KR20030071373A

KR20030071373A - 생리활성물질 또는 약물을 효과적으로 전달하는 요오드화오일 계열 지방유제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20030071373A
Application number: KR1020020011040A
Authority: KR
Inventors: 정서영; 권익찬; 정혜선; 김영진
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2003-09-03
Also published as: KR100428418B1

Abstract

본 발명은 세포 내로 유전자 DNA와 같은 생리활성물질 및 생물학적 활성 약물을 전달할 수 있는 요오드화 오일 또는 스쿠알렌/요오드화 오일 계열 지방유제, 이들을 이용한 제제 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 요오드화 오일 또는 스쿠알렌/요오드화 오일 계열 지방유제를 사용하여 세포 내로 DNA와 같은 생물학적 활성물질 또는 약물을 효과적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.

Description

생리활성물질 또는 약물을 효과적으로 전달하는 요오드화 오일 계열 지방유제 및 그 제조방법{IODIZED OIL EMULSION AS AN EFFICIENT PHYSIOLOGICALLY ACTIVE MATERIALS OR DRUG CARRIER AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 생체적합성을 가지며, 생분해성인 물질을 이용하여 제조된 요오드화 오일을 유상으로 하는 수중유 형(oil-in-water type)의 지방유제, 상기 지방유제와 유전자 등의 생리활성물질, 또는 지용성 또는 양쪽성 약물과의 복합 제제, 그들의 제조방법 및 상기 복합 제제를 사용하여 효율적으로 세포 내에 세포 활성물질을 전달하는 방법에 관한 것이다.

유전자 전달체계로 사용되는 지질입자들의 대표적인 예로서 리포좀과 지방유제 등을 들 수 있다. 리포좀을 이용한 유전자 요법은 이미 임상적용의 단계에 와 있고, 최근 3 년간 많은 연구 결과가 보고되어 있다. 최근 개발된 트리글리세라이드 계열 지방유제는 유전자와 복합 제제를 형성했을 때, 혈청 존재 하에서도 복합 제제의 물리적 안정성이 유지되고, 형질주입효율이 감소하지 않으며, 효율적으로 세포 내로 유전자를 전달하는 것으로 연구되어 있다(한국특허 특1998-067138). 그러나, 이러한 트리글리세라이드 계열 지방유제는 고분자성 지질(polymeric lipid)을 유화제로 첨가하지 않았을 때에는 안정성에 문제가 있다. 즉, 고분자성 지질의 일종인 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜)2000] (PEG2000PE)가 없을 때에는 지방유제 자체가 불안정해지며, 형질주입효율 역시 현격히 감소한다. 지방유제에 안정성을 부여하는 폴리에틸렌 글리콜 계열 고분자성 지질로는, PEG2000PE 이외에도 Span, Tween, Brij 등이 있다. 그러나, 이러한 물질들은, 입체장애로 인해 유전자와 지방유제와의 결합을 방해하는 문제점을 가지고 있다. 이와 같은 이유로, 고분자성 지질을 유화제로 사용한 양이온성 지방유제는, 유전자와 복합 제제를 형성함에 있어서, +/- 전하 비율로 볼 때 약 3∼4 배의 과량이 필요하게 된다. 이러한 과량 첨가의 문제점을 극복하기 위하여, 고분자성 지질을 첨가하지 않거나, 최소량의 고분자성 지질을 첨가함으로써, 안정한 지방유제를 제조하는 연구가 수행되었다. 그 일환으로 지방유제의 안정성에 영향을 미치는 여러 가지 인자 중 하나인 지방유제 기재(oil core)를 바꾸면서 유제를 제조하였다(한국특허 특2000-0012106). 적합한 지방유제 기재를 선정하기 위하여, Sigma Chemical Company의 카탈로그에 나오는 기름 중에서 독성이 낮고, 생체에 적합한 기름들을 이용하여 지방유제들을 제조하였다. 그 결과, 제조한 유제 중 스쿠알렌을 지방유제 기재로 하는 유제가 스쿠알렌의 물과의 계면에서의 높은 계면장력 때문에 아주 안정한 유제를 만들 수 있다는 것을 알아내었다. 이 때, 스쿠알렌을 지방유제 기재로 선정하게 된 것은 독성이 낮고 체내에서 대사가 될 수 있기 때문이다.

그러나, 이와 같이 개발된 스쿠알렌으로 제조된 지방유제는 스쿠알렌이 물보다 비중이 작은 오일이기 때문에, 실제 유전자 발현 효율 실험을 할 때에 있어서, 배지(media) 내에서 고르게 분산되게 된다. 이러한 이유로, 상기 스쿠알렌 기재의 지방유제는, 실험시 상대적으로 가라앉아 세포와의 접촉이 많은 리포펙타민, 리포펙틴 등의 리포좀 제형에 비하여 세포와의 접촉 기회가 적기 때문에, 발현효율이 떨어지는 문제점을 가지고 있었다.

또한, 종래의 지방유제는 혈청의 존재하에서 세포전달 효율이 현저하게 감소하기 때문에, 종래의 지방유제와 세포전달물질의 복합용액을 사용하는 유전자 발현 효율 실험에 있어서, 트랜스펙션 시키기 전에 혈청과 배지를 제거한 후, 지방유제 복합 용액을 첨가하여 트랜스펙션 시켜야 하기 때문에 단계가 복잡하고 발현 효율이 떨어진다는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 물보다 비중이 큰 요오드화 오일(iodized oil)을 이용하여 배지 내에서 가라앉는 지방유제를 제조함으로써, 세포와의 접촉 기회를 획기적으로 증가시켰다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명은 스쿠알렌과 요오드화 오일 등의 기름을 지방유제 기재로 하고 양 전하를 띠는 양이온성 계면활성제를 유화제로 사용하여 제조된 지방유제 및 그의 제조방법을 제공함으로써, 유전자 등과 같은 생리활성 물질을 효율적으로 전달할 수 있는 요오드화 오일 및 스쿠알렌/요오드화 오일 계열의 생리활성물질-지방유제 복합 제제 및 그의 제조방법, 약물을 효과적으로 전달할 수 있는, 요오드화 오일 및 스쿠알렌/요오드화 오일 계열의 약물-지방유제 복합 제제 및 그의 제조방법 및 상기 지방유제를 이용하여 유전자 및 약물을 효율적으로 세포 및 체내로 전달하는 방법을 제공한다.

도 1은 DNA/요오드화 오일 지방유제 복합 제제의 조성에 따른 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

1 번 줄 - 빈 것

2 - 11 번 줄 - DNA:지방유제의 비율이 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.5인 복합 제제

12 번 줄 - 순수한 DNA

도 2a는 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제의 조성비와 크기의 변화와의 상관관계를 도시한 그래프이며, 도 2b는 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제의 조성비와 표면전하와의 상관관계를 도시한 그래프이다.

도 3은 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제에서 DNA:DOTAP의 조성비의 변화에 따른 지질 유전자 전달체의 형질주입 효율의 변화를 도시한 그래프이다.

( ■ - 무혈청, □ - 혈청 10% )

도 4는 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제에서 내부 오일인 스쿠알렌과 요오드화 오일의 조성비의 변화에 따른 지질 유전자전달체의 형질주입 효율의변화를 도시한 그래프이다.

( ■ - 무혈청, □ - 혈청 10% )

도 5a는 점착성 세포주에서 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제의 형질주입 효율의 변화를 도시한 그래프이며(혈청 10%), 도 5b는 부유성 세포주에서 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제의 형질주입 효율의 변화를 도시한 그래프이다(혈청 10%).

도 6은 여러 가지 점착성 세포주에서 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제에서 내부오일인 스쿠알렌과 요오드화 오일의 조성비의 변화에 따른 지질 유전자 전달체의 형질주입 효율의 변화를 도시한 그래프이다(혈청 10%).

도 7은 COS-1 세포주에서 요오드화 오일 지방유제와 DNA의 복합 제제의 독성 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 8은 단순화된 실험 방법에 의한 요오드화 오일 지방유제와 DNA 복합 제제의 형질 주입 효율의 변화를 도시한 그래프이다.

본 발명은 유전자와 같은 생리활성 물질 또는 약물을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 지방 유제 및 그 제조방법, 상기 지방유제와, 유전자 등의 생리활성물질 또는 약물과의 복합 제제 및 그 제조 방법, 및 상기 복합 제제를 사용하여 세포활성물질을 세포 내로 효율적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 유제(emulsion)라 함은 두 가지 또는 그 이상의 섞이지 않는 액체가 계면활성제(emulsifier)에 의하여 분산되어 입자가 안정화된 불균질한 혼합물을 의미한다.

우선, 본 발명은 유전자와 같은 생리활성 물질 또는 약물을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 지방유제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 지방 유제는 (a)요오드화 오일 또는 요오드 오일과 1 가지 이상의 비트리글리세라이드계 오일이 혼합된 오일 혼합물 지방 유제 기재 2 ~ 30중량%, (b) 1 가지 이상의 유화제 0.01 ~ 40중량%, 및 (c) 나머지를 차지하는 물로 이루어진다.

본 발명의 지방유제는 상기 지방유제 기재로서 요오드화 오일 또는 요오드화 오일과 한 가지 이상의 비트리글리세라이드계 오일의 오일 혼합물을 포함하며, 전체 지방유제에 대하여 2 내지 30 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 오일 혼합물의 비트리글리세라이드계 오일로서는 스쿠알렌, 스쿠알란 등을 사용할 수 있고, 요오드화 오일로는 요오드화 양귀비씨 기름 (iodized poppy seed oil), 에티오돌 (ethiodol), 요오드화 대두유 (iodized soybean oil) 등을 사용할 수 있다. 요오드화 오일과 비트리글리세라이드계 오일 혼합물을 포함하는 경우, 상기 오일 혼합물의 요오드화 오일의 비율이 높을수록 오일 내부의 밀도가 증가하여, 시험관내 실험시 지방유제-생체활성물질 복합 제제 또는 약물-지방유제 복합 제제가 가라앉아 세포와의 접촉가능성이 높아지므로 유전자 발현 효율이 높아지게 된다. 따라서, 상기 오일의 혼합물이 요오드화 오일을 오일 혼합물 중량에 대하여 40 % 이상으로 함유하는 것이 바람직하다(표 1 및 도 4참조).

상기 유화제로서 양이온성 계면활성제를 사용하며, 이는 얻어진 지방유제가 전달하고자 하는 DNA와 같이 음전하를 띠는 생리활성물질과 복합 제제를 형성할 수 있도록 지방유제 표면이 양전하를 띠게 하기 위하여 선택되는 것으로서, 한 가지 이상의 양이온성 계면활성제를 전체 지방유제에 대하여 0.01 내지 40 중량%의 함량으로 포함하는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 지방유제는 유화제로서, 상기 양이온성 계면활성제와 더불어 비이온성 계면활성제나 인지질, 지방산, 지방 알코올 (fatty alcohol), 담즙산, 또는 콜레스테롤 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

유화제로 작용하는 양이온성 계면활성제로서, 예컨대, 1,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모니움 프로판(DMMAP), 1,2-다이팔미토일-3-트리메틸암모니움 프로판(DPTAP), 1,2-다이스테아로일-3-트리메틸암모니움 프로판(DSTAP), 1,2-다이올레일-3-트리메틸암모니움 프로판(DOTAP), 1,2-다이미리스토일-3-다이메틸암모니움 프로판(DMDAP), 1,2-다이팔미토일-3-다이메틸암모니움 프로판(DPDAP), 1,2-다이라우로일-3-다이메틸암모니움 프로판 (DLDAP), 1,2-다이라우로일-3-트리메틸암모니움 프로판 (DLTAP), 1,2-다이스테아로일-3-다이메틸암모니움 프로판(DSDAP), 1,2-다이올레일-3-다이메틸암모니움 프로판(DODAP), 다이메틸 다이옥타데실암모니움 브로마이드(DDAB) 또는 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA), 1,2-다이올레일-3-에틸포스포콜린 (DOEPC) 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있다. 상기 양이온성 계면 활성제들은 DNA 등과 같이 음성전하를 띠는 생리활성물질과의 복합 제제 형성을 용이하게 할뿐만 아니라, 여분의 양성전하로 세포와 접촉을 촉진시키므로 바람직하다.

상기 비이온성 계면활성제로서, 예컨대, 폴옥사머(Poloxamer, Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, BASF 사 제품), 솔비탄 에스테르(Sorbitan esters, Span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄(polyoxyethylene sorbitans, Tween), 폴리옥시에틸렌 에테르(polyoxyehtylene ethers, Brij) 계열 등을 포함할 수 있다.

상기 인지질로서, 예컨대, 포스파티딜콜린(PC) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(PE) 유도체, 포스파티딜세린(PS) 유도체 등을 포함할 수 있다. 상기 인지질 중에서, L-α-다이올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)은 형질주입 효율을 상승시키는 중성지질로써 엔도솜(endosome)의 막을 깨뜨려서 유전자를 세포질로 노출시키는 것으로 알려져 있다.

특히, DOPE 및 다이올레인 등과 같은 용해성 지질(fusogenic lipid)은 유화제로서 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 지방유제의 안정성을 향상시키기 위하여, 지방산, 지방 알코올(fatty alcohol), 콜레스테롤, 담즙산 등을 유화제로서 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 지방유제는 용해성 펩타이드 또는 용해성 단백질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10 중량%의 양으로 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 용해성 펩타이드로는 세포막을 쉽게 통과하는 인플루엔자 바이러스, HIV 바이러스등과 유사한 구조를 가지는 펩타이드를 합성하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 지방유제는 친수성 고분자 또는 친수성 고분자가 결합된 인지질, 디아세틸레이트화 인지질(diacetylated phospholipid)과 같이 중합가능한 인지질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10 중량%의 양으로 추가적으로 포함할 수 있다.

이 때, 상기 친수성 고분자로서, 예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리에틸옥사졸린, 폴리에틸렌글리콜(PEG)등을 사용할 수 있다. 특히, PEG는 지방유제에 입체구조를 부여함으로써 지방유제의 안정성을 향상시키며, 또한 PEG 자체가 형질주입 제제로도 사용되어 형질주입 효과를 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 지방유제는 DNA 등 생체활성물질 또는 약물을 전달하고자 하는 표적세포에 대한 표적화를 위하여, 당지질(glycolipid), 리포펩타이드, 항체, 수용체에 대한 리간드 또는 바이러스성 단백질 등과 같은 표적화 물질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10 중량%의 양으로 추가적으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 지방유제는 DNA등의 응축(condensation)을 보조하기 위하여, 프로타민 설페이트(protamin sulfate), 히스톤(histone) 또는 폴리라이신(polylysine)과 같은 양성고분자(polycation)를 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10 중량%의 양으로 추가적으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 지방유제는 DNA등의 응축을 보조하고, 지질 담체와 DNA사이의 상호작용을 변화시키기 위하여, 일가 또는 다가 음이온을 전체 지방유제에 대하여 0.01-5 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 등의 생리활성 물질 또는 약물을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 지방유제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전체 지방유제에 대하여 0.01-40 중량%의 유화제를 물과 혼합하여 수화시킨 후, 분해처리 하고, 상기에서 형성된 용액에 전체 지방유제에 대하여 2-30 중량%의 요오드화 오일 또는 요오드화 오일과 비트리글리세라이드계 오일의 혼합물을 첨가한 후, 분해 처리하여 유전자 등의 생리활성 물질 또는 약물을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 지방유제의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10 중량%의 추가적 첨가제를 첨가하는 단계가 추가적으로 포함할 수있다. 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 요오드화 오일, 비트리글리세라이드계 오일, 유화제 및 추가적 첨가제는 상기한 바와 같다.

또한, 본 발명은 상기 지방유제와 유전자 등의 생리활성 물질 또는 약물과의 복합 제제 및 그 제조방법을 제공한다. 상기 생리활성물질로서, DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보좀, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고 뉴클레오타이드를 사용할 수 있고, 약물로서 항바이러스제, 스테로이드계 소염제 (SAID), 비스테로이드계 소염제 (NSAID), 항생제, 항진균제, 비타민, 호르몬, 레티노인산, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 항암제, 항대사제, 축동제 (miotics), 콜린작동성 약물, 안드레날린 길항제, 항경련제, 항불안제, 정온제, 항우울제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 에스트로겐, 프로게스테론, 글리코사미노글리칸, 폴리뉴클레오타이드, 면역억제제 및 면역촉진제 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

생리활성물질-지방유제 복합 제제에 있어서, 상기 생리활성물질은 유화제로 작용하는 양이온성 계면활성제와 결합하여 작용하므로, 생리활성물질과 지방유제의 결합비율은 생리활성물질의 중량과 지방유제 내의 양이온성 계면활성제의 중량으로 표시하는 것일 용이하다. 따라서, 본 명세서 및 도면에 표시된 생리활성물질(DNA 등)과 지방유제의 비율은 모두 생리활성물질의 중량과 지방유제 내 양이온성 계면활성제의 중량의 비율로 나타내었다. 상기 생리활성물질-지방유제 복합 제제의 결합비율은 생리활성물질의 중량:지방유제 내 양이온성 계면활성제의 중량으로, 1:2 내지 1:8이 바람직하며, 1:4 내지 1:6이 더욱 바람직하다(도 3 참조).

약물-지방유제 복합 제제에 있어서, 상기 약물은 오일상의 지방유제 기재에혼합되어 복합 제제를 형성한다. 이 때, 혼합되는 약물의 양은 전체 복합 제제에 대하여 0.01 내지 10 중량%가 바람직하다.

본 발명에 따른 지방유제에 의하여, 적혈구, 백혈구, 섬유아세포, 종양세포, 바이러스에 감염된 세포, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 간 세포, 내분비선 세포, 신경 세포, 피부 세포, 성 세포, 난자, 정자, 조혈 세포, 태 세포, M 세포, 랑게르한스섬 세포, 거식구, 식물 세포 또는 동물 세포와 같은 표적세포에 생리활성물질 또는 약물을 전달할 수 있다.

본 발명에 따른 지방유제를 약물 또는 생리활성물질 전달시스템으로 적용할 때, 지방유제를 예방, 진단, 치료의 목적으로 정맥 주사, 근육내 주사, 비강내 투여, 피하 주사, 피내 주사, 기관내 투여 또는 피부에 직접 적용할 수 있다.

또한, 본발명은 in vivo 또는 in vitro에서 상기 생리활성물질 또는 약물을 표적세포 내로 전달하기 위하여 사용되는 본 발명의 지방유제의 용도에 관한 것이다. 유전자 등의 생리활성물질 또는 약물을 세포 내로 전달하는 유제의 생체내 또는 생체외 적용시, 약물을 세포 내로 전달할 때의 혈청 효과를 반드시 고려하여야 한다. 본 발명에 따른 지방유제는 혈청이 고농도로 존재하는 경우에도 안정하게 유지되며, 또한 높은 정도로 세포 내로 형질주입될 수 있다.

특히, 시험관내 세포 발현효율 시험방법은, 종래의 리포좀 제형이 혈청 존재하에서 발현 효율이 급격히 떨어지는 문제가 있어서, 혈청을 배제하기 위한 단계를 포함하여야 하지만, 본 발명의 지방유제는 혈청 존재하에서도 우수한 유전자 발현 효율을 보여주기 때문에, 상기와 같이 혈청을 배제하기 위하여 혈청을 함유하지 않은 배지로 표적세포를 세척하는 단계와 형질주입 후 세포를 배양하기 위하여 다시 혈청을 함유하는 배지를 첨가하는 단계가 필요하지 않게 된다. 따라서 본 발명은 간편하면서 효율적인 시험관내 유전자 발현 효율 시험 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 세포를 혈청을 함유하는 배지에서 배양하고 배지를 제거한 후, 여기에 본 발명의 생리활성물질-지방유제 복합 용액 또는 약물-지방유제 복합 용액을 첨가하여 형질주입을 수행한 후, 세포를 배양하는 간단하면서도 효율적인 시험관내 세포 발현효율 시험방법을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은, 처음 배양한 배지를 제거하는 단계도 생략된 보다 단순화되고 개선된 시험관 내 세포발현 효율 시험방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 시험관 내 세포발현 효율 시험방법은, 형질주입할 세포들을 혈청을 함유하는 배지에서 배양한 후, 본 발명의 생리활성물질-지방유제 복합 제제 또는 약물-지방유제 복합 제제를 직접 혈청을 함유하는 배양액에 첨가하는 단계로 구성되는 시험관 내 세포발현 효율 시험방법을 제공한다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1.

지방 유제의 내부 오일의 밀도

지방유제를 만드는데 들어가는 내부 오일의 밀도가 점착성 세포주에서의 유전자 발현 효율에 영향을 미친다. 오일의 밀도가 커질수록 시험관내 실험의 경우에 복합 제제가 밑으로 가라앉아 세포와의 접촉가능성이 높아지므로 유전자 발현 효율이 높아지게 된다. 스쿠알렌(Sigma), 요오드화 오일(Lipiodol, Guerbet), 및 이들의 혼합물의 밀도를 표 1에 나타내었다.

오일 혼합물 중량비(스쿠알렌:요오드화 오일)	밀도(g/ml)
스쿠알렌	0.8336
80:20	0.9302
60:40	1.0210
40:60	1.1032
20:80	1.1552
요오드화 오일	1.2680

실시예 2.

지방 유제의 제조

유상으로 요오드화 오일(Lipiodol) 계열 10%(v/v)을 사용하고 수상으로는 DOTAP(Avanti Polar Lipids) 리포좀 용액을 사용하였다. DOTAP을 24 mg/ml의 농도로 물과 섞고 37℃에서 수화시킨 후, 프로브타입 소니케이터로 2분간 초음파 분해 처리하여 리포좀을 형성시킨다. 형성된 리포좀 용액에 표 1에 있는 다양한 밀도의 스쿠알렌/요오드화 오일 혼합 오일 혼합물을 각각 최종 부피의 10 %가 되도록 첨가한 후, 2분간 3번에 걸쳐 초음파 분해 처리하여 지방 유제를 제조하였다.

실시예 3.

양이온성 지방유제와 DNA 와의 복합 제제 형성

음전하를 갖는 DNA와 지방유제가 결합된 유전자 전달 체계 복합 제제의 특성을 알아보기 위하여, 실시예 2에 따라서 제조된 지방유제의 양에 따른 DNA와의 복합 제제 형성 여부를 실험하였다. 시험관 내에서, 실시예 1에서 제조된 지방유제 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ㎍과 1 ㎍의 pCMV-베타(Clontech Laboratories)를 실온에서 혼합한 후, 30 분간 실온에서 방치하였다.

1% 아가로즈 젤에 상기의 복합 제제 혼합액을 적재하고, 트리스 아세테이트-EDTA 완충용액 (pH 8.0)을 통하여 전기영동하였다. 전기영동 후, 에티움 브로마이드로 30분간 염색하여 DNA-지방유제 복합 제제의 형성을 확인하고, 그 결과를 도 1 에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 지방유제의 양이 DNA의 1.5 배 이상일 때 음전하를 띠고 있는 DNA와 효과적으로 결합하여 복합 제제를 형성함을 알 수 있다.

지방 유제의 양을 변화시키면서 DNA와 결합을 유도한 복합 제제를 3차 증류수로 300배 희석한 후, Malvern Zetasizer(QELS 방법)로 그 크기와 표면전하 (ζ potential)를 측정하였으며(n=3), 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 복합 제제의 크기는, DNA와 지방유제의 비율(DNA의 중량:지방유제 내 DOTAP의 중량)이 1:1 일 때, 350 nm 정도로 비교적 크며, 지방유제의 양이 늘어나면서 줄어들어 1:3 이상에서는 240 - 230 nm 정도로 일정하였다. 또한, 도2b에 나타낸 바와 같이, 표면전하도 DNA와 지방유제의 비율이 1:1에서 14 mV 정도였다가 1:2에서는 49 mV 로 나타나고, 지방유제의 비율이 증가함에 따라 60 mV (요오드화 오일의 표면전하값)까지 서서히 증가하였다(3회 측정한 평균±표준편차).

실시예 4.

COS-1 세포주에서 양이온성 지방유제의 형질주입 효율 분석

시험관 내의 실험에서는 COS-1을 표준으로 하여 형질주입 효율을 분석하였다. COS-1 세포를 형질주입하기 약 12 시간 전 96 웰(well) 플레이트에 1 x 10⁴개 접종하였다. 0.5 ㎍의 pCMV-beta와 2 ㎍의 여러 종류의 리포좀(DOTAP 리포좀, 리포펙타민 또는 수퍼펙트)과, 다양한 양 (DOTAP 기준)의 실시예 2에 따른 지방유제를 각각 혈청을 함유하지 않는 DMEM 20 ㎕로 희석하였다. 희석된 리포좀 용액과 지방유제 용액을 각각 희석한 DNA 용액에 첨가하고 혼합한 후, 아래 위로 10 번 씩 섞어 주고 실온에서 30분 동안 방치하였다. 형질주입할 표적세포를 혈청을 함유하지 않은 DMEM으로 세척하고, 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지 160 ㎕를 첨가한 후, 지방유제의 함유량이 각기 다른 지방유제-DNA 복합 제제를 각각 첨가하였다. 그리고 나서, 세포 내로 DNA를 전달시키기 위하여, 상기 혼합용액을 1시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한 후, 세포를 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지로 세척하여 세포 내로 전달되지 않은 지방유제-DNA 복합 제제를 제거하고, 10%의 혈청이 포함된 배지를 다시 첨가하여 24 시간동안 배양하였다.

형질주입 후 24 시간 뒤, 페트리디쉬에서 배지를 제거하고 200 ㎕의 PBS로 세포를 세척한 후, 50 ㎕의 용해용액(lysis solution ; 0.1% .Triton X-100, 250 mM Tris, pH8.0)을 첨가하여 이를 - 70℃에서 냉동시키고, 이것을 다시 녹여서 세포를 완전히 용해시켰다. 각각의 웰에 50 ㎕의 0.5%의 우혈청 알부민을 포함하는 PBS용액을 첨가한 후, 다시 150 ㎕의 기질용액(1mg/ml 농도의 클로람페니콜 레드 갈락토피라노사이드)을 첨가하여 상온에서 약 1시간 동안 효소 반응시켰다. 상기의 방법과 동일하게 효소 반응시킨 후, 570 nm 에서 흡광도를 측정하여 상대적인 값으로 재조합 β-갈락토시데이즈의 활성을 산출하였다(n=3). 형질주입 효율은 상기의 베타-갈락토시데이즈의 활성으로 상대적으로 평가하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 지방유제를 포함하는 복합 제제는 혈청의 존재하에서도 높은 발현율을 나타내었다.

실시예 5.

COS-1 세포주에서 내부오일이 지방유제의 형질주입에 미치는 영향

지방유제의 내부오일의 밀도의 변화에 따라 DNA의 세포 내로의 전달능력을 알아보기 위하여 다양한 밀도의 내부 오일을 가지는 지방유제를 가지고 COS-1 세포주(한국세포주은행)에서 실시예 4의 방법에 따라 형질주입하고 효율을 분석하였다. 이상의 여러 지방유제의 형질주입 효율 실험 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 내부오일의 밀도가 커질수록 점착성 세포주에서 세포와의 접촉율이 많아져서 세포에서의 우수한 발현 효율을 나타내었다.

실시예 6.

다양한 세포주에서 양이온성 지방유제의 형질주입 효율 분석

실시예 4의 방법과 동일하게 다양한 세포주(COS-1, B16F10 (ATCC), Hela, Hep3B, H1299, MPC-11 및 Jurkat(한국세포주은행))에서의 요오드화 오일 계열 기재의 지방유제 및 수퍼펙트의 형질 주입 효율을 분석하여, 점착성 세포주(COS-1, B16F10, Hela, Hep3B 및 H1299)에서의 결과를 도 5a에, 부유성 세포주(MPC-11 및 Jurkat)에서의 결과를 도 5b에 각각 나타내었다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 내부오일을 밀도가 큰 요오드화 오일을 사용하여 형질 주입 실험을 하는 것이 세포와의 접촉이 늘어나 형질 주입 효율이 높게 나타났으며, 점착성 세포주에서의 우수한 형질 주입효율을 얻기 위하여 본 발명의 요오드화 오일을 포함하는 지방유제를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다. 도 5b에서는, 부유성 세포주에서는 밀도가 큰 요오드화 오일 계열의 지방유제가 수퍼펙트에 비하여 발현 효율이 낮게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 7.

다양한 세포주에서 내부오일이 지방유제의 형질주입에 미치는 영향

다양한 점착성 세포주에서 내부 오일의 밀도를 변화시키면서 실시예 4의 방법에 따라 지방유제의 발현 효율은 분석하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 내부오일의 밀도가 커질수록 점착성 세포주에서 세포와의 접촉율이 많아져서 세포에서의 우수한 발현 효율을 나타내었다.

실시예 8.

세포독성실험.

살아 있는 세포를 테트라졸륨 염인 MTT (3-4,5-디메틸티아졸-2-일),2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드를 사용하여 정량화할 수 있다. 테트라졸륨 염은 각종 탈수소 효소들에 의해 활성을 나타낸다. 테트라졸륨환은 활성 있는 미토콘드리아를 가지고 있는 살아있는 세포에서만 개환되어 황색의 수용성 테트라졸륨 염료가 보라색의 포르마잔 생성물로 변환된다. 이 반응은 정량성이 있으므로 스캐닝 멀티웰 분광광도계(ELISA 판독기)를 사용하여 빠르고 정확하게 살아있는 세포를 정량할 수 있다.

COS-1 세포를 실험하기 하루 전에 1 x 10⁴세포/웰로 96 웰 플레이트에 접종하였다. 지방유제를 일정량 취하여 성장 배지로 최종 부피를 200 ㎕로 맞춘 후 배지를 제거한 세포에 넣어주었다. 24 시간동안 배양한 후 매질을 제거하였다. PBS 용액으로 2번 세척하고 새로운 매질 200 ㎕와 MTT 용액 50 ㎕를 첨가한 후, 알루미늄 호일로 싸서 4시간동안 배양하였다. 매질을 제거한 후, MTT-포르마잔 결정에 DMSO 200 ㎕를 넣어 녹였다. 글리신 버퍼 50 ㎕를 넣은 후, 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다 (n=3). 이상의 여러 지방유제들의 세포독성 실험 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 요오드화 오일 계열의 지방 유제의 경우에 DNA 와의 조성이 DOTAP 기준으로 4배 정도이고 혈청이 존재하지 않는 경우에 독성이 아주 큰 것으로 나타났다. 그러나, 혈청 존재하에서는 요오드화 오일 계열의 지방유제들이 세포 독성이 크지 않아 일반적인 시험관내의 발현 실험시 혈청 존재하에서 독성도 적으면서 우수한 발현 효율을 나타내는 장점이 있다.

실시예 9.

양이온성 지방 유제의 시험관내의 형질주입 실험의 단순화

일반적으로 시험관내의 유전자 발현 효율 실험은 실시예 4의 방식으로 많이 행해진다. 그 이유는 주로 리포좀 제형이 혈청 존재하에서 발현 효율이 급격히 떨어지는 문제가 있어 혈청을 배제하고 실험을 하기 위해서이다. 하지만 본 발명에서 개발된 요오드화 오일 계열의 지방유제는 혈청 존재하에서도 우수한 유전자 발현 효율을 보여주기 때문에 혈청을 배제하려는 기존의 실시예 4와 같은 다단계의 실험방법을 따를 필요는 없다. 본 발명에서는 두 가지의 새롭고 간편화된 시험관내 유전자 발현 효율 시험 방법을 제시하였다. 실시예 4의 방법에서 형질주입할 세포들을 배양한 후 혈청을 함유하지 않는 DMEM으로 세척하여 남아있는 혈청 성분을 제거하는 단계를 제거한 방법과 형질주입할 세포들을 배양한 후 형질 주입을 할 지방유제와 DNA의 복합 제제를 바로 혈청을 가지고 있는 배양액에 첨가하여 발현 실험을 하는 방법이 있다. 두 가지의 새로운 발현 시험 방법에 따른 요오드화 오일 계열의 지방유제의 발현 효율 결과를 도 8에 나타내었다. 요오드화 오일 계열의 지방유제는 혈청이 존재하는 조건에서 우수한 발현율을 나타내고 간편화된 유전자 발현 효율 시험 방법에서 DNA와의 조성에 따른 큰 변화 없이 우수한 결과를 볼 수 있었다.

본 발명의 요오드화 오일계 기재의 지방유제는 점착성 세포주에서 기존의 리포좀이나 스쿠알렌 기재의 지방유제 제형에 비하여 아주 우수한 발현 효율을 나타냈을 뿐만 아니라, 혈청 존재하에서도 우수한 발현 효율을 보이므로, 실험 방법을 단순화 시켜 시험관내 유전자 발현 효율 실험을 쉽게 할 수 있도록 한다.

Claims

(a) 요오드화 오일 또는 요오드화 오일과 1 가지 이상의 비트리글리세라이드계 오일의 오일 혼합물 지방유제 기재 2 ~ 30 중량%, (b) 유화제로서 1 가지 이상의 양이온성 계면활성제 0.01 ~ 40%, 및 (c) 나머지를 차지하는 물로 이루어지는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 상기 요오드화 오일이 요오드화 양귀비씨 기름 (iodized poppy seed oil), 에티오돌 (ethiodol) 및 요오드화 대두유 (iodized soybean oil)로 구성되는 군 중에서 선택되는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 상기 비트리글리세라이드계 오일이 스쿠알렌 또는 스쿠알란인 지방유제.
제 1 항에 있어서, 상기 오일 혼합물이 요오드화 오일을 전체 오일 혼합물에 대하여 40 중량% 이상으로 함유하는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 상기 유화제로서의 양이온성 계면활성제가 1,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모니움 프로판(DMMAP), 1,2-다이팔미토일-3-트리메틸암모니움 프로판(DPTAP), 1,2-다이스테아로일-3-트리메틸암모니움 프로판(DSTAP), 1,2-다이올레일-3-트리메틸암모니움 프로판(DOTAP), 1,2-다이미리스토일-3-다이메틸암모니움 프로판(DMDAP), 1,2-다이팔미토일-3-다이메틸암모니움 프로판(DPDAP), 1,2-다이라우로일-3-다이메틸암모니움 프로판 (DLDAP), 1,2-다이라우로일-3-트리메틸암모니움 프로판 (DLTAP), 1,2-다이스테아로일-3-다이메틸암모니움 프로판(DSDAP), 1,2-다이올레일-3-다이메틸암모니움 프로판(DODAP), 다이메틸 다이옥타데실암모니움 브로마이드(DDAB), N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(DOTMA) 및 1,2-다이올레일-3-에틸포스포콜린 (DOEPC)으로 구성되는 군 중에서 선택되는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 유화제로서 인지질 또는 비이온성 계면활성제를 추가적으로 포함하는 지방유제.
제 6 항에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린(PC) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(PE) 유도체 및 포스파티딜세린(PS) 유도체, 다이아세틸레이티드 인지질과 같은 중합가능한 지질로 구성되는 군 중에서 선택되는 지방유제.
제 7 항에 있어서, 상기 인지질이 L-α-다이올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)인 지방유제.
제 6 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴옥사머, (Poloxamer,Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스터 (Sorbitan esters, Span), 폴리옥시에틸렌솔비탄 (polyoxyethylene sorbitans, Tween) 및 폴리옥시에틸렌에테르 (polyoxyehtylene ethers, Brij) 계열로 구성되는 군 중에서 선택되는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 유화제로서 다이올레인 (diolein), 지방산, 지방 알코올 (fatty alcohol), 콜레스테롤을 또는 담즙산을 추가적으로 포함하는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 친수성 고분자, 친수성 고분자가 결합된 인지질 또는 중합 가능한 인지질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10중량%의 양으로 추가적으로 포함하는 지방유제.
제 11 항에 있어서, 상기 친수성 고분자가 폴리옥시에틸렌, 폴리에틸옥사졸린 및 폴리에틸렌글리콜로 구성되는 군 중에서 선택되는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 글리세롤, 용해성 펩타이드 또는 용해성 단백질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10중량%의 양으로 추가적으로 함유하는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 당지질(glycolipid), 리포펩타이드, 항체, 수용체에 대한 리간드 및 바이러스성 단백질로 구성되는 군 중에서 선택되는 표적세포로의 표적화물질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10중량%의 양으로 추가적으로 포함하는 지방유제.
제 1 항에 있어서, 프로타민 설페이트, 히스톤, 및 양이온성 폴리머로 구성되는 군 중에서 선택된 물질을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10중량%의 양으로 추가적으로 함유하는 지방유제.
제 15 항에 있어서, 양이온성 폴리머가 폴리라이신인 지방유제.
제 1 항에 있어서, 일가 및 다가 이온을 가진 염을 전체 지방유제에 대하여 0.01 ~ 10중량%의 양으로 추가로 함유하는 지방유제.
DNA, RNA, 안티센스 핵산, 리보솜, 폴리누클레오타이드, 및 올리고누클레오타이드로 구성되는 군 중에서 선택되는 생리활성물질과 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 지방유제가 결합된 생리활성물질-지방유제 복합제제
제 18 항에 있어서, 상기 생리활성물질과 지방유제의 결합비율이 생리활성물질의 중량:지방유제 내 양이온성 계면활성제의 중량으로 1:2 내지 1:8인 생리활성물질-지방유제 복합제제.
항바이러스제, 스테로이드계 소염제 (SAID), 비스테로이드계 소염제 (NSAID), 항생제, 항진균제, 비타민, 호르몬, 레티노인산, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 항암제, 항대사제, 축동제 (miotics), 콜린작동성 약물, 안드레날린 길항제, 항경련제, 항불안제, 정온제, 항우울제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 에스트로겐, 프로게스테론, 글리코사미노글리칸, 폴리뉴클레오타이드, 면역억제제 및 면역촉진제로 구성되는 군 중에서 선택되는 약물과 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 지방유제가 결합된 약물-지방유제 복합제제.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 지방유제를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 표적세포에 생리활성물질 또는 약물을 전달하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 표적세포가 적혈구, 백혈구, 섬유아세포, 종양세포, 바이러스에 감염된 세포, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 간 세포, 내분비선 세포, 신경 세포, 피부 세포, 성 세포, 난자, 정자, 조혈 세포, 태 세포, M 세포, 랑게르한스섬 세포, 거식구, 식물 세포 또는 동물 세포인 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 지방유제가 정맥 주사, 근육내 주사, 비강내 투여, 피하 주사, 피내 주사, 기관내 투여 또는 피부로 적용되는 방법.
세포를 혈청을 함유하는 배지에서 배양하고 배지를 제거한 후, 제 1 항 내지제 17 항 중 어느 한 항에 따른 지방 유제와 생리활성물질 또는 약물의 복합 용액을 포함하는 새로운 혈청을 함유하는 배지를 첨가하여 형질주입을 수행한 후, 세포를 배양하는 단계를 포함하는 시험관내 세포 발현효율 시험방법.
세포를 혈청을 함유하는 배지에서 배양한 후, 여기에 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 지방 유제와 생리활성물질 또는 약물의 복합 용액을 직접 첨가하여 형질주입을 수행하는 시험관내 발현 효율 시험 방법.