KR20030068537A - 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면 - Google Patents

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KR20030068537A KR10-2003-7003471A KR20037003471A KR20030068537A KR 20030068537 A KR20030068537 A KR 20030068537A KR 20037003471 A KR20037003471 A KR 20037003471A KR 20030068537 A KR20030068537 A KR 20030068537A
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로이드 엠. 스미스
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위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

본 발명은 비산화된 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 및 게르마늄 기재상의 화학적으로 개질된 표면에 관한 것이다. 가시광선은 보호된 ω-개질된 α-불포화 아미노알켄 (바람직함)과 브롬-, 요오드- 또는 다른 관능기-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 표면과의 반응을 매개한다. 보호기의 제거는 아미노알칸-개질된 규소 표면을 형성시킨다. 이관능성 가교결합제를 사용하여 이러한 아미노기를 말단-개질된 올리고뉴클레오티드에 커플링시킴으로써 개질된 표면 및 배열을 만들 수 있다. 기재에 부착된 분자의 표면 밀도를 조절하는 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면 {Modified Carbon, Silicon and Germanium Surfaces}
핵산 고정에 적합한 표면은 최근 수년간 점점 더 중요한 생물학적 수단이 되고 있다. 이중 가닥 단편 또는 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로서 핵산 분자의 배열은 약물 개발, 유전자 서열분석, 의학 진단, 핵산-리간드 결합 연구 및 DNA 컴퓨터계산에 이용되어 왔다 (1-21). 용액 중에 존재하는 것들에 대하여 표면-결합된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것에 따른 주요 이점으로는 정제의 용이성, 물질 및 시약의 보존, 올리고뉴클레오티드들 사이의 간섭 감소 및 샘플 취급의 간편성을 들 수 있다 (12). 핵산의 고정을 위해 기존에 연구된 표면으로는 라텍스비즈 (5), 폴리스티렌 (1), 탄소 전극 (22-25), 금 (17,23,26-28), 및 산화된 규소 또는 글래스 (3,8,11,29-32)가 포함된다.
그러나, 이러한 기재와 관련된 표면 화학은 이상적인 표면의 많은 바람직한 특성을 보유하지 못한다. 이와 같은 이상적인 표면 특징으로는 표면 평탄성 및 균일성; 표면 특성의 조절; 열 및 화학 안정성; 재생성; 및 핵산 고정 및 생화학적 조작에 대한 허용성을 들 수 있다. 보다 최근에는, 고정된 핵산을 집적 회로 (33)에서 바이오센서로 사용하려는 요구에 따라 미세전자 포맷으로 집적시킬 수 있는 표면이 필요하게 되었다. 선행 기술의 표면 및 부착 화학의 한계는 이상적인 것들과 보다 밀접하게 유사한 다른 기재에 대한 요구를 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 비산화된 결정질 탄소, 규소 및 게르마늄, 이들의 동소체 (allotrope) 및 합금은 이들의 높은 순도, 고도로 조직 및 정의된 결정 구조 및 강직성으로 인해 핵산 및 이와 비슷하거나 유사한 반응성을 갖는 다른 화학물질의 고정을 위한 기재로서 이점을 제공한다. 규소는 미세전자 산업에 있어서의 그의 보편적인 용도로 인해 특히 바람직하다.
그러나, 예를 들어 천연 실리콘 표면은 주변 조건하에 공기와 반응하여 산화규소의 표면 박층을 형성한다. 이러한 산화된 규소 표면은 유리와 화학적으로 유사하며, 동일한 몇가지 단점, 즉 상대적인 수의 Si-O-Si 및 Si-OH 결합에서 비균일성 및 가변성을 나타낸다. 특히 이러한 표면을 커플링하는데 일반적으로 사용되는 실란 화학은 그 자체로서 안정성에 문제가 있는 경향이 있고, 조절하기 어려운 중합 공정이기 때문에, 상기 표면에서 발생하는 이러한 비균일성 및 수반된 화학적가변성은 결국 화학적으로 개질된 표면의 재생성 및 균일성에 있어서의 어려움을 초래할 수 있다 (34,35).
산화물 층이 없는 규소 기재를 직접적으로 관능화하는 화학 경로는 고도로 조절된 핵산 부착에 대한 새로운 가능성을 열어왔다. 이러한 새로운 부착 방법은 직접적인 탄소-규소 결합을 통해 개질된 규소 표면을 제공하여 (19,36-42), 메틸-, 염소-, 에스테르- 또는 산-말단의 기재를 형성시켰다 (36,39,40,43,44). 바그너 (Wagner) 등의 문헌 (19)은 N-히드록시숙신이미딜 에스테르-말단의 규소 표면을 사용하여 1752 bp 크기의 이중 가닥 DNA 단편을 고정시키는 것에 대하여 설명하고 있지만, 이 문헌은 일반적으로는 화학적으로 개질된 규소 표면, 특히 핵산-개질된 규소 표면을 제조하기 위한 체계적이고 재현가능한 방법을 개시하고 있지는 않다.
ω-알켄과 규소 표면과의 반응은 선행 기술 문헌에서 UV 조사 (19,41)를 통한 디아실 퍼옥시드 (36), 또는 직접적인 열 활성화 (39)에 의해 매개되는 것으로 기재되어 있다. 사용된 ω-알켄은 에스테르, 산 (39,44) 및 염화물 (36)을 비롯한 다양한 관능기를 포함하였다.
규소-기재 반도체를 위한 화학적 패시베이션화제 (passivating agent)로서의 할로겐의 용도가 또한 선행 기술 문헌 (52,53)에 기재되어 있다.
<발명의 개요>
본원에서 본 발명자들은 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면을 생성시키는 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 치환기를 갖는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알켄을 비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 치환된 알킬 잔기가 개재된 산소 원자 없이 직접 결합된 개질된 기재를 형성시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 제1 실시양태에서, 반응은 수소-말단의 규소, 탄소 또는 게르마늄 표면을 직접 이용하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 제1 실시양태는 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면을 생성시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 치환기를 갖는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알켄을 비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 치환된 알킬 잔기가 개재된 산소 원자 없이 직접 결합된 개질된 기재를 생성시키는 것을 특징으로 한다.
그러나, Si-H 결합 (및 C-H 및 Ge-H 결합도 마찬가지임)은 Si-Br 또는 Si-I 결합 (또는 상응하는 C-Br/I 또는 Ge-Br/I 결합)보다 더 큰 양호한 형태이다. 따라서, Si-H, C-H 또는 Ge-H 결합을 절단하도록 설계된 광개시 반응은 자외선 (UV) 조사를 이용해야 한다. 그러나, 자외선 조사는 여러 샘플 (예를 들어, 단파장 광 또는 에너지 입자에 의한 분해에 민감한 여러 생물학적 샘플 및 다른 분자 시스템)에 잠재적으로 손상을 입힐 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2 실시양태에서, Si-H, C-H 또는 Ge-H 결합을 먼저 Si-Br/I, C-Br/I 또는 Ge-Br/I 결합으로 치환한다. 이러한 결합은 보다 쉽게 파괴되며, 따라서 치환하는데 적은 에너지가 필요하다.
따라서, 본 발명의 제2 실시양태는 치환기를 갖는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알켄을 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 치환된 알킬 잔기가 개재된 산소 원자 없이 직접 결합된 개질된 기재를 형성시키는 단계를 포함하는, 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 제2 실시양태는 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 및 게르마늄 표면 (요오드가 바람직함)상에 개질된 표면을 생성시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 먼저 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질 및 보호된 알켄을 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 개재된 산소 분자 없이 기재에 공유적으로 결합된 보호된 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된 알칸 분자의 표면을 형성시키는 단계를 포함한다. 이후, 제1 단계의 개질된 알칸 분자를 (필요하다면) 탈보호하여 기재에 결합된 비보호 개질된 알칸 분자의 표면을 형성시킨다. 이후, 필요하다면 탈보호 개질된 알칸 분자를 가교결합제와 반응시킴으로써 가교결합제를 개질된 알칸 분자에 부착시킨다. 마지막으로, 핵산 또는 단백질 등의 분자를 이전 단계의 가교결합제에 부착시켜 기재상에 고정된 분자의 표면을 형성시킨다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 실시양태는 비산화된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면상에 개질된 표면을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 다음과 같은 단계들을 특징으로 한다: 먼저, 요오드 또는 브롬을 비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 요오드- 또는 브롬-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 형성시킨다. 이후, 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된 알켄을 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재상에 위치시킨다. 이어서 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된 알켄을 가시광선에 노출시켜 요오드 또는 브롬을 기재로부터 제거하고, 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된 알켄을 기재와 반응시켜 개재된 산소 분자 없이 기재에 공유적으로 결합된 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된알칸 분자의 표면을 형성시킨다. 그 다음, 개질된 알칸 분자를 가교결합제와 반응시켜 가교결합제를 개질된 알칸 분자에 부착시킨다. 마지막으로, DNA, RNA 또는 폴리펩티드 등의 분자를 가교결합제에 부착시켜 기재상에 고정된 분자의 표면을 형성시킨다.
개질된 알켄과 브롬- 또는 요오드-말단의 기재 표면과의 반응을 광개시하기 때문에, 반응 부위를 미리 선택하여 기재를 가시광선에 선택적으로 노출시킴으로써 기재 표면상에 원하는 패턴을 형성시킬 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 방법에 따라 제조된 개질된 기재에 관한 것이다.
상기 방법의 바람직한 실시양태에서, 가시광선은 임의로 보호된 ω-불포화 아미노알켄, 히드록시알켄, 카르복시알켄 또는 티오알켄 (t-BOC로 보호된 10-아미노데스-1-엔이 가장 바람직함)과 브롬- 또는 요오드-말단의 규소와의 반응을 매개한다. 보호기를 제거하여 아미노알칸-개질된, 히드록시알칸-개질된, 카르복시알칸-개질된 또는 티오알칸-개질된 규소 표면을 형성시킨다. 이후, 이러한 반응성 말단 기 (아미노, 히드록시, 카르복시, 티오)를 직접, 또는 헤테로이관능성 가교결합제, 바람직하게는 SSMCC를 사용하여 개질된 올리고뉴클레오티드 또는 다른 생분자 (폴리펩티드, 지질, 인지질 등)에 커플링시켜 다른 불활성 기재상에 생분자 배열을 형성시킬 수 있다.
바람직한 실시양태의 주요 이점은 기재의 포토패터닝을 실온에서 수행할 수 있으며, 민감한 생물학적 샘플을 파괴시킬 수 있는 열, 전자, 이온 또는 임의의 다른 에너지원에 노출시킬 필요가 없다는 점이다. 포토패터닝은 주변 온도에서 수행할 수 있으며, 진공 처리를 요하지 않는다. 중간 강도 (cm2당 대략 2 내지 5 밀리와트)의 가시광선을 사용하여 포토패터닝을 수행한다.
이는 수소-말단의 규소, 탄소 또는 게르마늄 기재를 사용하는 광개시 반응을 이용한 본 발명의 제1 실시양태와는 다르다. 이러한 반응은 말단의 수소를 제거하기 위한 고-에너지 UV 조사의 이용을 필요로 한다. 그러나, 샘플은 UV 조사에 의해 불리한 영향을 받지 않으며, 제1 실시양태는 기재를 브롬 또는 요오드로 처리할 필요가 없다는 점에서 매우 유용하다.
본 발명의 또다른 주요한 이점은 본 발명을 이용하여 불활성 무기 비산화 기재 상에, 올리고뉴클레오티드를 비롯한, 정의된 표면 밀도의 고도로 정렬된 생분자 배열을 형성시킬 수 있다는 것이다.
본 발명의 또다른 독특한 이점은 배열에서 생분자의 표면 밀도를 용이하게 조절하고 조작할 수 있다는 것이다. 표면 밀도의 조절은 두 가지 방식으로 제공된다. 첫번째 방법으로는, 보호된 ω-불포화 아미노알켄 및 도데센으로 된 이원 혼합물을 초기의 가시광선-매개 커플링 반응에 사용한다. 여기서, 이원 혼합물 중의 ω-불포화 아미노알켄의 몰 비율과 올리고뉴클레오티드 혼성화 부위의 밀도 사이에 선형 관계가 나타났다. 두번째 방법으로는, 탈보호 반응에 허용되는 시간을 제한하여 올리고뉴클레오티드 부착에 이용가능한 결합 부위의 수를 제한함으로써 보호기의 일부만을 알칸-개질된 기재 표면으로부터 제거한다.
본 발명의 또다른 이점은 배열의 안정성이다. 본 발명을 이용하여 형성한올리고뉴클레오티드-개질된 표면은 매우 안정하고 DNA 혼성화 분석에서 잘 기능한다. 이 표면은 생분자 인식 요소를 반도체 재료에 커플링하는 수단 뿐만 아니라, 핵산 배열에서 올리고뉴클레오티드의 표면 고정을 위한 금 또는 유리 기재에 대한 대체물을 제공한다.
개질된 표면 또는 배열내의 생분자의 밀도 조절을 가능하게 함으로써, 본원에 기술된 본 발명은 재현가능하고 잘 정의된 생분자 배열의 제조에서 중요한 측면인, 관능화된 규소, 게르마늄 또는 탄소 표면의 소수성 및 수반되는 습윤 특성의 조절을 또한 가능하게 한다.
본 발명은 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면 (탄소, 규소 및(또는) 게르마늄의 임의의 조합을 포함하는 합금의 개질된 표면을 포함)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다양한 다른 화학 잔기를 비산화된 수소-, 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 및 게르마늄 표면에 연결시킬 수 있는 결합된 링커 잔기를 갖도록 개질된 상기 표면에 관한 것이다. 이러한 개질된 표면은 둘 이상의 상기 표면을 포함하는 결합된 핵산 및 핵산 배열의 표면을 비롯하여 표면-결합된 화학물질을 제조하는데 적합하다.
도 1A:아민-개질된 규소 (001) 웨이퍼 상에 DNA를 고정시키기 위한 반응식. t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 층은 보호된 아민 박층을 웨이퍼에 적용하고 이것을 저압 수은 증기 램프로부터의 자외선에 노출시킴으로써 표면에 결합시켰다. 탈보호는 표면을 CH2Cl2중의 25％ TFA로 1시간 동안 처리한 후, 10％ NH4OH 중에서 5분 동안 수세함으로써 수행하였다. 가교결합제 SSMCC를 표면에 부가시켜 N-히드록시숙신이미딜 에스테르를 통해 유리 아민에 결합시켰다. 그 후에, 티올 DNA를 SSMCC의 말레이미드기에 결합시켰다.
도 1B:아민-개질된 규소 (001) 웨이퍼 상에 DNA를 고정시키기 위한 반응식. t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 층은 보호된 아민의 박층을 웨이퍼에 적용하고 이것을 아르곤 레이저로부터의 가시광선에 노출시킴으로써 요오드-말단의 규소 표면에 결합시켰다. 탈보호는 표면을 CH2Cl2중의 25％ TFA로 1시간 동안 처리한 후, 10％ NH4OH에서 5 분 동안 수세함으로써 수행하였다. 가교결합제 SSMCC를 표면에 부가시켜 N-히드록시숙신이미딜 에스테르를 통해 유리 아민에 결합시켰다. 그 후에, 티올 DNA를 SSMCC의 말레이미드기에 결합시켰다.
도 2a 내지 2f:규소 기재 상에 고정된 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 X-선 광전자 스펙트럼 (도 2a). 질소 스펙트럼은 400.5 eV에서 단일 피크를 나타낸다. 25％ TFA 중에서 1시간 동안 처리한 후 (도 2b), 2개의 피크가 기록된다. NH3 +및 1급 아민이 각각 401.9 및 400.2 eV의 피크에 할당된다. 25％ TFA로 처리한 후, 10％ NH4OH로 5 분 동안 수세한 표면은 400.3 eV에서 오로지 하나의 피크만을 나타낸다 (도 2c). 이것은 NH3 +질소가 완전히 탈양성자화되었음을 나타낸다. t-BOC-보호된 아민의 탄소 스펙트럼은 벌크 탄소에 할당된 285 eV에서 강한 피크 뿐만 아니라, t-BOC 기의 카르보닐 탄소에 할당된 289.7 eV에서의 피크를 나타낸다 (도 2d). 카르보닐 피크는 TFA (도 2e) 및 NH4OH (도 2f)로 탈보호한 후 약 70％만큼 감소한다. 287.2 eV에서의 숄더(shoulder)는 t-부틸 탄소에 기인한 것이다.
도 3a 내지 3c:분자 역학 "플루오르이미저(FluorImager)"-브랜드 형광 영상화 장치를 사용하여 수득한 DNA 개질된 규소의 영상. 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드를 직경이 약 2 mm인 2개의 점 안에서 표면에 부착시켰다. 윗쪽 점의 형광성 상보체와의 혼성화는 예상된 영상을 나타낸다 (도 3a). 아랫쪽 점에 대한 변성 및 혼성화도 또한 예상된 영상을 나타낸다 (도 3b). 두 상보체를 이용한 변성 및 혼성화는 점들이 모두 가시화되게 한다 (도 3c).
도 3d:ω-운데실렌산 메틸 에스테르기를 요오드-말단의 규소 기재에 부착시키기 위한 광개시 이후의 실시예 2 기재의 사진.
도 4:10-아미노데스-1-엔 및 도데센의 이원 혼합물을 사용한 올리고뉴클레오티드 밀도의 조절. 가시광선을 사용하여 상이한 비율의 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔 및 도데센을 함유하는 혼합물을 표면에 부착시켰다. 탈보호 및 SSMCC 및 티올 DNA의 부가에 이은 형광성 상보체와의 혼성화는 신호의 정량화를 가능하게 하였다. 수득된 형광 신호와 표면에 부착된 아민의 비율 사이에 선형 관계가 관찰되었다 (y = 0.0081x + 0.1664; R2= 0.9045).
도 5:본 발명에 따라 제조한 표면을 상이한 길이의 시간 동안 탈보호 조건에 노출시킴으로써 증명한 올리고뉴클레오티드 밀도의 조절. 표면을 탈보호시킨 후, SSMCC 및 티올 DNA로 개질하였다. 형광성 상보체와의 혼성화에 이은 "플루오르이미저"-브랜드 영상화 장치에서의 영상화는 신호의 정량화를 가능하게 하였다. TFA로의 노출은 t-BOC-개질된 10-아미노데스-1-엔 분자를 신속하게 탈보호시켜 표면 아민을 생성시켰다.
도 6:형광-태그된 올리고뉴클레오티드에 의해 공유적으로 개질된 규소 표면의 안정성. DNA-개질된 규소 표면은 본 발명에 따라 3' 티올 DNA를 5' 말단상의플루오레세인과 함께 사용하여 제조하였다. 표면을 HB 중에 밤새 보관한 후, "플루오르이미저"-브랜드 영상화 장치로 스캐닝하였다. 매시간 스캐닝하여 표면 형광 강도를 기록하였다. 관찰된 형광 신호는 전체 실험에서 안정하였다 (y = -0.0041x + 0.9395).
도 7:15회의 혼성화 및 변성 사이클 동안의, 본 발명에 따라 제조한 표면의 안정성. 혼성화된 DNA 및 플루오레세인으로 태그된 DNA 둘 다로부터 측정된 형광 신호는 매 혼성화 사이클마다 약 1％씩 감소하였다. 또한, 매 변성 단계 이후마다 표면을 영상화하여 형광성 상보체의 완전한 제거를 증명하였다. 변성 이후 상보체로부터 형광 신호가 관찰되지 않았다 (혼성화된 DNA 신호, y = -0.0097x + 1.0059; 플루오레세인으로 태그된 DNA; y = -0.0113x + 1.0241).
약어:
하기 약어를 명세서 전체에서 사용하였다.
"알칸(들)"= C2-C24선형, 분지형 또는 시클릭 알칸 및 적절할 경우 상응하는 알킬기.
"알켄(들)"및"α-알켄(들)"= C3-C24선형, 분지형 또는 시클릭 알켄, 모노- 또는 폴리-불포화,시스또는트랜스또는 이들의 배합물, 및 적절할 경우 상응하는 알케닐기. α-알켄은 하나의 불포화기를 가지며 불포화기가 분자의 말단 탄소 원자에 존재하는 알켄이다.
"생분자"= 생물학적 물질에서 발견되는 임의의 분자로서, 특히 핵산, 단백질, 펩티드, 항체, 효소, 인지질과 같은 세포벽 성분 등, 및 표지된 생분자 및 재조합 생분자와 같은 이들의 개질 및 합성된 형태를 포함하나, 이에 한정되지는 않음.
"가교결합제"= 분자간 결합을 형성하는데 이용가능한 2개의 반응성 잔기가 있는 임의의 화학적 가교결합 시약; 2개의 반응성 잔기는 동일하거나 상이할 수 있음.
"Fmoc"= 9-플루오레닐메톡시카르보닐.
"HB"= 혼성화 완충액; 2'SSPE/0.2％ SDS 완충액 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 7 mM 소듐 도데실 술페이트, pH 7.4) 또는 동등한 기능의 임의의 완충액과 동일한 의미임.
"헤테로이관능성 가교결합제"= 분자간 결합을 형성시키는데 이용가능한 서로 상이한 2개의 반응성 잔기가 있는 임의의 화학적 가교결합 시약.
"개질된 알켄"및"ω-개질된 알켄"= "개질된 알켄"은 아미노, 히드록시, 카르복시 또는 티올 잔기와 같은 화학-반응성 잔기의 부가에 의해 개질된 알켄이다. 반응성 잔기는 알케닐 탄소를 제외하고는 알켄 중의 어느 곳에나 위치할 수 있다. "ω-개질된 알켄"은 반응성 잔기가 알켄 사슬의 말단 탄소 상에 놓인 알켄이다.
"핵산"= 임의의 출처로부터의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 및 펩티드 헥산, 및 표지된 (방사성, 형광성 등) 핵산, 및 티올기 또는 비오틴 태그와 같은 결합성 잔기를 포함하도록 개질된 핵산을 포함하나 이에 한정되지는 않는 이들의 개질된 형태. "핵산"은 표준 염기 A, C, T, G 및 U, 및 이들의 개질된 염기, 예를 들면 모노- 또는 디메틸화 염기, 디데옥시 염기 등으로 이루어진 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 모두 포함한다.
"보호기"= 반응성 부위 이외의 부위에서의 화학적 실체의 조작을 가능하게 하기 위해 선택적으로 반응성 부위에 부가하거나 또는 반응성 부위로부터 제거할 수 있는 화학 잔기. 다수의 보호기가 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 보호기로는 메틸, 포르밀, 에틸, 아세틸, t-부틸, 아니실, 벤질, 트리플루오로아세틸, N-히드록시숙신이미드, t-부톡시카르보닐, 벤조일, 4-메틸벤질, 티오아니질, 티오크레실, 벤질옥시메틸, 4-니트로페닐, 벤질옥시카르보닐, 2-니트로벤조일, 2-니트로페닐술페닐, 4-톨루엔술포닐, 펜타플루오로페닐, 디페닐메틸, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 2,4,5-트리클로로페닐, 2-브로모벤질옥시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐, 트리페닐메틸 및 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-술포닐이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
"SSMCC"= 술포숙신이미딜 4-N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트.
"tBOC"= t-부톡시카르보닐, 보호기.
"TFA"= 트리플루오로아세트산.
"UV"= 자외선.
반응 챔버:
본원에 기술된 방법에서, ω-개질된 보호된 알켄을 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 기재에 공유결합된 보호된 ω-개질 알칸 분자의 배열을 생성한다. 본 발명의 제1 실시양태에서, 이 반응은 알켄을 기재와 접촉시킨 후, 이 둘을 적합한 파장의 자외선광, 예를 들어 254 nm에 노출시킴으로써 광개시하는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 광개시 화학 반응 수행을 위해 고안된 임의의 반응 챔버를 사용할 수 있다. 이러한 반응 챔버는 당업계에 널리 공지되어 있고, 제작하거나 많은 상업적 공급처를 통해 구입할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 반응 챔버는 실시예 7에서 상세하게 기술된다.
본 발명의 방법의 초기 반응이 광개시되기 때문에, 광이 기재/알켄 반응물 상에 닿는 곳을 조절함으로써 부착되는 점들을 포토패터닝(photopatterning)할 수 있다. UV 포토패터닝이 패터닝된 표면을 생성하는데 바람직하나, 패터닝된 표면을 생성하기 위한 수단은 그 방법이 목적하는 패턴을 신뢰할만하게 생성하는 이상 중요하지 않다. 예를 들어, 패터닝된 표면을 생성하기 위해 미세접촉인쇄법을 사용할 수도 있다. UV 패터닝을 사용할 경우, 가려진 위치에서 반응이 일어나지 않도록 하는 적합한 UV-불투명 마스크(mask)를 통해 표면을 UV 조사에 노출시킨다.
포토패터닝 후, 기재의 표면을 부드럽게 수세하여 임의의 잔류 반응물을 제거한다.
물론, 포토패터닝은 선택적인 것이다. 전체 기재를 UV 방사선에 노출시켜 공유적으로 부착된 ω-개질된 알칸으로 균일하게 코팅된 기재를 생성할 수 있다.광반응성 잔기는 알켄의 이중결합이며, 이것은 반응시에 소모되어 규소 기재의 경우 C-Si 공유결합 부착을 생성한다는 점에 유의한다.
기재 표면 제조:
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 규소 기재를 사용한다. 단지 간결함을 위해, 이하 개시에서는 규소 기재가 사용된다는 것을 가정할 것이다. 그러나, 방법은 게르마늄 또는 탄소를 기재로서 사용하여도 동일한 방식으로 똑같이 잘 기능한다. 규소 기재는 반도체 산업에서의 보편성으로 인해 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 규소 웨이퍼를 약간 변형된시에발(Sieval)에 의해 기술된 방법과 유사한 방법 (39,41)으로 처리하여 수소 분자로 말단화된 기재 표면을 생성한다. 웨이퍼를 아세톤 중에서 5 분 동안 초음파처리한 후, 메탄올 중에서 5 분 동안 초음파처리한다. 그 후에, 웨이퍼를 과산화수소-암모니아-물 조(1:1:4)에 75℃에서 5 분 동안 담그었다. 그 후에, 웨이퍼를 2％ 플루오르화 수소산에 잠깐 동안 침지시켜 규소 원자를 수소-말단화시켰다.
수소-말단의 표면에서 브롬- 또는 요오드-말단 표면으로의 교체:
기재를 처리하여 초기의 수소-말단의 표면을 생성한 후, 수소 원자를 기재 표면으로부터 제거하고 브롬 또는 요오드(또는 이들의 배합물)를 기재 표면에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 이것은 기재로부터 수소 원자를 신뢰할만하게 제거하고 수소 원자 대신 브롬 또는 요오드 원자로 대체할 임의의 시약 또는 시약들의 배합물을 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 수소-말단의 기재 웨이퍼를 I2/벤젠 용액에 담그어 수소를 요오드로 대체한다 (또는 브롬이 바람직할 경우에는 Br2/벤젠 용액에 담근다). 이 처리는 요오드 또는 브롬과 기재 표면 사이에 개재된 임의의 산소 원자 없이 기재 표면이 말단의 요오드 또는 브롬 분자에 결합된 기재 분자(규소, 탄소 또는 게르마늄일 수 있음)에 의해 균일하게 특징지워지는 표면을 생성한다.
개질된 알켄과 기재의 반응:
기재 분자가 브롬 또는 요오드로 말단화되도록 기재 표면을 제조한 후, 제조된 기재를 바람직하게는 광개시하여 반응시키면, 브롬이 제거되고 기재 분자가 개질된 알켄의 알켄기와 반응하여 공유결합으로 부착된, 반응성 잔기가 있는 알킬기 (또는, 개질된 알켄이 하나 이상의 불포화기를 함유할 경우에는 알케닐기)에 의해 특징지워지는 표면을 생성한다. 하기 단락에서 충분히 기술되는 바와 같이, 개질된 알켄이 하나의 α-위치의 이중결합 및 하나의 ω-위치의 화학반응성 잔기를 함유하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 개질된 알켄의 박막을 요오드-말단의 기재 웨이퍼 상에 놓은 후, 웨이퍼를 가시광선(바람직하게는 514 nm)에 노출시킨다. 가시광선은 요오드를 제거한다. 가시광선은 또한 개질된 알켄의 이중결합과 규소 표면 사이에 반응을 통하여 Si-C 결합의 형성을 개시한다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, ω-개질 및 보호된 α-알켄을 탄소,규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 기재에 공유결합된 보호된 ω-개질 알칸 분자의 배열을 생성한다. 이 반응은 알켄을 기재와 접촉시킨 후 이 둘을 적합한 파장의 가시광선, 예를 들어 514 nm에 노출시킴으로써 광개시하는 것이 가장 바람직하다. 이를 위하여, 광개시 화학 반응의 수행을 위해 고안된 임의의 반응 챔버를 사용할 수 있다. 이러한 반응 챔버는 당업계에 공지되어 있고, 제작하거나 많은 상업적 공급처를 통해 구입할 수 있다.
개질된 알켄과 요오드- 또는 브롬-말단의 기재 표면의 반응은 광개시되기 때문에, 광이 기재/알켄 상에 닿는 곳을 조절함으로써 부착되는 점들을 포토패터닝할 수 있다. 포토패터닝은 패터닝된 표면을 생성하는데 바람직하나, 패터닝된 표면을 생성하기 위한 방법은 그 방법이 목적하는 패턴을 신뢰할만하게 생성하는 이상 중요하지 않다. 예를 들어, 패터닝된 표면을 생성하기 위해 미세접촉인쇄법을 사용할 수도 있다. 포토패터닝을 사용할 경우, 하나 이상의 개질된 알켄으로 코팅된 기재 표면을 가려진 위치에서 반응이 일어나지 않도록 하는 적합한 광-불투명 마스크를 통해 가시광선에 노출시킨다.
포토패터닝 후, 기재의 표면을 부드럽게 수세하여 임의의 잔류 반응물을 제거한다.
물론, 포토패터닝은 선택적인 것이다. 전체 기재를 가시광선에 노출시켜 공유적으로 부착된 개질된 잔기로 균일하게 코팅된 기재를 생성할 수 있다. 또한, 기재 표면을 포토패터닝하여 각각 동일하거나 상이한 부착 잔기를 포함하는 점들의 목적하는 배열을 생성할 수 있다. α-알켄을 사용하는 바람직한 실시양태에서, 광반응성 잔기는 알켄의 이중결합이며, 이것은 반응시에 소모되어 규소 기재의 경우 C-Si 공유결합 부착을 생성한다는 점에 유의한다.
ω-개질된 알켄:
반응성 잔기 및 바람직하게는 말단(즉, ω-위치) 반응성 잔기가 있는 알켄은 알켄의 부가 후에 또다른 추가의 분자를 기재에 부착하는 수단을 제공하기 위해 본 발명에 사용된다. 반응성 잔기는 알케닐 탄소를 제외하곤 개질된 알켄 중의 어느 곳에서 위치할 수 있다. 반응성 잔기가 알켄의 말단에 부착될 경우, 이 알켄은 본원에서 ω-개질된 알켄으로서 정의한다. 알켄이 탄소 3 내지 24개의 길이이고, 알켄의 말단 탄소 또는 그의 가까이에 단일 불포화기를 갖는 것이 매우 바람직하다. 알켄은 하나 이상의 불포화기를 가질 수 있고, 선형, 분지형 또는 시클릭일 수 있다.
알켄에 대한 개질은 알켄이 기재 표면에 부착된 후에 알켄에 추가적인 공유결합을 일으킬 수 있게 하는 임의의 잔기를 부가시키는 것일 수 있다. 정의에서 언급한 바와 같이, 개질부가 반드시 알켄의 물리적 말단에 위치해야 할 필요는 없으나, 이는 개질부가 추가의 반응에 용이하게 이용될 수 있게 하기 때문에 매우 바람직하다. 이러한 개질로는 아민-함유기, 카르복실-함유기 또는 티올-함유기를 알켄 사슬의 ω탄소 또는 그의 가까이에 부가시키는 것이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
개질부는 그 자체가 반응성이기 때문에, 알켄과 기재의 첫번째 반응 동안 보호될 필요가 있을 수 있다. 그러나, 모든 반응성 개질부가 보호될 필요는 없다.예를 들어, 많은 카르복시-함유기는 알켄을 기재에 부착시키는데 이용되는 바람직한 광화학에 의해 부정적으로 영향을 받지 않을 것이므로 보호될 필요가 없다. 일반적으로, 알켄 상의 반응성 개질부의 보호는 선택된 반응성 개질부에 적합한 임의 유형의 보호기를 이용하여 이루어질 수 있다 (50). 적합한 보호기의 예시적인 목록은 정의에 제공되어 있다. 간략하게는, 사용되는 보호기의 선택은 알켄에 이루어지는 개질의 특성에 따라 크게 좌우된다. 개질이 카르복실기의 부가일 경우, 보호기가 전혀 필요없을 수도 있거나 또는 카르복실 보호기가 사용될 것이다. 마찬가지로, 개질이 아미노기 또는 티올기의 부가일 경우, 아미노 또는 티올 보호기가 각각 사용될 것이다. 이러한 수많은 보호기가 임의의 수의 반응성 잔기, 예를 들어 아민, 카르복시 및 티올 관능기에 대하여 당업계에 공지되어 있다. 많은 것이 상당히 소수성이다. 아미노-말단 알켄의 경우, t-BOC가 가장 바람직하다. t-BOC는 일반적인 산 불안정성 보호기이다 (50). 다른 산-불안정성 보호기가 당업계에 공지되어 있다.
아미노-개질된 t-BOC-보호된 알켄과 규소 기재의 광개시 반응의 예시적인 예를도 1에 나타내었다. 여기서, 보호된 아미노-개질된 알켄을 요오드-말단의 규소 기재와 접촉시키고, 514 nm의 가시광선에 노출시킨다. 이것은 알켄의 말단 이중결합이 비산화 규소 기재와 Si-C 공유결합을 형성하게 한다.
보호된 알켄이 기재와 반응하면, 보호기(있을 경우)가 제거된다. 제거는 화학적으로 수행될 수 있으며, 선택된 보호기의 유형에 따라 크게 좌우된다. 이러한 탈보호 방법은 당업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. t-BOC 보호기의 경우,TFA로 처리하면 보호기가 제거되어 반응성 1급 아민기가 생성된다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 개질된 알켄은 단일 α불포화기가 있는 ω-아미노-C3-C24-알켄이며, 직쇄 또는 시클릭 알켄이 분지형 알켄보다 바람직하고, 가장 바람직한 ω-개질된 알켄은 10-아미노데스-1-엔이다. 상기 언급한 바와 같이, 아민-개질된 알켄에 바람직한 보호기는 t-BOC이다.
표면-결합 잔기로의 분자 부착:
기재의 표면에 결합된 개질된 알칸(또는, 개질된 알켄이 하나 이상의 불포화기를 함유할 경우에는 알켄) 형태의 반응성 잔기의 단층을 함유하도록 기재 표면을 개질한 후, 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단으로 개질부에 분자를 결합시킬 수 있다. 분자는 개질부에 직접 부착되거나 또는 표면-결합 알칸, 및 부착될 도입 원자 사이에 개재된 가교결합제를 통해 부착될 수 있다.
알켄에 대한 개질부가 카르복시 또는 아미노 잔기일 경우, 폴리펩티드의 고상 합성에 널리 사용되는 잘 특징지워진 화학을 사용하여 단백질, 또는 다른 카르복시기 또는 아미노기를 함유하는 생분자를 표면-결합 알칸의 ω-개질부에 직접 결합시킬 수 있다.
간략하게는, 고상 반응에서, 부착점으로서 기능할 하나 이상의 잔기를 제외한, 기재에 결합될 도입 분자의 반응성 잔기를 보호한다. 특정 경우, 도입 분자 및 표면-결합 알칸의 개질부 사이의 반응을 유도하기 위해 목적하는 부착점에 존재하는 잔기를 활성화시켜야 한다. 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드와의 반응에 의한 것과 같은, 카르복실기가 있는 분자의 활성화에 의해, 도입 분자가 활성화된 카르복시 잔기에서 노출된 아미노기에 결합될 것이다. 반면, 펩티드 합성에서는, 부가적인 아미노산을 부가시키기 위해 공정을 계속해서 반복하며, 여기서, 도입 분자를 알칸-피복 표면상에 결합시키기 위해서는 오로지 한번의 커플링 반응만을 사용한다.
그러나, 분자와 알칸-피복 기재 사이의 결합을 제공하기 위하여 가교결합제를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하는 것이 보다 더욱 바람직하다. 가장 바람직한 가교결합제는 SSMCC이다. SSMCC는 아민-반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르 뿐만 아니라, 티올-반응성 말레이미드 잔기를 함유한다. 이러한 이관능성으로 인해 SSMCC는 티올-개질된 핵산을 알칸-개질된 기재에 결합시키는 능력을 갖게 되므로, 바람직한 가교결합제가 된다. 이러한 가교 형성은도 1A및1B에 도시한 마지막 반응 단계에서 나타난다. 핵산에 대한 티올 개질은 S-트리틸-6-메르캅토헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트 및 1-O-디메틸옥시트리틸-헥실-디술피드, 1'-{(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)}-포스포르아미디트와 같은 널리 공지된 시약을 사용하여 이루어질 수 있다.
다른 적합한 가교성 잔기가 다른 유형의 개질에 대하여 공지되어 있다. 예를 들어, 디아민, 디알데히드, 디카르복실산, 아미노산 등을 가교결합제로서 사용할 수 있다.
핵산을 개질된 기재-결합 잔기에 부착시키기 위해, 탈보호된 표면을 SSMCC의 N-히드록시숙신이미드 에스테르 부분이 결합된 알칸의 반응성 잔기(바람직하게는,아미노기)와 반응하기에 충분한 시간 동안 SSMCC와 접촉시킨다. 기재를 부드럽게 수세하여 미반응 SSMCC를 제거한다. 그 후에, SSMCC-개질된 기재를 티올-개질된 핵산과 반응시켜 규소 기재 상에 핵산 표면 또는 배열을 형성한다. 그 후에, 핵산-개질된 표면을 증류수로 수세하고, 37℃에서 HB에 보관하여 비특이적으로 결합된 핵산 가닥을 제거한다.
개질된 알켄과의 초기 반응, (존재한다면) 가교결합제와의 반응, 또는 핵산과 같은 다음 분자와의 반응의 품질을 확실하게 하기 위해, 각 반응 단계를 PM-FTIRRAS, XPS, 접촉각 측정기를 사용하여 모니터링할 수 있다.
X-선 광전자 (XPS) 측정:
탈보호의 범위를 측정하기 위해 보호 및 탈보호된 표면에서 X-선 광전자 분광기 (XPS)를 작동하였다. 규소 기재에 결합된 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 X-선 광전자 스펙트럼을 도 2a에 도시한다. 질소 스펙트럼은 400.5 eV에서 단일 피크를 나타낸다. 25％ TFA 중 1시간 동안 처리한 후 (도 2b), 2개의 피크가 기록된다. NH3 +및 1급 아민은 각각 401.0 및 400.2 eV에서의 피크에 해당한다. 25％ TFA로 처리한 후 10％ NH4OH 중 5분간 헹군 표면은 400.3 eV에서 하나의 피크만을 나타낸다 (도 2c). 이는 NH3 +질소가 완전히 탈양성자화되었음을 나타낸다. t-BOC 보호된 아민의 탄소 스펙트럼은 t-BOC 기의 카르보닐 탄소에 의한 289.7 eV에서의 피크뿐만 아니라, 벌크 탄소에 의한 285 eV에서의 강한 피크를 나타낸다 (도 2d). 카르보닐 피크는 TFA를 사용한 탈보호 (도 2e) 및 NH4OH를 사용한 탈보호 (도 2f) 이후에 약 70％ 감소된다. 287.2 eV에서의 편평한 부분은 t-부틸 탄소에 기여하였다.
유감스럽게도, t-BOC 보호된 표면의 질소 1s 피크는 1급 아민 표면에서의 질소 피크와 거의 동일하다 (도 2a 및 도 2c 참조). 수산화 암모늄에서 헹구기 전의 아민염의 XPS는 2개의 질소 피크를 명확히 보여준다 (도 2b). 401.9 eV 결합 에너지에서의 피크는 NH3 +를 나타내지만, 400.2 eV에서의 피크는 1급 아민 질소에 의한 것으로 생각된다. TFA 용액에 노출 후 질소가 완전히 양성자화되지 않는다는 것은 흥미롭다. 수산화 암모늄에서 헹군 후, 400.3 eV에서 단일 피크가 나타난다 (도 2c). 보호된 표면의 탄소 1s 스펙트럼은 t-BOC기의 카르보닐 탄소에 의한 289.7 eV에서의 피크를 나타낸다 (도 2d). 이러한 피크는 탈보호 조건을 사용하여 급격하게 감소되는데, 이는 대부분의 t-BOC기가 제거되었음을 나타낸다 (도 2e 및 2f). IGOR을 사용한 피크 피팅 (fitting)은 약 70％의 t-BOC기가 제거되었음을 나타낸다. 그러나, 피팅 파라미터와 관련된 많은 양의 오차로 인해 이러한 작은 피크의 면적은 추정할 수 밖에 없다는 것을 알아야 한다. 온도, TFA 농도, 및 반응 시간을 증가시킴으로써 탈보호를 극대화시켜 유사한 결과를 얻었다.
접촉각 측정:
접촉각을 탈보호의 다양한 단계에서의 표면에 대해 측정하였다.
표면 접촉각 θ
t-BOC-보호된 아민 78.1°
TFA-처리 55.4°
TFA & NH4OH-처리 76.8°
t-BOC 보호된 아민이 가장 소수성이었다. 양성자화된 아민 염과 관련된 친수성 표면으로부터 예상되는 거동과 일관되게, 25％ 트리플루오로아세트산에 1시간 동안 노출시에 접촉각이 더 작아졌다. 표면을 10％ 수산화 암모늄으로 다시 헹구어 염을 제거하여 1급 아민 표면을 제조하였고, 이는 접촉각 측정시의 증가에 의해 증명되었다.
특이적 혼성화:
실시예에 기재된 바와 같이, 아민-개질된 표면을 소형 DNA 배열의 제조를 위한 기재로 사용하였고, 이는 DNA 혼성화 실험에서 그들의 성능을 특징으로 한다 (도 3a-3c 참조). 본원에 기재된 방법을 사용하여 약 2 mm 직경 스팟에서 비산화된 요오드-말단의 규소 (001) 표면 (약 1 cm x 1 cm) 상에 2개의 상이한 유형의 올리고뉴클레오티드를 고정하였다. 고정된 올리고뉴클레오티드 중 하나와 상보적인 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 용액을 표면에 위치시켜 혼성화하였다. 도 3a는 혼성화 및 세척 후 얻어진 영상을 나타내고 있다. 단일 스팟이 나타나는 것은 선택된 올리고뉴클레오티드로의 성공적인 혼성화를 나타내는 것이다. 다른 형광성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 변성 및 혼성화한 이후의 영상은 2개의 개별적인 스팟을 나타낸다 (도 3b). 형광성으로 태그된 상보체를 사용한 최종적인 변성 및 이후의 혼성화 후, 예상한 바와 같이 두개의 스팟 모두가 영상으로 나타났다 (도3c).
부착 부위의 표면 밀도 조절:
표면 부착 부위의 밀도 조절은 올리고뉴클레오티드와 같은 결합된 생분자의 밀도를 조절할 수 있기 때문에 본 발명의 주된 이점이다. 예를 들어, 몇몇 분야에서 조밀하게 패킹된 DNA 가닥을 요구하고 있긴 하지만, 다른 분야에서는 결합된 올리고뉴클레오티드간에 더 큰 간격을 요구할 수 있다. 기재 표면 상에서 부착점의 표면 밀도의 조절은 2가지 상이한 방법, 즉 1) 부착 단계 동안 보호된 아미노-개질된 알켄 및 도데센의 혼합물을 사용함으로써, 2) t-BOC 보호된 아민 표면의 TFA에 대한 노출 시간을 조절함으로써 증명될 수 있으므로, 아민-개질된 표면의 탈보호 범위를 제한할 수 있다.
표면 반응성 아민 부위 개수의 조절은 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔 및 도데센의 혼합물을 사용하여 증명할 수 있다. 도데센은 ω반응성 잔기가 부족하기 때문에 규소 표면에 일단 부착되면 미반응성이다. t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 증가 분획물을 포함하는 혼합물을 요오드-개질화된 규소 기재에 도포하고 514 nm 가시광선 하에서 반응되도록 하였다. 이어서 표면을 본원에 기재된 바와 같이 TFA (탈보호를 위해), SSMCC (가교결합제) 및 DNA로 처리하였다. 형광성 상보체로 혼성화한 후 표면상에서 형광성 영상의 정량을 수행하였다. 도 4에 도시된 도면은 측정된 형광 신호와 10-아미노데스-1-엔의 분획물간의 선형 관계를 나타내고 있다. 이러한 발견은 표면 아민기의 밀도를 쉽게 조절할 수 있으며, 즉 혼성화 또는 또다른 연구에 사용할 수 있는 결합된 올리고뉴클레오디드 또는 다른 생분자의 최종 표면 밀도를 조절할 수 있다는 것을 명백하게 증명하고 있다.
표면 부착 부위의 밀도를 조절하는 다른 방법은 초기에 보호된 ω-개질된 표면의 탈보호 조건에 대한 노출 시간을 조절하는 것을 포함한다. 이러한 방법을 증명하기 위해, 4개의 요오드-말단의 규소 표면을 본 발명에 따라 t-BOC 보호된 10-아미노데스-1-엔과 반응시켰다. 이어서 표면을 25％ TFA에 0, 2, 15 및 60 분 동안 노출시켰다. 그 후, 표면을 SSMCC 및 5'-티올-DNA로 개질시키고 형광성 상보체로 혼성화하였다. 도 5는 이러한 각 표면의 형광 신호의 도면이다. 측정된 형광의 양은 탈보호제에 대한 노출 시간에 따른다. 탈보호는 약 15 분 이하의 노출 시간에 신속하게 발생하고 이때 대부분의 t-BOC 기가 제거된다. 탈보호를 60 분 동안 더 계속하면 반응에 이용할 수 있는 유리 아민이 약간 더 많이 얻어진다.
안정성
DNA-개질된 규소 표면의 중요한 파라미터는 핵산 혼성화 및 효소에 의한 조작과 같은 생화학적 방법에 사용되는 조건에 대한 이들의 안정성이다. DNA-개질된 표면의 안정성을 평가하기 위해 2가지 실험을 수행하였다. DNA 올리고뉴클레오티드를 공유적으로 표면에 연결하는 결합의 안정성을 올리고뉴클레오티드 (서열 3)에 공유적으로 부착된 형광 태그를 사용하여 평가하고; 표면을 HB에서 밤새 인큐베이션시키고 표면 형광을 반복적으로 측정하였다 (도 6 참조). 형광 세기의 유의한 감소는 관찰되지 않았는데, 이는 DNA-표면 결합이 조사된 조건하에서 안정하였다는 것을 의미한다.
제2 실험에서는, 한 영역에서 플루오레세인 표지된 DNA (서열 3)로 개질된표면 및 다른 영역에서 비표지된 DNA (서열 1)로 개질된 표면을 서열 1의 형광성 상보체를 사용하여 반복적으로 혼성화시켰다. 측정된 서열 3의 형광 강도는 일반적으로 형광성 상보체와 혼성화된 서열 1의 형광 강도의 3분의 2였다. 정규화된 데이타는 둘 다에서 실질적으로 동일한 비율의 신호 감소를 나타낸다 (도 7). 15 회 사이클 후 형광 강도는 초기 값에 비해 약 85％로 감소하였다. 이 값은 사이클 당 약 1％의 감소에 상응한다 (44). 이런 안정성은 비공유결합 표면 부착의 화학을 이용한 이전에 공개된 결과보다 우수하다 (44). 본 발명에 의해 개질된 비산화된 규소 표면은 사용된 저장 조건 및 혼성화 조건하에서 우수한 안정성을 보인다는 것을 상기 2가지 결과로 입증하였다.
하기 실시예는 단지 본원에 개시되고 청구된 본 발명을 더 완전히 이해시키기 위해서 제공된다. 실시예는 어떤 식으로든지 첨부된 청구 범위의 범위 또는 일반성을 제한하지 않는다.
실시예 1: 퍼플루오로옥타데센의 요오드 말단의 규소로의 부착
이 실시예에서, 규소 기재를 상기 바람직한 실시양태에서 개시한 HF 및 요오드의 벤질 용액으로 처리하여, Si-Br 결합으로 말단화된 표면을 갖는 규소 기재를 수득하였다.
퍼플루오로옥타데스-1-엔을 액적으로 기재 표면에 도포하였다. 이어서 코팅된 표면을 아르곤 레이저의 514 nm 가시광선에 노출시켰고, ㎠ 당 약 20 밀리와트의 세기에서 퍼짐 현상이 발생했다. 이는 레이저 포인터에 의해 발생한 대략적인에너지 양이다. 표면 조성 분석으로 시작 스펙트럼으로부터 Si-I 피크의 사라짐 및 불소 피크의 발생을 모니터링하여 x-선 광전자 분광법을 통해 반응을 수행하였다. 예상한 바와 같이, 노출시키는 동안 (3시간), Si-I 피크는 천천히 사라지고, 규소 기재의 표면에 부착된 퍼플루오로옥타데센으로서 불소 피크가 동시에 나타났다. 어두운 곳에서 수행한 대조 실험은 퍼플루오로 화합물이 기재 표면에 상당히 부착되지 않았음을 나타냈다.
실시예 2: 운데실렌산 메틸 에스테르를 사용한 포토패터닝
이 실시예에서, 요오드 말단의 규소 기재를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조하였다. 기재 표면 상에 ω-운데실렌산 메틸 에스테르의 박층을 코팅하였다. 이어서 코팅된 기재의 좁은 영역을 실시예 1에서와 동일한 방법으로 (2시간) 514 nm 레이저 광에 노출시키고, 샘플의 남은 영역은 코팅을 벗기고 어두운 곳에 방치하였다. 광 처리후, 샘플을 조심스럽게 세척하였다. 이 때, 기재의 조사된 부분 및 조사되지 않은 부분은 육안으로 쉽게 구별할 수 있었다 (도 3d 참조). 이어서 샘플을 도데센 (소수성 분자)에 담그고 샘플 전체를 칼륨 t-부톡시드 (염기)에 잠깐 담궈서, 에스테르를 가수분해시키고 산 형태를 수득하였다. 생성된 샘플은 기재의 조사된 부분에서는 습윤임을 나타냈고 조사되지 않은 부분에서는 소수성 특성을 보였다. 이는 사실 운데실렌산 메틸 에스테르가 기재의 표면과 결합을 형성하고 또한 결합된 분자의 메틸 에스테르 부분이 기재 표면으로부터 분자를 떼어냄 없이 제거될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드의 합성
모든 올리고뉴클레오티드를 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 (University of Wisconsin Biotechnology Center)(위스콘신주(Wisconsin) 매디슨(Madison) 소재)에서 합성하였다. 실시예에 사용된 2가지 유형의 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다: 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 및 표면에 혼성화시키기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드. 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드를 5'-티올-모디파이어(Modifier) C6 (HSC6, Glen Research, 22825 Davis Dr., Sterling, Virginia 28164, www.glenres.com) 시약을 사용하여 5' 말단, 또는 3'-티올-모디파이어 C3 S-S CPG (C3SH, Glen Research) 시약을 사용하여 3' 말단에 티올-개질시켰고, 각각의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 31개의 길이이고, 5' 말단의 15-mer dT 스페이서 서열 및 3' 말단의 특정 16-mer 서열로 구성되어 있다. 사용한 3 개의 31-mer 서열은 하기와 같다:
5'-HSC6-T15AA CGA TCG AGC TGC AA3'(서열 1),
5'-HSC6-T15AA CGA TGC AGG AGC AA3'(서열 2) 및
5'-FAM-T15AA CGA TCG AGC TGC AA-C3SH3'(서열 3).
서열 3에서, "FAM"은 6-FAM 포스포르아미디트 (Perkin-Elmer Biosystems, Foster, California) 시약을 사용하여 합성하는 동안 올리고뉴클레오티드로 혼입된 플루오레세인 염료를 의미한다. 표면 결합된 상보체와의 혼성화에 사용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 16개의 길이이고 서열 1 또는 서열 2의 3'의 뉴클레오티드 16개에 대해 상보적이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 5' 말단상에FAM으로 개질되어 있다. 티올-개질된 올리고뉴클레오티드를 글렌 리서치(Glen Research)의 지침에 따라 탈보호시키고 (45,46), 2원의 구배 용출제를 사용하는 역상 HPLC로 정제하였다. 뉴클레오티드 16개 길이의 상보체를 동일한 방식으로 정제하였다. 다른 언급이 없는 한 기타 시약은 알드리치 케미칼 컴퍼니(Aldrich Chemical Company)(위스콘신주 밀워키(Milwaukee) 소재)로부터 구입하였다: 1-도데센, 10-운데세노일 클로라이드, 나트륨 아지드, 트리플루오로아세트산 (TFA), 디-tert-부틸 디카르보네이트(Acros Organics, Janssens Pharmaceuticalaan 3A, 2440 Geel, Belgium, www.acros.com), 술포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SSMCC)(Pierce Chemical, Rockford, Illinois), 규소(001) 웨이퍼 (Virginia Semiconductor, Fredricksburg, Virginia, www.VirginiaSemi.com). 웨이퍼를 세척하는데 사용된 매우 순수한 물은 밀리포어 시스템 (Millipore system) (매사추세츠주(Massachusetts) 말보로(Marlborough))으로부터 구입하였다.
실시예 4: 10-아미노데스-1-엔의 합성
규소 표면을 개질하기 위해 사용된 10-아미노데스-1-엔을 쿠르티우스 (Curtius) 반응 (47)의 변형법을 이용하여 제조하였다. 40.5 g의 10-운데세노일 클로라이드 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (200 mg)의 용액을 300 mL의 디클로로메탄 중에서 제조하고 얼음조에서 냉각시켰다. 나트륨 아지드 (15.6 g)를 50 mL의 물에 용해시키고 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 얼음조에서 2시간 동안 연속적으로 교반하였다. 유기층을 제거하고, 50 mL의 물로 2회 세척하고, 36시간 동안무수 황산 마그네슘으로 건조시켜 여과하였다. 트리플루오로아세트산 (20.3 mL)을 교반시키면서 천천히 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 환류시켰다. 트리플루오로아세트아미드를 함유하는 생성된 혼합물을 냉각시키고 50 mL의 포화된 수성 중탄산나트륨으로 2회 세척한 후, 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과하였다. 용매를 회전 증발기로 제거하여 오일을 수득하고 진공 증류시켜 순수한 트리플루오로아세트아미드를 수득하였다. 핵 자기 공명으로 트리플루오로아세트아미드임을 확인하였다. 트리플루오로아세트아미드 분획 10 mL을 7％ 탄산 칼륨 물:메탄올 (2:5) 용액 (48) 500 mL 중에서 3시간 동안 환류시켜 절단하였다. 유리 아민을 100 mL의 에테르로 2회 추출하고, 황산 마그네슘으로 건조시켜 여과하였다. 회전 증발 및 진공 증류로 용매를 제거하여 원하는 생성물을 수득하였다. 핵 자기 공명으로 순수한 아민임을 확인하였다.
실시예 5: t-BOC-보호된 아민의 합성
표준 방법 (49)을 사용하여 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔을 제조하였다. 정제된 아민의 일부(5.11 g)를 클로로포름 60 ㎖에 용해시키고, 이를 물 50 ㎖ 중 NaHCO33 g의 용액에 가하였다. 염화나트륨(6.45 g)과, 클로로포름 몇 ㎖ 중에 용해되어 있는 디-tert-부틸 디카르보네이트 7.18 g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 90분 동안 환류시키고, 에테르 50 ㎖로 2회 추출하였다. 수집한 유기 추출물을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후 회전 증발로 에테르를 제거하였다. t-BOC-보호된 산물을 진공 증류로 정제한 후, NMR로 실재를 확인하였다. 상기 산물의 분취량 10 ㎖에 염화메틸렌 중 25％ TFA 1 ㎖를 실온에서 1시간 동안 처리하여 박층 크로마토그래피로 확인된 상기 유리 아민을 회수하였다.
실시예 6: DNA 개질된 표면의 제조
규소 웨이퍼를 선행 문헌 (19,41,44)에 기술된 방법으로 변형시켜 제조하였다. 상기 웨이퍼를 물 중 플루오르화수소산 2％ 용액에 잠시 노출시켜, 표면의 원자 말단에 수소를 결합시켰다. 그 후, 상기 웨이퍼를 즉시 반응 챔버에 위치시켜 10 내지 30 ㎖의 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔으로 표면을 덮고, UV 램프를 사용하여 2시간 동안 자외선에 노출시켰다. 사용된 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔의 부피는 표면을 덮기에만 충분하였고 웨이퍼 크기에 따라 달리하였다. 상기 웨이퍼를 덮고 있는 층의 두께를 직접 측정하거나 조절하지는 않았지만 전형적으로는 1 mm 미만이었다. 그 후, 개질된 표면을 염화메틸렌 중 25％ TFA로 처리하고, 이어서 10％ NH4OH로 3분 동안 세척하여 t-BOC 보호기를 제거하고, 1급 아민 말단의 표면을 만들었다. 상기 표면을, 헤테로이관능성 가교결합제인 SSMCC(100 mM 트리에탄올아민 완충액 중 1.5 mM, pH 7)를 포함한 50 ㎖ 액적에 20 분 동안 위치시켰다. SSMCC는 티올 반응성 말레이미드 잔기 뿐만 아니라 아민 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르도 포함하고 있다. DNA 배열을 만들기 위해, 상기 말레이미드 활성화된 표면을 약 1 mM의 티올-개질된 DNA 0.4 ㎖ 내지 0.8 ㎖ 액적과 밤새 반응시켰다. 이어서 DNA 개질된 표면을 증류수로 세척하고, 37 ℃에서 1시간 동안 2'SSPE/0.2％ SDS 완충액(20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA 및 7 mM 소듐 도데실 술페이트, pH 7.4, 본원에서는 "HB"로 칭함) 중에 보관하여 비특이적으로 결합된 가닥을 제거하였다.
실시예 7: 반응 챔버
UV 매개된 반응에 사용된 챔버는 직경 11.5 ㎝ 및 높이 5 ㎝의 원통형 알루미늄 베이스로 구성되어 있다. 상기 베이스의 내부를 연마하여 직경 9 ㎝ 및 깊이 4 ㎝의 챔버를 제작하였다. 얇은 테플론(Teflon) 판을 상기 챔버의 바닥에 위치시켰다. 질소 가스가 지속적으로 통과할 수 있도록 내부 및 외부 증기구를 추가하였다. 중앙에서 지름 8 ㎝ 부분을 제거한, 지름 11.5 ㎝ 및 높이 3.5 ㎝의 테플론 덮개를 알루니늄 베이스에 맞도록 제작하였다. 석영 창을 고정하기 위해 상기 지름 8 ㎝의 구멍을 연마하였다. 조립 후 사용시, 상기 덮개를 고정시키고 챔버 위에 UV 램프를 위치시켰다. 상기 UV 램프는 UV Products(부품번호 CPQ-7446)에서 구입하였고, 저압의 수은 증기로 채워진 오존-발생 석영 그리드 램프가 알루미늄 반사체에 결합되어 있다. 15 ㎝ 거리에서의 램프 강도는 2000 microwatts/㎝2(254 nm)이다.
실시예 8: 혼성화 및 변성
표면에 결합된 올리고뉴클레오티드에 형광의 상보체를 혼성화시키기 위해 사용되는 방법은 다른 문헌 (28,44)에도 상세히 기재되어 있다. 간략하게는, DNA-개질된 규소 웨이퍼를 HB에서 꺼내어 증류수로 세척한 후, HB 중 2 mM 5'-플루오레세인 표지된 상보체 5 ㎖ 내지 10 ㎖에 노출시키고, 실온에서 20분 동안 습윤챔버 내에서 혼성화시켰다. 혼성화된 표면을 HB에서 5분 동안 2회 세척하여 혼성화되지 않은 상보체를 제거하였다. 상기 혼성화된 DNA-개질된 표면을 뒤집어서 몰레큘러 다이나믹스 플루오르이미저 (Molecular Dynamics FluorImager) 575 판 위의 HB 액적에 위치시켜 스캔하였다. 상기 방법으로 규소 표면의 형광 부분을 관찰 및 정량하였다. 변성은 실온에서 5분 동안 상기 표면을 8.3 M 요소 용액에 넣은 다음, 물로 세척하여 수행하였다. 그 후, 상기 표면을 플루오르이미저로 재스캔하여 완전한 변성이 수행되었음을 확인하였다. 필요할 경우, 이후의 혼성화는 동일한 방법을 이용하여 반복할 수 있다. 별법으로, 수 밀도 측정 실험을 위해, 90 ℃에서 15분 동안 상기 혼성화된 표면을 소량의 물에 넣어 변성을 수행하였다. 상기 방법으로 이중쇄를 변성시키고, 형광성 상보체를 수집하여 정량하였다 (28,44).
실시예 9: DNA-개질된 아민 표면의 조절
결합된 올리고뉴클레오티드의 거동을 특성화하고, 유리 아민의 밀도를 조절하기 위해 일련의 실시예를 수행하였다. 상이한 2 종의 올리고뉴클레오티드(서열 1 및 서열 2)를 상기 표면에 고정시키고, 각각의 형광성 상보체에 선택적으로 혼성화시켜 혼성화 특성을 시험하였다. 수소-말단의 규소 표면을 t-BOC 보호된 아민 및 도데센의 혼합물과 반응시켜 상기 표면의 유리 아민 밀도를 조절하였다. 별법으로, 상기 t-BOC 보호된 아민 표면을 다양한 시간 동안 25％ 트리플루오로아세트산에 노출시켜 부분적으로 탈보호시켰다.
실시예 10: 표면 밀도 측정
상기 표면에 혼성화된 많은 분자들을 기존에 공개된 방법 (28,44)을 이용하여 측정하였다. 올리고뉴클레오티드를 상기 표면에 고정시키고 앞의 실시예에서와 같이 형광의 상보체로 혼성화시켰다. 상기 표면을 영상화하고 형광 영역을 측정하였다. 그 후, 상기 표면을 미세원심분리 튜브내 90 ℃의 물 800 ㎕에 15분간 넣어 이중쇄를 완전히 변성시켰다. 상기 표면을 물 200 ㎖로 2회 세척하고, 이를 정량적으로 최초의 800 ㎖로 용출시켰다. 상기 표면을 재스캔하여 완전한 변성이 일어났는지 확인하였다. 상보체를 포함하고 있는 물의 부피를 진공 원심분리하여 약 10 ㎖로 줄여서 폴리아크릴아미드겔의 1개의 레인에 로딩하고, 공지 양의 형광성 올리고뉴클레오티드 표준시료를 다른 레인에 로딩하였다. 전기영동 후 젤을 이미징하고 상기 표면에서 용리된 형광의 올리고뉴클레오티드의 양을, 공지 시료로부터 얻은 표준곡선을 참고하여 계산하였다. 상기 방법을 이용한, 혼성화된 분자의 밀도는 대략 2.3 x 1012분자/㎝2이었다.
실시예 11: 안정성 측정
상기 표면의 화학공정상 안정성을 고정된 형광 올리고뉴클레오티드를 관찰하고 혼성화를 반복하여 확인하였다. 직접적인 관찰을 위해, 5' 말단을 플루오레세인으로 표지시키고 3' 말단을 티올기로 표지시킨 올리고뉴클레오티드를 활성화된 표면에 공유결합시켰다. 공유결합이 생성되도록 한 후, 상기 표면을 27 ℃에서 밤새 HB내에 저장하였다. 그 후, 상기 표면의 형광 강도를 플루오르이미저로 스캔하여 측정하고, 다시 이 표면을 27 ℃에서 상기 완충액에 1시간 동안 저장하였다. 그 후, 상기 표면을 재스캔하고 형광을 측정하였다. 매 시간마다 총 10시간 동안상기 표면을 27 ℃에서 상기 완충액에 저장하면서 연속적으로 스캔하였다. 상기 실험 전반에 걸쳐 빛에 노출되는 것을 최소화하였다.
또한 혼성화 조건에 대한 상기 표면의 안정도를 시험하였다. 비-형광성의 서열 1뿐만 아니라 플루오레세인으로 표지된 서열 3을 상기 표면의 다른 2 개 부분에 공유결합시켰다. 상기 DNA-개질된 표면을 서열 1의 형광 표지된 상보체에 20분 동안 노출시키고 혼성화시켰다. 그 후, 혼성화된 표면을 플루오르이미저로 스캔하고 DNA-개질된 양쪽 부분의 형광 신호를 계량하였다. 상기 혼성화된 표면을 8.3 M의 요소에 위치시켜 이중쇄 가닥을 변성시키고, 재스캔하여 형광성 상보체가 제거된 것을 확인하였다. 상기 표면을 15회 주기로 혼성화, 스캐닝, 변성, 재스캐닝 및 재혼성화시켰다(결과 참고).
<참고문헌>

Claims (39)

  1. (a) 치환기를 갖는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알켄을 비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 치환된 알킬 잔기가 개재된 산소 원자 없이 직접 결합된 개질된 기재를 형성시키는 단계
    를 특징으로 하는, 개질된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면을 생성시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 반응을 광개시 (photoinitiation)하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (a)에서 자외선을 조사하여 반응을 광개시하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 자외선에 선택적으로 노출시켜 반응을 패턴화하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 아미노알켄, 카르복시알켄 및 티오알켄으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환된 알켄과 반응시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 (a)에서 알켄상의 치환기를 보호하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 보호된 아미노알켄과 반응시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 t-BOC-보호된 10-아미노데스-1-엔과 반응시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 알켄이 α-올레핀이고, 치환기가 알켄의 ω탄소상에 위치하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 이후에
    (b) 분자를 기재에 결합된 치환된 알킬 잔기에 부착시켜 고정된 분자를 갖는 개질된 표면을 형성시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (b)에서 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 분자를 치환된 알킬 잔기에 부착시키는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 단계 (b)에서 이관능성 가교결합제를 사용하여 분자를 치환된 알킬 잔기에 부착시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (b)에서 SSMCC를 가교결합제로 사용하는 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서
    비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 브롬- 또는 요오드-함유 반응물과 접촉시켜 비산화된 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 형성시킨 다음, 상기 비산화된 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 단계 (a)에서와 같이 반응시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서 기재를 브롬 또는 요오드 용액을 포함하는 시약과 접촉시키는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서 기재를 벤젠 중 브롬 또는 요오드의 용액을 포함하는 시약과 접촉시키는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 단계 (a)에서 514 nm의 파장을 갖는 가시광선을 사용하여 반응을 광개시하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 가시광선에 선택적으로 노출시켜 기재상의 미리 정해진 위치에서 반응을 광개시하는 방법.
  19. (a) 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질 및 보호된 알켄을 비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재와 반응시켜 개재된 산소 분자 없이 기재에 공유적으로 결합된 보호된 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질된 알칸 분자의 표면을 형성시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 개질된 알칸 분자를 탈보호하여 기재에 결합된 비보호 개질된 알칸 분자의 표면을 형성시키는 단계;
    (c) 단계 (b)의 탈보호 개질된 알칸 분자를 가교결합제와 반응시켜 가교결합제를 개질된 알칸 분자에 부착시키는 단계; 및
    (d) 분자를 단계 (c)의 가교결합제에 부착시켜 기재상에 고정된 분자의 표면을 형성시키는 단계
    를 포함하는, 비산화된 탄소, 규소 및 게르마늄 표면상에 개질된 표면을 생성시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서
    비산화된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 브롬- 또는 요오드-함유 반응물과 접촉시켜 비산화된 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 형성시킨 다음, 상기 비산화된 브롬- 또는 요오드-말단의 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재를 단계 (a)에서와 같이 반응시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서 기재를 브롬 또는 요오드 용액을 포함하는 시약과 접촉시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (a)에 앞서서 기재를 벤젠 중 브롬 또는 요오드의 용액을 포함하는 시약과 접촉시키는 방법.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 514 nm의 파장을 갖는 가시광선을 사용하여 반응을 광개시하는 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 가시광선에 선택적으로 노출시켜 기재상의 미리 결정된 위치에서 반응을 광개시하는 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 ω-아미노-, ω-카르복시- 또는 ω-티올-개질 및 보호된 알켄과 반응시키는 방법.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 아미노-, 카르복시- 또는 티올-개질 및 보호된 α-알켄과 반응시키는 방법.
  27. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 기재를 ω-아미노-, ω-카르복시- 또는 ω-티올-개질 및 보호된 α-알켄과 반응시키는 방법.
  28. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (c)에서 가교결합제가 SSMCC인 방법.
  29. 제19항 또는 제20항에 있어서, 단계 (d)에서 핵산을 부착시키는 방법.
  30. 제1항, 제14항, 제19항 또는 제20항에 따라 제조된 개질된 탄소, 규소 또는 게르마늄 표면.
  31. 비산화된 수소-말단의 탄소, 규소 및 게르마늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기재; 및
    개재된 산소 분자 없이 기재에 직접 결합된, 아미노-함유 치환기, 카르복시-함유 치환기 및 티올-함유 치환기로 이루어진 군으로부터 선택된 부착 치환기를 갖는 치환된 알칸 분자층
    을 포함하는, 개질된 탄소, 규소 또는 게르마늄 기재.
  32. 제31항에 있어서, 치환된 알칸 분자층에 결합된 가교결합 분자층을 추가로 포함하는 개질된 기재.
  33. 제32항에 있어서, 가교결합 분자가 SSMCC인 개질된 기재.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기를 알칸의 ω탄소에 부착시켜 치환된 알칸으로 한 개질된 기재.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 개질된 알칸의 치환기에 결합된 분자층을 추가로 포함하는 개질된 기재.
  36. 제35항에 있어서, 분자가 핵산인 개질된 탄소 기재.
  37. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치환된 알칸 분자층에 결합된 가교결합 분자층 및 이 가교결합 분자에 결합된 분자층을 추가로 포함하는 개질된 기재.
  38. 제37항에 있어서, 가교결합 분자에 결합된 분자층이 핵산인 개질된 기재.
  39. 제38항에 있어서, 가교결합 분자가 SSMCC인 개질된 기재.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7534729B2 (en) * 2003-02-28 2009-05-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Modification of semiconductor surfaces in a liquid
US6943417B2 (en) 2003-05-01 2005-09-13 Clemson University DNA-based memory device and method of reading and writing same
WO2005012362A1 (de) * 2003-07-25 2005-02-10 Charite-Universitätsmedizin Berlin Verfahren zum herstellen einer anordnung mit mehreren schichten auf basis eines halbleitersubstrats, mehrschichtanordnung und biosensor
EP1538481A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-08 Sony International (Europe) GmbH A method of activating a silicon surface for subsequent patterning of molecules onto said surface
KR20070046072A (ko) * 2004-06-21 2007-05-02 바헤닝엔 유니버시티 관능화된 맞춤형 규소 및/또는 게르마늄 표면
JP4614330B2 (ja) * 2005-01-31 2011-01-19 独立行政法人科学技術振興機構 有機基で修飾されたシリコン基板の製造方法
US20060199399A1 (en) * 2005-02-22 2006-09-07 Muscat Anthony J Surface manipulation and selective deposition processes using adsorbed halogen atoms
KR100763583B1 (ko) * 2006-12-07 2007-10-05 한국전자통신연구원 비변형 고체표면의 선택적 개질 방법 및 상기 개질된고체표면에 대한 활성물질의 고정화 방법
EP2183595B1 (en) 2007-08-01 2016-04-20 Surfix BV Protein repelling silicon and germanium surfaces
US8093177B2 (en) * 2008-11-06 2012-01-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Metal oxides having molecular and/or biomolecular functionalization
US9272914B2 (en) 2010-11-24 2016-03-01 University Of Delaware -NH- terminated silicon surface and a method for its preparation
CN108129661B (zh) * 2018-01-03 2021-01-22 京东方科技集团股份有限公司 一种聚合物、量子点膜层及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5429708A (en) 1993-12-22 1995-07-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Molecular layers covalently bonded to silicon surfaces
US5830539A (en) 1995-11-17 1998-11-03 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Methods for functionalizing and coating substrates and devices made according to the methods
EP0911088A3 (de) 1997-10-21 2002-07-31 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen
DE19827900A1 (de) * 1997-10-21 1999-04-22 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen
DE19945935B4 (de) 1999-09-24 2008-01-03 Universität Heidelberg Verfahren zur Herstellung eines oberflächenmodifizierten Schichtsystems

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