 축중으로 인해, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102로 표시된 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열과 다른 핵산 분자를 추가로 포함함으로써, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 것과 동일한 PCIP 단백질을 엔코딩한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 갖는다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ IDNO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102로 표시된 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열 이외에, PCIP 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 DNA 서열 다형성이 집단(예를 들어, 인간 집단)에 존재할 수 있다는 것(예를 들어, 인간 집단)이 당업자에게 이해될 것이다. PCIP 유전자내의 이러한 유전자 다형성은 천연의 대립형질 변형으로 인해 집단 내에 개별적으로 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 PCIP 단백질, 바람직하게는 포유동물 PCIP 단백질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하고 추가로 비코딩 조절 서열 및 인트론을 추가로 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.
인간 PCIP의 대립형질 변이체는 기능성 및 비기능성 PCIP 단백질 모두를 포함한다. 기능성 대립형질 변이체는 PCIP 리간드를 결합하고/하거나 본원에 설명된 임의의 PCIP 활성을 조절하는 능력을 보유한 인간 PCIP 단백질의 천연 아미노산 서열 변이체이다. 기능성 대립형질 변이체는 전형적으로 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ IDNO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109의 하나 이상의 아미노산의 보존 치환, 단백질의 비임계 영역에서 비임계 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 전형적으로 포함할 것이다.
비기능성 대립형질 변이체는 PCIP 리간드와 결합하고/하거나 본원에서 설명된 임의의 PCIP 활성을 조절하는 능력이 없는 인간 PCIP 단백질의 천연적으로 발생한 아미노산 서열 변이체이다. 비기능성 대립형질 변이체는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열의 비보존성 치환, 결실 또는 삽입 또는 조기 절단, 또는 임계 잔기 또는 임계 영역에서의 치환, 삽입 또는 결실을 전형적으로 함유할 것이다.
본 발명은, 인간 PCIP 단백질의 비인간 오르톨로그(orthologues)를 추가로제공한다. 인간 PCIP 단백질의 오르톨로그는 비인간 생물체로부터 단리된 단백질이고 인간 PCIP 단백질의 칼륨 채널 매개된 활성의 조절 및/또는 동일한 PCIP 리간드 결합을 갖는다. 인간 PCIP 단백질의 오르톨로그는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
또한, PCIP 패밀리 구성원을 엔코딩하여 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열과 다른 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 예를 들어, 다른 PCIP cDNA는 인간 PCIP의 누클레오티드 서열을 기초로 하여 동정될 수 있다. 더욱이, 다른 종으로부터 PCIP 단백질을 엔코딩하여 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 PCIP 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열과 다른 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자도 본 발명의 범위 내로 의도된다. 예를 들어, 마우스 PCIP cDNA는 인간 PCIP의 누클레오티드 서열을 기초로 동정될 수 있다.
천연의 대립형질 변이체 및 본 발명의 PCIP cDNAs의 유사체에 상응하는 핵산 분자는 엄격한 하이브리드화 조건 하에 표준 하이브리드화 기술에 따라 하이브리드화 프로브로서 본원에 개시된 cDNAs 또는 이들의 일부를 사용하여 본원에 개시된 PCIP 핵산에 대한 이들의 상동성을 기초로 단리될 수 있다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 길이가 15 이상, 20, 25, 30 이상의 누클레오티드이고, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호,제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 엄격한 조건 하에 하이브리드화된다. 다른 구체예에서, 핵산은 길이가 30 이상, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 307, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 949, 또는 950 누클레오티드이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "엄격한 조건하의 하이브리드화"는 서로 60% 이상 동일한 누클레오티드 서열이 전형적으로 서로에 대해 하이브리드화하는 조건 하에서 하이브리드화와 세정을 위한 조건을 설명하는 것으로 의도된다. 바람직하게, 이 조건으로 인해, 서로 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 85% 이상 또는 90% 동일한 서열이 전형적으로 서로 하이브리드화된 채로 남아있다.
이러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.(1995), sections 2, 4 and 6]에서 확인할 수 있다. 또한, 추가의 엄격한 조건은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989), chapters 7, 9 and 11]에서 확인할 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직하고 비제한적인 예에는, 약 65-70℃에서 4x 염화 나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서의 하이브리드화(또는 대안적으로, 약 42-50℃에서 4x SSC 플러스 50% 포름아미드에서의 하이브리드화)시킨 후에, 약 65-70℃에서 1x SSC에서의 1회 이상 세정시키는 것이 포함된다. 매우 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직하고 비제한적인 예에는, 약 65-70℃에서 1x SSC에서의 하이브리드화(또는 대안적으로, 약 42-50℃에서 1x SSC 플러스 50% 포름아미드에서의 하이브리드화)시킨 후에, 약 65-70℃에서 0.3x SSC에서의 1회 이상 세정시키는 것이 포함된다. 이보다 덜 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직하고 비제한적인 예에는, 약 50-60℃에서 4x SSC에서의 하이브리드화(또는 대안적으로, 약 40-45℃에서 6x SSC 플러스 50% 포름아미드에서의 하이브리드화)시킨 후에, 약 50-60℃에서 2x SSC에서의 1회 이상 세정시키는 것이 포함된다. 상기 언급된 값, 예컨대 65-70℃ 또는 42-50℃에 대한 중간 범위도 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. SSPE(1x SSPE는 0.15M NaCl, 10mM의 NaH2PO4및 1.25mM의 EDTA, pH 7.4)가 하이브리드화 및 세정용 완충액으로 SSC(1x SSC는 0.15M NaCl 및 15mM의 시트르산 나트륨이다)로 대체될 수 있다; 세정은 하이브리드화가 완료된 후 마다 15분 동안 실시된다. 길이가 50개 미만의 염기쌍으로 예측되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 융점(Tm)보다 낮은 5 내지 10℃이어야 하는데, 여기에서 Tm은 하기 식에 준하여 결정된다. 길이가 18개 미만의 염기쌍인 하이브리드에 대해서는, Tm(℃) = 2(A의 개수 + T 염기) + 4(G의 개수 + C 염기). 길이가 18 내지 49개의 염기쌍인 하이브리드에 대해서, Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G + C) - (600/N), 여기에서 N은 하이브리드 내의 염기의 개수이며, [Na+]는 하이브리드화 완충액 내의 나트륨 이온의 농도이다(1x SSC에 대한 [Na+]는 0.165M이다). 막에 대한 핵산 분자의 비특이적인 하이브리드화를 감소시키기 위해 하이브리드화 및/또는 세정 완충액에 부가적인 시약, 예컨대 여기에 한정되는 것은 아니나 블록킹제(예컨대, BSA 또는 연어 또는 청어의 정자 캐리어 DNA), 세제(예컨대, SDS), 킬레이트화제(예컨대, EDTA), 피콜, PVP 등을 포함하는 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막을 첨가할 수 있다. 나일론 막을 사용하는 경우에, 엄격한 하이브리드화 조건의 특히 부가적으로 바람직한 비제한적인 예는 약 65℃에서 0.25-0.5M NaH2PO4및 7%의 SOS 중에서 하이브리드화시킨 후에, 65℃에서 0.02M NaH2PO4및 1%의 SOS(참조: Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995) 또는 대안적으로 0.2x SSC 및 1%의 SDS에서 1회 이상 세정시키는 것이다.
바람직하게는, 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1의 서열로 하이브리드화하는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 천연적으로 발생한 핵산 분자에 상응한다. 본원에서 설명한 바와 같이, "천연적으로 발생한" 핵산 분자는 천연적으로 발생한 누클레오티드 서열(천연 단백질을 엔코딩한다)을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 지칭한다.
집단 내에 존재할 수 있는 PCIP 서열의 천연 발생적인 대립형질 변이체 이외에, 당업자는 추가로 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ IDNO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열로 돌연변이에 의해 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이며, 따라서 PCIP 단백질의 기능성 능력을 변형시키지 않으면서 엔코딩된 PCIP 단백질의 아미노산 서열을 변화시킬 것이다. 예를 들어, "필수적이지 않은" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 누클레오티드 치환은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열에서 이루어질 수 있다. "필수적이지 않은" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변형시키지 않으면서 PCIP의 야생형 서열(예컨대, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109의 서열)로부터 변형될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 위해 필수적이다. 예를들어, 본 발명의 PCIP 단백질 사이에서 보존된 아미노산 잔기는 특히 수정되지 않을 것으로 예측된다. 더욱이, 본 발명의 PCIP 단백질과 PCIP 패밀리 단백질의 다른 구성원 사이에서 보존된 추가의 아미노산 잔기는 수정되어 변형되지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 변화되는 PCIP 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 PCIP 단백질은 아미노산 서열 면에서 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109와 다르며, 여전히 생물학적 활성을 유지한다. 하나의 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는데, 상기 단백질은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109와 약 50% 이상, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 또는 SEQ ID NO:109의 단백질과 유사한 PCIP 단백질을 엔코딩하는 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열로의 하나 이상의 누클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 생성될 수 있으므로, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 엔코딩된 단백질에 도입된다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열로 특정 부위 돌연변위 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 돌연변이가 도입될 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 예상된 필수적이지 않은 아미노산 잔기에서 보존성 아미노산의 치환이 이루어진다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, PCIP 단백질에서 예상되는 필수적이지 않은 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 바람직하게는 치환된다. 또한, 다른 구체예에서, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의해서와 같이 PCIP 코딩 서열의 일부 또는 전부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 활성을 유지하는 돌연변이를 동정하기 위해 PCIP 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열의 돌연변이 유발이 일어난 후에, 엔코딩된 단백질은 재조합에 의해 발현될 수 있으며, 단백질의 활성이 측정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 돌연변이 PCIP 단백질은 (1) 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부와 상호 작용(예컨대, 결합)하고, (2) 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부의 인산화 상태를 조절하고, (3) 칼슘과 관련(예컨대, 결합)되어, 예컨대 칼슘 의존성 키나아제로서 작용하고, 예컨대 칼슘 의존성 방식으로 칼륨 채널을 인산화하고,(4) 칼슘과 관련(예컨대, 결합)되어, 예컨대 칼슘 의존성 전사 인자로서 작용하고, (5) 세포(예컨대, 뉴런 또는 심장 세포)에서 칼륨 채널 매개된 활성을 조절하여, 예컨대 세포에 유익하게 영향을 미치고, (6) 신경전달물질의 방출을 조절하고, (7) 막 여기성을 조절하고,(8) 막의 휴지 전위에 영향을 미치고, (9) 파형과 활동 전위의 빈도를 조절하고, (10) 자극의 역치를 조절하는 능력에 대해 분석될 수 있다.
앞서 설명된 PCIP 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자 이외에, 본 발명의 다른 면은 안티센스인 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. "안티센스" 핵산은 단백질을 엔코딩하는 "센스" 핵산에 대한 상보서열, "예컨대 이중 가닥의 cDNA 분자의 코딩 가닥에 대한 상보서열 또는 mRNA 서열에 대한 상보서열인 누클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 완전한 PCIP 코딩 가닥, 또는 단지 이의 일부에 대한 상보서열일 수 있다. 한 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 PCIP를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "코딩 영역"에 대한 안티센스이다. 용어 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 번역된 코돈을 포함하는 노클레오티드 서열의 영역을 지칭한다. 다른 구체예에서, 안티센스 핵산 분자는 PCIP를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "비코딩 영역"에 대한 안티센스이다. 용어 "비코딩 영역"은 아미노산으로 번역되지 않으며 코딩 영역을 플랭킹하는 5' 및 3' 서열을 지칭한다(5' 및 3' 비번역된 영역으로서 지칭하기도 한다).
본원에 개시된 PCIP를 엔코딩하는 코딩 가닥 서열인 경우, 본 발명의 안티센스 핵산은 왓슨과 크릭(Watson and Crick) 염기쌍의 법칙에 따라 디자인될 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 PCIP mRNA의 완전한 코딩 영역에 대한 상보서열일 수 있지만, 보다 바람직하게는 PCIP mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 단지 일부에 대한 안티센스인 올리고누클레오티드이다. 예컨대, 안티센스 올리고누클레오티드는 PCIP mRNA의 번역 개시 부위를 둘러싸는 영역에 대한 상보서열일 수 있다. 안티센스 올리고누클레오티드의 길이는, 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 누클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 과정을 사용하여 화학 합성 및 효소 결찰 반응을 사용하여 제작될 수 있다. 예컨대, 안티센스 핵산(예컨대, 안티센스 올리고누클레오티드)은 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나, 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을증가시키도록 디자인된 천연적으로 발생한 누클레오티드 또는 다양하게 개질된 누클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 예컨대 포스포로티오에이트 유도체와 아크리딘 치환된 누클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 발생시키는데 사용될 수 있는 개질된 누클레오티드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀴오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 이부톡소신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노푸린을 포함한다. 또한, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 하기 단락에서 추가 설명되는 중요한 표적 핵산에 대해 안티센스 배향될 것이다).
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 동일계내 발생되거나 개체에 전형적으로 투여되어, 이들이 하이브리드화하거나, PCIP 단백질을 엔코딩하는 게놈DNA 및/또는 세포 mRNA에 대해 결합하여, 예를 들어 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 단백질의 발현을 억제한다. 하이브리드화는 통상의 누클레오티드 상보성에 의해 이중 나선의 주요 그루브(groove)에서 특이적인 상호작용을 통해 DNA 듀플렉스에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 또는 안정한 듀플렉스를 형성한다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로 예에는, 조직 부위에서 직접적으로 주입하는 것을 포함한다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 표적으로 선택된 세포에 대해 개질되어 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여에 있어서, 안티센스 분자는, 예를 들어 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합한 펩티드 또는 항체에 결합시킴으로써, 이들이 선택된 세포 표면 위에서 발현되는 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 개질될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 본원에 개시된 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하도록, 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로모터의 조절 하에 위치된 벡터 제작물인 것이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 일반적인 β-유닛과는 달리, 가닥이 서로 평행한 상보적인 RNA와 특이적인 이중 가닥의 하이브리드를 형성한다(Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). 또한, 안티센스 핵산 분자는 2'-o-메틸리보누클레오티드(Inoue et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 리보자임이다. 리보자임은 이들이 상보적인 영역을 갖는 mRNA와 같은 단일 가닥의 핵산을 절단 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임[예컨대, 귀상어(hammerhead) 리보자임(Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591에서 설명된다)]은 PCIP mRNA 전사체를 촉매에 의해 절단하는데 사용되어 PCIP mRNA의 번역을 억제할 수 있다. PCIP 엔코딩 핵산에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 본원에 개시된 PCIP cDNA(즉, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열의 누클레오티드 서열)의 누클레오티드 서열을 기초로 디자인될 수 있다. 예를 들어, 테트라히메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 누클레오티드 서열이 PCIP-엔코딩 mRNA에서 절단된 누클레오티드 서열에 대해 상보적으로 제작될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Cech et al. 미국 특허 제 4,987,071호; 및 Cech et al. 미국 특허 제 5,116,742호]을 참조하라. 또한, PCIP mRNA는 RNA 분자의 푸울로부터 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Bartel, D. 및 Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418]을 참조하라.
또한, PCIP 유전자 발현은 PCIP의 조절 영역에 대해 상보적인 누클레오티드 서열(예를 들어, PCIP 프로모터 및/또는 인핸서)을 표적으로 하여 억제되어, 표적 세포에서 PCIP 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성할 수 있다. 이에 대해서는, 일반적으로 문헌[Helene, C.(1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660-27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15]을 참조하라.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 PCIP 핵산 분자는 염기 부분, 당 부분, 인산염 주쇄에서 개질되어, 예컨대 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 용해도를 향상시킬 수 있다. 예컨대, 핵산 분자의 데옥시리보스 인산염 주쇄가 개질되어 펩티드 핵산을 발생시킬 수 있다(Hyrup B. et al.(1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA" 주쇄는 핵산 모사체, 예컨대 DNA 모사체를 지칭하는데, 여기에서 데옥시리보스 인산염 주쇄는 슈도펩티드 주쇄에 의해 치환되고 단 4 개의 천연 누클레오염기가 유지된다. PNA의 천연 주쇄에 의해 낮은 이온 강도의 조건 하에서 DNA 및 RNA가 특이적으로 하이브리드화 할 수 있는 것으로 보인다. PNA 올리고머는 문헌[Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:14670-675]에 설명된 바와 같이 표준 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 합성될 수 있다.
PCIP 핵산 분자의 PNA는 치료 및 진단 분야에서 사용될 수 있다. 예컨대, PNA는 예컨대 전사 또는 번역 어레스트(arrest)를 유도하거나 복제를 억제함으로써 유전자 발현을 서열 특이적으로 조절하기 위한 안티센스 또는 항원 제제(agent)로서 사용될 수 있다. PCIP 핵산 분자의 PNA는 또한 (예컨대, PNA 유도된 PCR 클램핑에 의해) 하나의 유전자에서 단일 염기쌍 돌연변이를 분석할 때; 다른 효소[예를 들어, S1 누클레아제 [참고문헌: Hyrup B. (1996) supra])와 함께 사용될 때 '인공 제한 효소'로서; 또는 DNA 서열화 또는 하이브리드화용 프로브 또는 프라이머로서[참고문헌: Hyrup B.et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra] 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, PCIP의 PNA는 친지성 또는 다른 헬퍼 그룹을 PNA에 부착시키거나, PNA-DNA 키메라를 형성시키거나, 리포솜 또는 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 약물 전달 기술을 사용함으로써 개질(예컨대, 이들의 안정성 또는 세포 흡수율의 증대)될 수 있다. 예컨대, PNA와 DNA의 유리한 특성을 겸비할 수 있는 PCIP 핵산 분자의 PNA-DNA 키메라가 발생될 수 있다. 이러한 키메라는 DNA 인지 효소(예, RNAse H 및 DNA 폴리머라아제)가 DNA 부분과 상호작용할 수 있게 하는 반면, PNA 부분은 높은 결합 친화도 및 특이성을 제공할 것이다. PNA-DNA 키메라는 염기 스태킹, 누클레오염기들 간의 결합 수, 및 배향성을 기준으로 선택된 적합한 길이의 링커를 사용하여 결합될 수 있다[참고문헌: Hyrup B. (1996) supra]. PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌[Hyrup B. (1996) supra 및 Finn P.J.et al. (1996)Nucleic Acids Res. (24)(17):3357-63]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 예컨대, DNA 사슬은 표준 포스포르아미디트 커플링 화학을 사용하여 고형 지지체상에 합성될 수 있으며, 개질된 누클레오시드 유사체, 예컨대, 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미디트는 PNA와 DNA의 5' 말단 사이로서 사용될 수 있다[참고문헌: Mag, M.et al. (1989)Nucleic Acid Res. 17:5973-88]. 그 다음으로, PNA 단량체는 단계적으로 5'PNA 절편 및 3'DNA 절편과 커플링되어 키메라 분자를 생성시킨다[참고문헌: Finn P.J.et al. (1996) supra]. 대안적으로, 키메라 분자는 5'DNA 절편 및 3'PNA 절편과 합성될 수 있다[참고문헌: Peterser, K.H.et al. (1975)Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124].
다른 구체예에서, 올리고누클레오티드는 (예컨대, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한) 펩티드와 같은 다른 부속 그룹, 또는 세포막을 가로질러 수송을 용이하게 하는 제제[Letsingeret al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. US. 86:6553-6556; Lemaitreet al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:648-652; PCT 공보 제 WO88/09810호] 또는 혈액-뇌 배리어[PCT 공보 제 WO89/10134호]를 포함할 수 있다. 또한, 올리고누클레오티드는 하이브리드화 개시된 절단 제제[Krolet al. (1988)Bio-Techniques6:958-976] 또는 개재 제제(intercalating agents)[Zon (1988)Pharm. Res. 5:539-549]를 사용하여 개질될 수 있다. 이러한목적으로, 올리고누클레오티드가 또 다른 분자(예컨대, 펩티드, 하이브리드화 개시 가교제, 수송 제제 또는 하이브리드화 개시된 절단 제제)에 컨쥬케이션될 수 있다.
II. 단리된 PCIP 단백질 및 항-PCIP 항체
본 발명의 한 가지 양태는 단리된 PCIP 단백질 및 이들의 생물학적 활성 부분 뿐만 아니라 항-PCIP 항체를 배양시키기 위한 면역원으로서 사용하는데 적합한 폴리펩티드 단편에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 천연 PCIP 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 적절한 정제 방법으로 세포 또는 조직원으로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, PCIP 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 재조합 발현에 대한 대안으로서, PCIP 단백질 또는 폴리펩티드가 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이들의 생물학적 활성 부분은 PCIP 단백질이 유도되는 세포 또는 조직원으로부터의 세포질 또는 다른 오염되는 단백질을 사실상 함유하지 않거나, 화학적으로 합성될 때 화학적인 전구체 또는 다른 화학물질을 사실상 함유하지 않는다. 본원에서 사용되는 표현 "세포질 물질을 사실상 함유하지 않는"이란, 약 30% 미만(건조 중량을 기준으로 함)의 비PCIP 단백질(이것을 "오염되는 단백질"이라고도 지칭함), 보다 바람직하게는 약 20% 미만의 비PCIP 단백질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 비PCIP 단백질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비PCIP 단백질을 갖는 PCIP 단백질의 제조물을 포함한다. PCIP 단백질 또는 이들의 생물학적 활성 부분이 재조합적에 의해 생성될 때, 배양 배지를 사실상 함유하지 않는 것도 바람직하며, 즉, 배양 배지가 단백질 제조물 용적의 약 20%미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 나타내는 것이 바람직하다.
표현 "화학 전구체 또는 그 밖의 화학물질을 사실상 함유하지 않는"이란, 상기 단백질의 합성시에 관련되는 화학 전구체 또는 그 밖의 화학물질로부터 단백질이 단리되는 PCIP 단백질의 제조물을 포함한다. 하나의 구체예에서, 표현 "화학 전구체 또는 그 밖의 화학물질을 사실상 함유하지 않는"이란 약 30%(건조 중량을 기준으로 함) 미만의 화학 전구체 또는 비PCIP 화학물질, 보다 바람직하게는 약 20% 미만의 화학 전구체 또는 비PCIP 화학물질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 화학 전구체 또는 비PCIP 화학물질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 화학 전구체 또는 비PCIP 화학물질을 갖는 PCIP 단백질의 제조물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 PCIP 단백질의 "생물학적 활성 부분"은 PCIP 분자와 비PCIP 분자 사이의 상호작용에 참여하는 PCIP 단백질의 단편을 포함한다. PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분은 PCIP 단백질의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이러한 서열로부터 유도된 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ IDNO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하며, 상기 아미노산 서열은 전장 PCIP 단백질 보다 더 적은 수의 아미노산을 포함하며, PCIP 단백질의 하나 이상의 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 칼륨 채널 서브유닛의 결합과 같은 PCIP 단백질의 활성을 하나 이상 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어 10, 25, 50, 100, 200 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드일 수 있다. PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분은 칼륨 채널 매개된 활성을 조절하는 제제를 개발하기 위한 표적으로서 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, PCIP 단백질의 생물학적 활성 부분은 적어도 하나의 칼슘 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 PCIP 단백질의 바람직한 생물학적 활성 부분은 상기 동정된 구조 도메인 중의 적어도 하나를 함유할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. PCIP 단백질의 보다 바람직한 생물학적 활성 부분은 상기 동정된 구조 도메인 중 적어도 2개를 함유할 수 있다. 더욱이, 단백질의 다른 영역이 삭제되는 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으며, 천연 PCIP 단백질의 하나 이상의 기능적 활성에 대하여 평가될 수 있다.
바람직한 구체예에서, PCIP 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, PCIP 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109와 실질적으로 동일하며, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ IDNO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109의 단백질의 기능적 활성을 보유하지만, 상기 단락 I에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이, 천연 대립유전자 돌연변이 또는 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열이 다르다. 따라서, 또 다른 구체예에서, PCIP 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다.
본 발명의 단리된 단백질, 바람직하게는 1v, 9q, p19, W28559, KChIP4a, KChIP4b, 33b07, 1p 또는 7s 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열과 충분히 동일한 아미노산 서열을 갖거나, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, 또는 SEQ ID NO: 102과 충분히 동일한 누클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 본원에서 사용되는 용어 "충분히 동일한" 아미노산 서열 또는 누클레오티드 서열은 제 1 및 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 공통의 구조 도메인 또는 모티프 및/또는 공통의 기능적 활성을 공유하도록 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열에 충분히 또는 최소의 동일하거나 균등한(예를 들어, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기) 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 함유하는 제 1 아미노산 또는 누클레오티드 서열을 언급한다. 예를 들어, 공통의 구조 도메인을 공유하는 아미노산 또는 누클레오티드 서열은 도메인의 아미노산 서열을 가로질러 적어도 30%, 40% 또는 50% 서열 동일성, 바람직하게는 60% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 70% 내지 80%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 90 내지 95%의 서열 동일성을 가지며, 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 구조 도메인 또는 모티프를 함유하며, 본원에서는 이를 충분히 동일한 것으로 정의한다. 더욱이, 적어도 30%, 40% 또는 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70 내지 80% 또는 90 내지 95%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 또는 누클레오티드 서열은 공통의 기능적 활성을 공유하며 이를 본원에서는 충분히 동일한 것으로 정의한다.
바람직한 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인 및 바람직하게는 PCIP 활성을 갖는 PCIP 단백질이다. 그 밖의 바람직한 단백질은 하나 이상의 칼슘 결합 도메인을 갖는 PCIP 단백질이고, 바람직하게는, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ IDNO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, 또는 SEQ ID NO: 102의 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 하이브리드화되는 누클레오티드 서열을 갖는 핵산 서열에 의해 엔코딩된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 % 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 배열을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중의 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있으며, 비교 목적을 위해 비상동성 서열은 무시될 수 있다). 바람직한 구체예에서, 비교 목적으로 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱더 바람직하게는 60% 이상, 보다 더욱더 바람직하게는 70%, 80% 또는 90% 이상이다(예를 들어, 177개의 아미노산 잔기를 갖는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78,SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109의 PCIP 아미노산 서열에 제 2 서열을 정렬시킬 때, 80 이상, 바람직하게는 100 이상, 보다 바람직하게는 120 이상, 더욱더 바람직하게는 140 이상, 보다 더욱더 바람직하게는 150, 160 또는 170개 이상의 아미노산 잔기가 정렬된다). 그 다음으로, 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서 비교된다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 점유될 때, 상기 분자는 상기 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열간의 % 동일성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
두 서열간의 % 동일성의 결정 및 서열의 비교는 수학적인 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 두 아미노산 서열간의 % 동일성은 블로섬(Blosum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com으로부터 입수가능)내의 GAP 프로그램에 편입된 니들맨 (Needleman) 및 운취(Wunsch)[J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)] 알고리즘을 사용하여 결정된다. 더욱 또 다른 바람직한 구체예에서, 두 누클레오티드 서열간의% 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com으로부터 입수가능)의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 또 다른 구체예에서, 두 아미노산 또는 두 핵산 서열간의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0 또는 2.0U)에 편입된 이. 마이어스(E. Meyers) 및 더불유. 밀러(W. Miller)[CABIOS, 4:11-17 (1989)]의 알고리즘을 사용하여 결정된다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 공개된 데이터베이스를 조사하여 예를 들어 다른 패밀리 구성원 또는 관련된 서열을 동정하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 조사는 문헌[Altschul,et al. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 PCIP 핵산 분자와 동일한 누클레오티드 서열을 수득하기 위한 BLAST 누클레오티드 조사는 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 워드길이(wordlength)=12)으로 수행될 수 있다. 본 발명의 PCIP 단백질 분자와 동일한 아미노산 서열을 수득하기 위한 BLAST 단백질 조사는 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 워드길이 = 3)으로 수행될 수 있다. 비교 목적용의 갭이 형성된 정렬을 달성하기 위해, 캡이 형성된 BLAST가 문헌[Altschulet al. (1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭이 형성된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
본 발명은 또한 PCIP 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 PCIP "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비(non)-PCIP 폴리펩티드에 작동가능하게 결합된 PCIP 폴리펩티드를 포함한다. "PCIP 폴리펩티드"는 PCIP에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 언급하는 것인 반면, "비(non)-PCIP 폴리펩티드"는 PCIP 단백질과 사실상 동일하지 않은 단백질, 예를 들어, PCIP 단백질과는 상이하며 동일하거나 상이한 생물체로부터 유도되는 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 언급한다. PCIP 융합 단백질내에서, PCIP 폴리펩티드는 PCIP 단백질의 전부 또는 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 구체예에서, PCIP 융합 단백질은 PCIP 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PCIP 융합 단백질은 PCIP 단백질의 2개 이상의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 융합 단백질내에서, 용어 "작동가능하게 결합된"은 PCIP 폴리펩티드 및 비PCIP 폴리펩티드가 서로에 대하여 인-프레임(in-frame)으로 융합되는 것을 나타내도록 의도된다. 비PCIP 폴리펩티드는 PCIP 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다.
예를 들어, 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 PCIP 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합되는 GST-PCIP 융합 단백질이다. 그러한 융합 단백질은 재조합 PCIP의 정제를 용이하게 할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 이의 N-말단에서 이종의 시그널 서열을 함유하는 PCIP 단백질이다. 특정의 숙주 세포(예, 포유동물 숙주 세포)에서, PCIP의 발현 및/또는 분비는 이종의 시그널 서열을 사용함으로써 증가될 수 있다.
본 발명의 PCIP 융합 단백질은 약제 조성물내로 혼입되고 피검자의 생체내로 투여될 수 있다. PCIP 융합 단백질은 PCIP 기질의 생체이용율에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. PCIP 융합 단백질의 사용은 CNS 질환과 같은 칼륨 채널 관련 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환과 관련된 치매증(예, 피크 질환(Pick's disease)), 파킨슨 질환 및 그 밖의 루이 확산 소체 질환, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 핵상마비, 간질, 척수소뇌성 실조증, 및 크로이츠 펠트-야콥병과 같은 신경퇴행성 질환; 정신과 질환, 예를 들어, 우울증, 정신분열형 장애, 코르사코프 정신질환, 조증, 불안 장애 또는 공포 장애; 학습 또는 기억력 장애, 예를 들어, 기억상실증 또는 연령 관련 기억력 손실; 및 신경계 장애, 예를 들어, 편두통을 치료하기 위한 치료목적으로 유용할 수 있다. PCIP 융합 단백질의 사용은 또한 칼륨 채널 관련 장애, 예를 들어, 심혈관 장애, 예를 들어, 동맥 경화증, 국소빈혈 재관류 손상, 재협착증, 동맥 염증, 맥관벽 개형, 심실 개형, 심실급연조율, 관상 마이크로색전증(coronary microembolism), 빈맥, 서맥, 압력과부하, 대동맥궁, 관상 동맥 결찰, 혈관 심장 질환, 심방 세동 또는 울혈성 심부전을 치료하기 위한 치료목적으로 유용할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 PCIP 융합 단백질은 피검자에게 항-PCIP 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있고, PCIP 리간드를 정제하는데 사용될 수 있으며, PCIP 기질과 PCIP의 상호작용을 억제하는 분자를 동정하는 스크리닝 검정에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 PCIP 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA기술에 의해 생성된다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 통상의 기술에 따라, 예를 들어, 연결용 평활 단부 또는 스태거(stagger) 단부의 말단, 적합한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 경우 접착성 단부의 내충전, 원치 않는 결합을 피하기 위한 알칼리성 포스파타아제, 및 효소 결합을 사용함으로써 인-프레임으로 함께 결합된다. 또 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 발생시키기 위해 후속적으로 아닐링되고 재증폭될 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적인 오버행(overhangs)을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다[참조예:Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubelet al. John Wiley & Sons : 1992]. 더욱이, 융합 부분(예를 들어, GST 폴리펩티드)을 미리 코딩시킨 많은 발현 벡터는 입수가능하다. PCIP 엔코딩 핵산은 이러한 발현 벡터내로 클로닝되어 융합 부분이 인-프레임으로 PCIP 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 PCIP 작용제(유사체) 또는 PCIP 길항제로서 기능하는 PCIP 단백질의 돌연변이체에 관한 것이다. PCIP 단백질의 돌연변이체는 PCIP 단백질의 돌연변이유발, 예를 들어 분리점 돌연변이 또는 절단(truncation)에 의해 발생될 수 있다. PCIP 단백질의 작용제는 천연형 PCIP 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 서브세트를 보유할 수 있다. PCIP 단백질의 길항제는 예를 들어 PCIP 단백질의 칼륨 채널 매개된 활성을 경합적으로 조절함으로써 천연형 PCIP 단백질의 하나 이상의 활성을 억제시킬 수 있다. 이와 같이, 특정의 생물학적 효과는 제한된 기능의 돌연변이체에 의한 처리에 의해 유도될 수 있다. 하나의 구체예에서, 천연형의 상기된 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 돌연변이체에 의한 피검체의 처리는 천연형 PCIP 단백질에 의한 처리에 비하여 피검체에게 부작용을 덜 일으킨다.
하나의 구체예에서, PCIP 작용제(유사체) 또는 PCIP 길항제로서 기능하는 PCIP 단백질의 돌연변이체는 PCIP 단백질 작용제 또는 길항제 활성을 위한 PCIP 단백질의 돌연변이체, 예를 들어, 절단 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 하나의 구체예에서, PCIP 돌연변이체의 돌연변이화된 라이브러리는 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발에 의해 발생되며 돌연변이화된 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. PCIP 돌연변이체의 돌연변이화된 라이브러리는 예를 들어 합성 올리고누클레오티드의 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 결합시켜, 잠재적인 PCIP 서열의 축중 세트가 개개의 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로, PCIP 서열의 세트를 그 안에 함유하는 보다 큰 융합 단백질의 서브세트(예를 들어, 파지 디스플레이용)로서 발현 가능하게 함으로써 생성될 수 있다. 축중 올리고누클레오티드 서열로부터 잠재적인 PCIP 돌연변이체의 라이브러리를 생성시키는데 사용될 수 있는 방법은 다양하다. 축중 유전자 서열의 화학적인 합성은 자동화된 DNA 씬세사이저에서 수행될 수 있으며, 그후, 합성 유전자는 적절한 발현 벡터내로 결합된다. 유전자의 축중 세트의 사용은 잠재적인 PCIP 서열의 요망 세트를 코딩시키는 서열의 전부가 하나의 혼합물에 제공되게 한다. 축중 올리고누클레오티드를 합성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조예: Narang, S.A. (1983)Tetrahedron39:3; Itakuraet al. (1984)Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraet al. (1984)Science198:1056; Ikeet al. (1983)Nucleic Acid Res. 11:477].
또한, PCIP 단백질 코딩 서열의 단편의 라이브러리는 PCIP 단백질의 돌연변이체의 스크리닝 및 후속적인 선택을 위한 PCIP 단편의 돌연변이화된 집단을 발생시키는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 코딩 서열 단편의 라이브러리는 절단이 분자당 약 1회만 일어나는 조건하에서 누클레아제로 PCIP 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 처리하고, 상기 이중 가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 탈변성시켜 상이한 절단된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 생성시키고, S1 누클레아제에 의한 처리에 의해 재형성된 이중 구조물로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 결합시킴으로써 발생될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 다양한 크기의 PCIP 단백질의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩시키는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고 선택된 특성을 갖는 유전자 생성물용 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 수가지 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 PCIP 단백질의 조합 돌연변이유발에 의해 발생된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합할 수 있다. 고처리량으로 분석될 수 있으며 커다란 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 가장 널리 사용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터내로 클로닝시키는 것과, 적절한 세포를 생성된 벡터 라이브러리에 의해 형질전환시키는 것과, 요망 활성 검출이 유전자의 생성물이 검출되는 유전자를 코딩시키는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능성 돌연변이체의 빈도를 증대시키는 새로운 기술인 리크루시브 앙상블 돌연변이유발(Recrusive ensemble mutagenesis: REM)을 스크리닝 검정과 협력하여 사용하여 PCIP 돌연변이체를 동정할 수 있다[참고문헌: Arkin and Yourvan (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:7811-7815; Delgraveet al. (1993)Protein Engineering6(3):327-331].
하나의 구체예에서, 세포 기본 검정을 이용하여 돌연변이화된 PCIP 라이브러리를 분석할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 라이브러리가 보통 칼륨 채널 매개된 활성을 지니고 있는 세포주내로 트랜스펙션될 수 있다. 그 다음으로, 칼륨 채널 매개된 활성에 대한 PCIP 돌연변이체의 효과가 예를 들어 임의의 다수의 효소 검정에 의해 또는 신경전달물질의 방출을 검출함으로써 파악될 수 있다. 그 다음으로, 플라스미드 DNA가 칼륨 채널 매개된 활성의 억제 또는 증강에 대해 스코어링되는 세포, 및 추가로 특성화된 개개의 클론으로부터 회수될 수 있다.
단리된 PCIP 단백질, 또는 이들의 부분 또는 단편은 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조물을 제조하기 위한 표준 기술을 사용하여 PCIP에 결합되는 항체를 발생시키는데 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장 PCIP 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로는, 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 PCIP의 항원성 펩티드 단편을 제공한다. PCIP의 항원성 펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, 또는 SEQ ID NO: 109에 나타내어진 아미노산 서열중 8개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 펩티드에 대하여 생성된 항체가 PCIP와의 특이적 면역 복합체를 형성하도록, PCIP의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 항원성 펩티드는 10개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 15개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
항원성 펩티드에 의해 포함된 바람직한 에피토프는 단백질의 표면상에 위치하는 PCIP의 영역, 예를 들어, 친수성 영역, 및 항원성이 높은 영역이다.
PCIP 면역원은 전형적으로 적합한 피검체(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 그 밖의 포유동물)를 면역원으로 면역화시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적절한 면역원성 제조물은, 예를 들어, 재조합적으로 발현된 PCIP 단백질 또는 화학적으로 합성된 PCIP 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 이러한 제조물은 프로인트 완전 또는 불완전 면역 보강제와 같은 보강제, 또는 유사한 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 PCIP 제조물에 의한 적합한 피검체의 면역화는 폴리클로날 항-PCIP 항체 반응을 야기한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 항-PCIP 항체에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 PCIP와 같은 항원에 특이적으로 결합되는(항원과 특이적으로 면역반응을 일으키는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 언급한다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 펩신과 같은 효소로 항체를 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2단편을 포함한다. 본 발명은 PCIP에 결합되는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 PCIP의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 한종만을 함유하는 항체 분자의 집단을 언급한다. 전형적으로 모노클로날 항체 조성물은 이와 같이 면역반응을 일으키는 특정의 PCIP 단백질에 대해 단일 결합 친화도를 나타낸다.
폴리클로날 항-PCIP 항체는 PCIP 면역원으로 적합한 피검체를 면역화시킴으로써 상기된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 피검체의 항-PCIP 항체 역가는 면역화된 PCIP를 사용하여 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 시간의 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 요망된다면, PCIP에 대하여 유도된 항체 분자는 포유동물로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 분리될 수 있으며, IgG 분획을 수득하기 위해 단백질 A 크로마토그래피와 같은 널리 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 면역후 적절한 시점에서, 예를 들어, 항-PCIP 항체 역가가 최고일 때, 항체 생성 세포가 피검체로부터 수득될 수 있으며, 문헌[Kohler andMilstein(1975)Nature256:495-497]에 최초로 기술된 하이브리도마 기술과 같은 표준 기술[추가 참조예: Brownet al. (1981)J. Immunol.127:539-46; Brownet al. (1980)J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yehet al. (1976)Proc. Natl. Acad. Sci. USA76:2927-31; and Yehet al. (1982)Int. J. Cancer29:269-75], 보다 최근의 인간 B 세포 하이브리도마 기술[참고문헌: Kozboret al. (1983)Immunol Today4:72], EBV-하이브리도마 기술[참고문헌: Coleet al. (1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 76-96] 또는 트리오마 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체 하이브리도마를 생성시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있다[일반적인 참조예: R.H. Kenneth, inMonoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp.. New York. New York (1980); E. A. Lerner (1981)Yale J. Biol. Med.. 54:387-402; M. L. Gefteret al. (1977)Somatic Cell Genet. 3:231-36]. 간단히 말하면, 무한증식 세포주(전형적으로는 골수종 세포주)는 상기된 바와 같은 PCIP 면역원으로 면역화된 포유동물로부터 림프구(전형적으로는 비장세포)에 융합되며, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액은 PCIP에 결합되는 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마를 동정하도록 스크리닝된다.
림프구와 무한증식 세포주를 융합시키는데 사용되는 모든 많은 공지된 프로토콜이 항-PCIP 모노클로날 항체를 발생시킬 목적으로 적용될 수 있다[참조예: G. Galfreet al. (1977)Nature266:55052; Gefteret al. Somatic Cell Genet., 상기 인용됨; Lerner,Yale J. Biol. Med., 상기 인용됨; Kenneth,MonoclonalAntibodies,상기 인용됨]. 더욱이, 당해 기술분야의 숙련된 기술자라면 이러한 방법의 많은 변형 방법도 유용하게 사용될 수 있을 것이라는 것을 인지하고 있을 것이다. 전형적으로, 무한증식 세포주(예, 골수종 세포주)는 림프구와 같은 동일한 포유동물 종으로부터 유도된다. 예를 들어, 뮤린 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제조물로 면역된 마우스로부터의 림프구를 무한증식 마우스 세포주와 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 바람직한 무한증식 세포주는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 모든 다수의 골수종 세포주는 표준 기술에 따른 융합 파트너, 예를 들어, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주로서 사용될 수 있다. 이들 골수종 세포주는 ATCC로부터 입수할 수 있다. 전형적으로, HAT 민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비장 세포에 융합된다. 그런 다음, 융합으로부터 생성된 하이브리도마 세포는, 비융합 골수종 세포와 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는 HAT 배지를 사용하여 선택된다(비융합 비장 세포는 형질전환되지 않기 때문에 수일 후에 사멸한다). 본 발명의 모노클로날 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포는, 예를 들어 표준 ELISA 검정을 사용하여, PCIP에 결합되어 있는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
모노클로날 항체 분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안으로, 모노클로날 항-PCIP 항체는, PCIP와의 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여, PCIP에 결합되어 있는 면역글로불린 라이브러리 멤버를 단리시킴으로써 동정되고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 발생시키고 스크리닝하기 위한 키트는 입수가능하다[the PharmaciaRecombinant Phage Antibody System. Catalog No. 27-9400-01; 및 the StratageneSurfZAP(상표명)Phage Display Kit. Catalog No. 240612]. 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 발생시키고 스크리닝하는데 사용하기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어 라드너(Ladner) 등의 U.S. 특허 제 5,223,409호; 캉(Kang) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 92/18619호; 다우어(Dower) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 91/17271호; 윈터(Winter) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 92/20791호; 마클랜드(Markland) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 92/15679호; 브레이틀링(Breitling) 등의 PCT 국제 공보 WO 93/01288호; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 92/01047호; 가라드(Garrard) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 92/09690호; 래드너 등의 PCT 국제 공보 제 WO 90/02809호; 및 문헌[Fuchset al. (1991)Bio/Technology9:1370-1372; Hayet al.(1992)Hum. Antibod. Hybridomas3:81-85; Huseet al.(1989)Science246:1275-1281; Griffithset al. (1993)EMBO J12:725-734; Hawkinset al. (1992)J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarksonet al.(1991)Nature352:624-628; Gramet al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:3576-3580; Garradet al. (1991)Bio/Technology9:1373-1377; Hoogenboomet al.(1991)Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbaset al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:7978-7982; and McCaffertyet al. Nature(1990) 348:552-554]에서 찾을 수 있다.
또한, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있는, 인간 및 비인간 부분 둘 모두를 포함하는, 키메라 및 인화(humanized) 모노클로날 항체와 같은 재조합 항-PCIP 항체는 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 키메라 및 인화 모노클로날 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있는 재조합 DNA 기술, 예를 들어 로빈손(Robinson) 등의 국제 출원 제 PCT/US86/02269호; 아키라(Akira) 등의 유럽특허출원 제 184,187호; 타니구치, 엠.(Taniguch, M.)의 유럽특허출원 제 171,496호; 모리손(Morrison) 등의 유럽특허출원 제 173,494호; 뉴베르거(Neuberger) 등의 PCT 국제 공보 제 WO 86/01533호; 카빌리(Cabilly) 등의 U.S. 특허 제 4,816,567호; 카빌리 등의 유럽특허출원 제 125,023호; 및 문헌[Betteret al.(1988)Science240:1041-1043; Liuet al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:3439-3443; Liuet al. (1987)J. Immunol.139:3521-3526; Sunet al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:214-218; Nishimuraet al. (1987)Canc. Res. 47:999-1005; Woodet al. (1985)Nature314:446-449; and Shawet al. (1988)J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison. S. L. (1985)Science229:1202-1207; Oiet al.(1986)BioTechniques4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Joneset al. (1986)Nature321:552-525; Verhoeyanet al.(1988)Science239:1534; and Beidleret al. (1988)J. Immunol. 141:4053-4060]에 기술된 방법을 사용함으로써 생성될 수 있다.
항-PCIP 항체(예, 모노클로날 항체)는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 PCIP를 단리시키는데 사용될 수 있다. 항-PCIP 항체는세포로부터 천연 PCIP 및 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 PCIP의 정제를 용이하게 할 수 있다. 더욱이, 항-PCIP 항체는 PCIP 단백질의 발현의 패턴과 풍부성을 평가하기 위해 PCIP 단백질(예 세포 용해물 또는 세포 상청액중의)을 검출하는데 사용될 수 있다. 항-PCIP 항체는 임상 시험 과정의 일부로서 조직내 단백질 수준을 모니터링하여 주어진 치료법의 유효성을 결정하는데 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 성분에 커플링(즉, 물리적 결합)시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출 가능한 성분의 예로는 다양한 효소, 보조 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예로는 양고추냉이 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제, 알칼리성 갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제가 포함되고; 적합한 보조 그룹 복합체의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며; 적합한 형광성 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되며; 생물발광 물질의 예로는 루시페라아제, 루시페린 및 아쿠오린(aequorin)이 포함되고; 적합한 방사성 물질의 예로는125I,131I,35S 또는3H가 포함된다.
III. 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 다른 양태는 벡터, 바람직하게는 PCIP 단백질(또는 그의 일부)을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터에 관관 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 다른 핵산에 연결되어 있으며 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 타입의 벡터는 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 환상의 이중 가닥 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 다른 타입의 벡터는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적인 복제능이 있다(예를 들어, 세균의 복제 원점을 가진 세균성 벡터 및 에피솜성 포유류 벡터). 다른 벡터들(예를 들어, 비에피솜성 포유류 벡터)은 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터들은 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터들은 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 "플라스미드"와 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 균등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태인 본 발명의 핵산을 포함하는데, 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포를 기준으로 선택되고, 발현하고자 하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터내에서, "작동적으로 연결된"이라 함은 관심있는 누클레오티드 서열이 누클레오티드 서열의 발현을허용하는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있음을 의미한다(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입될 때의 숙주 세포에서). 용어 "조절 서열"은 프로모터, 증폭제(enhancer), 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 괴델(Goeddel)의 문헌[참조: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acadmic Press, San Diego, CA(1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 타입의 숙주 세포에서 누클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들 및 특정 숙주 세포에서만 누클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 좌우될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입됨으로써, 본원에 기재된 핵산에 의해 엔코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다(예를 들어, PCIP 단백질, PCIP 단백질의 돌연변이 형태, 융합 단백질 등).
본 발명의 재조합 발현 단백질은 원핵 또는 진핵 세포에서 PCIP 단백질의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, PCIP 단백질은 대장균과 같은 세균 세포, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 괴델(Goeddel)의 문헌[참조: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acadmic Press, San Diego, CA(1990)]에 서 또한 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
원핵생물에서의 단백질 발현은 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도적 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 대장균에서 가장 빈번히 수행된다. 융합 벡터는 많은 아미노산을 엔코딩된 단백질, 통상적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단에 첨가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 3가지 목적으로 작용한다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 용해성 증가; 및 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제 보조. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백분해성 절단 부위는 융합 단백질의 정제 후에 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있도록 융합 부분과 재조합 단백질의 접합부에 도입된다. 이러한 효소, 및 이들의 동족 인지 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터는 글루타치온 S-트랜스페라제 (GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 각각 융합시키는 pGEX(파마시아 바이오텍 인코포레이티드; Smith D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 비벌리, MA) 및 pRIT5(파마시아, 피스켓어웨이, NJ)를 포함한다.
정제된 융합 단백질은 PCIP 활성 검정에 사용되거나(예를 들어, 하기에서 상세하게 기재되는 직접 검정 또는 경쟁적 검정), 예를 들어 PCIP 단백질에 특이적인 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 레트로바이러스 발현 벡터에서 발현되는 PCIP 융합 단백질은 조사된 수용주내로 후속하여 이식되는 골수 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 충분한 시간이 경과한후에(예를 들어, 6주), 피험자인 수용주의 병리학적 검사를 실시한다.
적당한 유도성 비융합 대장균 벡터의 예로는 pTrc(Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) 및 pET 11d(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)이 포함된다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 프로모터로부터 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공동발현된 바이러스 RNA 중합효소 (T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사적 조절하에서 T7 gn1 유전자를 잠복하는 상주 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 제공된다.
대장균에서 재조합 단백질 발현을 최대화하는 한가지 방법은 재조합 단백질을 단백분해적으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 세균에서 단백질을 발현시키는 것이다[참조: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California(1990) 119-128]. 다른 방법은 발현 벡터내로 삽입시키고자 하는 핵산의 핵산 서열을 변화시켜 각 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 대장균에서 선택적으로 이용되는 것들이 되도록 하는 것이다[참조, Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118]. 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변화는 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, PCIP 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 S. 세르비새(S. cervisae)에서 발현용 벡터의 예로는 pYepSec1[Baldari et al.,(1987) Embo J. 6:229-234], pMFa(Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943], pJRY88[Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123], pYES2[Invitrogen Corporation, San Diego, CA], 및 picZ(InVitrogen Corp. San Diego, CA]가 포함된다.
대안적으로, PCIP 단백질은 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf 9 세포)에서 단백질의 발현에 사용가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAC 계열[Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2156] 및 pVL 계열[Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39]를 포함한다.
또다른 구체예에서는, 본 발명의 핵산이 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8[Seed, B. (1987) Nature 329:840] 및 pMT2PC[Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6:187-195]이 포함된다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스 및 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40)으로부터 얻는다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템에 대하여는 하기 문헌을 참조한다[Sambrook, J. Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989의 Chapter 16 및 17].
다른 구체예에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 핵산의 발현을 특정한 세포 타입에서 선택적으로 지시가능하다(예를 들어, 조직 특이적 조절 요소가 핵산을 발현하는데 사용된다). 조직 특이적 조절 요소는 당해 분야에 공지되어 있다. 적당한 조직 특이적 프로모터의 비한정적인 예로는 알부민 프로모터(간 특이적; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), 림프 특이적 프로모터(Calame and Eaton(1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) 및 면역글로불린(Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), 뉴런 특이적 프로모터(예를 들어, 신경섬유 프로모터; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), 췌장 특이적 프로모터(Edlund et al., (1985) Science 230:912-916) 및 유즙 분비선 특이적 프로모터(예를 들어 유장 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제 264,166호)가 포함된다. 또한, 발생적으로 조절되는 프로모터, 예를 들어 쥐과동물 혹스(hox) 프로모터(Kessel and Gruss(1990) Science 249:374-379) 및 α-태아단백질 프로모터(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)도 포함된다.
본 발명은 또한 안티센스 방향으로 발현 백터내로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, DNA 분자는 PCIP mRNA에 안티센스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의한)을 허용하는 방식으로 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동적으로 연결된 조절 서열은 다양한 세포 타입에서 안티센스 RNA 분자의 연속적인 발현을 지시하는것들, 예를 들면 바이러스 프로모터 및/또는 증폭제로 선택될 수 있거나, 또는 조절 서열은 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포 타입 특이적인 발현을 지시하는 것들로 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약화된 바이러스의 형태일 수 있으며, 상기 형태에서는 안티센스 핵산이 고효율의 조절 영역의 제어하에서 생산되며, 이것의 활성은 벡터가 도입되는 세포 타입에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현의 조절에 관한 논의에 대해서는 하기 문헌을 참조한다[참조: Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정한 시험 세포 뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것은 물론이다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인하여 특정한 변형이 다음 세대들에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와는 동일하지 않을 수 있으나, 본원에서 사용된 용어의 범주내에 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, PCIP 단백질은 대장균과 같은 세균 세포, 효모 또는 포유류 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포)에서 발현될 수 있다. 다른 적당한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection) 기술에 의해 원핵 또는 진핵 세포에 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "형질전환" 및 "트랜스펙션"은 외부 핵산(예를 들어 DNA)를 숙주 세포에 도입하는 다양한 공지된 기술을 지칭하는 것을 의미하며, 이에는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 리포펙션(lipofection), 또는 일렉트로포레이션 (electroporation)이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션하는 적당한 방법은 하기 문헌 및 기타 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989].
포유류 세포의 안정한 트랜스펙션에 대해서는, 사용된 발현 벡터 및 트랜스펙션 기술에 따라, 단지 소분획의 세포만이 그 게놈내로 외부 DNA를 통합할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 구성성분을 확인 및 선택하기 위해서, 선별 마커(예를 들어, 항생제에 내성)을 엔코딩하는 유전자를 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포내로 도입하는 것이 일반적이다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신(hygromycin) 및 메토트렉세이트와 같은 약제에 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선별 마커를 엔코딩하는 핵산은 PCIP 단백질을 엔코딩하는 것과 동일한 벡터상에서 숙주 세포내로 도입될 수 있거나, 또는 별개의 백터상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 트랜스펙션된 세포는 약제 선택에 의해 확인할 수 있다(예를 들어, 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하지만, 다른 세포는 사멸한다).
본 발명의 숙주 세포, 예를 들어 배양액중의 원핵 또는 진핵성 숙주 세포는 PCIP 단백질을 생산(즉, 발현)하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 PCIP 단백질을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포(PCIP 단백질을 엔코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있음)를 적당한 배지에서 배양하여 PCIP 단백질을 생산하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 PCIP 단백질을 배지 또는 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 숙주 세포는 비인간 유전자이식 동물을 생산하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 PCIP 코딩 서열이 도입된 수정된 난모세포 또는 배아 간세포이다. 이러한 숙주 세포는 외인성 PCIP 서열이 게놈내로 도입된 비인간 유전자이식 동물을 만들거나 내인성 PCIP 서열이 변형된 상동 재조합 동물을 만드는데 사용될 수 있다. 이러한 동물들은 PCIP의 기능 및/또는 활성을 연구하고 PCIP 활성의 조절제를 확인 및/또는 평가하는데 유용하다. 본원에서 사용된 "유전자이식 동물"은 비인간인 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 래트 또는 마우스와 같은 설치류이며, 상기 동물 세포의 하나 이상이 이식유전자를 포함한다. 유전자이식 동물의 다른 예는 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등을 포함한다. 이식유전자는 세포의 게놈에 통합된 외인성 DNA로서, 이로부터 유전자이식 동물이 발육하고 성숙된 동물의 게놈중에 잔류함으로써, 상기 유전자 이식 동물의 하나 이상의 세포 타입 또는 조직에서 엔코딩된 유전자 산물의 발현을 지시한다. 본원에서 사용된 "상동 재조합 동물"은 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 마우스이며, 동물의 발육 전에, 내인성 PCIP 유전자가 내인성 유전자와 상기 동물의 세포, 예를 들어 동물의 배아 세포에 도입된 외인성 DNA 분자간의 상동 재조합에 의해 변형된다.
본 발명의 유전자이식 동물은 PCIP 엔코딩 핵산을 수정된 난모세포의 수컷 전핵내로, 예를 들어 마이크로주입, 레트로바이러스 감염에 의해 도입하고, 난모세포를 가임신된 양모(female foster) 동물에서 발육시킴으로써 만들 수 있다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, 또는 SEQ ID NO: 102의 PCIP cDNA 서열은 이식유전자로서 비인간 동물의 게놈내로 도입될 수 있다. 또한, 인간 PCIP 유전자의 비인간 동족체, 예컨대, 마우스 또는 래트 PCIP 유전자가 이식유전자로서 사용될 수 있다. 또한, 또 다른 PCIP 패밀리 구성원과 같은 PCIP 유전자 동족체는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102의 PCIP cDNA 서열 또는 수탁 번호 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993 또는 98994로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열 (상기 서브섹션 I에 추가로 기재되어 있음)과의 하이브리드화에 기초하여 단리되어 이식유전자로서 사용될 수 있다. 또한, 인트론 서열 및 폴리아데닐화 시그널가 이식유전자내에 포함되어 이식유전자의 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 조직-특이적 조절 서열(들)이 PCIP 이식유전자에 작동가능하게 연결됨으로써 특정 세포에 대해 PCIP 단백질이 발현되도록 할 수 있다. 배 조작 및 미세주입을 통해 유전자이식 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당분야에 있어서 통상적인 것이 되었고, 예컨대, 레더(Leder) 등의 미국 특허 제 4,736,866호 및 제 4,870,009호, 와그너(Wagner) 등의 미국 특허 제 4,873,191호 및 호간, 비(Hogan, B.)의 문헌[참조: Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]에 기재되어 있다. 유사한 방법을 다른 유전자이식 동물을 생성시키기 위해 사용하였다. 유전자이식된 파운더 (founder) 동물은 게놈내 PCIP 이식유전자의 존재 및/또는 상기 동물의 조직 또는 세포내에서의 PCIP mRNA의 발현에 기초하여 확인될 수 있다. 그런 다음 유전자이식된 파운더 동물은 상기 이식유전자를 보유한 추가적인 동물을 낳도록 하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PCIP 단백질을 엔코딩하는 이식유전자를 보유한 유전자이식 동물은 다른 이식유전자를 보유한 다른 유전자이식 동물로 추가로 사육될 수 있다.
상동 재조합 동물을 생성시키기 위해, 벡터는 결실, 첨가 또는 치환이 도입됨으로써 PCIP 유전자를 변화, 예컨대, 기능적으로 파괴시키도록 벡터내에 PCIP 유전자의 적어도 일부분을 함유하도록 제조된다. PCIP 유전자는 인간 유전자(예컨대, SEQ ID NO:1의 cDNA)일 수 있지만, 더욱 바람직하게는, 인간 PCIP 유전자(예컨대, SEQ ID NO:3 또는 5)의 비인간 동족체이다. 예를 들어, 마우스 PCIP 유전자를 사용하여 마우스 게놈내에 내인성 PCIP 유전자를 변화시키기에 적합한 상동 재조합 벡터를 작제할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 벡터는 상동 재조합시에 내인성 PCIP 유전자가 기능적으로 파괴되도록 디자인된다(즉, 더 이상 기능적인 단백질을 엔코딩하지 않으며; "녹 아웃" 벡터라 칭한다). 또한, 상기 벡터는 상동 재조합시에 내인성 PCIP 유전자가 돌연변이되거나 그렇지 않으면 변화되지만 여전히 기능적인 단백질을 엔코딩하도록 디자인될 수 있다(예컨대, 업스트림 조절 영역이 변화됨으로써 내인성 PCIP 단백질의 발현을 변화시킬 수 있다). 상동 재조합 벡터에서, PCIP 유전자의 변화된 부분은 PCIP 유전자의 추가적인 핵산 서열에 의해 이의 5' 및 3'에 플랭킹되어 상동 재조합이 벡터에 의해 운반된 외인성 PCIP 유전자와배 줄기 세포내의 내인성 PCIP 유전자 사이에서 일어나도록 한다. 추가적인 플랭킹 PCIP 핵산 서열은 내인성 유전자와의 성공적인 상동 재조합을 위해 충분한 길이이다. 전형적으로, 수 kb의 플랭킹 DNA(5' 및 3' 말단 모두에서)는 상기 벡터내에 포함되어 있다[상동 재조합 벡터에 대한 설명에 대해 다음 문헌을 참조하라: Thomas, K.R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503]. 상기 벡터는 배 줄기 세포주내로 도입되고(예컨대, 일렉트로포레이션에 의해) 도입된 PCIP 유전자가 내인성 PCIP 유전자와 상동 재조합되는 세포가 선별된다[참조: Li, E. et al. (1992) Cell 69:915]. 그런 다음 선별된 세포는 동물(예컨대, 마우스)의 포배낭내로 도입되어 응집 키메라를 형성한다[참조: Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). 그런 다음 키메라 배는 적합한 가임신 암컷 수양 동물내에 착상되어 상기 배는 일정기한까지 유지된다. 배아 세포내에 상동 재조합된 DNA를 보유하고 있는 자손은 동물의 모든 세포가 이식유전자의 배아 세포주 전달에 의해 상동 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 사육하기 위해 사용될 수 있다. 상동 재조합 동물 및 상동 재조합 벡터를 작제하는 방법은 문헌[참조: Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 and PCT International Publication Nos.: WO 90/11354 by Le Mouellec et al.; WO 91/01140 by Smithies et al.; WO 92/0968 by Zijlstra et al.; and WO 93/04169 by Berns et al.]에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, 유전자이식된 인간 이외의 동물은 이식유전자의 조절된발현을 가능하게 하는 선택된 시스템을 함유하도록 생성될 수 있다. 이러한 시스템의 한가지 예는 박테리오파지 P1의cre/loxP재조합효소 시스템이다.cre/loxP재조합효소 시스템의 설명에 대해선 문헌[참조: Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236]을 참조하라. 재조합효소 시스템의 또 다른 예는 사카로마이세스 세레비시애의 FLP 재조합효소 시스템이다[참조: O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355].cre/loxP재조합효소 시스템이 이식유전자의 발현을 조절하기 위해 사용되는 경우,Cre재조합효소과 선택된 단백질 둘 모두를 엔코딩하는 이식유전자를 함유하는 동물이 필요하다. 이러한 동물은 예컨대, 2가지 유전자이식 동물, 즉 선택된 단백질을 엔코딩하는 이식유전자를 함유하는 동물과 재조합효소를 엔코딩하는 이식유전자를 함유하는 동물의 교배에 의한 "이중" 유전자이식 동물의 작제를 통해 제공될 수 있다.
본원에 기술된 인간 이외의 유전자이식 동물의 클론은 또한 문헌[참조: Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 and PCT International Publication Nos. WO 97/07668 and WO 97/07669]에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있다. 요약하면, 유전자이식 동물로부터의 세포, 예컨대, 체세포를 단리하고 성장 주기를 벗어나도록 유도시키고 G0기(phase)에 진입하도록 할 수 있다. 그런 다음 상기 침묵 세포를 예컨대, 전기적 펄스를 사용하여, 침묵 세포가 단리된 동일종의 동물로부터의 핵이 제거된 난모세포와 융합시킬 수 있다. 그런 다음 재작제된 난모세포는 상실배 또는 포배낭으로 발달하도록 배양된 다음 가임신 대리모로 옮겨진다. 이러한대리모의 자손은 세포, 예컨대, 체세포가 된리된 동물의 클론일 것이다.
IV. 약제학적 조성물
본 발명의 PCIP 핵산 분자, PCIP 단백질의 단편 및 항-PCIP 항체(또한 본원에서 "활성 화합물"로 칭함)는 투여에 적합한 약제학적 조성물내로 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 핵산 분자, 단백질 또는 항체 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함한다. 본원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 캐리어"는 약제학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물로 부적합한 경우를 제외하고는, 조성물내에 이의 용도를 고찰하였다. 보충 활성 화합물을 또한 조성물내에 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 포뮬레이션된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예컨대, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예컨대, 흡입), 경피(국소적), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분들을 포함할 수 있다: 주사용 물과 같은 멸균 희석제, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트와 같은 산화방지제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화 나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 긴장의 조절을 위한 작용제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구 제제를 앰플, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 담을 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 캐리어에는 생리학적 식염수, 세균발육저지성 물, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에 있어서, 상기 조성물은 멸균되어야 하고 용이하게 주사할 수 있을 만큼 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 캐리어는 용매 또는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예컨대, 파리벤, 클로로부타놀, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 조성물내에 등장성 작용제, 예컨대, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써달성될 수 있다.
멸균 주사 용액은 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물(예컨대, PCIP 단백질 또는 항-PCIP 항체의 단편)을 단독으로 혼입시키거나 상기 나열된 성분들의 조합물과 함께 혼입시키고, 필요한 경우, 여과 멸균을 후속시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 성분으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클내로 상기 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 함께 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결-건조이다.
경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 캐리어를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐로 둘러싸이거나 정제내로 압착될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어 정제, 구내정 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구용 조성물은 또한 구강청결제로서 사용하기 위해 유체 캐리어를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서 유체 캐리어내의 화합물은 경구적으로 적용되어 스위시되고 뱉어지거나 삼켜진다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 애쥬번트 물질은 조성물의 일부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 구내정 등은 임의의 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미정질 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 분해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 교질성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 박하, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 착향제.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예컨대, 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압된 용기 또는 분산장치, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피적 수단에 의해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피적 투여를 위해, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 포뮬레이션중에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있으며, 이에는 예컨대, 경점막 투여를 위해, 계면활성제, 담즙염 및 푸시드산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비성 스프레이 또는 좌약을 사용하여 수행될 수 있다. 경피적 투여를 위해, 활성 화합물은 당분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림내에 포뮬레이션된다.
또한 상기 화합물은 직장을 통한 전달을 위해 좌약(예컨대, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 베이스와 함께) 또는 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.
하나의 구체예에서, 활성 화합물은 이식물 및 미세캡슐화된 운반 시스템을 포함하여, 제어된 방출 포뮬레이션과 같은, 체내로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호하게 될 캐리어와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수화물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체들이 사용될 수 있다. 이러한 포뮬레이션을 제조하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 또한 상기 물질들은 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티컬스, 인크(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 사용적으로 입수될 수 있다. 또한 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 가진 감염된 세포에 대해 표적화된 리포솜을 포함하는)이 약제학적으로 허용되는 캐리어로서 사용될 수 있다. 이들은 예컨대, 미국 특허 제 4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
용이한 투여 및 일정한 투여량을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 단위 투여량 형태로 포뮬레이션하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이 단위 투여량 형태는 치료될 피검자에 대한 1회 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며; 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 각각의 단위는 필요한 약제학적 캐리어와 함께 요망되는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된다. 본 발명의 단위 투여량 형태에 대한 상세사항은 개체의 치료를 위한 활성 화합물의 독특한 특징, 달성하고자 하는 특정한 치료 효과 및 상기 활성 화합물을 제조하는 기술 분야에서의 고유한 제한사항에 의해 규정되고 직접적으로 의존한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험용 동물에서 표준 약제학적 절차,예컨대, LD50(군집의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED50(군집의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이며 이것은 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 간염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 상기 화합물이 영향받는 조직 부위를 표적화하는 운반 시스템을 디자인하도록 주의해야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량의 범위를 포뮬레이션하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량의 범위는 바람직하게는 독성을 거의 갖지 않거나 독성이 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 동물 모델내에서 증상의 최대 절반을 억제하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 달성하도록 포뮬레이션될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에게 사용가능한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 농도는 예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정도리 수 있다.
본원에 정의한 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드의 치료학적 유효량(즉, 유효 용량)은 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 30 mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 25 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 20 mg, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 10 mg, 2 내지 9 mg, 3 내지 8 mg, 4 내지 7 mg, 또는 5 내지 6 mg이다. 당업자는 질병 또는 질환의 중증도, 이전의 치료, 피검자의 전반적인 건강상태 및/또는 연령, 및 기타 질병 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정한 인자들이 피검자를 효과적으로 치료하기 위해 필요한 투여량에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 치료학적 유효량의 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 사용한 피검자의 치료는 단일 치료, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
바람직한 예에서, 피검자는 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 체중 1 kg당 약 0.1 내지 20 mg의 항체, 단백질 또는 폴리펩티드로 치료된다. 치료를 위해 사용된 유효량의 항체, 단백질 또는 폴리펩티드는 특정한 치료 과정에 걸쳐 증가되거나 감소될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 투여량의 변화는 본원에 기술된 바와 같이 진단 검정의 결과로부터 분명해지고 결정될 수 있다.
본 발명은 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 포함한다. 작용제는 예를 들어, 작은 분자일 수 있다. 예를 들어, 이러한 작은 분자에는 펩티드, 펩티도모사체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리누클레오티드, 폴리누클레오티드 유사체, 누클레오티드, 누클레오티드 유사체, 1몰 당 약 10,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물(즉, 헤테로유기 화합물 및 유기금속 화합물을 포함하여), 1몰 당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 1몰 당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 1몰 당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 기타 약제학적으로 허용되는 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
작은 분자 작용제의 적절한 양은 의사, 수의사 또는 연구자의 지식내의 수많은 인자들에 의존하는 것으로 이해된다. 작은 분자의 용량은 예컨대, 피검자 또는 치료된 샘플의 정체, 크기 및 상태, 추가로 투여될 조성물의 투여 경로, 가능한 경우, 실시자가 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 상기 작은 분자에게 바라는 효과에 따라 다양할 것이다.
전형적인 용량은 피검자 또는 샘플 중량 1 kg 당 작은 분자 1 밀리그램 또는 1 마이크로그램을 포함한다(예컨대, 1 kg 당 약 1 마이크로그램 내지 1 kg 당 약 500 밀리그램, 1 kg 당 약 100 마이크로그램 내지 1 kg 당 약 5 밀리그램, 또는 1 kg 당 1 마이크로그램 내지 1 kg 당 약 50 마이크로그램). 작은 분자의 적절한 양은 조절될 발현 또는 활성에 대한 작은 분자의 효능에 의존하는 것으로 추가로 이해된다. 이러한 적절한 용량은 본원에 기술된 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 1종 이상의 이들 작은 분자가 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 동물(예컨대, 인간 투여되는 경우, 예를 들어, 의사, 수의사 또는 연구자는 우선 비교적 낮은 용량을 처방하고, 적절한 반응이 생성될 때까지 용량을 후속적으로 증가시킬 수 있다. 또한, 어떤 특정 동물 피검자에 대한 특정 용량 농도는 사용된 특정한 화합물, 피검자의 연령, 체중, 전반적인 건강상태, 성별 및 식이 요법, 투여 시간, 투여 경로, 분비 속도 임의의 약물 배합 및 조절될 발현 또는 활성의 정도를 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것으로 이해된다.
또한, 항체(또는 이의 단편)는 세포독소, 치료제 또는 방사성 금속 이온과 같은 치료학적 부분과 컨쥬게이션될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제에는 항대사산물(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예컨대, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파민, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 컨쥬게이트는 소정의 생물학적 반응을 변경시키기 위해 사용될 수 있으며, 약물 부분은 고전적인 화학 치료제에 제한되는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 부분은 요망되는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 조직 플라스미노젠 활성인자와 같은 단백질; 또는 예컨대, 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자와 같은 생물학적 반응 변경인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료학적 부분을 항체에 컨쥬게이션시키는 기술은 널리 공지되어 있다[참조: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]. 또한, 세갈(Segal)의 미국 특허 제 4,676,980호에 기재된 바와 같이 항체는 2차 항체와 컨쥬게이션되어 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 벡터내에 삽입되어 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(참조: 미국 특허 제 5,328,470호) 또는 정위 주입[참조: Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057]에 의해 피검자에게 전달될 수 있다. 유전자 치료 벡터의약제학적 제제는 허용되는 희석제내에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 운반 비히클이 임베딩된 방출속도가 느린 매트릭스를 포함할 수 있다. 또한, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포로부터 온전하게 생성되는 경우, 예컨대, 레트로바이러스 벡터, 이러한 약제학적 제제는 유전자 운반 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩 또는 분배기내에 포함될 수 있다.
V. 본 발명의 용도 및 방법
본원에 기술된 핵산 분자, 단백질, 단백질 동족체 및 항체는 다음중 하나 이상의 방법에서 사용될 수 있다: a) 스크리닝 검정; b) 예측 의학(예컨대, 진단학적 검정, 예후 검정, 모니터링 임상 시도 및 약리유전학); 및 c) 치료 방법(예컨대, 치료학적 및 예방학적). 본원에 기술한 바와 같이, 본 발명의 PCIP 단백질은 다음중 하나 이상의 활성을 갖는다: (1) 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분과 상호작용한다(예컨대, 결합); (2) 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 인산화 상태를 조절한다; (3) 칼슘과 결합하여, 예컨대, 칼슘 의존성 키나제로서 작용할 수 있다. 예컨대, 칼륨 채널 또는 G-단백질 커플링된 수용체를 칼슘-의존적 방식으로 인산화시킨다; (4) 칼슘과 결합하여, 예컨대, 칼슘 의존성 전사 인자로서 작용한다; (5) 예컨대, 세포에 유리한 영향을 미치기 위해 세포(예컨대, 뉴런 또는 심장 세포)에서의 칼륨 채널 매개된 활성을 조절한다; (6) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 염색질 형성을 조절한다; (7) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 소포트래픽 및 단백질 수송을 조절한다; (8) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 사이토카인 시그널링을 조절한다; (9) 세포성 세포골격과 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 결합을 조절한다; (10) 세포성 증식을 조절한다; (11) 신경전달물질의 방출을 조절한다; (12) 막 감수성을 조절한다; (13) 막의 휴지 전위에 영향을 끼친다; (14) 활동 전위의 파형 및 주파수를 조절한다; (15) 여기의 임계치를 조절함으로써, 예컨대, (1)칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 활성을 조절하고; (2) 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 인산화 상태를 조절하고; (3) 칼슘-의존적 방식으로 칼륨 채널 또는 G-단백질 커플링된 수용체의 인산화 상태를 조절하고; (4) 칼슘과 결합하여 칼슘 의존성 전사 인자로서 작용하고; (5) 예컨대, 세포에 유리한 영향을 미치기 위해 세포(예컨대, 뉴런 또는 심장 세포)에서의 칼륨 채널 매개된 활성을 조절하고; (6) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 염색질 형성을 조절하고; (7) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 소포 트래픽 및 단백질 수송을 조절하고; (8) 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 사이토카인 시그널링을 조절하고; (9) 세포성 세포골격과 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 결합을 조절하고; (10) 세포성 증식을 조절하고; (11) 신경전달물질의 방출을 조절하고; (12) 막 민감성을 조절하고; (13) 막의 휴지 전위에 영향을 끼치고; (14) 활동 전위의 파형 및 빈도를 조절하고; (15) 자극의 역치를 조절하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는 하기에 추가로 기술하는 바와 같이, 예컨대, PCIP 단백질을 발현시키고(예컨대, 유전자 치료법에서 숙주 세포내에서 재조합 발현 벡터를 통해), PCIP mRNA(예컨대, 생물학적 샘플에서) 또는 PCIP 유전자내의 유전학적 변경을 탐지하고, PCIP 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. PCIP 단백질은 PCIP 기질의 불충분한 생성 또는 초과 생성 또는 PCIP 억제제의 생성에 의해 특징화되는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, PCIP 단백질은 PCIP 단백질의 불충분한 생성 또는 초과 생성 또는 PCIP 야생형 단백질과 비교하여 감소되거나 이상 활성을 갖는 PCIP 단백질 형태의 생성을 특징으로 하는 장애(예컨대, 퇴행성 신경 장애, 예컨대, 알츠하이머병, 알츠하이머병과 관련된 치매(피크병과 같은), 파킨슨병, 기타 미만성 루이 소체 질병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 핵상 마비, 간질, 척수소뇌성 실조증 및 크로이츠펠트야콥병과 같은 CNS 장애; 정신 질환, 예컨대, 우울증, 정신분열증, 코르사코프정신병, 조증, 불안증, 양극성 정동 장애 또는 공포병; 학습 또는 기억 장애, 예컨대, 기억상실증 또는 연령-관련 기억 상실; 신경계장애, 예컨대, 편두통; 통증, 예컨대, 통각과민 또는 근골격장애; 척수손상; 발작; 및 두부외상; 또는 동결절 기능장애, 심부전, 고혈압, 심장세동, 심방조동, 확장성심근증, 특발성심근증, 심근경색증, 관상동맥질환, 관상동맥연축 또는 부정맥과 같은 심혈관질환)를 치료하는 것 뿐만 아니라 천연 PCIP 기질을 스크리닝하고, PCIP 활성을 조절하는 약물 또는 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-PCIP 항체는 PCIP 단백질을 검출하고 단리하고, PCIP 단백질의 생체이용률을 조절하고, PCIP 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
A.스크리닝 검정:
본 발명은 예컨대, PCIP 발현 또는 PCIP 활성에 대해 자극 또는 억제 효과를 갖거나, 예컨대, PCIP 기질의 발현 또는 활성에 대해 자극 또는 억제 효과를 갖는 조절인자, 즉, PCIP 단백질에 결합하는 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제(예컨대, 펩티드, 펩티도모사체, 작은 분자 또는 기타 약물)을 확인하기 위한 방법(또한 "스크리닝 검정"이라고도 부름)을 제공한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 PCIP 단백질 또는 폴리펩티드의 기질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분인 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 검정법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 PCIP 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분에 결합하거나 이들의 활성을 조절하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 검정법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 당분야에 공지된 조합적인 라이브러리 방법으로 임의의 수많은 접근법을 사용하여 수득될 수 있으며, 이에는 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레서블(addressable)한 평행한 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화도 크로마토그래피 선택법을 사용하는 합성 라이브러리 방법이 포함된다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 제한되지만, 다른 4가지 접근법은 화합물의 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 작은 분자 라이브러리에 적용할 수 있다[참조: Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145].
분자적 라이브러리를 합성하는 방법의 예는 예컨대 다음 문헌에서 찾아볼 수있다: 문헌들[참조: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233].
화합물의 라이브러리는 용액중에 제공되거나[참조: Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421], 비드[참조: Lam (1991) Nature 354:82-84], 칩[참조: Fodor (1993) Nature 364:555-556], 세균[참조: Ladner USP 5,223,409], 포자[참조: Ladner USP '409], 플라스미드[참조: Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869] 또는 파아지[참조: Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra]상에 제공될 수 있다.
하나의 구체예에서, 검정은 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분을 발현시키는 세포를 시험 화합물과 접촉시켜 PCIP 활성, 예컨대 칼륨 채널 또는 이의 일부분에 결합하는 것을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 세포-기재 검정법이다. PCIP 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 뉴런 세포, 예컨대, 흑색질 뉴런 세포, 또는 심장 세포와 같은 PCIP를 발현시키는 세포로부터의 신경전달물질, 예컨대, 도파민의 방출을 모니터링함으로써 수행될 수 있다. 또한, PCIP 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 심장 세포와 같은 PCIP를 발현시키는 세포로부터의 신경전달물질의 Ito전류 또는 방출을 모니터링함으로써 수행될 수 있다. 세포내 전류, 예컨대, Ito전류는 예를 들어, 하밀(Hamill) 등의 문헌[참조: 1981. Pfluegers Arch. 391:85-100]에 기재된 기술을 사용하는 실시예 섹션에 기술한 바와 같이 패치-클램프 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 포유류로부터 기원할 수 있다. 기질에 결합하는 PCIP의 능력을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, PCIP에 PCIP 기질이 결합하는 것이 복합체내에서 표지된 PCIP 기질을 검출함으로써 결정되도록 방사성동위원소 또는 효소 표지물과 PCIP 기질의 커플링에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 화합물(예컨대, PCIP 기질)은 직접적으로 또는 간접적으로125I,35S,14C 또는3H로 표지될 수 있고, 방사능동위원소는 방사능 방출의 직접적인 카운팅 또는 신틸레이션 카운팅에 의해 검출될 수 있다. 또한, 화합물은 예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제를 사용하여 효소적으로 표지될 수 있으며, 이러한 효소적 표지물은 적합한 기질의 생성물로의 전환을 결정함으로써 검출될 수 있다.
또한 본 발명은 임의의 상호작용물을 표지시키지 않고 PCIP와 상호작용하는 화합물(예컨대, PCIP 기질)의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 사용하여 화합물 또는 PCIP를 표지하지 않고 PCIP와 화합물의 상호작용을 검출할 수 있다[참조: McConnell, H. M. et al.(1992) Science 257:1906-1912]. 본원에 사용되는 바와 같이, "마이크로피지오미터"(예컨대, 사이토센서(Cytosensor))는 광-어드레서블 전위차 센서(LAPS)를 사용하여 세포가 자신의 환경을 산성화시키는 속도를 측정하는 분석 장치이다. 이러한 산성화 속도에서의 변화는 화합물과 PCIP 사이의 상호작용의 지표로서 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 검정은 PCIP 표적 분자(예컨대, 칼륨 채널 또는 이의 단편)을 발현시키는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, PCIP 표적 분자의 활성을 조절하는(예컨대, 자극하거나 억제하는) 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함하는 세포-기재 검정법이다. PCIP 표적 분자의 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, PCIP 표적 분자, 예컨대, 칼륨 채널 또는 이의 단편에 결합하거나 이와 상호작용하는 PCIP 단백질의 능력을 결정함으로써 수행될 수 있다.
PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편이 PCIP 표적 분자에 결합하거나 이와 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 직접적인 결합을 위한 상기 기술한 방법중 하나에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, PCIP 표적 분자에 결합하거나 이와 상호작용하는 PCIP 단백질의 능력을 결정하는 것은 상기 표적 분자의 활성을 결정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자의 활성은 표적의 세포성 2차 메신저(즉, 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3등)의 유도를 검출하거나, 적절한 기질에 대해 표적의 촉매/효소 활성을 검출하거나, 리포터 유전자(검출가능한마커, 예컨대, 루시퍼라제를 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 표적-반응성 조절 엘리먼트를 포함하는)의 유도를 검출하거나, 신경전달물질의 방출과 같은 표적-조절된 세포성 반응을 검출함으로써 결정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 검정은 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 시험 화합물과 접촉되고 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 무세포 검정법이다. 본 발명의 검정에 사용되는 PCIP 단백질의 바람직한 생물학적 활성 부분은 비-PCIP 분자, 예컨대, 칼륨 채널 또는 이의 단편, 또는 높은 표면 개연성 스코어를 갖는 단편과의 상호작용에 참여하는 단편을 포함한다. PCIP 단백질에 시험 화합물이 결합하는 것은 상기 기술한 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 검정은 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 PCIP에 결합하는 공지된 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성시키고, 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고, PCIP 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 PCIP 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 공지된 화합물과 비교하여 PCIP 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 검정은 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시키고 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절하는(예컨대, 자극하거나 억제하는) 시험 화합물의 능력을 결정하는 무세포 검정법이다. PCIP 단백질의 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 직접적인 결합을 결정하기 위한 상기 기술한 방법중 하나에 의해 PCIP 표적 분자에 결합하는 PCIP 단백질의 능력을 결정함으로써 수행될 수 있다. PCIP 표적 분자에 결합하는 PCIP 단백질의 능력을 결정하는 것은 실시간 생체분자 상호작용 분석(BIA)와 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다[참조: Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705]. 본원에 사용되는 바와 같이, "BIA"는 임의의 상호작용물을 표지시키기 않고, 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다(예컨대, BIAcore). 표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학 현상에서의 변화는 생물학적 분자간의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, PCIP 단백질의 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 PCIP 표적 분자의 다운스트림 이펙터의 활성을 추가로 조절하는 PCIP 단백질의 활성을 결정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 적합한 표적에 대한 이펙터 분자의 활성은 앞서 기술한 바와 같이 결정될 수 있거나 적합한 표적에 이펙터의 결합은 앞서 기술한 바와 같이 결정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 무세포 검정은 PCIP 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 PCIP 단백질에 결합하는 공지된 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성시키고, 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고, PCIP 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 PCIP 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 PCIP 표적 분자에 우선적으로 결합하거나 이의 활성을 조절하는 PCIP 단백질의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 무세포 검정은 단리된 단백질의 가용성 형태 및/또는 막-결합된 형태 둘 모두를 사용할 수 있다. 단리된 단백질의 막-결합된 형태가 사용되는 무세포 검정의 경우에(예컨대, 칼륨 채널), 단리된 단백질의 막-결합된 형태가 용액중에 유지되도록 가용화제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예에는 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, Triton®X-100, Triton®X-114, Thesit®, 이소트리데시폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암미니오]-1-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암미니오]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO), 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 설포네이트와 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 상기 검정법에 대한 하나 이상의 구체예에서, 단백질중 하나 또는 둘 모두의 복합체화되지 않은 형태로부터 복합체화된 형태의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 도모하기 위해 PCIP 또는 이의 표적 분자를 고정시키는 것이 바람직하다. PCIP 단백질에 시험 화합물의 결합, 또는 후보 화합물의 존재 및 부재하에 표적 분자와 PCIP 단백질의 상호작용은 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 용기의 예로는 마이크로역가 플레이트, 시험관 및 마이크로-원심분리 튜브가 포함된다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 단백질중 하나 또는 둘 모두가 매트릭스에 결합되게 하는 도메인을 첨가함으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/PCIP 융합 단백질또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제/표적 융합 단백질은 글루타티온 세포로오스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 유도체화된 마이크로역가 플레이트상에 흡착될 수 있으며, 그런 다음 시험 화합물 또는 시험 화합물과 비-흡착된 표적 단백질 또는 PCIP 단백질과 배합되고, 이 혼합물은 복합체 형성에 도움이 되는 조건하에서(예컨대, 염과 pH에 대한 생리학적 조건) 인큐베이션된다. 인큐베이션 이후에, 비드 또는 마이크로역가 플레이트 웰을 세척하여 결합되지 않은 성분들을 제거하고, 매트릭스를 비드의 경우에 고정시키고, 복합체를 예를 들어, 상기 기술한 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 결정하였다.
또한 매트릭스상에 고정된 단백질에 대한 다른 기술들이 본 발명의 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, PCIP 단백질 또는 PCIP 표적 분자는 바이오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 사용하여 고정화될 수 있다. 바이오티닐화된 PCIP 단백질 또는 표적 분자는 당분야에 공지된 기술(예컨대, 바이오티닐화 키트(Pierce Chemicals, Rockford, IL))을 사용하여 바이오틴-NHS(N-하이드록시-숙신이미드)로부터 제조되어, 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 플레이트(Pierce Chemical)의 웰에 고정될 수 있다. 또한, PCIP 단백질 또는 표적 분자와 반응성이지만 표적 분자에 대한 PCIP 단백질의 결합을 방해하지 않는 항체는 상기 플레이트의 웰에서 유도체화될 수 있고, 결합되지 않은 표적 또는 PCIP 단백질을 항체 컨쥬게이션에 의해 웰에서 트래핑하였다. GST-고정된 복합체에 대해 상기 기술한 방법에 추가하여 이러한 복합체를 검출하는 방법에는 PCIP 단백질 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 사용하는 복합체의 면역검출법 뿐만 아니라 PCIP 단백질 또는 표적 분자와 연관된 효소적 활성을 검출하는 것에 의존하는 효소-결합 검정법이 포함된다.
바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예컨대, 문헌[참조: Komada M. et al. (1999) Genes Dev. 13(11):1475-85, and Roth M.G. et al. (1999) Chem. Phys. Lipids. 98(1-2): 141-52](이들 참고문헌의 내용을 본원에 참조로 인용함)에 기재된 검정법을 사용하여 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 소포 트래픽 및 단백질 수송을 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 시험관내 키나제 검정을 사용하여, 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분의 인산화 상태를 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다. 요약하면, PCIP 표적 분자를 발현시키는 세포주로부터의 PCIP 표적 분자, 예컨대, 면역침전된 칼륨 채널은 MgCl2및 MnCl2, 예컨대, 10 mM MgCl2및 5 mM MnCl2를 함유하는 완충액중에 PCIP 단백질 및 방사성 ATP, 예컨대, [γ-32P]ATP와 함께 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후에, 면역침전된 PCIP 표적 분자, 예컨대, 칼륨 채널을 환원 조건하에 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 막, 예컨대, PVDF 막으로 옮기고, 자동방사선사진법을 수행할 수 있다. 자동방사선사진상의 검출가능한 밴드의 출현은 PCIP 기질, 예컨대, 칼륨 채널이 인산화되었음을 나타낸다. 또한 인산화된 기질의 포스포아미노산 분석을 수행하여 PCIP 기질상의 잔기가 인산화되었는지를 결정할 수 있다. 요약하면, 방사능인산화된 단백질 밴드는 SDS 겔로부터 절제되어 부분적인 산 가수분해될 수 있다. 그런 다음 생성물은 1차원 전기영동에 의해 분리되고, 예를 들어, 포스포이미저 상에서 분석되고 닌하이드린-염색된 포스포아미노산 표준물질과 비교될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[Tamaskovic R. et al. (1991) Biol. Chem. 380(5):569-78]에 기재된 바와 같은 검정법이 또한 사용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Liu L. (1999) Cell Signal. 11(5):317-24 and Kawai T. et al. (1999) Oncogene 18(23):3471-80]에 기재된 검정법을 사용하여, 칼슘과 결합하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Okuwaki M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(51):34511-8 and Miyaji-Yamaguchi M. (1999) J. Mol. Biol. 290(2): 547-557]에 기재된 검정법을 사용하여, 세포내의 염색질 형성을 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Baker F.L. et al. (1995) Cell Prolif. 28(1):1-15, Cheviron N. et al. (1996) Cell Prolif. 29(8):437-46, Hu Z.W. et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 290(1):28-37 and Elliott K. et al. (1999) Oncogene 18(24):3564-73]에 기재된 검정법을 사용하여, 세포성 증식을조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[Gonzalez C. et al. (1998) Cell Mol. Biol. 44(7):1117-27 and Chia C.P. et al. (1998) Exp. Cell Res. 244(1):340-8]에 기재된 검정법을 사용하여, 칼륨 채널 단백질 또는 이의 일부분과 세포성 세포골격의 결합을 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Bar-Sagi D. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(8):4740-4 and Barker J.L. et al. (1984) Neurosci. Lett. 47(3):313-8]에 기재된 검정법을 사용하여, 막 민감성을 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 후보 화합물, 시험 화합물 또는 작용제는 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Nakashima Y. et al. (1999) J. Bone Joint Surg. Am. 81(5):603-15]에 기재된 검정법을 사용하여, 세포, 예컨대, 뉴런 또는 심장 세포에서 사이토카인 시그널링을 조절하는 PCIP 분자의 능력을 억제하거나 자극하는 이들의 능력에 대해 시험된다.
또 다른 구체예에서, PCIP 발현의 조절인자는 세포를 후보 화합물과 접촉시키고 세포내의 PCIP mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하는 방법으로 확인된다. 후보 화합물의 존재하에 PCIP mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 후보 화합물의 부재하에 PCIP mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교된다. 그런 다음 후보 화합물은 이러한 비교에 기초하여 PCIP 발현의 조절인자로서 확인될 수 있다. 예를 들어, PCIP mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재시보다 존재하에 더 큰(통계적으로 상당히 큰) 경우, 후보 화합물은 PCIP mRNA 또는 단백질 발현의 자극인자로서 확인된다. 또한, PCIP mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재시보다 존재하에 더 작은(통계적으로 상당히 작은) 경우, 후보 화합물은 PCIP mRNA 또는 단백질 발현의 억제제로서 확인된다. 세포내의 PCIP mRNA 또는 단백질 발현 수준은 PCIP mRNA 또는 단백질을 검출하기 위한 본원에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, PCIP 단백질은 PCIP("PCIP-결합 단백질" 또는 "PCIP-bp")에 결합하거나 이와 상호작용하고 PCIP 활성에 관여하는 다른 단백질을 확인하기 위해 2-하이브리드 검정 또는 3-하이브리드 검정[참조: U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300]에서 "미끼 단백질"로서 사용될 수 있다(하기 실시예 섹션에서 더욱 상세히 기재됨). 또한 이러한 PCIP-결합 단백질은 예컨대, PCIP-매개된 시그널링 경로의 다운스트림 엘리먼트와 같이 PCIP 단백질 또는 PCIP 표적에 의한 시그널의 전달에 관여하는 것 같다. 또한, 이러한 PCIP-결합 단백질은 PCIP 억제제인 것 같다.
2-하이브리드 시스템은 분리될 수 있는 DNA-결합 및 활성화 도메인으로 구성된, 대부분의 전사 인자의 모듈 특성에 기초한다. 요약하면, 상기 검정은 2가지 상이한 DNA 작제물을 사용한다. 하나의 작제물에서, PCIP 단백질을 코딩하는 유전자는 공지된 전사 인자의 DNA 결합 도메인(예컨대, GAL-4)을 엔코딩하는 유전자와 융합된다. 다른 하나의 작제물에서, 미확인 단백질("프레이(prey)" 또는 "샘플")을 엔코딩하는, DNA 서열의 라이브러리로부터의 DNA 서열은 공지된 전사 인자의 활성화 도메인을 코딩하는 유전자와 융합된다. "미끼" 및 "프레이" 단백질이 생체내에서 상호작용하여 PCIP-의존성 복합체를 형성할 수 있는 경우, 전사 인자의 DNA-결합 및 활성화 도메인은 근접성이 된다. 이러한 근접성은 전사 인자에 반응성인 전사 조절 부위에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자(예컨대, LacZ)가 전사되게 한다. 리포터 유전자의 발현은 검출될 수 있고 기능적인 전사 인자를 함유하는 세포 콜로니는 단리되어 PCIP 단백질과 상호작용하는 단백질을 엔코딩하는 클로닝된 유전자를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 기술한 스크리닝 검정법에 의해 확인된 신규한 작용제에 관한 것이다. 따라서, 적당한 동물 모델에서 본원에 기술된 바와 같이 확인된 작용제의 추가적인 사용은 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본원에 기술한 바와 같이 확인된 작용제(예컨대, PCIP 조절제, 안티센스 PCIP 핵산 분자, PCIP-특이적 항체 또는 PCIP-결합 파트너)를 동물 모델에서 사용하여 이러한 작용제를 사용하는 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정할 수 있다. 또한, 본원에 기술한 바와 같이 확인된 작용제를 동물 모델에서 사용하여 이러한 작용제의 작용 메카니즘을 결정할 수 있다. 또한, 본 발명은 치료, 예컨대, 본원에 기술한 바와같이 CNA 장애 또는 심혈관 장애의 치료를 위한 상기 기술한 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 작용제의 용도에 관한 것이다.
B.검출 검정
본원에서 동정된 cDNA 서열(및 대응하는 완전한 유전자 서열)의 일부 또는 단편이 폴리누클레오티드 시약으로서 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 서열은 (ⅰ) 염색체 상에 이들 각각의 유전자의 맵핑; 및 이에 따라 유전 질환과 관련된 유전자 영역의 추적; (ⅱ) 소량의 생물 샘플로부터 개체의 식별(조직 타이핑); 및 (ⅲ) 생물 샘플의 법의학적 동정 등에 사용될 수 있다. 이러한 응용은 하기에 기술된다.
1. 염색체 맵핑
일단 유전자의 서열(또는 서열의 부분)이 단리되면, 이러한 서열은 염색체상의 유전자의 위치를 맵핑하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법을 염색체 맵핑이라고 한다. 따라서, 상기한 바와 같이 PCIP 누클레오티드 서열의 일부 또는 단편이 염색체상에서 PCIP 유전자의 위치를 맵핑하는데 사용될 수 있다. PCIP 서열의 염색체로의 맵핑은 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 관련시키는데 중요한 제 1 단계이다.
요약하면, PCIP 유전자가, PCIP 누클레오티드 서열로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15-25 bp 길이)를 제조함으로써 염색체로 맵핑될 수 있다. PCIP 서열의 컴퓨터 분석은 게놈 DNA에서 하나 이상의 엑손을 연결하지 않는 프라이머를 예측하는데 사용될 수 있으며, 이는 증폭 공정을 복잡하게한다. 다음, 이들 프라이머는개체 인간의 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용될 수 있다. PCIP 서열과 대응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭 단편을 생산할 것이다.
체세포 하이브리드는 상이한 포유동물(예를 들어, 인간 및 마우스 세포)로부터의 체세포를 융합하여 제조된다. 인간과 마우스 세포의 하이브리드가 성장하고 분열됨에 따라, 인간 염색체가 무작위적으로 점차 소실되나 마우스 염색체는 유지된다. 특정 효소를 결핍함에 의해 마우스 세포는 자랄 수는 없으나, 인간 세포는 자랄 수 있는 배지를 사용함으로써, 필요한 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 인간 염색체가 유지될 수 있다. 다양한 배지를 사용함에 의해, 하이브리드 세포주의 패널이 설정될 수 있다. 패널 중의 각 세포주는 단일의 인간 염색체 또는 소수의 인간 염색체, 및 완전한 세트의 마우스 염색체를 함유하여, 특이적 인간 염색체에 대한 개체 유전자의 맵핑이 용이하게된다(참고문헌: D'Eustachio P. et al. (1983) Science 220;919-924). 인간 염색체의 단지 단편만을 함유하는 체세포 하이브리드가 또한 인간 염색체를 전위 및 결실시킴으로써 제조될 수 있다.
체세포 하이브리드의 PCR 맵핑은 특정 서열을 특정 염색체에 할당하기 위한 신속한 공정이다. 하루에 3개 이상의 서열이 단일 온도 순환기를 사용하여 할당될 수 있다. PCIP 누클레오티드 서열을 올리고누클레오티드 프라이머의 디자인을 위해 사용함으로써, 특이적 염색체로부터의 단편의 패널을 이용한 하위배치가 달성될 수 있다. 유사하게 PCIP 서열을 염색체에 대해 맵핑시킬 수 있는 다른 맵핑 방법은, 그 위치에서의 하이브리드화(참고문헌: Fan, Y et al., (1990) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 87:6223-27), 표지된 플로우-소팅(flow-sorting) 염색체와의 예비 스크리닝, 및 염색체 특이적 cDNA 라이브러리로의 하이브리드화에 의한 예비선택이다.
중기 염색체 전개에 대한 DNA 서열의 동일계내 형광성 하이브리드화(Fluorescencein situhybridization(FISH))가 하나의 단계에서 정밀한 염색체 위치를 제공하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 염색체 전개는, 화학물질 예를 들어, 유사분열 방추를 방해하는 콜세미드 (colcemid)에 의해 중기에서 분열이 차단된 세포를 이용하여 이루어질 수 있다. 염색체를 트립신으로 짧은 순간 처리한 다음, 짐사(Giemsa)로 염색한다. 염색체상에 밝고 어두운 밴드의 패턴이 전개되어, 염색체가 각각 동정될 수 있다. FISH 방법은 500 또는 600 염기의 짧은 DNA 서열을 사용할 수 있다. 그러나, 1,000 염기 보다 더 큰 클론이 단순한 검출에 충분한 시그널 세기로 특정 염색체 위치에서 결합될 가능성이 보다 더 크다. 바람직하게는, 1,000 염기, 및 보다 더 바람직하게는 2,000 염기가 적당한 시간에 우수한 결과를 얻기에 충분하다. 이러한 방법은 참고문헌에 개시된다(Verma et al, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques(Pergamon Press, New York 1988).
염색체 맵핑용 시약이 단일 염색체 또는 염색체상의 단일 부위를 개별적으로 마킹하는데 사용될 수 있거나 시약의 패널이 다중부위 및/또는 다중 염색체를 마킹하는데 사용될 수 있다. 사실상, 유전자의 코딩하지 않는 영역에 사응하는 시약이 맵핑에 바람직하다. 코딩 서열은 유전자 계열에서 보다 더 보존적일 수 있으며,이에 따라 염색체 맵핑동안 크로스 하이브리드화의 가능성을 증가시킨다.
일단 서열이 정밀한 염색체 위치로 맵핑되면, 염색체 상에서의 서열의 물리적인 위치는 유전자 맵 데이터와 관련될 수 있다(이러한 데이터는 예를 들어, 참고문헌(V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, available on-line through Johns Hopkins University Welch Medical Library)에서 찾아 볼 수 있다). 다음, 동일한 염색체 영역에 맵핑된 유전자와 질환의 관계가 연결 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공유전(coinheritance))을 통해 확인될 수 있다(참고문헌: Egeland, J. et al., (1987) Nature, 325:783-787).
또한, PCIP 유전자와 관련된 질환에 감염된 개체와 감염되지 않은 개체 사이의 DNA 서열에서의 상이점이 측정될 수 있다. 감염된 개체의 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰되나 감염되지 않은 개체에서는 관찰되지 않는다면, 돌연변이는 특정 질환의 병원체일 것이다. 감염된 개체와 감염되지 않은 개체의 비교는, 일반적으로 1차적으로 염색체의 구조적인 변이 예컨대, 염색체 전개를 통해 관찰할 수 있거나 DNA 서열에 기초한 PCR로 검출할 수 있는 유전자의 결실 또는 전위를 찾는 것을 포함한다. 궁극적으로, 수 개의 개체로부터의 유전자 서열의 완성은 다형성으로부터 돌연변이의 존재를 확인하고 돌연변이를 구별하기 위해 수행될 수 있다.
2.조직 타이핑
본 발명의 PCIP 서열은 또한 개체를 소량의 생물 샘플로부터 식별하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미군은 제한 단편의 다형성(RELP)을 인간의 식별에 이용할 것을 고려하고 있다. 이러한 방법에서, 개체의 게놈 DNA가 하나 이상의 제한효소로 분해되고, 서던 블롯에서 프로빙되어 식별을 위한 독특한 밴드가 생성된다. 이러한 방법은 상실되거나, 스위칭되거나 도난당할 수 있어 양성 식별을 어렵게하는 "도그 태그(Dog Tags)"가 지닌 한계를 제거한다. 본 발명의 서열은 RFLP를 위한 부가의 DNA 마커로서 유용하다(참고문헌: 미국특허 제 5,272,057호).
또한, 본 발명의 서열은 개체 게놈의 선택된 부분의 실제의 염기 대 염기 서열을 결정하는 대안적인 방법을 제공하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 PCIP 누클레오티드 서열은, 서열의 5' 말단 및 3' 말단으로부터 2개의 PCR 프라이머를 제조하는데 사용될 수 있다. 다음, 이들 프라이머는 개체 DNA를 증폭시키고, 후속하여 서열분석하는데 사용될 수 있다.
이러한 방법으로 제조된, 개체로부터의 대응하는 DNA 서열의 패널은, 각각의 개체가 대립하는 상이점으로 인해 독특한 DNA 서열 세트를 가지게 됨에 따라, 독특한 개체 식별을 제공할 수 있다. 본 발명의 서열은 개체 및 조직으로부터 이러한 식별 서열을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 PCIP 누클레오티드 서열은 인간 게놈의 부분을 독특하게 나타낼 수 있다. 대립형질 변화가 이들 서열의 코딩 영역에서 다소 발생하며, 비코딩 영역에서 보다 더 많이 발생한다. 개체 인간 사이의 대립형질의 변화가 500 염기마다 약 1회의 빈도로 발생하는 것으로 평가된다. 본원에 기술된 각각의 서열은 개체로부터의 DNA가 식별을 위한 목적으로 비교될 수 있는 표준으로 사용될 수 있다. 보다 더 많은 수의 다형성이 비코딩 영역에서 발생하기 때문에, 개체를 구분하는데는 보다 더 적은 수의 서열이 필요하다. 비코딩서열은 각각 100 염기의 비코딩 증폭 서열을 산출하는 약 10 내지 1,000 프라이머의 패널로, 만족할만한 양성 개체 식별을 제공할 수 있다. 예측된 코딩서열이 사용되는 경우, 양성 개체 식별을 위해 보다 더 적합한 프라이머의 수는 500-2000일 것이다.
본원에 기술된 PCIP 누클레오티드 서열로부터의 시약의 패널이, 개체에 대한 독특한 식별 데이터베이스를 생성시키기 위해 사용되는 경우, 동일한 시약이 이후에 개체로부터의 조직을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 독특한 식별 데이터베이스를 사용하여, 개체의 양성 식별, 생존 또는 죽음을 소량의 조직 샘플로부터 수행할 수 있다.
3. 법의학적 생물학에서의 부분 PCIP 서열의 용도
DNA 기초한 식별 방법은 또한 법의학적 생물학분야에서 이용될 수 있다. 법의학적 생물학은 예를 들어, 범죄 용의자의 양성 식별을 위한 수단으로서, 범죄 현장에서 발견되는 생물학적 증거의 유전적 타이핑을 이용하는 과학 분야이다. 이러한 식별을 위해, PCR 방법이 범죄 현장에서 발견되는 매우 소량의 생물학적 샘플 예컨대, 조직 예를 들어, 머리카락 또는 피부, 또는 체액 예를 들어, 침, 혈액, 또는 정액으로부터 채취한 DNA 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 다음, 증폭된 서열은 표준과 비교되며, 그에 따라 생물 샘플의 기원이 식별될 수 있다.
본 발명의 서열은 인간 게놈의 특이적 위치에 표적화된 폴리누클레오티드 시약 예를 들어, PCR 프라이머의 제공하는데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 다른 "식별 마커"(즉, 특정 개체에서 독특한 또 다른 DNA 서열)를 제공함으로써 DNA에 기초한 법의학적 식별의 신뢰성을 증가시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 실제염기서열 정보가 제한 효소에 의해 생성된 단편에 의해 형성된 패턴에 대한 정확한 대안으로서 식별을 위해 사용될 수 있다. 비코딩 영역에 표적화된 서열은, 비코딩 영역에서 보다 더 많은 수의 다형성이 발생하므로 이러한 용도에 특히 적합하며, 이것은 이러한 방법으로 개체를 식별하는 것을 보다 더 용이하게 한다. 폴리누클레오티드 시약의 예는, PCIP 누클레오티드 서열 또는 이것의 부분으로서 20 염기 이상, 바람직하게는, 30 염기 이상의 길이를 갖는 것을 포함한다.
본원에 기술된 PCIP 누클레오티드는 또한 예를 들어 동일계내 하이브리드화 기술에 사용될 수 있는 표지되거나 표지될 수 있는 프로브인 폴리누클레오티드 시약을 제공하는데 사용되어 특이적 조직, 예를 들어 뇌 조직을 동정할 수 있다. 이는 법의학적 병리학자가 알려지지 않은 기원의 조직을 제공하는 경우에 유용할 수 있다. 이러한 PCIP 프로브의 패널은 종 및/또는 기관 타입에 의해 조직을 동정하는데 사용될 수 있다.
유사한 형태로, 이들 시약, 예를 들어, PCIP 프라이머 또는 프로브는 오염물에 대한 조직 배양물을 스크리닝(배양물내 상이한 타입의 세포 혼합물의 존재에 대해 스크리닝)하는데 사용될 수 있다.
C.예측 의학:
본 발명은 또한 진단 검정, 예후 검정 및 임상 실험 모니터링이 진단(예측) 목적으로 사용되어 개인을 예방적으로 치료하는 예측 의학의 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 양태는 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)을 바탕으로 PCIP 단백질 및/또는 핵산 발현뿐만 아니라 PCIP 활성을 측정하므로써,개인이 질병 또는 장애를 앓고 있는 지, 또는 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질병을 발병시킬 위험이 있는 지를 측정하기 위한 진단 검정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개인이 PCIP 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 관련된 질병이 발병될 위험이 있는 지를 측정하기 위한 진단(또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, PCIP 유전자에서의 변이는 생물학적 샘플에서 검정될 수 있다. 이러한 검정은 진단 또는 예방의 목적으로 사용되어 PCIP 단백질, 핵산 발현 또는 활성에 의해 특징되거나, 이와 관련된 질병의 발병 전에 개인을 예방 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 임상 실험에서 PCIP의 발현 또는 활성에 대한 작용제(예를 들어, 약제, 화합물)의 영향을 모니터링하는 것에 관련된다.
이러한 작용제 및 그 밖의 작용제는 하기에 보다 상세히 기술될 것이다.
1.진단 검정
생물학적 샘플에서 PCIP 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검정하기 위한 예시적 방법은, 시험 대상으로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계 및 생물학적 샘플을, PCIP 단백질 또는 PCIP 단백질을 엔코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA, 게놈 DNA)를 검출할 수 있는 화합물 또는 작용제와 접촉시켜 생물학적 샘플내의 PCIP 단백질 또는 핵산의 존재 여부를 검출하는 것을 포함한다. PCIP mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하기 위한 바람직한 작용제는 PCIP mRNA 또는 게놈 DNA를 하이브리드화시킬 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 핵산 프로브는 예를 들어, 전체 길이의 PCIP 핵산, 예컨대, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100 또는 SEQ ID NO: 1002의 핵산, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호 또는 제 98994호로 ATCC에 기탁된 DNA 삽입플라스미드, 또는 이들의 일부, 예컨대 길이에 있어서 적어도 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 누클레오티드의 올리고누클레오티드일 수 있으며, 이는 PCIP mRNA 또는 게놈 DNA로 엄격한 조건 하에 특이적으로 하이브리드화시키기에 충분하다. 본 발명의 진단 검정에 사용하기 위한 그 밖의 적합한 프로브가 본원에 기재된다.
PCIP 단백질을 검출하기 위한 바람직한 작용제는 PCIP 단백질에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 손상되지 않은 항체, 또는 이의 단편(예를 들어, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "표지된"은, 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질을 커플링(즉, 물리적 결합)시키는 직접 표지 뿐만 아니라, 직접 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지를 포함하는 것으로 의도된다. 간접 표지의 예에는 형광 표지된 제 2 항체를 사용하여 제 1 항체를 검출하는 것과, 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 DNA 프로브를 비오틴으로 말단 표지시키는 것을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상으로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체뿐만 아니라 대상내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내 뿐만 아니라 생체내 생물학적 샘플에서 PCIP mRNA, 단백질, 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PCIP mRNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 노던 하이브리드화(Northern hybridization) 및 동일계내 하이브리드화를 포함한다. PCIP 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술에는 효소면역법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전법 및 면역형광법이 포함된다. PCIP 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술에는 서던 하이브리드화(Southern hybridization)가 포함된다. 추가로, PCIP 단백질의 검출을 위한 생체내 기술에는 대상에 표지된 항-PCIP 항체를 도입시키는 것이 포함된다. 예를 들어, 이러한 항체는 대상에의 존재 및 위치가 표준 이미지화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
한 구체예에서, 생물학적 샘플은 시험 대상으로부터의 단백질 분자를 포함한다. 다르게는, 생물학적 샘플은 시험 대상으로부터의 mRNA 분자 또는 시험 대상으로부터의 게놈 DNA 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 생물학적 샘플은 대상으로부터 통상의 수단에 의해 단리된 혈청 샘플 또는 뇌척수액이다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 대조 피검자로부터 대조 생물학적 샘플을 획득하는 단계, 대조 샘플을, PCIP 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 작용제와 접촉시켜 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재를 생물학적 샘플 중에서 검출시키는 단계 및 대조 샘플에서 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재를 시험 샘플에서의 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재와 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 PCIP의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플에서 PCIP 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 작용제; 샘플내 PCIP 양을 측정하기 위한 수단; 및 샘플내 PCIP의 양을 표준과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 상기 화합물 또는 작용제는 적합한 용기에 패키징될 수 있다. 키트는 PCIP 단백질 또는 핵산을 검출하는데 키트를 사용하기 위한 안내서를 추가로 포함할 수 있다.
2.예후 검정
본원에 기술된 진단 방법은 또한 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 가지고 있거나 가질 위험이 있는 대상을 확인하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 선행 진단 검정 또는 후속 검정과 같은 본원에 기재된 검정은 신경변성 질환, 예를 들어, 알츠하이머병, 알츠하이머병과 관련된 치매(피크병과 같은), 파킨슨병 및 그 밖의 루이 디퓨스 바디(Lewy diffuse body) 질병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 전진적 상핵 마비, 간질, 척수소뇌 운동 실조증 및 크로이츠펠트야콥병; 정신 장애, 예를 들어, 우울증, 정신분열증, 코르사코프 정신병, 조증, 불안증, 이극성 장애 또는 공포증; 학습 또는 기억 장애, 예를 들어, 기억 상실 또는 노화 관련 기억력 상실; 신경성 질환, 예를 들어, 편두통; 통증 장애, 예를 들어, 근골격 장애와 관련된 통각과민 또는 통증; 척수 손상; 심장 마비; 및 두부 외상; 또는 심혈관 질환, 예를 들어, 동결절 부전, 협심증, 심장 발작, 고혈압, 심장세동, 심방조동, 확장형 심근병증, 특발성 심근병증, 심근경색, 관상동맥 질환, 관상동맥 경련 또는 부정맥과 같은 PCIP 단백질 활성 또는 핵산 발현에서의 조절오류와 관련된 질환이 있거나 발병 위험이 있는 대상을 확인하는데 이용될 수 있다.
다르게는, 예후 검정은 칼륨 채널 관련 질환과 같은 PCIP 단백질 활성 또는 핵산 발현에서의 조절 오류와 관련된 질환이 있거나 발병 위험이 있는 대상을 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험 샘플을 대상으로부터 획득하고, PCIP 단백질 또는 핵산(예를 들어, mRNA 또는 게놈 DNA)를 검출하여, PCIP 단백질 또는 핵산의 존재가 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 질환이 있거나 발병 위험이 있는 대상을 진단하는, 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 "시험 샘플"은 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플을 의미한다. 예를 들어, 시험 샘플은 생물학적 유체(예를 들어, 혈청), 세포 샘플, 또는 조직일 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 예후 검정은 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위해 대상에게 작용제(예를 들어, 효능제, 길항제, 펩티도모사체(peptidomimetic), 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 또는 그 밖의 약제 후보)를 투여할 수 있는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 대상이 CNS 질환 또는 심혈관 질환용 작용제로 효과적으로 치료될 수 있는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 시험 샘플을 얻어, PCIP 단백질 또는 핵산 발현 또는 활성을 검출하여(예를 들어, 다량의 PCIP 단백질 또는 핵산 발현 또는 활성이, 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질환을 치료하기 위한 작용제가 투여될 수 있는 대상을 진단하여)하여, 대상이 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질환에 대한 작용제로 효과적으로 치료될 수 있는 지를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 또한 PCIP 유전자에서 유전적 변형을 검출하므로써, 변형된 유전자를 갖는 대상이 CNS 질환 또는 심혈관 질환과 같은 PCIP 단백질 활성 또는 핵산 발현에서의 조절 오류에 의해 특징되는 질환의 발병 위험성이 있는 지를 측정하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상으로부터의 세포 샘플에서, PCIP-단백질을 엔코딩하는 유전자의 무결성 또는 PCIP 유전자의 오발현에 영향을 미치는 하나 이상의 변형에 의해 특징되는 유전자 변형의 존재 여부를 검출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 유전자 변형은 1) PCIP 유전자로부터의 하나 이상의 누클레오티드의 결실; 2) PCIP 유전자로의 하나 이상의 누클레오티드의 첨가; 3) PCIP 유전자의 하나 이상의 누클레오티드의 치환; 4) PCIP 유전자의 염색체 재배열; 5) PCIP 유전자의 mRNA 전자 수준의 변형; 6) 게놈 DNA의 메틸화 패턴과 같은 PCIP 유전자의 이상 변형, 7) PCIP 유전자의 mRNA 전사의 비야생형 슬라이싱 패턴의 존재, 8) PCIP-단백질의 비야생형 수준, 9) PCIP 유전자의대립형질 손실, 및 10) PCIP 단백질의 부적합 후번역 변형중 하나 이상의 존재를 확인하므로써 검출될 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같이, PCIP 유전자에서의 변형을 검출하는데 사용될 수 있는 당해 공지된 검정 방법이 많이 존재한다. 바람직한 생물학적 샘플은 대상으로부터 통상적인 수단에 의해 단리된 조직 또는 혈청 샘플이다.
특정 구체예에서, 변형의 검출은 앵커(anchor) PCR 또는 RACE PCR와 같은 PCR(polymerase chain reaction)(참조예: 미국 특허 제 4,683,195호 및 제 4,683,202호), 또는 다르게는 LCR(ligation chain reaction)(참조예: Landegran et al. (1988)Science241:1077-1080; and Nakazawa et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:360-364)의 프로브/프라이머 사용을 포함하며, LCR은 PCIP 유전자에서 점 돌연변이를 검출하는데 특히 유용할 수 있다[참조: Abravaya et al. (1995)Nucleic Acids Res.23:675-682]. 이 방법은 대상으로부터 세포 샘플을 수집하는 단계, 샘플 세포로부터 핵산(예를 들어, 게놈, mRNA, 또는 이둘 모두)을 단리시키는 단계, 하나 이상의 프라이머와 상기 핵산 샘플을 접촉시켜 PCIP 유전자(존재하는 경우)의 하이브리드화시키는 단계, 및 증폭이 일어나는 조건 하에서 PCIP 유전자에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 단계 및 증폭 생성물의 존재 또는 부재를 검출하거나, 증폭 생성물의 크기를 검출하고, 대조 샘플에 대해 길이를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. PCR 및/또는 LCR이 본원에 기재된 변이를 검출하는데 사용된 기술과 함께 예비 증폭 단계로서 사용하는 것이 바람직할 것으로 추측된다.
또 다른 증폭 방법은 자립 서열 복제(Guatelli, J.C. et al., (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh, D.Y. et al., (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177), Q-베타 리플리카제(Lizardi, P.M. et al.(1988)Bio-Technology6:1197), 또는 그 밖의 핵산 증폭 방법을 포함하고, 이후 당업자들에게 널리 공지된 기술을 사용하여 증폭된 분자를 검출한다. 이러한 검출 방법은 이러한 분자가 매우 소수로 존재하는 경우에 핵산 분자를 검출하는데 특히 유용하다.
또 다른 구체예에서, 샘플 세포로부터의 PCIP 유전자에서의 변이는 제한 효소 분해 패턴에서의 변형에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 샘플 및 대조 DNA를 분리하고, 증폭(임의로)시키고, 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 분해하고, 단편 길이 크기를 겔 전기 영동에 의해 측정하고 비교한다. 샘플과 대조 DNA 간의 단편 길이 크기에서의 차이가 샘플 DNA에서의 변이를 나타낸다. 또한, 서열 특이적 리보자임(참조예: 미국 특허 제 5,498,531호)의 사용이 리보자임 분해 부위의전개 또는 손실에 의한 특이적 변이의 존재를 기록하는데 이용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, PCIP에서의 유전자 변이는 샘플 및 대조 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 수백 또는 수천개의 올리고누클레오티드 프로브를 함유하는 고밀도 배열로 하이브리드화하여 확인될 수 있다[참조: Cronin, M.T. et al., (1996)Human Mutation7:244-255; Kozal, M.J. et al.(1996)Nature Medicine2:753-759]. 예를 들어, PCIP에서의 유전자 변이는 상기 크로닌, 엠. 티. 등의 문헌에서 기재된 바와 같이 광-생성된 DNA 프로브를 함유하는 2차원 배열에서 확인될 수 있다. 요약하면, 프로브의 제 1 하이브리드화 배열이 샘플 및 대조표준에서 DNA의 긴 스트레치(stretch)를 두루 스캐닝하는데 사용되어 순차 중복 프로브의 선형 배열을 만들어 서열간의 염기 변화를 확인할 수 있다. 이러한 단계는 점 돌연변이의 확인을 가능하게 한다. 이 단계 이후에는 검출되는 모든 변형체 또는 변이체에 대해 상보적인, 보다 작고 특정화된 프로브를 사용하므로써 특이적 변이의 특징화를 가능하게 하는 제 2 하이브리드화 배열이 이루어진다. 각각의 변이 배열은 하나는 야생형 유전자에 상보적이고, 나머지 하나는 변이 유전자에 상보적인 평행 프로브 셋(set)으로 이루어진다.
또 다른 구체예에서, 당해 공지된 여러 서열분석 반응이 PCIP 유전자를 직접 서열분석하고, 샘플 PCIP의 서열을 상응하는 야생형(대조표준) 서열과 비교하므로써 변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 서열분석 반응의 예에는 막심(Maxam) 및 길버트(Gilbert)((1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:560) 또는 상거(Sanger)((1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:5463)에 의해 개발된 기술을 기초로 하는 것들이 포함된다. 또한, 여러 자동화 서열분석 절차가 질량 분광법(참조예: PCT 국제 출원 WO 94/16101; Cohen et al. (1996)Adv. Chromatogr.36:127-162; and Griffin et al. (1993)Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159)에 의해 서열분석하는 것을 포함하여 진단 검정((1995)Biotechniques19:448)을 수행하는 경우에 이용될 수 있는 것으로 숙고된다.
PCIP 유전자에서의 변이를 검출하기 위한 다른 방법은, 분해제로부터의 보호작용이 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스(heteroduplex)에서의미스매치(mismatch) 염기를 검출하는데 사용된다[참조: Myers et al(1985)Science230:1242]. 일반적으로, "미스매치 분해"의 당해 기술은 야생형 PCIP 서열을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 조직 샘플로부터 얻어진 잠재적 돌연변이체 RNA 또는 DNA로 하이브리드화시키므로써 형성된 헤테로듀플렉스를 제공하여 개시된다. 이중 가닥 듀플렉스는 대조표준과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미치매치로 인해 존재할 듀플렉스의 단일 가닥 영역을 분해시키는 작용제로 처리된다. 예를 들어, RNA/DNA 듀플렉스는 미스매치 영역을 효소적으로 분해시키는 S1 누클레아제로 처리된 RN아제 및 DNA/DNA 하이브리드로 처리될 수 있다. 다른 구체예에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스는 하이드록실아민 또는 사산화오스뮴으로, 그리고 피페리딘으로 처리되어 미치매치 영역을 분해시킬 수 있다. 미치매치 영역의 분해 후, 형성된 물질은 이후 폴리아크릴아미드 겔 변성에 대한 크기로 분해되어 변이 부위를 측정한다[참조예: Cotton et al.(1988)Proc. Natl Acad Sci USA85:4397; Saleeba et al. (1992)Methods Enzymol. 217:286-295]. 바람직한 구체예에서, 대조 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 미치매치 분해 반응은 세포의 샘플로부터 획득한 PCIP cDNA에서 점 돌연변이를 검출하고 맵핑(mapping)하기 위해 정의된 시스템에서 이중 가닥 DNA(소위 "DNA 미스매치 복구" 효소)에서 미치매치 염기쌍을 인지하는 하나 이상의 단백질을 사용한다. 예를 들어, E.coli의 mutY 효소는 G/A 미치매치에서 A를 분해시키고, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 분해시킨다[참조: Hsu et al. (1994)Carcinogenesis15:1657-1662]. 예시적구체예에 따르면, PCIP 서열, 예를 들어, 야생형 PCIP 서열을 기초로 하는 프로브는 시험 세포로부터의 cDNA 또는 다른 DNA 생성물로 하이브리드화된다. 이 듀플렉스는 DNA 미스매치 복구 효소로 처리되어, 존재하는 경우 분해 생성물이 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다[참조예: 미국 특허 제 5,459,039호].
또 다른 구체예에서, 전기영동 이동성에서의 변경이 PCIP 유전자에서의 변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, SSCP(single strand conformation polymorphism)이 변이체와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동성에서의 차이를 검출하는데 사용될 수 있다[참조: Orita et al.(1989)Proc Natl. Acad. Sci USA:86:2766; Cotton(1993)Mutat. Res. 285:125-144; and Hayashi(1992)Genet. Anal. Tech. Appl.9:73-79]. 샘플 및 대조 PCIP 핵산의 단일 가닥 DNA 단편은 변성되고, 탈변성될 것이다. 단일 가닥 핵산의 제 2 구조는 서열에 따라 다양하며, 이에 따른 전기 영동 이동성에서의 변형이 단일 염기 변화까지도 검출할 수 있게 한다. DNA 단편은 표지된 프로브로 표지되거나 검출될 수 있다. 검정의 민감도는 RNA(DNA보다는)를 사용하므로써 증강될 수 있으며, 이때 제 2 구조는 서열 변화에 보다 민감하다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 헤테로듀플렉스 분석을 이용하여 전기 영동 이동성에서의 변화를 기초로 이중 가닥 헤테로듀플렉스 분자를 분리시킨다[참조: Keen et al.(1991)Trends Genet7:5].
또 다른 구체예에서, 변성체의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드겔에서 변이체 또는 야생형 단편의 이동이 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)를 사용하여 검정된다[참조: Myers et al.(1985)Nature313:495]. DGGE가 분석방법으로서 사용되는 경우, DNA는, 예를 들어, 약 40bp의 고용융 GC-부유 DNA의 GC 클램프(clamp)를 PCR에 의해 첨가하므로써 완전히 변성하지 않는 것이 보장되도록 변형될 것이다. 또 다른 구체예에서, 온도 구배를 변성 구배 대신에 사용하여 대조표준과 샘플 DNA의 이동성 차이를 확인한다[참조: Rosenbaum and Reissner(1987)Biophys Chem265:12753].
점 돌연변이를 검출하기 위한 또 다른 기술의 예에는 선택적 올리고누클레오티드 하이브리드화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 연장이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 올리고누클레오티드 프라이머는, 공지된 변이를 중앙에 놓고, 이후 완전한 매치가 발견되는 경우에만 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 표적 DNA로 하이브리드화시켜 제조될 수 있다[참조: Saiki et al.(1986)Nature324:163; Saiki et al.(1989)Proc. Natl Acad. Sci USA86:6230]. 이러한 대립형질 특이적 올리고누클레오티드는, 올리고누클레오티드가 하이브리드화 막에 부착되어 표지된 표적 DNA와 하이브리드화되는 경우에 PCR 증폭된 표적 DNA 또는 다수의 상이한 변이체로 하이브리드화된다.
다르게는, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립형질 특이적 증폭 기술은 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 특이적 증폭에 프라이머로서 사용되는 올리고누클레오티드는 분자의 중심에(증폭이 차별적 하이브리드화에 의존하도록)(Gibbs et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:2437-2448) 또는 적합한 조건 하에서 미스매치가 중합효소 연장을 방지하거나 감소시킬 수 있는 프라이머의 극한 3' 말단(Prossner (1993)Tibtech11:238)에 대상이 되는 돌연변이체를 지닐 수 있다. 또한, 변이영역에 신규 제한 부위를 도입시켜 분해에 근거한 검출을 창출시키는 것이 바람직할 수 있다[참조: Gasparini et al.(1992)Mol. Cell Probes6:1]. 특정 구체예에서, 증폭은 증폭을 위한 Taq 리가제를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 예측된다[참조: Barany(1991)Proc. Natl. Acad. Sci USA88:189]. 이러한 경우에, 5' 서열의 3' 말단에서 완전한 매치가 있는 경우에만 연결이 일어나 증폭의 존재 또는 부재를 찾으므로써 특이적 부위에서 공지된 돌연변이의 존재를 검출가능하게 할 것이다.
본원에 기재된 방법은 예를 들어, PCIP 유전자에 관여하는 질병 또는 병의 증상 또는 가족력을 보이는 환자를 진단하기 위한 임상적 설정에 편리하게 사용될 수 있는 본원에 기재된 하나 이상의 프로브 핵산 또는 항체 시약을 포함하는 판매전 포장되는 진단 키트를 이용하므로써 수행될 수 있다.
더우기, PCIP가 발현되는 세포 타입 또는 조직이 본원에 기재된 진단 검정에 이용될 수 있다.
3. 임심 실험 동안의 효과 모니터링
PCIP 단백질의 발현 또는 활성에 대한 작용제(예를 들어, 약제)의 영향(예를 들어, 막 흥분성 또는 휴지 전위(resting potential)의 조절)을 모니터링하는 것이 기본 약제 스크리닝 뿐만 아니라 임상 실험에서 적용될 수 있다. 예를 들어, PCIP 유전자 발현, 단백질 수준을 증가시키거나, PCIP 활성을 상향 조절하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝 검정에 의해 결정된 작용제의 효능은 감소된 PCIP 유전자 발현, 단백질 수준 또는 하향 조절된 PCIP 활성을 보이는 대상의 임상 실험에서 모니터링될 수 있다. 다르게는, PCIP 유전자 발현, 단백질 수준을 감소시키거나, PCIP 활성을 하향 조절하기 위한 스크리닝 검정에 의해 측정되는 작용제의 효능이 증가된 PCIP 유전자 발현, 단백질 수준 또는 상향 조절된 PCIP 활성을 보이는 대상의 임상 시험에서 모니터링될 수 있다. 이러한 임상 실험에서, PCIP 유전자 및 바람직하게는 예를 들어 칼륨 채널 관련 질환에 관련된 그 밖의 유전자의 발현 또는 활성은 특별 세포의 표현형 마커 또는 "해독 정보(read out)"으로서 사용될 수 있다.
예를 들어, PCIP 활성(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝 검정에서 확인된)을 조절하는 작용제(예를 들어, 화합물, 약제 또는 소분자)로 처리하므로써 세포에서 조절된, PCIP를 포함하는 유전자가 확인될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어 임상 실험에서 칼륨 채널 관련 질환에 대한 작용제의 효과를 연구하기 위해, 세포를 단리하여, RNA를 준비하고, PCIP 및 칼륨 채널 관련 질환에 관련된 다른 유전자의 발현 수준을 각각 분석할 수 있다. 유전자 발현(예를 들어, 유전자 발현 패턴)의 수준은 본원에 기재된 바와 같이 노던 블롯 분석 또는 RT-PCR에 의해, 또는 다르게는 생성된 단백질의 양을 측정하므로써, 본원에 의해 기재된 방법중 어느 하나에 의해, 또는 PCIP 또는 다른 유전자의 활성 수준을 측정하므로써 정량화될 수 있다. 이러한 방식으로, 유전자 발현 패턴이 작용제에 대한 세포의 생리적 반응을 나타내는 마커로서 작용할 수 있다. 따라서, 이러한 반응 상태는 개인이 작용제로 치료되기 전 및 치료되는 동안 여러 시점에서 측정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 (i) 작용제를 투여하기 전에 대상으로부터 투여전 샘플을 획득하는 단계; (ii) 투여전 샘플에서 PCIP 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 발현 수준을 검출하는 단계; (iii) 대상으로부터 하나 이상의 투여후 샘플을 획득하는 단계; (iv) 투여후 샘플로부터 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 단계; (v) 투여전 샘플의 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA와, 투여후 샘플(들)의 PCIP 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 비교하는 단계; 및 (vi) 이에 따라 대상으로의 작용제의 투여를 변경하는 단계를 포함하여, 대상을 작용제(예를 들어, 효능제, 길항제, 펩티도모사체, 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자 또는 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 그 밖의 약물 후보)로 치료하는 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 작용제의 투여를 증가시키는 것은 PCIP의 발현 또는 활성을 검출되는 수준보다 높게 증가시키는데, 즉, 작용제의 효능을 증가시키는데 바람직하다. 다르게는, 작용제의 투여를 감소시키는 것은 PCIP의 발현 또는 활성을 검출되는 수준보다 낮게 감소시키는데, 즉, 작용제의 효능을 감소시키는데 바람직하다. 이러한 구체예에 따르면, PCIP 발현 또는 활성은 관찰가능한 표현형 반응의 부재에서도 작용제의 효능에 대한 인지제로서 사용될 수 있다.
D.치료 방법
본 발명은 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 질환이 있거나 발병 위험이 있는(걸리기 쉬운) 대상을 치료하는 예방적 및 치료적 방법을 제공한다. 예방적 및 치료적 치료 방법과 관련하여, 이러한 치료는 "약리유전학(pharmacogenomics)"의 분야로부터 얻어진 지식을 기초로 특이적으로 맞춰지거나 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 "약리유전학"은 유전자 서열분석, 통계 유전학 및 임상적 개발 및 시장에서의 약물에 대한 유전자 발현 분석과 같은 게놈 기술의 적용을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 환자의 유전자가 어떻게 약물에 대한 반응(예를 들어, 환자의 "약물 반응 표현형" 또는 "약물 반응 인자형")을 결정하는지를 연구하는 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 이러한 개인의 약물 반응 인자형에 따라 본 발명의 PCIP 분자 또는 PCIP 조절제로 개인의 예방적 또는 치료적 치료를 맞추는 방법을 제공한다. 약리유전학은 임상가 또는 의사가 치료로부터 매우 유리할 환자를 예방적 또는 치료적으로 치료가능하게 하고, 독성 약물 관련 부작용이 있을 환자가 치료받지 않도록 할 수 있다.
1.예방 방법
한 가지 양태에서, 본 발명은 PCIP 발현 또는 하나 이상의 PCIP 활성을 조절하는 작용제 또는 PCIP를 대상에 투여하므로써 이상 PCIP 발현 또는 활성과 관련된 상태 또는 질병을 대상으로부터 억제시키는 방법을 제공한다. 이상 PCIP 발현 또는 활성에 의해 초래되거나 이들이 기여하는 질병의 발병 위험성이 있는 대상은 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 진단 또는 예방 검정 또는 이들의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방제의 투여는 질병 또는 질환이 예방되거나, 다르게는 진행이 지연되도록 PCIP 이상의 특징이 되는 증상이 표명화되기 전에 이루어질 수 있다. PCIP 이상의 타입에 따라, 예를 들어, PCIP, PCIP 효능제 또는 PCIP 길항제가 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 적합한 작용제가 본원에 기재된 스크리닝 검정을기초로 측정될 수 있다.
2.치료 방법
본 발명의 또 다른 양태는 치료 목적으로 PCIP 발현 또는 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 예시적 구체예에서, 본 발명의 조절 방법은 세포를, 세포와 관련된 PCIP 단백질 활성의 하나 이상의 활성을 조절하는 작용제 또는 PCIP와 접촉시키는 것을 포함한다. PCIP 단백질 활성을 조절하는 작용제는 핵산 또는 단백질, PCIP 단백질의 천연 표적 분자(예를 들어, PCIP 기질), PCIP 항체, PCIP 효능제 또는 길항제, PCIP 효능제 또는 길항제의 펩티도모사체 또는 그 밖의 소분자와 같은, 본원에 기재된 바와 같은 작용제일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 작용제는 하나 이상의 PCIP 활성을 자극한다. 이러한 자극성 작용제의 예에는 세포로 도입된 PCIP를 엔코딩하는 핵산 분자 및 활성 PCIP 단백질이 포함된다. 또 다른 구체예에서, 상기 작용제는 하나 이상의 PCIP 활성을 억제한다. 이러한 억제제의 예에는 안티센스 PCIP 핵산 분자, 항-PCIP 항체 및 PCIP 억제제가 포함된다. 이러한 조절 방법은 시험관내에서 (예를 들어, 세포를 작용제와 배양시키므로써), 또는 다르게는, 생체내에서(예를 들어, 작용제를 대상에 투여하므로써) 수행될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 PCIP 단백질 또는 핵산 분자의 이상 발현 또는 활성에 의해 특징되는 질병 또는 질환을 앓고 있는 개인을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 질환의 예에는, 신경변성 질환과 같은 CNS 질환, 예를 들어, 알츠하이머병, 알츠하이머병과 관련된 치매(피크병과 같은), 파킨슨병 및 그 밖의 루이 디퓨스 바디 질병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 전진적 상핵 마비, 간질 및 크로이츠펠트야콥병; 정신 장애, 예를 들어, 우울증, 정신분열증, 코르사코프 정신병, 조증, 불안증, 이극성 장애 또는 공포증; 학습 또는 기억 장애, 예를 들어, 기억 상실 또는 노화 관련 기억력 상실; 신경성 질환, 예를 들어, 편두통; 통증 장애, 예를 들어, 근골격 장애와 관련된 통각과민 또는 통증; 척수 손상; 심장 마비; 및 두부 외상; 또는 심혈관 질환, 예를 들어, 동맥경화증, 허혈 재관류 손상, 재협착증, 동맥 염증, 혈관벽 재형성, 심실재형성, 빠른 심신 조율, 관상 미세색전증, 빈박, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 휨, 관상 동맥 연결, 맥관성 심장병, 심방 세섬유화, 장QT 증후군, 울혈성 심부전, 동결절 부전, 협심증, 심장 발작, 고혈압, 심장세동, 심방조동, 확장형 심근병증, 특발성 심근병증, 심근경색, 관상동맥 질환, 관상동맥 경련 또는 부정맥이 포함된다. 한 구체예에서, 본 발명은 PCIP 발현 또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절하거나 하향조절)하는 작용제(예를 들어, 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 작용제) 또는 작용제의 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료제로서 PCIP 단백질 또는 핵산 분자를 투여하여 감소된 또는 이상 PCIP 발현 또는 활성을 보상하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에는 치료 유효량의 PCIP 항체를 대상에 투여하는 단계를 포함하여, PCIP 관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 포함된다. 본원에 정의되는 바와 같이, 항체의 치료 유효량(즉, 효과적인 투여량)는 체중 kg당 0.001 내지 30mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 25mg, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 20mg, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 10mg, 2 내지 9mg, 3 내지 8mg, 4 내지 7mg, 또는 5 내지 6mg이다. 당업자들은 질환 또는 장애의 중증도, 대상의 전반적인 건강 상태 및/또는 연령, 및 존재하는 그 밖의 질병을 포함하는(이로 제한되는 것은 아님) 특정 요인이 대상을 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 대상을 치료 유효량의 항체로 치료하는 것에는 단일 치료를 포함할 수 있고, 또는 바람직하게는 병행 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 주당 1회, 약 0.1 내지 20mg/체중 kg 범위의 항체로 치료된다. 또한, 치료에 사용된 항체의 효과적인 투여량은 특정 치료의 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있음이 인지되어야 할 것이다. 투여량의 변화는 본원에 기재된 진단 검정의 결과로부터 기인할 수 있다.
PCIP 활성의 자극은 PCIP가 비정상적으로 하향조절되고/되거나 증가된 PCIP 활성이 유리한 효과를 가질 것 같은 상황에서 바람직하다. 예를 들어, PCIP 활성의 자극은, PCIP가 하향조절되고/되거나 증가된 PCIP 활성이 유리한 효과를 가질 것 같은 상황에 바람직하다. 마찬가지로, PCIP 활성의 억제는, PCIP가 비정상적으로 상향조절되고/되거나 감소된 PCIP 활성이 유리한 효과를 가질 것 같은 상황에 바람직하다.
3.약리유전학
본 발명의 PCIP 분자 뿐만 아니라 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인되는 PCIP 활성(예를 들어, PCIP 유전자 발현)에 대한 촉진 또는 억제 효과를 갖는 작용제 또는 조절제가 개인에게 투여되어 이상 PCIP 활성과 관련된 칼륨 채널 관련장애(예를 들어, 신경변성 질환과 같은 CNS 질환, 예를 들어, 알츠하이머병, 알츠하이머병과 관련된 치매(피크병과 같은), 파킨슨병 및 그 밖의 루이 디퓨스 바디 질병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 전진적 상핵 마비, 간질, 척수소뇌 운동 실조증 및 크로이츠펠트야콥병; 정신 장애, 예를 들어, 우울증, 정신분열증, 코르사코프 정신병, 조증, 불안증, 이극성 장애 또는 공포증; 학습 또는 기억 장애, 예를 들어, 기억 상실 또는 노화 관련 기억력 상실; 신경성 질환, 예를 들어, 편두통; 통증 장애, 예를 들어, 근골격 장애와 관련된 통각과민 또는 통증; 척수 손상; 심장 마비; 및 두부 외상; 또는 심혈관 질환, 예를 들어, 동맥경화증, 허혈 재관류 손상, 재협착증, 동맥 염증, 혈관벽 재형성, 심실재형성, 빠른 심신 조율, 관상 미세색전증, 빈박, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 휨, 관상 동맥 연결, 맥관성 심장병, 심방 세섬유화, 장QT 증후군, 울혈성 심부전, 동결절 부전, 협심증, 심장 발작, 고혈압, 심장세동, 심방조동, 확장형 심근병증, 특발성 심근병증, 심근경색, 관상동맥 질환, 관상동맥 경련 또는 부정맥)을 (예방적으로 또는 치료적으로) 치료할 수 있다. 이러한 치료와 함께, 약리유전학(개인의 인자형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 개인의 반응 간의 관계에 대한 연구)가 고려될 수 있다. 치료제의 대사에서의 차이는 약물학적으로 활성인 약물의 투여량 및 혈액 농도 간의 관계를 변경시키므로써 심각한 독성 또는 치료 실패를 유발시킬 수 있다. 따라서, 의사 또는 임상가는, PCIP 분자 또는 PCIP 조절제를 투여할 지에 대한 결정 뿐만 아니라 PCIP 분자 또는 PCIP 조절제를 사용하는 치료의 치료 섭생 및/또는 투여량을 조정하는 것에 있어서 관련된 약리유전학 연구에서 얻어진 지식을 적용할 것을 고려할 수 있다.
약리유전학은 병에 걸린 인간에게서의 변경된 약물 특성 및 이상 작용으로 인한 약물에 대한 반응에서 임상적으로 중요한 유전 변형을 다룬다[참조예: Eichelbaum, M. et al.(1996)Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 and Linder, M.W. et al.(1997)Clin. Chem.43(2):254-266]. 일반적으로, 두가지 타입의 약물유전(pharmacogenetic) 상태로 구분될 수 있다. 약물이 인체에 작용하는 방식을 변경하는(변형된 약물 작용) 단일 인자로서 유전되는 유전 상태 또는 인체가 약물에 작용하는 방식을 변경하는(변형된 약물 대사) 단일 인자로서 유전되는 유전 상태가 그것이다. 이러한 약물유전 상태는 자연 발생 다형성으로서 또는 희귀 유전 결함으로서 일어날 수 있다. 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 결핍(G6PD)은, 주요 임상적 합병증이 산화성 약물(항-말라리아제, 술폰아미드, 진통제, 니트로푸란)의 섭취 후와 잠두(fava beans)의 소모 후의 용혈인 일반적인 유전적 효소병이다.
"게놈-와이드 어소시에이션(genome-wide association)"으로서 공지된 약물 반응을 예측하는 유전자를 확인하는 약리유전학 방법 중 하나는, 주로 이미 공지된 유전자 관련 마커(예를 들어, 각각 두개의 변이체를 갖는 인간 게놈 상의 60,000-100,000 다형성 또는 가변성 부위로 이루어진 "비-대립형질" 유전자 마커 맵)로 구성된 인간 게놈의 고해상 지도에 의존한다. 이러한 고해상 유전 지도는 특정 관찰된 약물 반응 또는 부작용과 관련된 마커를 확인하기 위해 페이스 II/III 약물 시험에 참여하는 통계적으로 중요한 수의 환자 각각의 게놈 지도를 비교할 수 있다.다르게는, 이러한 고해상 지도는 인간 게놈의 수천만의 공지된 단일 누클레오티드 다형질(SNP)의 조합으로부터 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "SNP"는 DNA 스트레치에서 단일 누크레오티드 염기에서 발생하는 일반적인 변형이다. 예를 들어, SNP는 DNA의 매 1000개의 염기당 한번 일어날 수 있다. SNP는 질병 과정에 관련될 수 있지만, 대다수는 질병에 관련이 없을 수 있다. 이러한 SNP 발생을 기초로 하는 유전 지도가 주어지면, 개인은 개인의 게놈에서 SNP의 특별한 패턴에 의존하는 유전 카테고리로 그룹지을 수 있다. 이러한 방식으로, 이러한 유전적으로 유사한 개인 사이에서 공통적일 수 있는 특성을 고려하여, 유전적으로 유사한 개인의 군으로 조정할 수 있다.
다르게는, "후보 유전자법"이 약물 반응을 예측하는 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 약물 표적을 엔코딩하는 유전자가 공지된 경우(예를 들어, 본 발명의 PCIP 단백질), 이러한 유전자의 모든 일반적인 변이체는 그 집단에서 상당히 용이하게 확인될 수 있으며, 다른 유전자에 대해 어느 한 형태의 유전자를 갖는 것이 특정 약물 반응과 관련되는 지가 측정될 수 있다.
예시적 구체예로서, 약물 대사 효소의 활성은 약물 활성의 강도 및 지속시간 양자에 대한 주요 결정인자이다. 약물 대사 효소의 유전적 다형성의 발견은, 몇몇 환자가 표준 및 안전 용량의 약물을 복용한 후에 기대되는 약효를 획득하지 못하거나 과도한 약물 반응 및 심각한 독성을 나타내는 이유에 대한 설명을 제공하였다. 이들 다형성은 집단 내에서 2개의 표현형, 광역대사환자(EM) 및 저대사환자(PM)로 발현된다. PM의 우세는 다양한 집단내에서 상이하다. 예를 들어, CYP2D6에 대한유전자 코딩은 고도로 다형성이고, 여러 변이가 PM내에서 동정되었으며, 이들은 모두 작용성 CYP2D6의 결핍을 초래한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 저대사환자는 표준 용량이 투여된 경우 매우 빈번히 과도한 약물 반응 및 부작용을 경험한다. 대사물질이 활성 치료 부분인 경우, PM은 치료 반응을 나타내지 않는데, 이는 CYP2D6-형성 대사물질 모르핀에 의해 매개된 코데인의 진통 효과에 대해 입증된 바와 같다. 다른 극단적인 것으로 소위 초고속 대사자가 있는데 이들은 표준 용량에 대하여 반응하지 않는다. 최근에, 초고속 대사작용이 CYP2D6 유전자 증폭에 기인한 것으로 분자적 근거가 동정되었다.
대안적으로, "유전자 발현 프로파일링"이라는 방법을 이용하여 약물 반응을 예측하는 유전자를 동정할 수 있다. 예를 들어, 약물(예를 들어, 본 발명의 PCIP 분자 또는 PCIP 조절제)이 투여된 동물의 유전자 발현은 독성과 관련된 유전자 경로가 개시되었는지에 대한 암시를 제공할 수 있다.
상기 하나 이상의 약리유전학(pharmacogenomics)적 접근에 의해 생성된 정보는, 개체의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 적당한 용량 및 처치 요법을 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 지식은, 투약 또는 약물 선택에 적용할 경우, 부작용 또는 치료 실패를 회피할 수 있고, 따라서 환자를 PCIP 분자 또는 PCIP 조절제, 예를 들어 본원에 설명된 예시적 스크리닝 검정 중 하나에 의해 동정되는 조절제로 처치하는 경우 치료적 또는 예방적 효능을 증가시킬 수 있다.
4.대용 표지자로서의 PCIP 분자의 용도
또한, 본 발명의 PCIP 분자는 질환 또는 질병 상태의 마커로서, 질병 상태의전조용 마커로서, 질병 상태의 소인용 마커로서, 약물 활성의 마커로서, 또는 환자의 약리유전학적 프로필의 마커로서 유용하다. 본원에 설명된 방법을 사용하면, 본 발명의 PCIP 분자의 존재, 부재 및/또는 정량이 검출될 수 있으며, 인체내 하나 이상의 생물학적 상태와 연관될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 PCIP 분자는 하나 이상의 질환 또는 질병 상태를 위한, 또는 질병 상태에 이르기까지의 조건을 위한 대용 표지자로서 작용한다.
본원에서 "대용 표지자"란, 질환 또는 질병의 부재 또는 존재와 관련되거나 질환 또는 질병의 진행과 관련된 (예를 들어, 종양의 존재 또는 부재와 관련된) 객관적인 생화학적 마커이다. 그러한 마커의 존재 또는 양은 질병의 원인에는 독립적이다. 따라서, 이들 마커는 질병 상태 또는 질환을 경감시키는데 특정 처치 경로가 유효한지를 나타낸다. 대용 표지자는 질병 상태 또는 질환의 존재 또는 정도가 표준 방법론으로는 검정하기 어려운 경우(예를 들어, 초기 단계 종양), 또는 질병의 진행에 대한 검정이 잠재적으로 위험한 임상적 종점에 도달하기 전에 요구되는 경우에 특히 유용하다(예를 들어, 심근경색증 또는 충분히 진행된 AIDS의 바람직하지 않은 임상적 출현에 앞서, 심혈관 질병의 검정이 대용 표지자로서 콜레스테롤 수준을 이용하여 잘 수행되고, HIV 감염 여부의 분석이 대용 표지자로서 HIV RNA 수준을 이용하여 잘 수행된다). 종래 기술에서 대용 표지자의 사용예는 참고문헌[Koomen et al., (2000) J. Mass. Spectrom. 35:258-264; and James (1994) AIDS Treatment News Archive 209]에 있다.
또한, 본 발명의 PCIP 분자는 약물동력학적 마커로서 유용하다. 본원에서 "약물동력학적 마커"란 약물 효과와 특이적으로 관련된 객관적인 생화학적 마커이다. 약물동력학적 마커의 존재 또는 양은 약물이 투여되는 질병 상태 또는 질환과는 관련되지 않는다; 따라서, 마커의 존재 또는 양은 환자내에서 약물의 존재 또는 활성을 암시한다. 예를 들어, 약물동력학적 마커는, 약물의 수준과 관련하여 조직내에서 마커가 발현 또는 전사되거나 비발현 또는 비전사되므로, 생물학적 조직내에서의 약물의 농도를 암시할 수 있다. 이러한 방식으로, 약물의 분포 또는 흡수가 약물동력학적 마커에 의해 관찰될 수 있다. 유사하게, 약물동력학적 마커의 존재 또는 양은 약물의 대사 생성물의 존재 또는 양과 관련될 수 있으며, 그리하여 마커의 존재 또는 양은 생체내에서의 약물의 상대적 붕괴율을 암시한다. 약물동력학적 마커는 약물 효과의 검출 민감도를, 특히 약물이 소량으로 투여된 경우에 증가시키는데 특히 유용하다. 비록 소량의 약물이라도 수회의 마커(예를 들어 PCIP 마커) 전사 또는 발현을 활성시키기에 충분할 수 있으므로, 증폭된 마커는 약물 자체 보다 즉시 검출될 수 있는 양이 될 수 있다. 또한, 마커는 자체의 성질에 기인하여 보다 용이하게 검출 될 수 있다; 예를 들어, 본원에 설명된 방법을 이용하여, 항-PCIP 항체가 PCIP 단백질 마커에 대한 면역 기초 검출 시스템에 이용될 수 있거나, PCIP 특이적 방사능 표지된 프로브가 PCIP mRNA 마커를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 게다가, 약물동력학적 마커의 사용은 가능한 직접적인 관찰 범위를 초과하는 약물 처치에 기인하는 위험에 대하여 메카니즘에 기초한 예측을 제공한다. 종래 약물동력학적 마커의 사용예는 참고문헌[Matsuda et al. US 6,033,862; Hattis et al. (1991) Env. Health Perspect. 90:229-238; Schentag (1999) Am. J.Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S21-S24; 및 Nicolau (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3:S16-S20]에 있다.
또한, 본 발명의 PCIP 분자는 약리유전학적 마커로서 유용하다. 본원에서 "약리유전학적 마커"란 환자에서의 특이적인 임상적 약물 반응 또는 감수성과 관련되는 객관적인 생화학적 마커이다[참고문헌: 예를 들어, McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35(12):1650-1652]. 약리유전학적 마커의 존재 또는 양은 약물을 투여하기 전에 특정 약물 또는 약물류에 대한 환자의 예측되는 반응과 관련된다. 환자내의 하나 이상의 약리유전학적 마커의 존재 또는 양을 검정하여, 환자에게 가장 적합하거나 보다 크게 성공할 것으로 예측되는 약물 치료가 선택될 수 있다. 예를 들어, 환자내의 특정 종양 마커용으로 RNA 또는 단백질(예를 들어, PCIP 단백질 또는 RNA)의 존재 또는 양에 기초하여, 환자에게 존재할 수 있는 특정 종양의 처치에 최적화된 처치 약물 또는 경로가 선택될 수 있다. 유사하게, PCIP DNA내에서의 특이 서열 변이의 존재 또는 부재는 PCIP 약물 반응과 관련될 수 있다. 따라서, 약리유전학적 마커의 사용은 처방약을 투여할 필요없이 각 환자에게 가장 적합한 치료를 적용할 수 있게 한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명될 것이며, 이것은 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌의 내용, 도면 및 서열은 본원에 참고내용으로 포함되었다.
실시예
하기 재료 및 방법이 실시예에 사용되었다.
균주, 플라스미드, 베이트 cDNA, 및 일반 미생물학적 기술
본 실험에 사용된 기본 효모 균주(HF7c, Y187) 베이트(pGBT9) 및 피쉬(fish)(pACT2) 플라스미드는 클론테크(Palo Alto, CA)사로부터 구입하였다. 래트 Kv4.3, Kv4.2, 및 Kv1.1을 인코딩 하는 cDNA는 웨쓰-아예르스트(Wyeth-Ayerst) 리서치(865 Ridge Rd., Monmouth Junction, NJ 08852)로부터 제공받았다. L-류신, L-트립토판 및 L-히스티딘이 결핍된 합성 완전 배지를 포함하는 표준 효모 배지를 준비하고, 효모 유전자 조작을 참고문헌[Sherman (1991) Meth. Enzymol. 194:3-21]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 효모 형질전환을 표준 프로토콜[Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1425; Ito et al (1983) J. Bacteriol. 153:163-168]을 이용하여 수행하였다. 플라스미드 DNA를 표준 방법[Hoffman and Winston (1987) Gene 57:267-272]에 의해 효모 균주으로부터 단리시켰다.
베이트 및 효모 균주 구성
rKv4.3의 최초 180개 아미노산[참고문헌: Serdio P. et al. (1996) J. Neurophys 75: 2174-2179]을 PCR로 증폭시켜, 프레임적으로 pGBT9내로 클로닝시켜 플라스미드 pFWA2(이하 "베이트")를 수득하였다. 이러한 베이트를 2-하이브리드 스크리닝 균주 HF7c내로 형질전환시키고, 발현 및 자가-활성화에 대하여 시험하였다. 이러한 베이트를 웨스턴 블롯에 의한 발현에 대하여 동정하였다. rKv4.3 베이트는 10mM의 3-아미노-1,2,3-트리아졸(3-AT)의 존재하에서 자가-활성화하지 않았다.
라이브러리 구성
래트 중뇌 조직을 웨쓰-아예르스트 리서치(Monmouth Junction, NJ)로부터 제공받았다. 전체 세포질 RNA를 표준 기술[참고문헌: Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Clonin: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]을 이용하여 조직으로부터 추출하였다. 뉴잉글렌드 바이오랩(Beverly, MA)로부터 구입된 폴리-A 스핀 mRNA 단리 키트를 이용하여 mRNA를 준비하였다. 스트라타젠(La Jolla, CA)로부터 구입한 cDNA 합성 키트를 이용하여 mRNA 샘플로부터 cDNA를 합성하고, pACT2' EcoRI 및 XhoI 위치로 결찰시켜서, 2-하이브리드 라이브러리를 생성시켰다.
2-하이브리드 스크리닝
필수적으로 참고문헌[Bartel, P. et al. 91993) "Using the Two-Hybrid Systemto Detect Polypeptide-Polypeptide Interactions" in Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, Hartley, D.A. ed. Oxford University Press, Oxford, pp. 153-179]에 기술된 바와 같이, rkv4.3 베이트-래트 중뇌 라이브러리의 베이트-라이브러리 쌍으로 2-하이브리드 스크린을 수행하였다. 필수적으로 참고문헌[Brill et al. (1994) Mol. Biol. Cell. 5:297-312]에 설명된 바와 같이, 필터 디스크 베타-갈락토시다제(beta-gal) 검정을 수행하였다. 리포터 유전자 활성(히스 및 베타-갈락토시다제) 모두에 대하여 포지티브인 클론을 기록하고, 피쉬 플라스미드를 효모로부터 단리시켜, 대장균 균주 KC8내로 형질전환시키고, DNA 플라스미드를 정제하고, 수득된 플라스미드를 종래 방법[Sanger F. et al.(1997) PNAS, 74:5463-67]에 의해 서열분석하였다.
특이성 시험
포지티브 인터랙터 클론의 결합 특이성 시험을 하였고, 여기에서 이들은 참고문헌[Fineley R.L. Jr. et al. (1994) PNAS, 91(26):12980-12984]에 설명된 메이팅(mating) 계획에 의해 관련된 및 비관련된 베이트의 패널에 노출된다. 요약하면, 포지티브 피쉬 플라스미드를 Y187내로 형질전환시키고, 베이트의 패널을 HF7c내로 형질전환시켰다. 형질전환된 피쉬 및 베이트 세포를 선택 배지 플레이트 상에서 줄무늬로 스트리킹하고, YPAD 플레이트상에 결합시키고, 리포터 유전자 활성에 대하여 시험하였다.
분석
PCIP 뉴클레오티드를 BLASTN 1.4.8MP 프로그램[Altschul et al. (1990) Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215:403-410]으로 핵산 히트(hit)에 대하여 분석하였다. PCIP 단백질을 BLASTN 1.4.9MP 프로그램으로 폴리펩티드 히트에 대하여 분석하였다.
전기생리학 방법
포유류 생체내 연구
HEK 293 및 CHO 세포를 일시적 트랜스펙션시킨 후에 기록을 위해 1-3일 동안 사용하였다. 전체 세포 전류를 녹색 형광으로 동정되는 GFP를 발현시키는 세포로부터 기록하였다. 필라멘트화 붕규소유리로부터 인출된 전극(Sutter Instrument Co. Novato, CA)을 3-5 ㏁의 초기 저항을 부여하였다. 기가실(gigaseal) 및 파열된 전체 세포 구성의 액세스 후, 저항은 10 ㏁ 미만이었다. 전체 세포 배쓰 용액은 하기 최종 농도(mM)를 갖는 10X Hank 균형된 염 용액으로부터 제조하였다: 138 NaCl, 5.4 KCl, 1.3 MgCl2, 1.3 CaCl2, 5.5 D-Glukos 및 10 HEPES, pH 7.4. 세포내 전극 용액은 (mM 단위) 140 KCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.5 MgCl2, pH 7.3로 구성된다. 모든 화학물질은 시그마(St. Louis, MO)사 또는 피셔 사이언티픽(Houston, TX)사로부터 구입하였다. 막 전류는 EPC9 패치-클램프 증폭기(HEKA, Germany)를 이용하여 기록하였다. 데이타를 매트랩(Natick, Ma)을 이용하여 분석하였고, 필요한 경우 누설을 공제하였다. 모든 실험을 실온에서 수행하였다.
제노푸스 난모세포 연구
개구리를 2회 이상 수술하고, 수술은 잘 정립된 기술로 수행하였다. 전날 채취된 단계 Ⅳ의 제노푸스 난모세포에 총 cRNA(1-10 ng)을 주사하였다. 제조푸스 난모세포를 18℃에서 (젠타마이신 50㎍/ml)에 더하여 96 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 5 HEPES를 함유하는 pH 7.6의 ND96내에서 배양하였다. 제노푸스 난모세포를 주사후 3-7일 동안 연구하였다. 2개 전극 전압 클램프 기록을 터보텍 03 클램프 증폭기(ALA Scientific Instruments, Westbury, NY)를 사용하여 ND96 용액내에서 수행하였다. 양 전극을 3M KCl로 충전하고, 전극 저항을 0.2-1 ㏁ 정도로 유지시켰다. 전류 신호를 PC(Gateway, CA)로 전달되기 전에 펄스 소프트웨어(HEKA, Germany)를 사용하여 1000 Hz에서 여과하였다.
실시예 1: 래트 PCIP cDNA의 동정
Kv4.3 유전자 코딩 서열(초기 180개 아미노산의 코딩을 위한)을 PCR로 증폭시키고, pGBT9내로 클로닝하여 GAL4 DNA-결합 도메인-Kv4.3(1-180) 유전자 융합체(플라스미드 pFWA2)를 생성시켰다. HF7c를 이 구성물질로 형질전환시켰다. 수득된 균주를 10mm 3-AT의 존재하에 L-트립토판 및 L-히스티딘이 결핍된 합성 완전 배지상에서가 아니라 L-트립토판이 결핍된 합성 완전 배지상에서 성장시켰고, 이것은 {GAL4 DNA-결합 도메인}-{vKv4.3(1-180)} 유전자 융합체가 10mM 3-AT에 의해 허용되는 임계값보다 큰 내인성 전사 활성화 활성을 갖지 못한다는 것을 입증한다.
이 실시예에서, 효모 2-하이브리드 검정을 수행하였고, 여기에서 {GAL4 DNA-결합 도메인}-{rKv4.3(1-180)} 유전자 융합체를 함유하는 플라스미드를 상기 효모 2-하이브리드 스크리닝 균주 HF7c내로 도입시켰다. 그 후, HF7c를 래트 중뇌 2-하이브리드 라이브러리로 형질전환시켰다. 약 6백만 개의 형질전환체(transformant)를 수득하고 선택 배지내에 플레이팅시켰다. 선택 배지내에서 성장하고 베타-갈락토시다제 리포터 유전자를 발현시키는 콜로니를 추가로 특정하여 재형질전환시키고 특이성 검정을 수행하였다. 재형질전환 및 특이성 검정으로 Kv4.3 폴리펩티드에 결합될 수 있는 3개의 PCIP 클론(래트 1v, 8t 및 9qm)을 수득하였다.
래트 1v 유전자의 전장 서열, 및 8t 및 9qm 유전자의 부분 서열을 하기와 같이 유도하였다. 부분 래트 PCIP 서열을 사용하여 프로브를 제조하고, 이를 예를 들어 래트 중뇌 cDNA 라이브러리의 스크린에 이용하였다. 표준 기술을 이용하여 포지티브 클론을 동정하고, 증폭시키고, 서열분석하여 전장 서열을 수득하였다. 또한, 현존 래트 PCIP cDNA 말단을 고속 증폭시켜(예를 들어 Gibco, BRL에 의한 5'RACE를 이용하여) 전사체의 5' 말단을 완성하였다.
실시예 2: 인간 1v cDNA의 동정
인간 1v 핵산 분자를 수득하기 위하여, 인간 해마로부터 제조된 cDNA 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)를 하기와 같은 덜 엄격한 조건하에 스크리닝하였다: 클론테크 익스프레스 Hyb 용액내에서 42℃에서 4시간 동안 예비하이브리드화하고, 42℃에서 밤새 하이브리드화시켰다. 사용된 프로브는32P dCTP로 표지된 래트 서열 중 뉴클레오티드 49-711을 포함하는 PCR 생성된 단편이다. 필터를 55℃에서 2XSSC/0.1% SDS 중에서 6회 세척하였다. 동일한 조건을 포지티브 단리체의 제 2스크리닝에 사용하였다. 그렇게 수득된 클론을 ABI 자동 DNA 서열분석 시스템을 이용하여 서열분석하고, SEQ ID NO:3에 나타난 래트 서열뿐만 아니라 진뱅크 데이타베이스로부터의 공지된 서열과 비교하였다. 라이브러리 스크린으로부터의 최장 클론을 후속하여 서열을 확인하기 위하여 pBS-KS+(Stratagene, La Jolla, CA)내로 서브클로닝(subclone)시켰다. 515개 염기쌍 클론을 결정하여 1v 유전자의 인간 상동체를 나타내고, 이들은 5' UTR의 211개 염기쌍 및 304개 염기쌍 코딩 영역을 포함한다. 전장 cDNA를 생성하기 위하여, 제조자(Clontech Advantage PCR kit)의 지시에 따라 3' RACE를 사용하였다.
실시예 3: 1v 스플라이스 변이체의 단리 및 특성화
SEQ ID NO:5에 나타난 마우스 1v 및 SEQ ID NO:7에 나타난 래트 1vl 스플라이스 변이체를 실시예 1에 설명된 2-하이브리드 검정을 이용하여 단리시켰다. SEQID NO:7에 나타난 마우스 1 vl 스플라이스 변이체를 마우스 뇌 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 단리시키고, SEQ ID NO:11에 나타난 래트 1v 스플라이스 변이체를 BLAST 검색을 이용하여 단리시켰다.
실시예 4: 9Q 및 다른 PCIP의 단리 및 동정
래트 9ql(SEQ ID NO:15)를 데이타베이스 마이닝에 의해 단리시키고, 래트 9qm(SEQ ID NO:21)을 2-하이브리드 검정에 의해 단리시키고, 래트 9qc(SEQ ID NO:27)을 데이타베이스 마이닝으로 동정하였다. 인간 9ql(SEQ ID NO:13), 및 인간 9qs(SEQ ID NO:23)을 실시예 2에 설명된 바와 같이 동정하였다. 마우스 9ql(SEQ ID NO:17), 원숭이 9qs(SEQ ID NO:25), 인간 p193(SEQ ID NO:39), 래트 p19(SEQ ID NO:33), 및 마우스 p19(SEQ ID NO:35)을 데이타베이스 마이닝으로 동정하였다. 래트 8t(SEQ ID NO:29)를 2-하이브리드 검정을 이용하여 동정하였다. W28559(SEQ ID NO:37)의 서열을 데이타베이스 마이닝 및 진뱅크 검색 번호 AI352454로 식별된 EST의 서열분석에 의해 동정하였다. 단백질 서열은 1v, 9ql 및 p19와 강한 상동성을 갖는 41개 아미노산 영역을 포함하는 것으로 발견되었다. 그러나, 이러한 상동성 영역의 하류에서는 서열이 PCIP 패밀리의 것으로부터 이탈하였다. 이 서열은 PCIP 패밀리 구성원에서 발견되는 유사한 도메인에 상동성인 41개 아미노산 도메인을 갖는 유전자를 나타낼 수 있다.
인간 게놈 9q 서열(SEQ ID NO:46 및 47)은 인간 9qm cDNA의 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 이용하여 BAC 게놈 DNA 라이브러리(Reasearch Genetics)를 스크리닝하여 단리시켰다. 2개의 포지티브 클론을 동정하고(448O2 및 721I17), 서열분석하였다.
실시예 5: 래트 조직내에서의 1V, 8T 및 9Q mRNA의 발현
래트 및 마우스 복수 조직 노던 블롯(Clontech)을, 래트 1v 서열(뉴클레오티드 35-124; SEQ ID NO:3)의 5'-비번역 및 5'-코딩 영역을 지향하는 (이 프로브는 래트 1v 및 1vl에 특이적임), 8t 서열(뉴클레오티드 1-88; SEQ ID NO:29)의 5' 코팅 영역을 지향하는 (이 프로브는 8t에 대하여 특이적임), 또는 래트 9qm 서열(뉴클레오티드 1-195; SEQ ID NO:21)의 5' 말단을 지향하는 (이 프로브는 8t를 제외하고, 모든 9q 이소폼에 대하여 특이적임) [32P]-표지된 cDNA 프로브로 탐침하였다. 표준 기술을 사용하여 블롯을 하이브리드시켰다. 래트 1v 프로브와 하이브리드된 노던 블론은 뇌 RNA를 함유하는 레인내에서만 2.3kb에서 단일 밴드를 나타내었고, 이것은 1v 발현이 뇌 특이적임을 암시한다. 래트 8t 프로브로 탐침된 노던 블롯은 2.4kb에서 주된 밴드를 나타내었다. 래트 8t 밴드는 심장 RNA를 함유하는 레인내에서 가장 강하고, 또한 뇌 RNA를 함유하는 레인내에서 보다 약한 밴드가 존재한다. 9q cDNA 프로브로 하이브리드된 노던 블롯은 뇌 및 심장에서의 현저한 발현과 함께 2.5kb에서 주된 밴드를 나타내고, 4kb 이상에서 소형 밴드를 나타낸다. 소형 밴드는 불완전하게 슬라이싱되거나 프로세싱된 9q mRNA를 나타낸다. 노던 블롯으로부터의 결과는 p19가 심장에서 현저히 발현됨을 추가로 암시한다.
실시예 6: 뇌에서의 1V, 8T 및 9Q의 발현
뇌에서의 래트 1v 및 8t/9q의 발현은 [35S]-표지된 cRNA 프로브 및참고문헌[Rhodes et al. (1996) J. Neurosci., 16:4846-4860]에 설명된 것과 동일한 하이브리드화 절차를 이용하는 생체내 하이브리드화 조직화학(ISHH)으로 관찰하였다. cRNA 프로브를 제조하기 위한 주형은 표준 PCR 방법으로 생성시켰다. 요약하면, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표적 cDNA의 3'- 또는 5'-비번역 영역의 단편을 증폭시키고, 또한 T7 및 T3 중합효소에 대한 프로모터 인식 서열을 부가하도록 설계하였다. 그리하여, 1v mRNA의 3'-비번역 영역을 지향하는 300개 뉴클레오티드 프로브를 생성하기 위하여, 하기 프라이머를 사용하였다:
5-TAATACGACTCACTATAGGGACTGGCCATCCTGCTCTCAG-3(T7, 정방향, 센스; SEQ ID NO:42)
5-ATTAACCCTCACTAAAGGGACACTACTGTTTAAGCTCAAG-3(T3, 역방향, 안티센스; SEQ ID NO:43). 밑줄 친 염기는 T7 및 T3 프로모터 서열에 대응한다. 8t 및 9q mRNA에 의해 공유되는 3'-비번역 서열의 325 bp 영역을 지향하는 프로브를 생성시키기 위하여, 하기 프라이머를 사용하였다:
5-TAATACGACTCACTATTAGGGCACCTCCCCTCCGGCTGTTC-3(T7, 정방향, 센스; SEQ ID NO:44)
5-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGAGCAGCAGCATGGCAGGGT-3(T3, 역방향, 안티센스; SEQ ID NO:45).
1v 또는 8t/9q mRNA 발현을 ISHH 국부화하기 위하여 처리된 래트 뇌 조직 절편의 자가방사선상은 1v mRNA가 교세포 또는 내피세포에 반대로 뉴런의 표지화와 일치하는 패턴으로 뇌내에서 폭 넓게 발현됨을 나타낸다. 1v mRNA는 피질, 해면및 선조 중간뉴런, 시상의 그물핵, 안쪽 고삐, 및 소뇌 과립 세포내에서 크게 발현된다. 1v mRNA은 흑색질 및 상구(superior colliculus)을 포함하는 중뇌 핵 내에서, 기타 여러 시상 핵내에서, 그리고 기저 전뇌의 중간 중격 및 대각섬유줄 핵내에서 중간 정도로 발현된다.
8t 및 9q의 발현을 분석하기 위하여 사용된 프로브는 8t 및 9q mRNA에서와 동일한 3-비번역 영역 중에 하이브리드되므로, 이 프로브는 복합 이미지를 생성시키고, 이것은 8t/9q mRNA가 상기에 서술된 바와 같이 1v에 대한 부분과 부분적으로 중첩되는 패턴으로 뇌내에서 폭 넓게 발현됨을 나타낸다. 그러나, 8t/9q mRNA는 선조체, 해마형성체, 소뇌 과립 세포, 및 신피질내에서 크게 발현된다. 8t/9q mRNA는 중뇌, 시상 및 뇌줄기내에서 중간 정도로 발현된다. 이들 중 많은 영역에서, 8t/9q mRNA가 주세포에 더하여 중간뉴런에 집중되는 것으로 보이며, 모든 영역에서 8t/9q 발현이 교세포에 나란히 뉴런내에 집중되는 것으로 보인다.
단일- 및 이중-표지 면역조직화학은, PCIP 및 Kv4 폴리펩티드가 많은 세포형 및 뇌 영역내에서 정확히 공동국부화(colocalization)하고 PCIP 및 Kv4 mRNA가 공동발현(coexpression)되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 9qm은 해마 과립 및 피라밋 세포의 몸통 및 가지돌기내의 Kv4.2, 중간 고삐핵 및 소뇌 바구니 세포내의 뉴런과 공동국부화되는 반면, 1v는 뒤색대(posterior cingulate) 피질의 Ⅱ층 뉴런내에서, 해면 중간뉴런내에서 그리고 소뇌 과립 세포의 서브셋내에서 Kv4.3과 공동으로 위치한다. 면역침전 검정은, 1v 및 9qm이 래트 뇌막 내의 Kv4 α-서브유닛과 공동결합(coassociation)됨을 나타낸다.
실시예 7: COS 및 CHO 세포내의 PCIP 및 Kv4 채널의 공동결합
C0S1 및 CHO 세포를 필수적으로 제조자(Boehringer Mannheim)에 의해 설명된 바와 같은 절차에 더하여 리포펙타민을 이용하여 Kv4.2 또는 Kv4.3과 함께 또는 단독으로 개개의 PCIP(KChIP1, KChIP2, KChIP3)에 의해 일과성 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간이 지나고, 세포를 세척하고, 고정시키고, 상기와 같이 면역형광 가시화를 위해 처리하였다(Bekele-Arcuri et al. (1996) Neuropharmacology, 35:851-865). Kv4 채널 또는 PCIP 단백질에 대한 친화성-정제된 토끼 폴리클로날 또는 마우스 모노클로날 항체를 표적 단백질의 면역형광 검출에 이용하였다.
단독으로 발현되는 경우, 세포질 단백질에 대하여 기대되는 바와 같이, PCIP는 COS-1 및 CHO 세포의 세포질에 걸쳐 확산하여 분포한다. 대조적으로, 단독으로 발현되는 경우, Kv4.2 및 Kv4.3 폴리펩티드는 핵주위 ER 및 골지 구획내에 집중되고, 몇몇 면역반응력은 세포의 외부 자투리에 집중된다. PCIP가 Kv4 α-서브유닛과 공동발현되는 경우, 특성적 PCIP 확산 분포가 극적으로 변하여 PCIP가 정확하게 Kv4 α-서브유닛과 공동발현한다. PCIP의 이러한 재분포는 이들이 Kv1.4 α-서브유닛과 공동발현하는 경우에는 일어나지 않으며, 이것은 변경된 PCIP 국부화가 과발현의 결과가 아니라는 것과 이들 PCIP가 Kv4-패밀리 α-서브유닛과 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
PCIP 및 Kv4 폴리펩티드가 긴밀히 결합되고 공동-트랜스펙션 된 세포내에 단순히 공동국부화하는 것이 아님을 입증하기 위하여, 상기 PCIP 및 채널-특이적 항체를 이용하여 상호 면역침전 검정을 수행하였다. 코트랜스펙션된 세포로부터 준비된 용해질로부터 KChIP1, KChIP2 및 KChIP3 단백질을 면역침전시킬 수 있는 항-Kv4.2 및 항-Kv4.3 항체의 능력 및 이러한 동일한 용해질로부터 Kv4.2 및 Kv4.3 α-서브유닛을 면역침전시킬 수 있는 항-PCIP 항체의 능력에 의해 입증되는 바와 같이, 모든 3개의 PCIP 폴리펩티드는 코트랜스펙션된 세포에서 Kv4 α-서브유닛과 공동결합되어 있었다. 세포를 세정제와 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액에서 용해시키고, 본질적으로 공지된 바와 같이 면역침전 반응을 위해 준비하였다 (Nakahira et al. (1996) J. Biol. Chem., 271:7084-7089). 면역침전을 나카히라(Nakahira) 등의 문헌[(1996) J. Biol. Chem., 271:7084-7089)] 및 할로우 이.(Harlow E.)와 레인, 디(Lane, D.)의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, c1988]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 면역침전으로부터 생성된 생성물을 SDS-PAGE에 의해 크기 분별하고, 표준 과정을 사용하여 니트로셀룰로오스 필터로 옮겼다.
Kv4 채널의 세포질 N-말단이 PCIP와 상호작용을 위해 충분한지 확인하기 위해, KChIP1 또는 KChIP2를 전체 219개 아미노산 세포질 C-말단 테일(tail)이 결여된 Kv4.3 돌연변이체(Kv4.3ΔC)와 공동발현시켰다. 일과성 트랜스펙션된 COS-1 세포에 있어서, Kv4.3ΔC 돌연변이체를 핵주위 ER 및 골지내에서 광범위하게 트랩핑(trapping)하였다: 세포의 외부 가장자리에서 염색(staining)은 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, KChIP1와 KChIP2는 코트랜스펙션된 세포에서 Kv4.3ΔC와 정확하게 공동국부화되었고, 더욱이, Kv4.3ΔC는 PCIP 항체에 의해 효율적으로 공동면역침전되었는데, 이는 이러한 PCIP와 Kv4 α-서브유닛의 상호작용이 채널의 세포질 C-말단을 필요로 하지 않음을 나타낸다.
실시예 8: 천연 조직에서의 PCIP와 Kv4 채널의 공동결합
PCIP가 천연 조직에서 Kv4와 공동국부화되고 이와 공동결합되는지 결정하기 위해, Kv4- 및 PCIP-특이적 항체를 래트 뇌막의 단일-표지 및 이중-표지 면역조직화학적 분석 및 상호 공동면역침전 분석을 위해 사용하였다. 래트 뇌 절편의 면역조직화학적 염색은 KChIP1과 KChIP2가 영역 및 세포 타입 특이적 방식으로 Kv4.2와 Kv4.3과 공동국부화됨을 나타내었다. 예를 들어, KChIP1은 해마 중간뉴런, 소뇌 과립 세포 및 소뇌 사구체(glomeruli)인 소뇌 바구니의 수상돌기와 골지 세포 사이의 특수 시냅스 배열 및 이끼섬유 말단에서 Kv4.3과 공동국부화되었다. KChIP2는 치상회내의 과립 세포의 수상돌기, 해마 및 신피질 피라미드 세포의 선단 및 기저 수상돌기, 및 선조체 및 상구를 포함하는 수 개의 피질하 구조체에서 Kv4.3 및 Kv4.2와 공동국부화되었다. 전체 래트 뇌로부터 준비된 시냅스막을 사용하여 수행된 공동면역침전 분석 결과, PCIP (KChIP 1, 2 및 3)는 뇌 K+채널 복합체에서 Kv4.2 및 Kv4.3과 긴밀하게 결합되어 있는 것으로 나타났다. 항-PCIP 항체는 뇌막으로부터 Kv4.2 및 Kv4.3을 면역침전시켰고, 항-Kv4.2 및 Kv4.3 항체는 PCIP를 면역침전시켰다. PCIP 폴리펩티드는 어느 하나도 항-Kv2.1 항체에 의해 면역침전되지 않았는데, 이는 이러한 PCIP와 뇌 Kv 채널의 결합이 Kv4 α-서브유닛에 대해 특이적일 수 있음을 나타낸다. 종합해보면, 이러한 해부학적 및 생화학적 분석은 이러한 PCIP가 천연 Kv4 채널 복합체의 구성 성분임을 나타낸다.
실시예 9: 칼슘 결합 단백질인 PCIP
KChIP 1, 2 및 3이 Ca2+와 결합하는지 결정하기 위해, GST 융합 단백질을 각각의 PCIP에 대해 생성시키고, GST-PCIP 단백질 뿐만 아니라 GST로부터 효소 절단된 재조합 PCIP 폴리펩티드가45Ca2+와 결합할 수 있는 능력을 필터 중첩(overlay) 검정을 사용하여 조사하였다 (참조: Kobayashi et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 189(1):511-7). 관련되지 않은 GST 융합 단백질이 아닌 모든 3개의 PCIP 폴리펩티드는 이러한 검정에서 강력한45Ca2+결합을 나타낸다. 더욱이, 모든 3개의 PCIP 폴리펩티드는 SDS-PAGE 상에서 Ca2+의존성 이동 변위를 나타내며, 이는 이러한 패밀리의 그 밖의 구성원들과 같이 KChIP 1, 2 및 3이 실제로 Ca2+결합성 단백질임을 나타낸다 (Kobuyashi et al. (1993) supra; Buxbaum et al. Nef(1996). Neuron-specific calcium sensors (the NCS-1 subfamily). In: Celio MR (ed) Guidebook to the calcium-binding proteins. Oxford University Press, New York, pp94-98; Buxbaum J.D., et al. (1998) Nature Med. 4(10):1177-81).
실시예 10: PCIP의 전기생리학적 특징화
KChIP1 (1v), KChIP2 (9ql), 및 KChIP3 (p19)와 같은 PCIP가 뇌에서 Kv4 α-서브유닛과 공동국부화되고 공동결합되기 때문에, 또 다른 중요한 문제는 이러한 PCIP가 Kv4 채널의 전도 특성을 변경시키는지 결정하는 것이었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, Kv4.2 및 Kv4.3을 단독으로 및 개개의 PCIP와 조합하여 발현시켰다. CHO 세포를 제조업자(Boehringer Mannheim, Inc.)에 의해 기술된 DOTAP 리포펙션 방법을 사용하여 cDNA로 일과성 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 관심있는 유전자와 함께 향상된 GFP를 코트랜스펙션시킨 후 세포가 녹색의 GFP 형광을 함유하는지 결정함으로써 확인하였다. CHO 세포내의 전류를 패치-클램프 기법을 사용하여 측정하였다 (Hamill et al. 1981. Pfluegers Arch. 391:85-100).
CHO 세포에서의 래트 Kv4.2 α-서브유닛의 일과성 트랜스펙션은 전형적인 A-타입 K+ 전도성의 발현을 생성시켰다. Kv4.2와 KChIP1의 공동발현은 채널에 대한 KChIP1의 몇몇 현저한 효과를 나타내었다 (도 41 및 표 1). 첫째로, Kv4.2 전류의 크기는 KChIP1의 존재하에서 약 7.5배 증가하였다 (Kv4.2 단독의 크기 = 0.60+/- 0.096 nA/세포; Kv4.2+KChIP1 = 4.5 +/- 0.55 nA/세포). 세포 표면막 면적의 측정치를 세포 커패시턴스에 대해 보정함으로써 전류 밀도로 변환시키는 경우, Kv4.2 전류 밀도는 KChIP1의 공동발현으로 12배 증가하였는데 (Kv4.2 단독 = 25.5 +/- 3.2 pA/pF; Kv4.2 + KChIP1 = 306.9 +/- 57.9 pA/pF), 이는 KChIP가 Kv4.2 표면 발현을 촉진시키고/거나 안정화시킴을 나타낸다. 전류 밀도의 이러한 증가와 함께, Kv4.2 전류의 활성화에 대한 임계값의 현저한 좌향 변위가 Kv4.2 및 KChIP1을 발현시키는 세포에서 관찰되었다 (Kv4.2 단독에 대한 활성화 V1/2 = 20.8 +/- 7.0mV, Kv4.2 + KChIP1 = -12.1+/-1.4mV). 마지막으로, Kv4.2 비활성화의 속도론은 Kv4.2가 KChIP1과 공동발현되는 경우 현저하게 늦추어지며 (Kv4.2 단독의 비활성화 시간 상수 = 28.2 +/- 2.6ms; Kv4.2 + KChIP1 = 104.1 +/- 10.4ms), 채널은 Kv4.2 단독을 발현시키는 세포(회복 tau = 272.2 +/- 26.1ms)에 비해 Kv4.2와 KChIP1 둘 모두를 발현시키는 세포(회복 tau = 53.6 +/- 7.6ms)에서 훨씬 더 빨리 비활성화로부터 회복되었다.
KChIP 1, 2 및 3은 독특한 N-말단을 지니지만 C-말단 "코어(core)" 도메인내에서 상당한 아미노산 동일성을 공유한다. 이러한 독특한 N-말단에도 불구하고, Kv4.2 전류 밀도 및 속도론에 대한 KChIP2와 KChIP3의 효과는 KChIP1에 의해 생성된 효과와 현저하게 유사하였다 (표 1). 따라서, 모든 3개의 EF-핸드(hand)를 함유하는 보존된 C-말단 코어 도메인이 Kv4 전류 밀도 및 속도론을 조절하기에 충분한지 확인하기 위해, KChIP1과 KChIP2의 N-말단 절단 돌연변이체를 제조하였다. KChIP1ΔN2-31 및 KChIP2ΔN2-67 돌연변이체는 C-말단 185개 아미노산 코어 서열에 대해 각각 절단된 KChIP1 및 KChIP2 이다. CHO 세포에서의 KChIP1ΔN2-31 또는 KChIP2ΔN2-67과 kv4.2와의 공동발현은 전장 KChIP1 또는 KChIP2에 의해 생성된 효과와 구별할 수 없는 Kv4.2 전류 밀도 및 속도론의 변화를 생성시켰다 (표 1).
이러한 KChIP의 조절 효과가 Kv4 채널에 대해 특이적인지 조사하기 위해, KChIP1을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 Kv1.4와 Kv2.1과 공동발현시켰다. 제노푸스 난모세포에 표준 시험관내 전사 기법 (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press)을 사용하여 제조한 난모세포 당 1 내지 3ng의 cRNA를 주입하였다. 제노푸스 난모세포내의 전류를 2-전극 전압 클램프에 의해 측정하였다. KChIP1은 Kv1.4 또는 Kv2.1 전류에 대한 어떠한 효과도 지니지 않는 것으로 여겨졌으며 (표 2), 이는 이러한 기능적 효과가 Kv4 채널에 대해 특이적일 수 있음을 나타낸다. KChIP 효과에 대한 최종 대조표준으로서 및 Kv4 전류에 대한 KChIP의 효과가 발현 시스템에 비의존적임을 입증하기 위해, 제노푸스 난모세포에서 Kv4.3 및 KChIP mRNA를 발현시킨 후에 상기 속도론적 분석을 반복하였다. 제노푸스 난모세포 시스템에서의 Kv4.3에 대한 KChIP1의 효과는 CHO 세포에서의 Kv4.2에 대한 효과와 현저하게 유사하였다 (표 1).
이러한 KChIP가 Ca2+와 결합하기 때문에, 또 다른 중요한 문제는 Kv4.2 전류에 대한 KChIP1의 효과가 Ca2+ 의존성인지 결정하는 것이다. 이러한 문제는 각각의 KChIP의 EF-핸드 도메인내에서 점 돌연변이를 도입시킴으로써 간접적으로 해결되었다: 하나의 돌연변이체는 최초 2개의 EF 핸드에서 점 돌연변이를 지니며 (D199→A, G104→A, D135→A 및 G140→A) 및 나머지 하나는 모든 3개의 EF 핸드에서 점 돌연변이를 지닌다 (D199→A, G104→A, D135→A, G140→A, D183→A 및 G188→A). 이러한 돌연변이는 EF-핸드 컨센서스내에서 2개의 가장 고도로 보존되는 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다 (도 25: Linse, S and Forsen, S. (1995) Determinants that govern high-affinity Calcium binding. In Means, S. (Ed.)Advances in second messenger and phosphoprotein research. New York, Ravens Press., 30:89-150). COS 세포에서의 이러한 KChIP1 삼중 EF-핸드 돌연변이체와 Kv4.2 또는 Kv4.3과의 공동발현은 이러한 돌연변이체가 공동국부화하고, COS-1 세포에서 Kv4 α-서브유닛과 효율적으로 공동면역침전됨을 나타내었다. 그러나, 이러한 EF-핸드 점 돌연변이는 Kv4.2 속도론에 대한 KChIP1의 효과를 완전히 제거시켰다 (표 1). 종합해보면, 이러한 결과는 KChIP1과 Kv4.2 사이의 결합 상호작용이 Ca2+ 비의존성인 반면, KChIP1에의한 Kv4.2 속도론의 조절은 Ca2+ 의존성이거나 EF-핸드 도메인내에서의 점 돌연변이에 의해 유도된 구조적 변화에 대해 감수성임을 나타낸다.
Kv4 채널에 대한 KchIP의 기능적 효과
전류파라미터 rKv4.2 + 벡터 rKv4.2 + KchIP1 rKv4.2 + KchIP1 ΔN2-31 rKv4.2 + KchIP2 rKv4.2 + KchIP2 ΔN2-67 rKv4.2 + KchIP3 rKv4.3 rKv4.3 +KchIP1
피크전류(50MV에서 nA/세포) 0.60*±0.096 4.5*±0.055 6.0*±1.1 3.3*±0.45 5.8*±1.1 3.5*±0.99 7.7㎂±2.6 18.1㎂*±3.8
피크 전류 밀도(50mV에서 pA/pF) 25.5±3.2 306.9*±57.9 407.2*±104.8 196.6*±26.6 202.6*±27.5 161.7*±21.8 … …
비활성화 시간 상수(ms, 50mV에서) 28.2±2.6 104.1±10.4 129.2±14.2 95.1*±8.3 109.5*±9.6 67.2*±14.1 56.3±6.6 135.0±15.1
비활성화로부터의 회복 시간 상수 272.2 53.6* 98.1* 49.5* 36.1* 126.1* 327.0 34.5*
* 대조표준과 현저하게 상이함
그 밖의 Kv 채널에 대한 KChIP의 기능적 효과
난모세포 난모세포
전류 파라미터 HKv1.4 hKv1.4 + 1v HKv2.1 HKv2.1 + 1v
피크 전류 8.3 6.5 3.7 2.9
(50MV에서㎂/세포) ±2.0 ±0.64 ±0.48 ±0.37
비활성화 시간 상수 53.2 58.2 1.9s 1.7s
(ms, 50mV에서) ±2.8 6.6± ±0.079 0.078
비활성화로부터의 회복 시간 상수(sec, -80mV에서) 1.9 1.6 7.6 7.7
활성화 V1/2(mV) -21.0 -20.9 12.0 12.4
정상 상태 비활성화 V1/2 (mV) -48.1 -47.5 -25.3 -23.9
실시예 11: COS-1 세포에서의 Kv4-α 서브유닛의 표면 발현에 대한 KChIP1의 효과
Kv4 채널의 표면 발현을 향상시킬 수 있는 KChIP1의 능력을 조사하기 위해, Kv4 채널과 PSD-95의 코-클러스터(co-cluster)의 형성을 촉진시킬 수 있는 KChIP1의 능력을 모니터하였다. PSD-95는 복합체의 가시화를 용이하게 하는 데에 사용된다.
Kv4.3과 PSD-95 사이의 상호작용을 촉진시키기 위해, 키메라 Kv4.3 서브유닛 (Kv4.3ch)를 생성시켰으며, 여기서, rKv1.4로부터의 C-말단 10개 아미노산 (SNAKAVETDV, SEQ ID NO:73)이 Kv4.3의 C-말단에 추가되었다. rKv1.4로부터의 C-말단 10개 아미노산을 사용하였는데, 이는 이들이 PSD-95와 결합하며, Kv4.3 C-말단에 융합된 경우 PSD-95와 결합할 수 있는 능력을 Kv4.3 단백질에 부여해주기 때문이다. COS-1에서의 Kv4.3ch의 발현은 Kv4.3ch 폴리펩티드가 세포의 외부 가장자리에서 최소의 검출성 Kv4.3ch 면역반응성을 지니면서 핵주위 세포질에서 트랩핑됨을 나타내었다. Kv4.3ch가 PSD-95와 공동발현된 경우, PSD-95는 핵주위 세포질에서 트랩핑되고, Kv4.3ch와 공동국부화되었다. 그러나, KChIP1이 Kv4.3ch와 PSD-95와 공동발현된 경우, Kv4.3ch, KChIP1 및 PSD-95의 거대한 플라크 유사 표면 코-클러스터가 관찰되었다. 삼중-표지 면역형광은 이러한 표면 클러스터가 모든 3개의 폴리펩티드를 함유함을 확인해주었고, 상호 공동면역침전 분석은 3개의 폴리펩티드가 이러한 표면 클러스터에서 공동결합됨을 나타내었다. 대조 실험은 KChIP1가 PSD-95 단독과 상호작용하지 않으며, 표면 클러스터에서 Kv1.4 및 PSD-95와 공동국부화되지 않음을 나타내었다. 종합해보면, 이러한 데이터는 KChIP1이 Kv4.3 서브유닛을 세포 표면으로 수송하는 것을 촉진시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 12: PCIP 단백질의 특징화
본 실시예에서, PCIP 단백질의 아미노산 서열을 공지된 단백질의 아미노산 서열과 비교하고, 다양한 모티프를 동정하였다.
아미노산 서열이 SEQ ID NO:3에 도시되는 1v 폴리펩티드는 216개 아미노산 잔기를 포함하는 신규한 폴리펩티드이다. 칼슘 결합에 관여하는 것으로 추정되는 도메인 (Linse, S. and Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research 30, Chapter 3, p89-151, edited by Means, AR., Raven Press, Ltd., New York)을 서열 정렬에 의해 동정하였다 (도 21 참조).
아미노산 서열이 SEQ ID NO:30에 도시되는 8t 폴리펩티드는 225개 아미노산 잔기를 포함하는 신규한 폴리펩티드이다. 칼슘 결합에 관여하는 것으로 추정되는 칼슘 결합 도메인 (Linse, S. and Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research 30, Chapter 3, p89-151, edited byMeans, AR., Raven Press, Ltd., New York)을 서열 정렬에 의해 동정하였다 (도 21 참조).
9q 폴리펩티드는 칼슘 결합에 관여하는 것으로 추정되는 칼슘 결합 도메인 (Linse, S. and Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research 30, Chapter 3, p89-151, edited by Means, AR., Raven Press, Ltd., New York)을 포함하는 신규한 폴리펩티드이다 (도 21 참조).
p19 폴리펩티드는 칼슘 결합에 관여하는 것으로 추정되는 칼슘 결합 도메인 (Linse, S. and Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research 30, Chapter 3, p89-151, edited by Means, AR., Raven Press, Ltd., New York)을 포함하는 신규한 폴리펩티드이다 (도 21 참조).
래트 1v1의 누클레오티드 서열의 BLASTN 2.0.7 검색 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403)은 래트 1vl이 래트 cDNA 클론 RMUAH89 (수탁번호 AA849706)와 유사함을 나타내었다. 래트 1 vl 핵산 분자는 누클레오티드 1063 내지 1488에 걸쳐서 래트 cDNA 클론 RMUAH89 (수탁번호 AA849706)와 98% 동일하다.
인간 9ql의 누클레오티드 서열의 BLASTN 2.0.7 검색 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403)은 인간 9ql이 인간 cDNA 클론 1309405 (수탁번호 AA757119)와 유사함을 나타내었다. 인간 9ql 핵산 분자는 누클레오티드 937 내지 1405에 걸쳐서 인간 cDNA 클론 1309405 (수탁번호 AA757119)와 98% 동일하다.
마우스 P19의 누클레오티드 서열의 BLASTN 2.0.7 검색 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403)은 마우스 P19가 Mus 근육 cDNA 클론 MNCb-7005 (수탁번호 AU035979)과 유사함을 나타내었다. 마우스 P19 핵산 분자는 누클레오티드 1 내지 583에 걸쳐서 Mus 근육 cDNA 클론 MNCb-7005 (수탁번호 AU035979)와 98% 동일하다.
실시예 13: 세균 세포에서의 재조합 PCIP 단백질의 발현
본 실시예에서, PCIP는 대장균에서 재조합 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 융합 폴리펩티드가 단리되고 특징화된다. 상세하게는, PCIP를 GST에 융합시키고, 이 융합 폴리펩티드를 대장균, 예를 들어 균주 BI21에서 발현시킨다. BI21에서의 GST-PCIP 융합 단백질의 발현을 IPTG를 사용하여 유도시켰다. 재조합 융합 폴리펩티드를 유도된 BI21 균주의 미정제 세균 용해질로부터 글루타티온 비드상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 세균 용해질로부터 정제된 폴리펩티드의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 사용하여, 생성된 융합 폴리펩티드의 분자량을 결정하였다.
래트 1v와 9ql을 pGEX-6p-2 (Pharmacia)내로 클로닝시켰다. 생성된 재조합 융합 단백질을 대장균에서 발현시키고, 당 분야에 공지된 방법을 수행하여 정제하였다 (참조: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). 정제된 단백질의 동일성을 래트 1v와 9ql의 펩티드 에피토프에 대해 생성시킨 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.
실시예 14: COS 세포에서의 재조합 PCIP 단백질의 발현
COS 세포에서 PCIP 유전자를 발현시키기 위해, pcDNA/Amp 벡터(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)를 사용하였다. 이 벡터는 SV40 복제 기원, 암피실린내성 유전자, 대장균 복제 기원, CMV 프로모터, 폴리링커 영역, 및 SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 순서대로 함유한다. 완전한 PCIP 단백질을 엔코딩하는 DNA 단편 및 단편의 3' 말단에 프레임적으로 융합된 HA 태그 (Wilson et al. (1984) Cell 37:767) 또는 FLAG 태그를 벡터의 폴리링커 영역내로 클로닝함으로써, 재조합 단백질의 발현이 CMV 프로모터의 조절하에 있게 되도록 한다.
플라스미드를 구성하기 위해, PCIP DNA 서열을 2개의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 프라이머는 관심있는 제한 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 PCIP 코딩 서열의 약 20개 누클레오티드를 함유하며; 3' 말단 서열은 관심있는 그 밖의 제한 부위에 대한 상보서열, 번역 종료 코돈, HA 태그 또는 FLAG 태그 및 PCIP 코딩 서열의 최종 20개 누클레오티드를 함유한다. PCR 증폭된 단편 및 pCDNA/Amp 벡터를 적합한 제한 효소를 사용하여 분해하고, 벡터를 CIAP 효소 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 탈인산화시켰다. 바람직하게는, 선택된 2개의 제한 부위는 PCIP 유전자가 올바른 배향으로 삽입되도록 상이하였다. 연결 혼합물을 대장균 세포 (스트라타진 클로닝 시스템즈(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로부터 입수가능한 균주 HB101, DH5a, SURE가 사용될 수 있음) 내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트상에 플레이팅하고, 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 단리시키고, 제한 분석에 의해 올바른 단편의 존재에 대해 조사하였다.
그런 다음, COS 세포를 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침법, DEAE-덱스트란-매개된 트랜스펙션, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션을 사용하여 PCIP-pcDNA/Amp 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시켰다. 숙주 세포를 트랜스펙션시키기 위한 그 밖의 적합한 방법은 샘브룩, 제이. (Sambrook, J.), 프리취, 이. 에프.(Fritsh, E.F.) 및 마니아티스, 티. (Maniatis, T.)의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에서 발견될 수 있다. PCIP 폴리펩티드의 발현은 방사선표지 (NEN(Boston, MA)으로부터 입수가능한35S-메티오닌 또는35S-시스테인이 사용될 수 있음) 및 HA 특이적 모노클로날 항체를 사용하는 면역침전 (Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)에 의해 검출된다. 요약하면, 세포를35S-메티오닌(또는35S-시스테인)으로 8시간 동안 표지시켰다. 그 후, 배지를 수거하고, 세포를 세정제를 사용하여 용해시켰다 (RIPA 완충액, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH 7.5). 세포 용해질 및 배지 둘 모두 HA 특이적 단클론성 항체와 침전되었다. 그 후, 침전된 폴리펩티드를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
대안적으로, PCIP 코딩 서열을 함유하는 DNA를 적합한 제한 부위를 사용하여 pCDNA/Amp 벡터의 폴리링커내로 직접 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 상기 설명된 방식으로 COS 세포내로 트랜스펙션시키고, PCIP 폴리펩티드의 발현을 방사선표지 및 PCIP 특이적 모노클로날 항체를 사용하는 면역침전에 의해 검출하였다.
래트 1v를 포유동물 발현 벡터 pRBG4내로 클로닝하였다. COS 세포내로의 트랜스펙션을 리포펙타민 플러스 (LipofectAmine Plus)(Gibco BRL)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 발현된 1v 단백질을 토끼 또는 마우스에서 1v에 대해 생성시킨 항체를 사용하여 면역세포화학 및/또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다.
실시예 15: 인간 전장 p19의 동정 및 특징화
인간 전장 p19 서열을 RACE PCR을 사용하여 동정하였다. p19(KChIP3라고도 부름)의 서열을 도 16에 도시하였다. 인간 p19의 아미노산 서열은 마우스 p19 유전자(SEQ ID NO:35)와 92% 동일하였다.
인간 p19의 단백질 서열을 사용한 TBLASTN 검색에서 인간 p19가 두 가지 서열, 칼세닐린(Calsenilin)[참조: (1998) Nature Medicine 4: 1177-1181] 및 DREAM[프로디노르핀 및 c-fos 전사의 Ca2+-의존성 조절물질(참조 : Carrion et al. (1999) Nature 398: 80-84)]과 상동성인 것으로 밝혀졌다. 인간 p19는 누클레오티드 레벨에서 칼세닐린과 100% 동일하며(그러나, 공개된 서열에 대해 3'로 연장되어 있다) 누클레오티드 레벨에서 DREAM과 99% 동일하다.
프리세닐린과 함께 동시-국재화되어 전사 인자로서 작용하는 p19(뿐만 아니라 그 밖의 PCIP 패밀리 구성원)의 능력을 노던 블롯, 동일계내 하이브리드화, β-gal 검정, DNA 이동 검정(참조 : Carrion et al. (1999) Nature 398:80) 및 KchIP에 대해 특이적인 항체를 사용하는 DNA 이동 슈퍼쉬프트 검정과 같은 공지된 기술을 사용하여 측정하였다.
PCIP 패밀리 구성원과 프리세닐린과의 관련성을 평가하기에 적합한 다른 검정에는 동시-면역침전법(참조 : Buxbaum et al. (1998) Nature Medicine 4:1177)이 있다.
실시예 16: 원숭이 KChIP4의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 원숭이 KChIP4a(jlkbd352e01t1) 및 대안적으로는 스플라이싱된 원숭이 KChIP4b(jlkbb231c04t1), KChIP4c(jlkxa053c02) 및 KChIP4d (jlkx015b10)를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 공지된 PCIP 패밀리 구성원의 서열을 사용하여 독점 데이터베이스에서 TBLASTN 검색을 통해 4가지 클론 jlkbb231c04t1, jlkbd352e01t1, jlkxa053c02 및 jlkx015b10을 동정하였다. 상기 4가지 원숭이 클론을 입수하여 서열분석하였다.
독점 원숭이 클론 jlkbb231c04t1 및 jlkbd352e01t1의 서열은 본 명세서에서 KChIP4로서 명명되는 추가적인 PCIP 패밀리 구성원의 대안적으로 스플라이싱된 변이체에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 클론 jlkbb231c04t1은 jlkbd352e01t1에 비해 822bp 결실부위를 포함하고 있어서(추정적으로 엑손의 스플라이싱 제거에 기인함), 결과적으로 마지막 EF 핸드 도메인이 상실되어 있다. 클론 jlkbd352e01t1에 있어서, 마지막 EF 핸드 도메인은 보존되어 있고, C-말단은 PCIP 패밀리 구성원 1v, 9ql 및 p19의 C-말단과 고도로 상동성을 가진다. KChIP4, 1v, 9ql 및 p19간의 상동성 C-말단의 전반적인 동일성은 아미노산 레벨에서 71%-80% 범위였다(정렬은 CLUSTALW를 사용하여 수행하였다).
독점 데이터베이스를 검색하기 위한 질의어로서 원숭이 KChIP4a를 사용하여BLASTN 검색함으로써 원숭이 KChIP4c 및 KChIP4d를 발견하였다.
원숭이 KChIP4a cDNA의 누클레오티드 서열 및 KChIP4a 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 23 및 SEQ ID NO:48과 SEQ ID NO:49에 각각 제시하였다.
원숭이 KChIP4b cDNA의 누클레오티드 서열 및 KChIP4b 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 24 및 SEQ ID NO:50과 SEQ ID NO:51에 각각 제시하였다.
원숭이 KChIP4c cDNA의 누클레오티드 서열 및 KChIP4c 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 35 및 SEQ ID NO:69와 SEQ ID NO:70에 각각 제시하였다.
원숭이 KChIP4d cDNA의 누클레오티드 서열 및 KChIP4d 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 36 및 SEQ ID NO:71과 SEQ ID NO:72에 각각 제시하였다.
도 37은 KChIP4a, KChIP4b, KChIP4c 및 KChIP4d의 단백질 서열의 배열을 도시한 것이다.
클론테크(Clontech)로부터 구입한 노던 블롯을 래트 KChIP4의 3'-비번역 영역으로부터의 DNA 단편을 사용하여 프로빙한 노던 블롯 실험에 의해 나타난 바와 같이, 래트 KChIP4는 뇌에서 우세하게 발현되고, 신장에서는 약하게 발현되지만, 심장, 뇌, 비장, 폐, 간, 골격근 또는 고환에서는 발현되지 않았다.
실시예 17: 인간 및 래트 33b07의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 및 인간 33b07을 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 부분 래트 33b07(클론 이름 9o)을 베이트로서 rKv4.3N을 사용하는 상기 기술한 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다. 전장 래트 33b07 클론을 독점 데이터베이스를 마이닝함으로써 동정하였다.
전장 래트 33b07 cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 33b07 폴리페비드의 예측된 아미노산 서열을 도 26 및 SEQ ID NO:52와 SEQ ID NO:53에 각각 제시하였다. 래트 33b07 cDNA는 약 44.7 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 407 아미노산 잔기이다.
래트 33b07은 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.2N에 대한 약한 선호도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 래트 33b07은 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 래트 33b07-Kv4N 상호작용이 특이적임을 가리킨다.
래트 33b07은 노던 블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이 뇌에서 우세하게 발현된다.
또한 인간 33b07 오르톨로그(ortholog)(클론 106d5)를 독점 데이터베이스를 마이닝함으로써 동정하였다. 전장 인간 33b07 cDNA의 누클레오티드 서열 및 인간 33b07 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 27 및 SEQ ID NO:54와 SEQ ID NO:55에 각각 제시하였다. 인간 33b07 cDNA는 약 45.1 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 414 아미노산 잔기이다.
인간 33b07은 아미노산 레벨에서 인간 KIAA0721(GenBank 수탁 번호: AB018264)와 99% 동일하다. 그러나, GenBank 수탁 번호: AB018264는 기능적인 주석을 가지고 있지 않다. 또한 인간 33b07은 고환-특이적 (Y-엔코딩된) 단백질(TSP(Y)), SET 및 누클레오좀 조립 단백질(NAP)과 상동성이다. 인간 33b07은 인간 SET 단백질(GenBank 수탁 번호 Q01105=U51924)과 아미노산 204 내지 337에걸쳐 38% 동일하고 아미노산 334 내지 387에 걸쳐 46% 동일하다.
또한 인간 SET를 HLA-DR 관련 단백질 II(PHAPII)[참조 : Hoppe-Seyler (1994) Biol. Chem. 375:113-126]이라 부르기도 하고 일부 경우에 있어서는 SET-CAN 융합 유전자의 형성을 초래하는 전좌 사건의 결과로서 급성 미분화성 백혈병(AUL)과 연관되어 있다[참조 : Von Lindern M. et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3346-3355]. 또한 SET의 대안적으로 스플라이싱된 형태를 주형 활성 인자-I 알파(TAF)라 부르기도 한다. TAF는 골수성 백혈병유발과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다[참조 : Nagata K. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (10), 4279-4283]. 또한 인간 SET는 포스파타제 2A의 강력한 단백질 억제제이다[참조 : Adachi Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2258-2262]. NAP는 염색질 형성의 조절에 관련될 수 있고 세포 증식의 조절에 기여할 수 있다[참조 : Simon H.U. et al. (1994) Biochem. J. 297, 389-397].
따라서, 33b07은 상기 동정된 단백질들에 대한 이의 상동성에 기인하여 포스파타제, 암유전자(oncogene) 및/또는 염색질 조절물질의 단백질 억제제로서 기능할 수 있다. 단백질 포스파타제 억제제인 SET에 대한 33b07의 상동성이 특히 흥미롭다. 많은 채널, 특히 Kv4 채널(33b07이 연관되어 있는)은 PKC 및 PKA에 의한 인산화에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다[참조 : (1998) J. Neuroscience 18(10): 3521-3528; Am J Physiol 273: H1775-86 (1997)]. 따라서, 33b07은 칼륨 채널의 인산화 상태를 조절함으로써 Kv4 활성을 조절할 수 있다.
실시예 18: 래트 1p의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 1p를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 부분 래트 1p를 베이트로 rKv4.3N을 사용하여 상기 기술한 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다.
부분 길이 래트 1p cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 1p 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 28 및 SEQ ID NO:56과 SEQ ID NO:57에 각각 제시하였다. 래트 1p cDNA는 약 28.6 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 267 아미노산 잔기이다.
래트 1p는 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 대해 약한 선호도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 1p는 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 1p-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 1p는 노던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 뇌에서 우세하게 발현된다.
래트 1p의 아미노산 서열의 100 스코어 및 3 단어 길이[참조 : Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403]를 사용하여 BLASTP 1.4 검색함으로써 래트 1p가 인간 레스틴(Restin, GenBank 수탁 번호 P30622; 세포질 링커 단백질-170 알파-2(CLIP-170)로도 명명됨, M97501))과 동일함을 밝혔다. 래트 1p 단백질은 아미노산 잔기 105 내지 182에 걸쳐 인간 레스틴과 58% 동일하고 아미노산 잔기 115 내지 186에 걸쳐 인간 레스틴과 55% 동일하고 아미노산 잔기 173 내지 246에 걸쳐 인간 레스틴과 22% 동일하고 아미노산 잔기 169 내지 218에 걸쳐 인간 레스틴과 22% 동일하고 아미노산 잔기 217 내지 228에 걸쳐 인간 레스틴과 58% 동일하다.
또한 레스틴은 리드-스턴베르그(Reed-Sternberg) 중간생성물 필라멘트 관련 단백질로도 명명된다. 리드-스턴베르그 세포는 호지킨병(Hodgkin's disease)을 진단하기 위한 종양 세포이다. 이는 레스틴 과발현(overexpression)이 호지킨병의 진행에 있어서 기여 인자일 수 있음[참조 : Bilbe G. et al. (1992) EMBO J. 11:2103-13]을 시사하는 것이고 레스틴은 세포내 소포를 미세소관에 연결시키는 중간생성물 필라멘트 관련 단백질인 것 같다[참조 : Pierre P, et al. (1992) Cell 70 (6), 887-900].
세포골격은 칼륨 채널의 활성[참조 : Honore E, et al. (1992) EMBO J. 11:2465-2471 and Levin G, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:29321-29328] 뿐만 아니라 그 밖의 채널, 예컨대, Ca++채널[참조 : Johnson B.D. et al. (1993) Neuron 10:797-804]; 또는 Na+채널[참조 : Fukuda J. et al. (1981) Nature 294:82-85]의 활성을 조절한다.
따라서, 레스틴 단백질에 대한 이의 상동성에 기초하여, 래트 1p 단백질은 세포골격과 결합할 수 있고 세포골격에 이의 결합을 통해 칼륨 채널, 예컨대, Kv4의 활성을 조절할 수 있다.
실시예 19: 래트 7s의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 7s를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 부분 래트 7s를 베이트로서 rKv4.3N을 사용하여 상기 기술한 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다. 래트 7s는 예컨대, 문헌[참조 : van Hille B. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (10), 7075-7080]에 기술된 인간 공포성(空砲性) H(+)-ATPase 촉매 서브유닛 A(수탁 번호 P38606 및 B46091)의 래트 오르톨로그이다.
부분 길이 래트 7s cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 7s 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 29 및 SEQ ID NO:58과 SEQ ID NO:59에 각각 제시하였다. 래트 7s cDNA는 약 28.6 kD의 분자량을 가진 단백질이고 이 단백질의 길이는 270 아미노산 잔기이다.
래트 7s는 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 대한 선호도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 7s는 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 7s-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 7s는 노던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 폐, 간, 심장, 고환 및 골격근에서 보다는 뇌와 신장에서 현저하게 높은 레벨로 발현된다.
실시예 20: 래트 29x 및 25r의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 29x를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 래트 29x를 베이트로서 rKv4.3N을 사용하여 상기 기술한 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티드 클론으로서 단리하였다. 래트 25r은 29x의 스플라이싱 변이체이다. 이들은 5' 비번역되는 영역에 차이가 있지만, 코딩 영역 및 아미노산 레벨에서는 동일하다.
래트 29x cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 29x 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 30 및 SEQ ID NO:60과 SEQ ID NO:61에 각각 제시하였다. 래트 29xcDNA는 약 40.4 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 351 아미노산 잔기이다.
래트 25r cDNA의 누클레오티드 서열을 도 31 및 SEQ ID NO:62에 제시하였다. 래트 25r cDNA는 약 40.4 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 351 아미노산 잔기이다.
래트 29x는 비장, 폐, 신장, 심장, 뇌, 고환, 골격근 및 간에서 발현되는데, 비장에서 가장 높은 레벨로 발현되고 간에서 가장 낮은 레벨로 발현된다.
래트 29x는 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 대한 약한 선호도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 29x는 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 29x-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 29x는 아미노산 레벨에서 래트 SOCS-1(사이토카인 시그널링의 서프레서)[참조 : Starr R. et al. (1997) Nature 387: 917-921]; JAB[참조 : Endo T.A. et al. (1997) Nature 387: 921-924]; 및 SSI-1(STAT-유도된 STAT 억제제-1)[참조 : Naka T. et al. (1997) Nature 387:924-928]과 동일하다. 상기 단백질들은 SH2 도메인을 가지고 있다는 특징이 있으며, JAK 키나제에 결합하여 이를 억제시킴으로써 사이토카인 시그널링을 조절한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "SH2 도메인"은 Src 상동 2 도메인을 말하며, 포스포티로신 잔기, 예컨대, 다른 단백질들의 포스포티로신 잔기의 결합과 관련된 약 100 아미노산 길이의 단백질 도메인을 포함하고 있다. 표적 부위를 SH2-결합 부위라고 부른다. SH2 도메인은 2개의 알파 헬릭스 및 6개 내지 7개의베타-가닥으로 구성된 보존된 3D 구조를 가지고 있다. SH2 도메인의 코어는 2개의 연결된 베타-시트로 구성된 연속적인 베터-미앤더에 의해 형성되어 있다[참조 : Kuriyan J. et al. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:828-837]. SH2 도메인은 서열 특이적이고 엄격하게 인산화-의존성 수단으로 포스포티로신을 포함하고 있는 표적 펩티드와 높은 친화도로 상호작용함으로써 세포내 시그널링 캐스케이드의 조절 모듈로서 기능한다[참조 : Pawson T. (1995) Nature 373:573-580]. 일부 단백질들은 다중 SH2 도메인을 가지고 있는데, 이것은 인산단백질에 결합하기 위한 이들의 친화도를 증가시키거나 상이한 인산단백질에 결합하는 능력을 부여한다. 래트 29x는 SEQ ID NO:61의 아미노산 잔기 219-308에 SH2 도메인을 가지고 있다.
티로신 인산화는 칼륨 채널 활성을 조절한다[참조 : Prevarskaya N.B. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:24292-24299]. JAK 키나제는 단백질을 티로신에서 인산화시키며 채널 활성의 조절에 관련되어 있다(참조 : Prevarskaya N.B. et al. supra). 따라서, SOCS-1, JAB 및 SSI-1에 대한 이의 상동성에 기초하여, 래트 29x는 JAK 키나제 활성을 조절함으로써 칼륨 채널, 예컨대, Kv4의 활성을 조절할 수 있다.
실시예 21: 래트 5p의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 5p를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 래트 5p를 베이트로서 rKv4.3N을 사용하는 상기 기술된 효모-2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다.
래트 5p cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 5p 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 32 및 SEQ ID NO:63과 SEQ ID NO:64에 각각 제시하였다. 래트 5p cDNA는 약 11.1 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 95 아미노산 잔기이다.
래트 5p는 효모 2-하이브리드 검정에서 유사한 강도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 5p는 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 5p-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 5p는 노던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 비장, 폐, 골격근, 심장, 신장, 뇌, 간 및 고환에서 발현된다.
래트 5p는 래트 칼팍틴(Calpactin) I 경쇄 또는 P10(수탁 번호 P05943)과 동일하다. P10은 아넥신 II(p36)에 결합하여 이의 이량체화를 유도한다. P10은 p36 단량체가 티로신-특이적 키나제의 우선 표적인 경우 단백질 인신화의 조절물질로서 기능할 수 있다[참조 : Masiakowski P. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (4): 1277-1281].
티로신 인산화는 칼륨 채널의 활성을 조절한다(참조 : Prevarskaya N.B. et al. supra). 따라서, P10에 대한 이의 동일성에 기인하여, 래트 5p는 티로신-특이적 키나제의 활성을 조절함으로써 칼륨 채널, 예컨대, Kv4의 활성을 조절할 수 있다.
실시예 22: 래트 7q의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 7q를 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 래트 7q를 베이트로서 rKv4.3N을 사용하는 하기 기술된 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다. 전장 래트 7q를 RACE PCR에 의해 수득하였다.
래트 7q cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 7q 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 33 및 SEQ ID NO:65와 SEQ ID NO:66에 각각 제시하였다. 래트 7q cDNA는 약 23.5 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 212 아미노산 잔기이다.
래트 7q는 효모 2-하이브리드 검정에서 동일한 강도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 7q는 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 7q-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 7q는 노던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 심장, 뇌, 비장, 폐, 간, 골격근, 신장 및 고환에서 발현된다.
래트 7q는 아미노산 레벨에서 RAB2(래트 RAS-관련 단백질, 수탁 번호 P05712)와 동일하다. RAB2는 소포성 운송 및 단백질 이동과 관련되어 있는 것 같다[참조 : Touchot N. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (23): 8210-8214]. 따라서, RAB2에 대한 이의 상동성에 기초하여, 래트 7q는 칼륨 채널, 예컨대, Kv4 운송과 연관될 수 있다.
실시예 23: 래트 19r의 동정 및 특징화
본 실시예에서는, 래트 19r을 엔코딩하는 유전자의 동정 및 특징화에 대해 기술한다. 부분 래트 19r을 베이트로서 rKv4.3N을 사용하는 상기 기술한 효모 2-하이브리드 스크리닝으로부터 포지티브 클론으로서 단리하였다. 전장 래트 19r을RACE PCR에 의해 수득하였다.
래트 19r cDNA의 누클레오티드 서열 및 래트 19r 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열을 도 34 및 SEQ ID NO:67과 SEQ ID NO:68에 각각 제시하였다. 래트 19r cDNA는 약 31.9 kD의 분자량을 가진 단백질을 엔코딩하고 있고 이 단백질의 길이는 271 아미노산 잔기이다.
래트 19r은 노던 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 심장, 뇌, 비장, 폐, 간, 골격근, 신장 및 고환에서 발현된다.
래트 19r은 효모 2-하이브리드 검정에서 rKv4.3N에 대해 약한 선호도로 rKv4.3N 및 rKv4.2N에 결합한다. 대조적으로, 19r은 rKv1.1N에 결합하지 않으며, 이는 19r-Kv4N 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
래트 19r은 문헌[참조 : Dickeson S.K. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 16557-16564]에 기술되어 있는 래트 포스패티딜이노시톨(PTDINS) 이동 단백질 알파(PTDINSTP, 수탁 번호 M25758 또는 P16446)와 동일하다. PTDINSTP는 포스포리파제 C-베타(PLC-베타) 시그널링, 포스패티딜이노시톨 이동 단백질(PtdIns-TP) 합성, 분비 소포 형성 및 포스패티딜이노시톨 3-키나제(PtdIns 3-키나제) 활성의 향상과 관련되어 있다고 생각되고 있다[참조 : Cunningham E. et al. (1995) Curr. Biol. 5(7): 775-783; (1995) Nature 377 (6549): 544-547; and Panaretou C. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (4): 2477-2485].
따라서, PTDINSTP와 이의 상동성에 기초하여, 래트 19r은 PLC-베타 시그널링 및/또는 PtdIns 3-키나제 시그널링 경로를 통해 칼륨 채널, 예컨대, Kv4 활성을 조절할 수 있다. 또한 래트 p19r은 칼륨 채널, 예컨대, Kv4 수송과 관련될 수 있다.
실시예 24: 인간 9q의 염색체 위치결정
본 실시예에서는, 인간 PCIP 9q를 방사 하이브리드 패널(패널 GB4)을 사용하여 염색체적으로 맵핑하였다. h9q를 D10S192:10q22-q24로 명명되는 부분 간질과 관련성을 가지는 것으로 앞서 제시된 염색체 10q의 영역에 대해 맵핑하였다[참조 : Ottman et al. (1995) Nature Genetics 10:56-60](도 43 참조). 상기 관찰에 기초하여, 본 발명은 단백질의 9q 패밀리가 항간질 약물을 개발하기 위한 표적 및 간질의 의학적 간섭을 위한 표적으로서 역할할 수 있음을 명백하게 입증한 것이다.
또한, h9q를 D10S192 및 D10S1265:10q24로 명명되는 IOSCA와 관련성을 가지는 것으로 앞서 제시된 염색체 10q의 영역에 대해 맵핑하였다[참조 : Nikali, Genomics 39:185-191 (1997)](도 42 및 도 43 참조). 상기 관찰에 기초하여, 본 발명은 단백질의 9q 패밀리가 항척수소뇌성 실조증 약물을 개발하기 위한 표적 및 척수소뇌성 실조증의 의학적 간섭을 위한 표적으로서 역할할 수 있음을 명백하게 입증한 것이다.
실시예 25: KV4/KChIP 채널의 아라키돈산 조절
AA에 의한 Kv4 전류의 속도론적 조절은 KChIP-의존적이다
아라키돈산(AA)은 제노푸스 난모세포에서 발현된 재조합 Kv4 전류를 억제하는 것으로 나타났다 [참조: Villarroel, A. and Schwarz, T. L., 1996, J. Neuroscience 16: 2522-32]. 그러나, 조절은 피크 전류 크기로 관찰되기만 하고 전류 속도론적 파라미터는 AA의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 대조적으로, 해마 뉴런으로부터 얻은 막 패치의 기록은 피크 크기의 억제에 더하여 AA가 Kv4 채널에 의하여 A-전류의 속도론적 매개변수를 변경하는 것으로 나타났다[참조: Keros, S. and McBain, C. J., 1997, J. Neuroscience 17: 3476-87]. 주목할 만하게는, 비활성화 시간 상수는 상당히 감소되었다(참고: 비활성화 시간 상수는 비활성화율과 반비례로 상관된다). 따라서, 비활성화는 가속되었다[참조: Keros, 1997 상기와 같음].
본 실시예에서, KChIP가 상기 속도론적 불일치를 설명하는 빠진 보조 서브유닛이라는 가정은 Kv4를 단독으로 또는 CHO 세포 및 제노푸스 난모세포 둘 모두의 KChIP와 함께 발현시키고, 비활성화 시간 상수를 측정함에 의하여 조사하였다(예를 들어, 문헌(An et al., 2000, Nature 403: 553-6; Keros, S. and McBain, C.J., 1997; J. Neuroscience 17: 3476-87; 및 Villarroel, A. and Schwarz, T.L., 1996, J. Neuroscience 16: 2522-32)에 기술된 것을 사용함).
AA에 의한 Kv4의 속도론적 조절은 KChIP-의존적임이 증명되었다(표 3). Kv4.2가 CHO 세포에서 단독으로 발현되는 경우에, 생성된 전류의 비활성화 시간 상수는 10μM의 AA의 부재 또는 존재 시에 변화되지 않았다(32 ±3 대 32 ±2 밀리초(ms) ±표준 오차 평균(SEM)). 대조적으로, KChIP1과 함께 발현시킨 경우에, Kv4.2 전류의 비활성화 시간 상수는 10μM의 AA의 부재 시의 88 ±8ms로부터 AA의 존재 시에 37 ±3ms로 감소되었다. 상기 결과는 AA에 의한 Kv4 전류의 속도론적 조절이 KChIP의 존재에 의존적임을 증명한다. 제노푸스 난모세포의 KChIP1(표 4) 및 KChIP2의 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. AA의 존재 하의 Kv4/KChIP의 속도론적 변화는 KChIP가 Kv4-기초 전류의 내인성 서브유닛이라는 것을 지지하는 신경 막에서 설명된 것과 일치한다[참조: Keros, 1997, 상기와 동일].
AA는 또한 CHO 세포 및 제노푸스 난모세포 둘 모두의 Kv4/KChIP 전류의 피크 크기를 억제하는 것을 알 수 있다(표 3 및 표 4). 이는 Kv4 전류의 피크 크기의 조절이 KChIP와 무관하다는 것을 의미한다.
CHO 세포에서의 Kv4 및 Kv4/KChIP1 전류의 AA 조절
Kv4.2 Kv4.2 KV4.2/KChIP1 KV4.2/KChIP1
0μM AA 10μM AA 0μM AA 10μM AA
비활성화 시간 상수(ms ±SEM) 32 ±3 32 ±2 88 ±8 37 ±3
피크 크기(pA ±SEM) 620 ±80 336 ±82 4539 ±448 2827 ±496
A-전류에 대한 아라키돈산 효과를 또한 Kv4 및 KChIP 둘 모두가 존재하는 신경계(배양된 1차 소뇌 과립 뉴론)에서 조사하였다. TEA(10mM)를 부유된 외부 소성분을 차단하는 데 적용하였다. 10μM 아라키돈산의 부재 및 존재 시에 A 전류의 비활성화 시간 상수는 각각 44 ±5 ms 및 21 ±3 ms (평균 ±SEM)이었다. 상응하는 피크 크기는 2.0 ±0.6 nA에서 1.2 ±0.4 nA로 감소되었다. 상기 결과로부터 Kv4 A-전류 크기 및 네이티브(native) 세포에서의 속도론 둘 모두를 조절한다는 것을 확인하였다.
Kv4/KChIP 전류의 아라키돈산 조절은 농도-의존적이고 가역적이다
Kv4/KChIP 전류에 대한 아라키돈산의 상이한 농도의 효과를 제노푸스 난모세포에서 연구하였다. 아라키돈산의 생리학적 농도가 종종 10μM 미만이기 때문에[참조: Needleman, et al., 1986 Annu Rev Biochem 55: 69-102; Anderson and Welsh, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:7334-8; Meves 1994, Prog Neurobiol 43: 175-86], 아라키돈산을 1 내지 10μM 범위에서 시험하였다. Kv4.3 전류의 피크 크기의 농도-의존 차단은 KChIP1의 존재에 무관하였다 (도 64A 참조). 또한, 농도 증가에 대한 크기 감소의 기울기는 KChIP 존재 시와 부재 시가 매우 유사하였다. 피크 전류 차단은 10μM로 포화되는 것으로 보이지 않았다. 문헌[Villarroel and Schwarz, 1996, J.Neurosci 16: 2522-32]에 Kv4α서브유닛에 대한 아라키돈산의 IC50은 난모세포에서 대략 8μM이었다. KChIP1의 부재 시에 비활성화 시간 상수는 시험된 모든 아라키돈산 농도에서 변화하지 않았다. 그러나, KChIP1의 존재 하에, 비활성화 시간 상수는 농도-의존 형태로 감소하였다(도 64B 참조).
10μM 아라키돈산에 의한 Kv4.3의 KChIP-의존성 불활성 가속 및 KChIP-비의존성 전류 차단의 시작은 거의 즉각적이었다(도 65). 적어도 일부가 약간 지연되는 것(14초)은 저장고에서 기록 쳄버로의 용액의 이동으로 인한 것이다. 크기 차단은 시간에 따라 점차적으로 진전되었다(도 65A). KChIP1의 존재는 실질적으로 시간에 따른 백분율 감소 또는 전류 차단율을 변경하지 않거나 시간에 따른 Kv4.3 전류 크기의 회복율을 변경하지 않았다(도 65B). 아라키돈산이 세척된 경우에, Kv4.3 전류 크기 및 비활성화 시간 상수는 KChIP1의 존재 시에 유사한 비율로 완저히 회복되었다(도 65A 및 65B를 비교하면 알 수 있다). 패널 B에서 Kv4.3 단독 플롯에서의 2개의 작은 굴곡은 완충액 교환에 의한 것이다.
다른 지방산에 의한 Kv4/KChIP의 조절
과거에 특정 지방산은, Kv4α가 단독으로 발현되는 경우에 제노푸스 난모세포 중의 Kv4 전류에 대한 아라키돈산의 효과를 모방하는 것으로 나타났다(Villarroel and Schwarz, J Neurosci 16: 2522-32,1996). 이와 같이, KchIP의 존재 시 Kv4 전류에 대한 지방산 선별성을 조사하였다. 아라키돈산은 C5에서 제 1 이중 결합을 가지는 4개의 cis 이중 결합을 가지는 20개의 탄소 지방산이다(20:4 c5). 뚜렷한 구조적 특징을 가지는 하기 아라키돈산 유사체를 연구하였다: γ-리놀렌산(18:3 c9)은 4개의 이중 결합 대신에 3개의 시스 이중 결합을 가지고, 리놀레라이딘산(18:2 t9)는 4개의 시스 이중 결합 대신에 4개의 트란스 이중 결합을 가지고, 5,8,11,14-에이코사테트라이논산(ETYA, 20:4 n5)은 아라키돈산(ETI, 20:3 n5)에서 발현된 이중 결합 대신에 4개의 삼중 결합을 가지고(n은 제 1 삼중 결합의 위치를 의미한다), 5,8,11-에이코사트리논산(ETI, 20:3 n5)는 3개의 삼중 결합을 가진다. 도 66A는 Kv4.3 전류의 피크 크기가 KChIP1의 존재와 무관하게 비지방산 대조표준과 비교하여 γ-리놀레산, ETI, ETYA 및 아라키돈산 10μM에 의해 상당히 저해되었음을 보인다. Kv4 단독 및 Kv4/KChIP의 크기의 저해율은 상기 지방산과 그다지 다르지 않았다. 통계학적으로 중요한 10μM 리놀레라이딘산에 의한 Kv4 전류 크기의 차단이 그 값이 각각의 대조표준과 비교될 때 KChIP1의 존재 시에는 관찰되었으나 KChIP1의 부재 시에는 관찰되지 않았다. 그러나, Kv4.3 와 Kv4.3/KChIP KChIP1와 비교할 경우에 상당한 차이가 있었다.
KChIP1의 부재 시에, 시험된 지방산의 어느 것도 Kv4.3 비활성화 기간 상수에 통계학적으로 중요한 효과를 보이지 않았다(도 66B). KChIP(γ-리놀렌산, ETI, ETY, 및 아라키돈산)과 무관하게 실질적인 전류 차단을 유발하는 지방산만이 KChIP1과 함께 발현될 경우에 Kv4.3 비활성화 시간 상수를 감소시켰다. 단지 적당한 KChIP-의존성 Kv4.3 전류 차단을 보이는 리놀레산은 Kv4.3 비활성화 시간 상수에 영향을 주지 않았다(도66B). 따라서, 특정 장쇄 지방산은 아라키돈산을 모방하여 KChIP-의존 형태로 Kv4 전류 속도론을 조절할 수 있다. 일반적으로, 피크 크기를 차단하고 Kv4/KChIP 전류의 속도론을 변형할 수 있는 소정 지방산의 능력에는 우수한 연계가 있다.
아라키돈산은 Kv4 및 KChIP의 결합을 붕괴시키지 않는다
상기 실험을 위하여 하기 검정법을 사용하였다.
생체외 결합 검정
래트 Kv4.3의 N-말단 도메인을 GST 융합체(GST-Kv4.3N)로서 발현시켰고 기본적으로 애머샴 파마시아 바이오테크(피츠버그, 뉴저지)로부터 제공받은 프로토콜에 따라 E.coli로부터 정제하였다. 재조합 래트 KChIP1 단백질을 우선 발현시켜 GST-융합체로서 정제한 후에, GST 잔기를 프리시젼(PreScisson) 프로티아제(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 절단하여 유리 KCHIP1 단백질을 생성하였다. GST-Kv4.3N 및 KChIP 단백질 둘 모두가 변성 겔의 코마시 염색에 의해 95% 초과로 측정되었다. 생체외 결합 검정을 바이아코어 AB(Biacore AB)의 바이아코어 3000(웁살라, 스웨덴)을 사용하여 수행하였다. 1mM CaCl2및 0.05% 폴리소르베이트 P-20을 함유한 인산염완충액(PBS), pH 7.4 중에서 실험을 수행하였다. 항-GST 항체(바이아코어 AB)를 아민 커플링을 사용하여 2000 공명 유닛(resonance unit, RU)의 레벨에서 CM-5 칩의 3개의 플로우셀에 커플링시켰다. 최종 플로우셀을 활성화하고 에탄올아민으로 차단하여 기준 대조 표면으로 사용하였다. GST-Kv4.3N 말단 도메인을 2개의 항-GST 플로우셀 상에 캡쳐링(capturing)하고, GST 단독을 150RU의 레벨에서 제 3 항-GST 플로우셀에 결합시켰다. 다음에, 정제된 KChIP1을 10μM 아라키돈산의 존재 및 부재 하에 모두 4개의 플로우셀에 주입하였다. 또한, 아라키돈산(10μM)을 단독으로 주입하였다. 데이터는 GST 기준-공제 센소그램(GST reference-subtracted sensogram)으로 나타내었다.
효모 2-하이브리드 세포주 및 증식 검정
베이트(Kv4.3의 N-말단 도메인 또는 엠프티(empty) 벡터 pGBT9) 및 피쉬(KChIP1) 플라스미드를 함유하는 2배체 세포주를 문헌(An, et al., 2000)에 기술된 바와 같이 수득하였다. 동기화(synchronization)를 위하여, 세포주를 포화 상태로 증식시킨 후에, 상호작용-의존성 증식을 선별하는 TrpLeuHis 비함유 합성 완전 배지(SC-WLH) 5㎖ 또는 10μM ETYA의 존재 또는 부재시에 비선별적인 SC-WL 배지 5㎖에 동일한 OD 600으로 접종하였다. 5mM 3-AT (3-아미노-1,2,4-트리아졸)을 배지에 포함시켜 Kv4.3 N-말단 도메인 베이트로부터 약한 자기-활성화 활성을 억제하였다. 배양액을 17시간 동안 30℃에서 증식시켰고 분광광도계로 OD가 600이었다.
아라키돈산이 Kv4 및 KChIP 사이의 결합을 방해함에 의해 작용한다는 가정을 시험하기 위하여, 먼저 표면 플라스몬 공명 측정(바이오센서)을 사용하여 아라키돈산의 존재 및 부재 시의 Kv4-KChIP 상호작용의 결합 및 분해 단계를 모니터링하였다. Kv4.3의 세포 내 N-말단 도메인을 GST 융합 단백질(GST-Kv4.3N)으로 발현시켰고, 바이오센서 칩의 표면에 고정시켰다. 재조합 KChIP1 단백질을 10μM 아라키돈산의 존재 및 부재 시에 칩 표면을 통과시켰다. 도 67A에 도시된 바와 같이, KChIP1 단백질을 GST-Kv4.3N 표면에 결합시켰으나, 질적 차이는 KChIP1 및 Kv4.3 N-말단 도메인의 온- 및 오프- 상으로 관찰되지 않았다. 바이오센서 결과는, 선별성 SC-WLH 배지 중의 Kv4-KChIP 상호작용-의존성 증식이 10μM ETYA에 의해 영향받지 않는 효모 2-하이브리드 시스템에서 추가로 확인되었다(도67B). 아라키돈산 대신에 ETYA가 상기 실험에서 사용되었는데, ETYA 및 아라키돈산 둘 모두가 Kv4 전류에 거의 동일하게 영향을 주는 반면에, ETYA는 대사가능하지 않고 따라서 상기 실험에 적절하지 않기 때문이다. 함께 고려하면, 상기 결과는 시험된 지방산이 Kv4와 KChIP간의 결합을 분열시키지 않는다는 것을 보인다.
Kv4/KChIP는 Kv1.1/Kvβ1 보다 AA 조절에 민감하다
칼륨 채널의 포어-형성 알파 서브유닛을 포함하여 이온 채널의 포어-형성 알파 서브유닛은 종종 단독으로 기능하지 않는다. 이들은 보조 서브유닛과 결합하고, 이들 보조 서브유닛은 패널 활성을 상당히 변화시킬 수 있다. 따라서, 생리적으로 적합한 채널이 알파-보조 서브유닛의 복합체인 것과 같이 이들의 보조 서브유닛과 조합된 알파 서브유닛을 연구하는 것이 더욱 유용하다.
단독으로 발현된 경우에, 재조합 Kv4 알파 서브유닛은 몇몇 다른 전압에 의해 개방된 칼륨 채널의 알파 서브유닛보다 AA 저해에 대해 훨씬 더 민감한 것으로 나타났다(예를 들어, Kv1.1)(Villarroel, 1996, 상기와 같음). 그러나, 상기 논문은 채널의 알파 서브유닛 만의 AA 조절을 연구하였다. 모든 채널이 이들의 동족 보조 서브유닛의 존재 하에 시험된 경우에, Kv4 전류가 다른 채널 전류보다 AA 조절에 보다 민감할지 여부는 알려지지 않았다.
본 실시예에서, 2개의 알파/보조 복합체: Kv4.3/KChIP1 및 Kv1.1/Kvβ1을 측정함에 의하여 상기된 바를 시험하였다(Kvβ1은 전통적인 칼륨 채널 베타 서브유닛 중 하나이고 Kv1.1 속도론을 상당히 변화시킨다). Kv4.3/KChIP1 및 Kv1.1/Kvβ1을 제노푸스 난모세포 중에서 각각 발현시켰고, 이에 의해 생성된 전류를 10μM AA의 존재 또는 부재 하에 기록하였다. Kv1.1/kvβ1 전류의 피크 크기가 10μM AA에서 그다지 증가하지 않은(11 ±4 내지 14 ±1μA) 반면에, Kv4.3/KChIP1의 피크 크기는 상당히 증가하였다는(44 ±10 내지 21 ±1μA, 표 4) 것을 의미한다. 속도론적으로, KvKv4.3/KChIP1은 Kv1.1/Kvβ1보다 AA 조절에 보다 민감하였다(표 4). 10μM AA가 Kv1.1/Kvβ1의 비활성화 시간 상수(11 ±1 내지 9 ±1ms)의 통계적으로 중요한 감소를 유발하지 않은 반면에, 동일한 농도의 AA가 Kv4.3/KChIP1의 비활성화 시간 상수(104 ±7 내지 55 ±4ms)로 감소시켰다. 상기 결과는 AA가 Kv1.1/Kvβ1의 속도론 및 크기 보다 용이하게 네이티브 뉴런의 Kv4/KChIP의 속도론 및 크기 둘 모두를 용이하게 조절한다는 것을 의미한다.
제노푸스 난모세포의 Kv4, Kv4/KChIP1, Kv1.1, Kv1.1/Kvβ1 전류의 AA 조절
Kv4.3 Kv4.3 KV4.3/KChIP1 KV4.3/KChIP1 Kv1.1 Kv1.1 Kv1.1/Kvβ1 Kv1.1/Kvβ1
0μM AA 10μM AA 0μM AA 10μM AA 10μM AA 10μM AA 0μM AA 10μM AA
비활성화시간 상수(ms±SEM) 75 ±7 66 ±6 104 ±7 55 ±4 N.A. N.A. 11 ±1 9 ±1
피크 크기(μA±SEM) 30 ±7 13 ±1 44 ±10 21 ±4 19 ±2 21 ±3 11 ±4 14 ±1
실시예 26: K-채널 상호작용 단백질-2(KChIP2), 스플라이스 변이체, 염색체 구조화 및 국재화
본 실시예에서, KChIP2의 변이체 및 이들의 염색체 구조화를 표준 기술을 하용하여 동정하였다. KChIP2 유전자는 인간, 래트, 및 마우스 간에 아미노산 레벨에서 매우 보존적이다. 다중 인간 스플라이스 변이체를 데이터베이스 마이닝 및 cDNA 라이브러리 스크리닝에 의해 동정하였다. 선택적인 스프라이싱은 길이가 다양한 N-말단 도메인을 생성하나, 코어 C-말단 도메인은 Kv4와 결합하고 이를 조절하는데 충분하다. 인간 KChIP2 유전자는 WI-8488 및 WI-6750 사이의 인간 염색체의 q23 영역에서 약 18kb이다. 상기 영역은 D19Mit40 및 D19Mit11 사이의 마우스 염색체 19에 신테니(syntenic)하다. 데이터베이스 마이닝에 의해 발견된 래트 변이체는 마지막 5개의 아미노산을 변화시키고, Kv4와 결합하고 이를 조절하는 능력을 유지하였다. 따라서, KChIP2의 상기 다중 변이체는 Kv4 조절에 유사하게 기능하는 것으로 보인다.
실시예 27: KChIP1L 기능 및 발현
RT-PCR을 수행하여 래트 KChIP11(KChIP1 길이) 스플라이스 변이체의 조직 발현을 검사하였다. 심장, 뇌, 폐, 비장, 간, 골격근, 신장 및 고환으로부터의 PolyA+ RNA를 클론텍으로부터 구입하였다. PCR 조건을 변형시켜(1시간 동안 50℃; 3분 동안 94℃; 30초 동안 94℃로 50 사이클; 30초 동안 65℃; 및 2분 동안 68℃) 5' 프라이머 GGTACCTTCTCGTCCCTGCAGACCAAACAAAG(SEQ ID NO: 104) 및 3' 프라이머 CGGTAAAGGACTTGCAGTTCTCTC(SEQ ID NO: 105)를 증폭시키고 클론텍의 1 단계 RT-PCR 키트를 사용하여 RT-PCR을 사용하였다. 5' 프라이머는 KChIP1-특이적이다. KChIP1 및 KChIP11 둘 모두는 동일한 프라이머 세트에 의하여 증폭될 수 있고, 이는 전기영동에 의해 두개의 밴드로 나누어 지는 두개의 상이한 PCR 생성물을 생성한다. KChIP11-특이적 밴드는 뇌에서만 발견되고, 이는 이것이 뇌에서 특이적으로 발현됨을 의미한다. 동일한 반응은 또한 뇌의 경우에 강한 KChIP-1 특이적 시그날을 보였고, 골격근에서는 거의 보이지 않는 밴드로 나타났다. KChIP1 또는 KChIP11 시그날은 조사된 임의의 다른 조직에서 관찰되지 않았다. 요악컨데, KChIP11 발현은 뇌-특이적인 반면에 KChIP1 발현은 골격근에서는 아주 낮은 레벨로 발현되었고, 뇌에서 우세하였다.
제노푸스 난모세포에서 KChIP11의 기능을 또한 검사하였다. Kv4.3 cRNA를 KChIP11 cDNA의 존재 또는 부재 하에서 제노푸스 난모세포로 주입하였다. KChIP1과 유사하게, KChIP11은 Kv4.3의 피크 크기를 15 ±4μA 로부터 55 ±7μA로 증가시켰고, 비활성화 시간 상수를 56 ±40ms에서 100 ±8ms로 증가시켰다(표 5). 상기 데이터는 체외에서 KChIP1과 같이 KChIP11이 피크 크기 및 Kv4 전류의 속도론을 조절함을 증명하였다.
KChIP1 및 KChIP11 둘 모두에 공통된 185개의 C-말단 아미노산이 Kv4.3와의 결합을 담당하고 있다는 것을 고려하면, KChIP11은 뇌의 Kv4와 함께 결합하는 것으로 보인다. KChIP11 단백질의 추가 아미노산의 삽입은 미지의 기능에 중요할 수 있고, 이 아미노산을 엔코딩하는 DNA 서열이 상기 특정 스플라이스 변이체의 세포 조직 및/또는 세포 타입 특이적인 발현을 검출하는데 특이적인 유전자 마커로서 사용될 수 있다.
KChI11 스플라이스 변이체에 특이적인 DNA 및 단백질 서열은 래트와 인간에 동일하다. 따라서, 하나의 종으로부터 KChIP11 분자로 수득한 기능적 데이터는 또한 다른 종으로부터 얻은 것에도 적용된다.
KChIP11 및 KChIP1N에 의한 Kv4.3의 조절
우측과 공동 발현된 Kv4.3 Kv4.3 단독 발현 KChIP11 KChIP1 KChIP1N
비활성화 시간 상수(ms ±SEM) 56 ±4 100 ±8 112 ±3 1778 ±136
피크 크기(μA ±SEM) 15 ±4 55 ±7 59 ±5 18 ±3
실시예 28: KChIP1N 기능 및 발현
프로브 GGCAAAGAAGCGCGATTTT (SEQ ID NO: 106), 전방 프라이머 TCCCGGGTAGGCAAGCA (SEQ ID NO: 107) 및 역 프라이머 CCTGCTCAAGCCCAGCACTGCA (SEQ ID NO: 108)을 사용하여 태크만(Taqman) 기술로 래트 KChIP1N의 발현을 조사하였다. 프로브는 KChIP1N에 특이적이다. 도 68에 도시된 바와 같이, KChIP1N은 배근 신경절(dorsal root ganglion, DRG)에서 우세하게 발현되었고 척수 및 뇌에서 낮은레벨로 발현되었다.
제노푸스 난모세포에서의 KChIP1N의 기능을 또한 검사하였다. Kv4.3 cRNA를 KChIP1N cRNA의 존재 또는 부재 하에 제노푸스 난모세포로 주입시켰다. KChIP1 및 KChIP11과 비교하여, KChIP1N은 Kv4.3의 피크 크기에 영향을 주지 않았다(KChIP1N 존재 및 부재하에 15 ±4 대 18 ±3, 표 5). 놀랍게도, KChIP1N은 KChIP1 또는 KChIP11보다 훨씬 큰 Kv4.3의 비활성화 시간 상수의 증가를 유발하였다(KChIP1N에 의해 32배 증가 대 KChIP1 또는 KChIP11에 의한 2배 이하의 증가; 표 5).
전술한 데이터는 KChIP1N 또는 KChIP11과 다른 방식으로 KChIPN이 생체외에서 Kv4 전류를 조절하는 것을 증명하였다. 먼저, KChIP1N의 비활성화 시간 상수의증가는 KChIP1 또는 KChIP11에 의해 매개된 증가와 반대로 상당히 컸다. 결과적으로, KChIP1N은 500ms 초 +40 볼트 펄스 동안 빠르게 비활성화되는 Kv4.3 전류를 거의 비활성화되지 않는 것으로 변화시킬 수 있엇다. 둘째, 시험된 특정 농도에서 KChIP1N은 Kv4 피크 크기에 영향을 주지 않았다. 모든 KChIP1 스플라이스 변이체가 C-말단 196 아미노산을 공유하기 때문에, 상기 데이터는 독특한 36개 아미노산의 KChIP1N의 N-말단 도메인의 중요하고 뚜렷한 기능을 가리킨다.
실시예 29: KChIP2 스플라이스 변이체 기능
본 실시예에서, 제노푸스 난모세포의 KChIP2 스플라이스 변이체, 래트 KChIP21, 인간 KChIP2 및 래트 KChIP2C의 기능을 조사하였다. 상기 실험으로부터 얻은 결과를 하기 표에 요약하였다.
KChIP2 스플라이스 변이체에 의한 KV4의 조절
우측과 공동발현된 Kv4.3 KChIP21 KChIP2m KChIP2 KChIP2C 단독 발현
피크 크기(μA ±SEM) 51 ±4 40 ±4 44 ±3 44 ±3 14 ±3
비활성화 시간 상수(ms ±SEM) 87 ±4 70 ±2 90 ±3 74 ±4 55 ±4
데이터는 상기 KChIP2 스플라이스 변이체가 KChIP2m과 유사한 Kv4 전류를 조절한다는 것을 증명하였다(표 6). 래트 및 인간 KChIP2 사이에는 아미노산 레벨의 매우 높은 상동성(>95%)이 있기 때문에, 하나의 종으로부터 얻은 KChIP2 분자를 사용하여 얻은 결과가 다른 종으로부터 얻은 KChIP2 분자와 유사할 것이다.
실시예 30: KChIP4 기능 및 발현
KChIP4의 조직 발현을 측정하기 위하여 노던 분석을 수행하였다. KChIP4의 N-말단 스플라이스 변이체 모두에 공통적인 래트 KChIP4(568-909)의 3'UT 영역으로부터 취한 프로브를 사용하여 래트 클론텍 MTN 노던 블롯을 프로빙하였다. 노던 블롯에 나타난 조직(심장, 뇌, 허파, 비장, 간, 근육, 신장 및 고환) 중에 약 2.4kb의 우세한 밴드는 뇌에서만 발견되었다. 다소 빠른 운동성을 가진 희미한 밴드가 신장에 존재하였다. 따라서, KChIP4의 N-말단 스플라이스 변이체가 뇌에서 우세하게 발현되고 신장에서 낮은 레벨로 발현되었다.
Kv4와 결합하는 KChIP4의 능력은 또한 효모 2-하이브리드 검정을 사용하여 검사하였다. KChIP4의 모든 N-말단 스플라이스 변이체에 공통되고, 다른 KChIP에 상동성을 가지는 KChIP4의 H 도메인을 표준 기술을 사용하여 "피쉬"로서 발현하고, Kv4.3. Kv4.2의 N-말단 도메인은 "베이트(각각 Kv4.3N, Kv4.2N)"로서 발현하였다.KChIP4H는 증식 검정 및 β-갈락토시다제 검정 둘 모두에서 Kv4.3N 및 Kv4.2N과 결합하였지만 Kv1.1N 또는 다른 대조 베이트와 결합하지 못했다. 상기 결과는 KChIP4가 특정 형태로 Kv4 채널과 결합하는 것을 의미한다.
실시예 31: KChIP4N2의 기능적 분석
KChIP1, KChIP2 및 KChIP3와 달리, KChIP4N2는 이들이 제노푸스 난모세포로 함께 주dlq될 경우에 Kv4.3의 피크 크기 상에 용량-의존tjd 효과를 도시하였다(표 7). 높은 농도(예: 저장 용액을 5배 희석)로, KChIP4N2는 Kv4.3 전류 크기를 억제하는 반면에, KChIP4N2의 보다 더 희석된 농도는 Kv4 전류 크기에 대한 효과를 증강시키거나 이에 대해 효과를 보이지 않았다(표 7).
KChIP1, KChIP2 및 KChIP3과 달리, KChIP4N2는 이들이 제노푸스 난모세포로 함께 주입될 경우에 Kv4.3의 비활성화 속도론에 용량-의존적인 효과를 보였다(표 7). 높은 농도에서, KChIP4는 빠르게 비활성화되는 Kv4.3 전류를 거의 비활성화되지 않는 전류로 전환되었다(예: 저장 용액의 5배 희석 시에, 전류 커브가 너무 느려서 시간에 따라 감소하여 비활성화 시간 상수를 고정하여 수득할 수 없었다). 보다 희석된 KChIP4N2 cRNA가 주입된 경우에, 비활성화 시간 상수는 KChIP4N2의 부재 시에 얻어진 값으로 점차 감소하였다.
제노푸스 난모세포에서 KChIP4N2의 상이한 농도에 의한 Kv4.3 전류의 피크 크기 및 속도론의 조절
우측 숫자에 의하여 희석된 KChIP4N2로 공동 발현된 Kv4.3(1×=저장용액) 1× 5× 30× 120× 500× none
비활성화 시간 상수 (ms ±SEM) 681 ±28 193 ±13 84 ±5 56 ±4
피크 크기(μA ±SEM) 0 ±0 4 ±1 25 ±2 16 ±3 9 ±4 15 ±4
KChIP4N2의 N-말단 도메인은 KChIP4N2의 관찰된 작용을 위하여 필요하다. N-말단 도메인의 결실은 기본적으로 야생형 KChIP4N2의 피크 크기에 대한 효과 및 Kv4.3의 비활성화 시간 상수의 효과를 제거하였다(표 8).
KChIP4N2의 N-말단 도메인의 작용은 다른 KChIP 분자에 대해 우세한 것으로 보인다. 본 발명자들은 KChIP4N2의 N-말단 도메인이 KChIP1의 185개 아미노산의 C-말단 H 도메인에 융합된 키메라 분자, 4N-1H를 제조하였다(KChIP1H가 다른 KCHIP와 상동성을 가진다). KChIP1H는 Kv4와 함께 발현된 경우에, 4N-1H는 KChIP1H과 거의 동일하게 Kv4 전류를 조절하였고, KChIP4N2에 의해 생성된 것과 꽤 상이한 조절 프로파일을 생성하였다(An F. et al. 2000, Nature 403: 553-556). 그러나, 4N-1H가 Kv4.3과 함께 발현되었을 경우에, 이는 KChIP1H 또는 KChIP1의 조절 프로파일 대신에 KChIP4N2의 조절 프로파일과 거의 구별되지 않는 조절 프로파일을 생성하였다(표 6). 이는 KChIP4N2의 N-말단 도메인이 모듈로서 작용할 수 있고, 이의 조절 효과가 다른 KChIP의 조절 효과에 비하여 우세하였다.
KChIP4N2의 N-말단 도메인은 KChIP4N2의 효과를 위하여 필요하고 KChIP1에 비하여 우세하였다
우측의 것과 공동발현된 Kv4.3 KChIP4(30×희석율) KChIP4H 4N-1H
비활성화 시간 상수(ms ±SEM) 681 ±28 105 ±4 680 ±39
피크 크기(μA ±SEM) 25 ±2 19 ±2 26 ±3
KChIP4 및 다른 KChIP가 Kv4 N-말단 도메인(Kv4N)과 결합하기 때문에, 상기 KChIP가 Kv4N 상의 동일한 위치에서 결합함을 알 수 있다. 이러한 경우에, KChIP4N2 및 KChIP1은 이들 둘 모두가 Kv4와 함께 결합하는 경우에, Kv4 전류를 조절하기 위하여 서로 경쟁해야만 한다. 이러한 가정을 시험하였고, 도 61에 도시된 바와 같이, KChIP4N2 및 KChIP1이 실제로 Kv4 전류를 조절하기 위하여 서로와 경쟁하였다. 제노푸스 난모세포로 주입된 KChIP4 cRNA의 농도는 일정하게 유지되는 반면에, KChIP4 cRNA의 농도는 차츰 증가하기 때문에, Kv4.3 전류 프로파일이 KChIP4 cRNA의 프로파일로부터 KChIP1과 유사한 것으로 변화하였다. 상호적으로 KChIP1 cRNA의 농도가 일정하게 유지되는 반면에 KChIP4 cDNA의 농도가 차츰 증가하기 때문에 전류 프로파일이 KChIP1의 전류 프로파일로부터 KChIP4와 유사한 것으로 변화하였다.
상기 결과는 KChIP1 및 KChIP4가 Kv4.3N 상의 동일한 위치와 경쟁적으로 결합하여 기능적으로 서로와 경쟁하는 것을 의미한다. 상기 결과는 또한 KChIP4N2 및 다른 KChIP의 상이한 조합이 질적으로 양적으로 모(parental) 프로파일과 유사하거나 상이한 하이브리드 프로파일을 가지는 전류를 발생시켰다. KChIP4N2 및 다른 KChIP가 생체 내에서 특정 세포 타입에서 공동 발현되는 것을 상상할 수 있다(예: 뇌). 따라서, 특정 세포 타입에서 생체내 농도에 따라, KChIP4N2 및 다른 KChIP는 포어-형성 알파 서브유닛이 동일한 Kv4 분자임을 통해서 조차 꽤 상이한 전류를 생성할 수 있다.
KChIP4N2에 관해 예상되는 관찰의 관계는 많은 측면이 있다. 데이터는 N-말단 도메인이 (Kv4에 결합하여 상술된 An et al.에 기술된 Kv4 전류 크기 및 속도론을 조절하는) H 도메인의 기능으로부터 분리될 수 있는 우세한 조절 기능을 가지는 것을 의미한다. 결과적으로, KChIP4N2의 N-말단 도메인이 Kv4의 N-말단 도메인 이외에 칼륨 채널의 일부와 상호작용하는 것을 알 수 있다. 비활성화 속도론에 대한 KChIP4N2의 상당한 효과를 고려할 경우에, Kv4 상의 상기 다른 위치는 채널을 통하여 칼륨 이온의 이동을 조절하기 위하여 중요할 것으로 보인다. KChIP4N2의 N-말단 도메인을 상기 독특한 활성을 해독된 정보로 사용하는 단백질/펩티드/화합물 스크린을 설계하고 수행하기 위한 도구로서 사용하는 것이 가능하다. 상기 스크리닝 검정을 사용하여 KChIP 의존 또는 비의존 형식으로 Kv4 활성을 조절하는 단백질/펩티드/화합물을 수득하는 것이 가능하다.
상기 논의된 바와 같이, KChIP1N 및 KChIP4N2는 유사한 Kv4 전류 조절 특성을 공유한다. 둘 모두는 빠르게 비활성화되는 Kv4 전류를 거의 비활성화되지 않는 전류로 전환시킬 수 있다. 둘 모두는 Kv4의 피크 크기에 영향을 미치지 못한다. 흥미롭게도, 인간 KChIP1N 및 원숭이 KChIP4N2의 N-말단 도메인이 나열되는 경우(Megalign, DNA Star을 사용)에, 이들은 KChIP1N 및 KChIP4N2에 의한 독특한 조절을 예고하는 단백질 모티브의 존재를 제시하는 상당한 상동성(도 62)을 보였다. 대조적으로, 인간/래트 KChIP1 및 원숭이 KChIP4N2의 N-말단 도메인은 꽤 달랐다(도 62).
실시예 32: KChIP4N1 및 KChIP4N3의 기능적 분석
KChIP4N1 및 KChIP4N3을 Kv4.3 cRNA와 함께 제노푸스 난모세포로 주입하였다. Kv4.3 상에 다른 단백질의 조절 효과를 표 9에 요약하였다. 둘 모두는 Kv4.3의 비활성화 시간 상수를 증가시켰다. KChIP4N3이 Kv4.3의 피크 크기를 증가시키는 반면에, KChIP4N1은 Kv4.3 크기에 대한 통계적으로 그다지 중요한 효과를 보였다.
제노푸스 난모세포의 KChIP4N1 및 KChIP4N3에 의한 Kv4의 조절
우측과 공동 발현된 Kv4.3 KChIP4N1 KChIP4N3 단독 발현
피크 크기(μA ±SEM) 6 ±1 (ns) 43 ±4 15 ±4
비활성화 시간 상수(ms ±SEM) 112 ±7 85 ±4 56 ±4
등가물
당업자는 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 양태에 대한 많은 등가물들을 일상적인 실험만을 사용함으로써 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물들을 하기 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims (53)

  1. a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열, 또는 이들의 상보서열과 60% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    b) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열, 또는 이들의 상보서열을 포함하는 핵산의 583개 이상의 누클레오티드의 단편을 포함하는 핵산 분자;
    c) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호,제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열과 약 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자;
    d) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 단편을 엔코딩하는 핵산 분자 (여기서, 단편은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 15개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함한다); 및
    e) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이체를 엔코딩하는 핵산 분자 (여기서, 핵산 분자는 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된다)로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자.
  2. 제 1항에 있어서,
    a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열, 또는 이들의 상보서열을 포함하는 핵산 분자; 및
    b) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
  3. 제 1항에 있어서, 벡터 핵산 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제 1항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 핵산 분자.
  5. 제 1항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  6. 제 5항에 있어서, 포유류 숙주 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제 1항의 핵산 분자를 함유하는 인간을 제외한 포유류 숙주 세포.
  8. a) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 단편 (여기서, 단편은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ IDNO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함한다);
    b) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이체 (여기서, 폴리펩티드는 엄격한 조건하에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 핵산 분자에 의해 엔코딩된다); 및
    c) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102의 누클레오티드 서열, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열을 포함하는 핵산과 60% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드; 및
    d) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 폴리펩티드.
  9. 제 8항에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  10. 제 8항에 있어서, 이종 아미노산 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제 8항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체.
  12. 핵산 분자가 발현되는 조건하에서 제 5항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하여, 하기 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 생성시키는 방법:
    a) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 단편 (여기서, 단편은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함한다); 및
    c) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, 또는 SEQ ID NO:109의 아미노산 서열 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이체 (여기서, 폴리펩티드는 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, 또는 SEQ ID NO:102, 또는 수탁 번호 제 98936호, 제 98937호, 제 98938호, 제 98939호, 제 98940호, 제 98941호, 제 98942호, 제 98943호, 제 98944호, 제 98945호, 제 98946호, 제 98947호, 제 98948호, 제 98949호, 제 98950호, 제 98951호, 제 98991호, 제 98993호, 제 98994호 또는 PTA-316으로서 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되는 핵산 분자에 의해 엔코딩된다).
  13. a) 샘플을 제 8항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 화합물이 샘플내의 폴리펩티드에 결합하는 지를 결정함으로써 샘플내의 제 8항의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내의 제 8항의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 폴리펩티드에 결합하는 화합물이 항체임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 8항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 화합물 및 사용설명서를 포함하는 키트.
  16. a) 샘플을 제 1항의 핵산 분자에 선택적으로 하이브리드화되는 핵산 프로브 또는 프라이머와 접촉시키는 단계; 및
    b) 핵산 프로브 또는 프라이머가 샘플내의 핵산 분자에 결합하는 지를 결정함으로써 샘플내의 제 1항의 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내의 제 1항의 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 샘플이 mRNA 분자를 포함하며, 핵산 프로브와 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항의 핵산 분자에 선택적으로 하이브리드화되는 화합물 및 사용설명서를 포함하는 키트.
  19. a) 제 8항의 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 폴리펩티드가 시험 화합물에 결합하는 지를 결정하는 단계를 포함하여, 제 8항의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 동정하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    a) 시험 화합물/폴리펩티드 결합의 직접 검출에 의해 결합을 검출하는 방법;
    b) 경쟁 결합 검정을 사용하여 결합을 검출하는 방법; 및
    c) PCIP 활성에 대한 검정을 사용하여 결합을 검출하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 시험 화합물이 폴리펩티드에 결합하는 것을 검출함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 8항의 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 상기 폴리펩티드의 활성을 조절하기에 충분한 농도의 상기 폴리펩티드에 결합하는 화합물과 접촉시키는 것을 포함하여, 제 8항의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 방법.
  22. a) 제 8항의 폴리펩티드를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 폴리펩티드의 활성에 대한 시험 화합물의 효과를 결정함으로써 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 단계를 포함하여, 제 8항의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
  23. 제 1항의 PCIP 핵산 분자의 발현 또는 제 8항의 PCIP 폴리펩티드의 활성을조절하는 화합물 또는 작용제의 능력을 검정함으로써 비정상적 PCIP 핵산 발현 또는 비정상적 PCIP 단백질 활성을 특징으로 하는 질환을 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 것을 포함하여, 비정상적 PCIP 핵산 발현 또는 비정상적 PCIP 단백질 활성을 특징으로 하는 질환을 치료할 수 있는 화합물을 동정하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 질환이 CNS 질환임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 질환이 간질임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 질환이 척수소뇌성 실조증임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23항에 있어서, 질환이 심혈관 질환임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 심혈관 질환이 비정상적 Ito전류와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 피검자의 세포 샘플에 유전자 손상이 존재하는 지의 여부를 검출하는 것을 포함하여 피검자가 비정상적 PCIP 핵산 발현 및/또는 비정상적 PCIP 단백질 활성을 특징으로 하는 질환에 걸릴 위험이 있는 지를 결정하는 방법으로서, 유전자 손상이제 8항의 PCIP 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 무결성에 영향을 미치는 변화 또는 제 1항의 PCIP 핵산 분자의 오발현(misexpression)을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 질환이 CNS 질환임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 질환이 간질임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 질환이 척수소뇌성 실조증임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29항에 있어서, 질환이 심혈관 질환임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 심혈관 질환이 비정상적 Ito전류와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 피검자로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 샘플에 유전자 손상이 존재하는 지의 여부를 검출함으로써 비정상적 PCIP 핵산 발현 및/또는 비정상적 PCIP 단백질 활성을 특징으로 하는 질환에 걸린 피검자를 확인하는 것을 포함하여, 비정상적 PCIP 핵산 발현 및/또는 비정상적 PCIP 단백질 활성을 특징으로 하는 질환에 걸린 피검자를 확인하는 방법으로서, 유전자 손상이 제 8항의 PCIP 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 무결성에 영향을 미치는 변화 또는 제 1항의 PCIP 핵산 분자의 오발현을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 질환이 CNS 질환임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 질환이 간질임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항에 있어서, 질환이 척수소뇌성 실조증임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 35항에 있어서, 질환이 심혈관 질환임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 심혈관 질환이 비정상적 Ito전류와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 피검자에게 제 8항의 PCIP 폴리펩티드 또는 이의 일부를 치료가 일어나도록 투여하는 것을 포함하여, 칼륨 채널 관련 질환에 걸린 피검자를 치료하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 질환이 CNS 질환임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 질환이 간질임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 질환이 척수소뇌성 실조증임을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 질환이 심혈관 질환임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 심혈관 질환이 비정상적 Ito전류와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  47. 피검자에게 제 8항의 PCIP 폴리펩티드 또는 이의 일부를 엔코딩하는 핵산을 치료가 일어나도록 투여하는 것을 포함하여, 칼륨 채널 관련 질환에 걸린 피검자를 치료하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 질환이 CNS 질환임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 질환이 간질임을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 48항에 있어서, 질환이 척수소뇌성 실조증임을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 47항에 있어서, 질환이 심혈관 질환임을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 심혈관 질환이 비정상적 Ito전류와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  53. 칼륨 채널 관련 질환을 치료하는 데에 사용되는, 제 23항의 방법으로 동정된 화합물의 용도.
KR10-2003-7004460A 2000-09-27 2001-09-27 칼륨 채널 상호작용물질 및 이의 용도 KR20030074604A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7067312B1 (en) 2001-09-19 2006-06-27 Myriad Genetics, Inc. PN7718 nucleic acids and use thereof
EP1572102A4 (en) * 2002-11-01 2006-06-14 Decode Genetics Ehf HUMAN DIABETES TYPE II: PATHWAY OF THE KV-PROTEIN INTERACTION GENE (KCHIP1) LOCATED ON CHROMOSOME 5
US9029080B2 (en) * 2008-11-06 2015-05-12 Basf Se Screening assay for insecticides
CN105483276B (zh) * 2016-02-01 2019-06-11 成都望路医药技术有限公司 Kcnip4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4758997A (en) * 1996-10-17 1998-05-11 Nps Pharmaceuticals, Inc. Potassium channel blocking compounds and their use
US6117989A (en) * 1998-03-26 2000-09-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human calcium-binding proteins
JP2002530104A (ja) * 1998-11-20 2002-09-17 ミレニアム ファーマスーティカルズ インク カリウムチャンネル相互作用物質及びその利用法
AU5151100A (en) * 1999-05-19 2000-12-05 Incyte Genomics, Inc. Extracellular signaling molecules
EP1242443A4 (en) * 1999-12-23 2005-06-22 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES

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