KR20030073635A

KR20030073635A - 인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질

Info

Publication number: KR20030073635A
Application number: KR1020020013292A
Authority: KR
Inventors: 김진우
Original assignee: 김진우
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2003-09-19
Also published as: WO2003076563A3; AU2003215925A1; KR100472747B1; WO2003076563A2; AU2003215925A8

Abstract

본 발명은 신규 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 원암 유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 유방암, 난소암, 백혈병, 림프종, 자궁암, 폐암, 대장암, 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

인간 원암 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질{HUMAN PROTOONCOGENE AND PROTEIN ENCODED THEREIN}

본 발명은 기존의 보고된 원암 유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.

인간을 포함한 고등동물들은 약 100,000 개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15 %만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상, 즉 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화, 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death)등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee,Science257:967-971, 1992).

종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다.

종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M.,Cell64:235-248, 1991; Hunter, T.,Cell64:249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30 %는 원암 유전자가 증폭됨으로써 원암 유전자가 활성화되어 일어난다고 보고되어 있다. 원암 유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암 유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 자궁경부암 1 (HCCR-1)으로 명명된 원암 유전자가 암세포에서만 특이하게 발현된다는 것을 밝혀내어 이를 특허출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제2000-16757 호, 2000년 3월 31일). 원암 유전자는 구조적인 변이를 통하여 해당하는 단백질 산물의 질적 그리고 양적인 발현의 변화를 일으킨다 (Weinberg, R. A.,Cancer Research49:3713-3721, 1989). 암단백질은 세포 표면, 세포질 또는 핵에서 신호전달 경로 (signal transduction pathway)를 파괴하는데, 종양억제유전자 산물이 없는 경우 다른 종류의 암단백질과 함께 세포의 증식을 촉진하고, 세포주기 (cell cycle)를 교란시키며 또한 세포사멸 (아폽토시스) 기전을 파괴시킨다 (Todd, R.,Anticancer Research19:4729-4746, 2000).

이러한 단백질과 단백질의 상호작용을 규명해내는 효모 이-하이브리드 (Yeast two-hybrid) 방법은 1989년에 고안된 이래 (Fields, S. and Song, O.,Nature340:245-246, 1989), 세포사멸 기전 (Wallach, D. et al.,Curr Opin Immunol.10:131-136, 1998)과 여러 유전체계를 이용하여 생명현상을 밝히는데 매우 유용하게 이용되고 있다 (Pandey, A. and Mann, M.,Nature405:837-846, 2000). 본 발명자들은 효모 이-하이브리드 방법을 이용하여 새로운 원암 유전자인 KG-18 유전자를 밝혀내었으며 이를 미국 유전자 은행에 보고하여 신규 유전자임을 통고받았다 (GenBank Accession No.; AF 441865).

상기 원암 유전자는 유방암, 난소암, 백혈병, 림프종, 자궁암, 폐암, 대장암, 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 원암 유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 유도되는 mRNA에 상보적인 염기서열을 지닌 안티센스 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 안티센스 유전자를 사용하여 암을 치료 또는 예방하는 것이다.

본 발명의 한 태양에 따라, 서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 신규 원암 유전자 또는 그의 단편이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편이 제공된다.

도 1a는 정상 인간 12-열 다중 조직들, 즉 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간장, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 1b는 도 1a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 2a는 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 자궁암세포주인 HeLa, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주인 SW480, 폐암 세포주인 A549 및 흑색종 피부암 세포주인 G361들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 2b는 도 2a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 3a는 난소암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 도 3a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 4a는 유방암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 4b는 도 4a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 5a는 폐암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 5b는 도 5a와 동일한 샘플들을 β-액틴으로 하이브리드시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,

도 6a는 야생형 293 인간 태생기 신장세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이고,

도 6b는 KG-18 원암 유전자가 형질도입된 293 세포를 단층배양시킨 후 그 성장양상을 위상차 현미경으로 관찰한 것이고,

도 7은 KG-18 원암 유전자가 형질도입된 293 세포를 단층배양한 후 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 세포의 형태학적 특성을 관찰한 것이고,

도 8은 누드마우스에서 KG-18 원암 유전자가 형질도입된 293 세포의 종양형성능을 확인한 것이고,

도 9는 누드마우스에서 KG-18 원암 유전자가 형질도입된 293 세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것이고,

도 10은 KG-18 원암 유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 IPTG 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 SDS-PAGE 겔에서 전기영동한 결과이다.

본 발명의 신규 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)는 KG-18로 명명된 것으로서 서열번호: 1로 나타낸 바와 같은 523 bp 길이의 전체 염기서열을 가지며, 본 출원인에 의해 출원된 대한민국 특허출원 제 2000-16757 호에 기재된 인간 자궁경부암 1 (Human Cervical Cancer 1 protooncogene, HCCR-1, 이후 "HCCR-1 원암 유전자"로 지칭함)과 결합하는 성질을 가진다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 4 내지 339 부위에 해당하는 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 111개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "KG-18 단백질"로 지칭함).

그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암 유전자로부터 발현되는 단백질은 111개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2와 같은 서열을 가지며 크기는 약 12 kd이다. HCCR-1 원암 유전자로부터 코드되는 단백질에 결합하는 성질을 갖는 상기 단백질을 본 발명에서는 "HCCR-BP (HCCR-binding protein)" 또는 "KG-18 단백질"로 지칭한다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.

본 발명의 원암 유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 본원에서는 KG-18 원암 유전자 또는 그의 단편을 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 "KG-18 세포"로 지칭한다.

이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 예를 들면, pGEM-T 벡터 (Promega사)를 사용하여 KG-18 원암 유전자를 대장균 DH5α에 형질감염 (transfection)시키고, 이렇게 하여 얻어진 대장균 DH5α/KG-18/pGEM-T을 2001년 11월 8일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 10107BP 호로서 기탁하였다.

벡터의 제작시에는, 상기 원암 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현 조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.

본 발명의 유전자는 노던 블롯 (Northern blot) 등의 분석방법에서 정상 인간 조직들, 즉 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간장, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액들에서는 발현이 거의 확인되지 않은 반면 유방암, 난소암, 백혈병, 림프종, 자궁암, 폐암, 대장암, 피부암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 상기 암들을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 정상 293 태생기 신장세포 (human embryonic kidney; HEK)에 이 유전자를 형질도입 (transfection)시키면 정상 세포의 형태와는 전혀 다른 크기와 모양을 나타내는 형태의 세포 모양을 나타낸다. 새로운 형태의 세포들을 광학 현미경으로 분석하면 종양세포의 형태학적 소견을 확인할 수 있다. 즉 헤마톡실린-에오신 염색시에 암종 (carcinoma)이 확인되었다.

또한, 본 발명의 원암 유전자를 형질도입시킨 정상 293 태생기 신장세포를 누드 마우스의 둔위 부위에 접종시 약 14일이 경과하면서부터 종괴의 형성소견이 보이면서 약 21일이 경과시 1.5 ㎝ × 1.5 ㎝ 크기의 종양이 형성된다. 형성된 종괴는 헤마톡실린-에오신 염색시에 암종 (carcinoma)이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 원암 유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 원암 유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription polymerase chain reaction), 노던 블롯팅 (Northern blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자가 본 발명의 원암 유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는상기 원암 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.

형질전환 동물은 본 발명의 원암 유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본 발명에서, "안티센스 유전자 (anti-sense gene)"는 서열번호: 1의 원암 유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암 유전자의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암 유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 그 범위 내에 본 발명의 안티센스 유전자의 치료 효과량을 포함하며 환자에게 투여하여 암을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물을 이용한 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자를 포함하는 조성물은 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암 유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌 (J. S. Kim et al.,J. Controlled Release53:175-182, 1998)의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)를 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여한다.

본 발명의 항암 조성물은 활성성분으로서 본 발명의 안티센스 유전자를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.

실제로 투여되는 안티센스 유전자의 양은 치료하고자 하는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있다.

본 발명의 원암 유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암 유전자로부터 발현된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지된 효소 면역 측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역 측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 원암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암 유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 효모 이-하이브리드 분석

인간 원암 유전자인 HCCR-1 유전자 (Genebank Accession No.: AF195651)의 단백질 산물과 결합하는 단백질을 찾기 위하여, 매치메이커 LexA 이-하이브리드 시스템 (MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System; Clontech. Laboratories사)을 사용하고 기존의 보고된 방법 (Golemis, E. A.,et al.,Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons, Inc. Chapters 20.0 and 20.1, 1996)을 이용하여 실험을 수행하였다.

다음 실험에 이용된 균주와 벡터들은 상용화된 클론테크 (Clontech사)의 카탈로그 # K1609-1 키트에 포함된 것들이다.

효모 균주인 EGY48에 p8op-lacZ 벡터를 형질전환 (transformation)시킨 후 우라실 (Uracil)이 없는 합성 드롭아웃 (dropout) 배지인 SD/-우라실/글루코스 플레이트에 도말하여 자라는 균주 (colony)들을 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 SD/-우라실/글루코스 배지 (media)에서 배양한 후, HCCR-1 유전자를 pLexA 벡터의BamHI과SalI 부위에 삽입하여 제조한 벡터를 베이트 (bait)로서 이 효모 균주들에 형질전환시켰다. pLexA 벡터에 클로닝된 HCCR-1 유전자가 제대로 발현되는가를 확인하기 위하여, LexA 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 (western blotting)을 실시한 결과 원하는 크기인 64∼65 kDa에서 밴드를 얻을 수 있었다. 확인된 콜로니를 SD/-우라실, -히스티딘/글루코스 배지에서 배양한 후 인간 태아 뇌 (fetalbrain) 유래 AD 융합 라이브러리인 pBD42AD 벡터로 다시 형질전환시켰다. 베이트와 라이브러리가 결합하는 것을 확인하기 위하여 콜로니 리프팅 분석법 (colony lifting assay; Breeden, L. & Nasmyth, K.,Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio.50:643-650, 1985)을 수행하였다. 베이트와 라이브러리가 결합하면 X-gal이 들어있는 플레이트에서 파란색 콜로니가 형성된다. 효모를 배양한 후 글래스 비드 (glass bead)를 이용하여 DNA를 추출하고 대장균 (E. coli) KC8에 일렉트로포레이션법 (electroporation)으로 형질전환시킨 후 M9 최소 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 이것을 대장균 DH5α에 다시 형질전환시킨 후 DNA를 추출하여HindⅢ를 처리하여 원하는 크기인 약 0.5 kb를 갖는 클론을 구하였다.

<실시예 2> KG-18 원암 유전자의 전체 cDNA 서열 분석

실시예 1에서 수득한 클론을 통상적인 방법에 따라 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical사)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다. 그 결과, 서열번호: 1에 나타낸 523 bp로 이루어진 원암 유전자를 확인하여 이를 "KG-18"로 지칭하였으며 이 유전자가 삽입된 전체 KG-18 cDNA 클론을 2001년 11월 2일자로 등록번호 제 AF441865 호로 진뱅크 (GenBank)에 등록하였다.

서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암 유전자 KG-18의 전체 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 4내지 339에 해당하며, 서열번호: 2의 111개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.

상기 KG-18 유전자를 pGEM-T-easy 벡터 (Promega사)의 클로닝 부위에 T4 DNA 라이게이즈로 연결시켜 KG-18 발현 플라스미드 DNA를 제조하고, 제조된 플라스미드로 대장균 DH5α(Stratagene사)를 형질전환시켰다.

상기 수득한 대장균 DH5α/KG-18/pGEM-T을 2001년 11월 8일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 10107BP 호로서 기탁하였다.

<실시예 3> 다양한 세포와 조직들에서의 KG-18 유전자의 노던 블롯 분석

정상조직과 암세포에서 KG-18 유전자 발현 정도를 결정하기 위하여, 12종류의 장기에서 각각 정상 RNA를 추출하여 나이론 막위에 블롯팅시켜 놓은 상용화된 정상 인간 12-열 다중 조직들 (Clontech사) (도 1a 및 1b)과 8종류의 암세포들로부터 RNA들을 추출하여 막위에 블롯팅시켜 놓은 상용화된 인간 암세포 8-열 다중 조직들 (Clontech사) (도 2a 및 2b)를 구입하여 발현의 차이를 비교하였다. 두 종류의 막들은 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham사)을 사용하여 제조한³²P-표지된 무작위 프라임된 KG-18 전체 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 1a는 정상 인간 12-열 다중 조직들 (Clontech사), 즉, 뇌, 심장, 골격근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초혈액 백혈구 조직에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 1b는동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, KG-18 mRNA 전사물 (transcript)인 0.5 kb 전사물은 여러 정상조직들에서 발현이 확인되지 않았다.

도 2a는 인간 암 세포주들 (Clontech사), 즉, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 세포주에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, KG-18의 0.5 kb 전사물은 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 자궁암 세포주인 HeLa 세포, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주인 SW480, 폐암 세포주인 A549 및 피부암인 흑색종 세포주 G361 세포주들에서 높은 수준으로 발현되었다.

또한, KG-18 원암 유전자를 포함하는 스프라이싱 전의 전사물로 추정되는 약 7.5 kb 전사물도 전골수세포 백혈병 세포주인 HL-60, 자궁암 세포주인 HeLa 세포, 만성 골수 백혈병 세포주인 K-562, 임파구 백혈병 세포주인 MOLT-4, 버키트 림프종 세포주인 Raji, 대장암 세포주인 SW480, 폐암 세포주인 A549 및 피부암인 흑색종 세포주 G361 세포주들에서 높은 수준으로 발현되었다.

난소암, 유방암 및 폐암들에서 KG-18 유전자의 발현을 확인하기 위하여 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen사)를 사용하여 건강한 정상인의 난소, 유방 및 폐 조직, 및 난소암, 유방암 및 폐암 환자들로부터 얻은 난소암, 유방암 및 폐암 조직들에서 총 RNA를 추출하였다. 각각의 암조직들로부터 추출한 총 RNA 20 ㎍씩을 1 %포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim사)으로 옮겼다. 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham사)을 사용하여 제조한³²P-표지된 무작위 프라임된 KG-18 전체 cDNA 프로브로 블롯을 하이브리드시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.

도 3a는 정상 난소 조직, 난소암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, 난소암 조직들에서는 0.5 kb KG-18 mRNA 전사물의 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 난소 조직들에서는 발현 정도가 낮았다. 도 3a 및 3b에서, 정상열 (N)은 정상 난소 조직을, 암열 (C)은 난소암 조직을 각각 나타낸다.

도 4a는 정상 유방 조직 및 유방암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, 유방암 조직들에서는 0.5 kb KG-18 mRNA 전사물의 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 유방조직들에서는 발현 정도가 낮았다. 도 4a 및 4b에서, 정상열 (N)은 정상 유방 조직을, 암열 (C)은 유방암 조직을 각각 나타낸다.

도 5a는 정상 폐 조직 및 폐암 조직들에서 KG-18 원암 유전자의 발현여부를확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 하이브리드시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 폐암 조직들에서는 0.5 kb KG-18 mRNA 전사물의 현저한 유전자 발현이 관찰되었으나, 정상 폐조직들에서는 발현 정도가 낮았다. 도 5a 및 5b에서, 정상열 (N)은 정상 폐 조직을, 암열 (C)은 폐암 조직을 각각 나타낸다.

<실시예 4> 발현 벡터 및 형질전환된 세포의 제조

(단계 1) KG-18을 함유하는 벡터의 제조

KG-18의 코딩 부위를 함유하는 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다.

pcDNA3 (Invitrogen사) 진핵세포 발현 벡터에 추후 웨스턴 블롯팅 (western blotting)을 하는 경우 유전자의 삽입을 확인하기 위하여 먼저HindIII 와KpnI 제한효소 처리에 의해 글루타티온-S 트랜스퍼레이즈 (Glutathione-S Transferase; GST) 유전자를 도입시켰다. 상기 융합 벡터 pcDNA3-GST를 제한효소BamHI과XbaI으로 처리한 후 전체 코딩서열을 지닌 KG-18 유전자 (서열번호: 1에서 4 내지 339 염기에 해당함)를 상기 벡터에 연결하였다. 생성된 pcDNA3/GST/KG-18 발현 벡터를 리포펙타민 (Gibco BRL사)을 사용하여 293 인간 태생기 신장 상피세포 (ATCC CRL 1573)내로 형질도입시키고 G418 (Gibco BRL사)을 포함하는 DMEM (Gibco BRL사) 배지에서 선별하였다. KG-18 유전자가 형질도입된 293 세포를 "KG-18 세포"로 지칭하였다.

(단계 2) KG-18 원암 유전자를 형질도입시킨 293 인간 태생기 신장 상피세포

정상 293 상피세포 및 단계 1)에서 얻은 KG-18을 발현하는 293 세포 (KG-18세포)를 10% 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 단층배양한 후, 그 성장 양상을 위상차 현미경 (Phase contrast microscopy, Olympus사)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 분화된 상피세포인 정상 293 세포는 길고 가느다란 핵과 빈약한 세포질을 지닌 방추형 세포이다. KG-18 세포에서 KG-18이 발현되는 경우, 세포의 형태는 도 6b에 나타낸 바와 같이 난형의 핵 및 다량의 세포질을 지닌 다각형 모양으로 변화되었다.

단층배양한 KG-18 세포를 헤마톡실린-에오신 (hematoxylin-eosin, H & E)으로 염색한 후 관찰한 결과, 핵의 다형성, 뚜렷한 핵소체, 및 과립상 염색질 소견 및 종양 거대세포들을 보여주었고, 비정형 유사분열이 관찰되었다 (도 7).

<실시예 5> 동물에서 KG-18 원암 유전자의 종양 형성능 유무 조사

생후 5주된 10마리의 누드 마우스 (athymic nu/nu on BALB/c background; 대덕 화학연구소)를 대상으로 5 × 10⁶개의 원암 유전자 KG-18을 형질감염시킨 인간 293 세포 (KG-18 세포)를 각각 둔위 부위의 피하에 주입하였다. 피하 종양의 크기가 1.5 내지 2.5 ㎝가 되었을 때 누드 마우스를 희생시켰다.

도 8에 나타낸 바와 같이, KG-18 세포를 주입한 10마리의 마우스 모두가 21일 후 뚜렷한 종양을 나타내었다. KG-18 세포가 이식된 누드 마우스는 암종의 특성을 나타낸다. 도 9는 누드 마우스에서 KG-18 원암 유전자가 형질도입된 293 세포에 의해 형성된 종괴를 헤마톡실린-에오신으로 염색한 후 형태학적 특성을 관찰한 것으로, 섬유상 간질 조직에 의해 분리된 전형적인 암종세포를 나타낸다.

<실시예 6> KG-18 원암 유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기 결정

서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 4 내지 339에 해당하고, 서열번호: 2의 아미노산 번호 1 내지 111을 코드하는 것으로 예측되는 KG-18 원암 유전자의 코딩영역 전체를 GST 유전자가 융합된 pGEX 4T-3 벡터 (Amersham Pharmacia Biotech사)의 다중 클로닝 부위 내BamHI과NotI 제한효소 부위에 삽입하여 pGEX 4T-3/KG-18 벡터를 제조한 후, 이를 대장균 BL21 (ATCC 47092)에 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균을 LB 배양액에서 37℃로 16시간동안 진탕 배양한 후, 배양액을 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 1 mM의 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노즈 (Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside, IPTG, Sigma사)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.

IPTG 유도 전후에 배양액 시료를 취하여 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 도 10은 pGEX 4T-3/KG-18 벡터로 형질감염된 대장균 BL21 균주의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, IPTG 유도 후에 약 38 kDa의 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 38 kDa 융합단백질은 pGEX 4T-3 벡터의 유전자로부터 발현된 약 26 kDa 크기의 GST 단백질을 함유하고 있다.

본 발명의 원암 유전자는 기존의 보고된 발암 유전자와는 전혀 상동성을 나타내지 않는 신규 유전자로서 유방암, 난소암, 백혈병, 림프종, 자궁암, 폐암, 대장암, 피부암 등을 비롯한 암의 진단, 형질전환 동물의 제조 및 안티-센스 (anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

서열번호: 1의 염기서열을 갖는 인간 KG-18 원암 유전자 또는 그의 단편.
제 1항의 KG-18 원암 유전자에 의해 코드되며 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편.
제 1항의 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 벡터.
제 3항의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
제 4항에 있어서,

대장균 DH5α/KG-18/pGEM-T (기탁번호: KCTC 10107BP)인 미생물.
제 4항 또는 제 5항의 미생물을 배양하여 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제조하는 방법.
제 1항의 원암 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
제 2항의 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
제 1항의 원암 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA의 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암 유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자.