KR20030036242A - 리파아제를 이용한 글리세리드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
2-모노글리세리드(2-MG) 또는 트리글리세리드(TG), 특히 sn-2위에 고도 불포화 지방산(PUFA)잔기를 가지는 TG를 아주 고순도이며 고효율로 제조하는 방법을 제공한다.
원료 TG를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 2-MG를 제조한다. 더욱이 얻어진 2-MG에 제2의 1,3-리파아제로 1,3위에 지방산 잔기를 도입하여 TG를 제조한다. 바람직하게는, 2위의 지방산 잔기는 DHA, EPA, ARA잔기이다. 여기서, [제1의 리파아제]란 1,3위에 선택적이고, 알콜리시스를 행한 경우에 쇄장이 긴 지방산에도 작용하는 리파아제를 [제2의 리파아제]란 1,3위에 선택적이고, 2-MG와 지방산 에스테르 또는 유리지방산을 반응시킨 경우에 TG를 생성하는 리파아제를 의미한다.
Description
1,3위에 특이적인 리파아제를 이용하여 TG의 1,3위에 임의의 지방산을 도입하는 경우, 일반적으로는 목적 지방산으로 아시드리시스하는, 또는 목적 지방산 에스테를 에스테르 교환하는 등의 방법이 이용된다. 그러나 이 경우에는 상당히 과잉량의 지방산이나 에스테르를 이용하여야 하고, 또한 확률론적으로 일부는 원래의 1,3위의 지방산이 잔존하기 위하여 목적 구조 지질을 고순도로 얻는 것은 비교적 어렵다.
더욱이 리파아제에 따라서는 지방산의 쇄장에 따라 활성이 크게 변화하여 DHA 등의 장쇄 지방산에 대한 활성이 현저하게 약하므로, 목적의 구조지질을 얻을 수 없는 경우도 있다.
또한, 리파아제의 반응에는 가수분해 반응, 에스테르 교환반응, 아시드리시스, 에스테르화 반응 등을 들 수 있지만 모든 리파아제가 어떠한 반응에 대하여도 같은 조건에서 같은 정도의 활성을 나타내는 것은 아니고 여러가지 특성의 리파아제가 존재한다. 예를 들면, 아시드리시스에 대하여 강한 활성을 가진 1,3-리파아제를 이용하면 1,3위의 지방산의 치환에 유리하지만, 상기 리파아제가 DHA 등에 대하여 충분한 활성을 가지고 있지 않은 경우에는 1,3위에 DHA가 위치한 TG에서 다른 목적 지방산에의 치환은 상당히 곤란해진다. 물론, 아시드리시스에 고활성이고 DHA에도 활성이 높은 리파아제를 이용하면 목적은 달성할 수 있지만, 이와 같은 리파아제는 입수가 곤란하거나, 극히 고가이므로 공업적인 용도에 이용하는 것은 바람직하지 않다.
본 발명은 리파아제를 이용한 글리세리드의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 리파아제를 이용한 2-모노글리세리드 또는 트리글리세리드, 특히 sn-2위로 고도 불포화지방산(PUFA)잔기를 가지는 트리글리세리드(TG)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서. [DHA]는 도코사헥사엔산, [EPA]는 에이코사펜타엔산, [ARA]는 아라키돈산의 약칭으로서 사용하고 있다. 또한, DHA농축유지, 트리DHA-트리글리세리드라는 사용방법의 경우, 도코사헥사엔산 잔기의 약칭으로서 사용하고 있다.
또한, [MG]는 모노글리세리드, [2-MG]는 모노글리세리드, [TG]는 트리글리세리드의 약칭으로서 사용하고 있다.
또한, [제1의 리파아제]란 1,3위로 선택적으로, 알코리시스를 행한 경우에 쇄장이 긴 지방산에도 작용하는 리파아제를 의미한다.
또한, [제2의 리파아제]란 1,3위로 선택적으로, 2-MG와 지방산 에스테르 또는 유리지방산을 반응시킨 경우에 TG를 생성하는 리파아제를 의미한다.
(발명의 개시)
본 발명은 2-MG 또는 TG, 특히 sn-2위로 고도 불포화지방산(PUFA)잔기를 가지는 TG를 아주 고순도이며 고효율로 제조하는 방법의 제공을 목적으로 하고 있다.
본 발명은 원료 TG를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 2-MG를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법을 요지로 하고 있다.
2위의 지방산잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기이고, 그 경우, 본 발명은 원료 TG를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 2위의 지방산 잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기인 MG를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
원료TG가 고도불포화 지방산을 함유하는 유지, 바람직하게는 DHA농축유지, EPA농축유지 또는 ARA농축유지이고, 그 경우 본 발명은 고도 불포화지방산을 함유하는 유지, 바람직하게는 DHA농축유지, EPA농축유지 또는 ARA농축유지를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 2-MG를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
상기의 유지가 어유이고, 그 경우 본 발명은 어유, 바람직하게는 DHA농축어유, 또는 EPA농축어유를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 2-MG를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
원료TG가 트리DHA-TG, 트리EPA-TG, 또는 트리ARA-TG이고, 그 경우 본 발명은 트리DHA-TG, 트리EPA-TG를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 2-MG를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
또한, 본 발명은 상기의 2-MG, 즉 원료TG를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 얻어지는 2-MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위로 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법을 요지로 하고 있다.
2위의 지방산 잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기이고, 그 경우, 본 발명은 원료 TG를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2위의 지방산 잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기인 MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위로 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
1,3위에 도입되는 지방산 잔기가 탄소수 8,10 또는 12의 중쇄 포화지방산잔기이고, 그 경우, 본 발명은 원료 TG를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG, 바람직하게는 2위의 지방산 잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기인 MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위로 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
원료TG가 고도불포화 지방산을 함유하는 어유, 바람직하게는 DHA농축유지, EPA농축유지 또는 ARA농축유지이고, 그 경우, 본 발명은 고도불포화 지방산을 함유하는 유지, 바람직하게는 DHA농축유지, EPA농축유지 또는 ARA농축유지를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG를 경유하여 제2의 1,3-리파아제로 1,3위에 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
상기의 유지가 어유이고, 그 경우 본 발명은 어유, 바람직하게는 DHA농축어유, 또는 EPA농축어유를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위로 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
원료TG가 트리DHA-TG, 트리EPA-TG, 또는 트리ARA-TG이고, 그 경우 본 발명은 트리DHA-TG, 트리EPA-TG 또는 트리ARA-TG를 제1의 1,3리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위로 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법이다.
본 발명의 글리세리드의 제조방법의 바람직한 양태는, 원료TG를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG를 경유하여 제2의 1,3리파아제로 1,3위에 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 TG를 얻는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명은 리파아제의 반응을 2단계로 나누어, TG에서 제1의 1,3-리파아제를 이용하여 알콜리시스에 의하여 2-MG를 조제하고, 그 후 1,3위에 도입한 지방산의 저급 알킬 에스테르 또는 유리지방산을 이용하여 제2의 1,3리파아제로 2-MG의 에스테르화 반응에 의하여 TG를 조제하는 방법이다.
본 발명자들은 어느 종의 리파아제가 TG와의 반응으로 아시드리시스나 가수분해에서는 바라는 결과가 얻을 수 없는 경우라도, 알콜리시스를 행하는 것에 의하여, DHA등의 리파아제가 작용하기 어려운 지방산이 1,3위에 있는 경우라도, 거의 완벽하게 1,3위의 지방산을 제거하여 2-MG를 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 이어서 2-MG에는 1,3위로 도입하고 싶은 지방산의 에스테르 또는 유리지방산을 작용시키는 것으로 목적으로 하는 구조의 TG를 아주 고순도이고 고효율로 얻을 수 있는 것을 발견하고, 이들의 순서를 순서대로 조합함으로써 본 발명을 완성하였다.
제1단계에서 사용되는 제1의 리파아제는 1,3위로 선택적으로 에타노리시스 메타노리시스 등의 알콜리시스를 행한 경우에 DHA 등의 쇄장이 긴 지방산에도 작용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이 목적으로 이용할 수 있는 리파아제로서 Candida antarctica 리파아제(예를 들면 Novozym 435 [노보놀 디스크 바이오 인더스트리(주)])가 바람직한 것으로서 예시된다.
제2단계에서 사용되는 제2의 리파아제는 1,3위로 선택적이고, 2-MG와 지방산 에스테르 또는 유리지방산을 감압하에서 반응시켜 TG를 생성할 수 있다면 특별히 한정되지 않는다. 이 목적으로 이용할 수 있는 리파아제로서 Rhizomucor miehei 리파아제(예를 들면 Lipozyme IM[노보졸 디스크 바이오 인더스터리(주)])가 바람직한 것으로서 예시된다. 지방산 에스테르로서 에틸 에스테르 등의 저급 알킬 에스테르가 예시된다.
본 발명의 제조방법의 가장 바람직한 양태는 원료TG를 Novozym 435로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-MG를 경유하여 Lipozyme 1M에서 1,3위에 지방산 잔기를 도입하는 것으로 목적으로 하는 구조의 TG를 얻는 것을 특징으로 한다.
원료TG는 바람직하게는 고도불포화 지방산을 함유하는 유지이고, 고도불포화 지방산은 DHA, EPA 또는 ARA이다. 본 발명의 방법에서 이용되는 원료TG는 예를 들면 어유이고, 바람직하게는 DHA농축유지 또는 트리DHA-TG, 또는 EPA농축유지, 또는 트리EPA-TG, 또는 ARA농축유지 또는 트리ARA-TG이다. 본 발명의 방법에서 이용되는1,3위에 도입되는 지방산은 바람직하게는 탄소수 8,10 또는 12의 포화지방산이다.
본 발명에 있어서 원료의 TG로서 고도로 정제된 DHA만으로 구성되는 트리DHA-TG를 이용한 경우, 고순도로 X-DHA-X형의 TG를 얻는 것이 가능하고, 이것은 종래의 아시드리시스와 시판되는 리파아제의 조합으로는 조제가 아주 곤란하다. 또한, 이때 1,3위에 도입하는 지방산에 탄소수8~12의 중쇄지방산을 선택하면 흡수성이 우수한 DHA함유 TG를 얻을 수 있고 유아용의 분유 등에 이용하면 큰 효과를 기대할 수 있다.
또한, EPA를 함유한 구조지질도 마찬가지로 조제 가능하고 흡수성이 높은 EPA함유 TG를 얻은 경우에는 EPA가 가지는 많은 생리활성을 기대한 식품, 의약품 등을 기대할 수 있다.
더욱이 어유에는 원래부터 sn2위에 DHA가 국소적으로 존재하고 있는 것이 알려져 있고, 본 발명을 DHA함량이 비교적 높은 참치유나 가다랭이유에 적용하면 흡수성을 증대시킨 영양면에서 우수한 유지를 얻을 수 있다. 또한, 원료 어유의 DHA농도를 윈터링 등의 방법으로 농축한 어유를 이용하면 더욱 DHA를 고함량으로 한 목적으로 하는 구조의 TG를 얻을 수 있다.
리파아제의 반응을 2단계로 나누어, 제1 단계에서 TG에서 제1의 1,3-리파아제를 이용하여 알콜리시스함으로써, DHA 등의 리파아제가 작용하기 어려운 지방산이 1,3위에 있는 경우에도, 거의 완벽하게 1,3위의 지방산을 제거하여 2-MG를 얻을 수 있다.
그 후, 제2 단계에서 1,3위에 도입하고 싶은 지방산의 저급 알킬 에스테르또는 유리 지방산을 이용하여 제2의 1,3-리파아제로 2-MG의 에스테르화 반응을 함으로써, 목적으로 하는 구조의 TG를 아주 고순도이고 고효율로 얻을 수 있다.
(발명을 실시하기 위한 최량의 형태)
본원 발명의 상세를 실시예로 설명한다. 본원 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것이 아니다.
(실시예 1)
가다랭이유 1g, 에탄올3g, Novozym 435 0.4g을 혼합하여, 질소기류하 35℃에서 2시간 교반하였다. 반응후, 반응 혼합물의 지질 조성을 이아트로 스캔(iatron scan)으로 측정한 결과, 에틸 에스테르 69.5%, 디글리세리드 2.3%, MG 28.3%이고 TG, 유리지방산은 검출되지 않았다. 박층 크로마토그래피 분석 결과, MG는 2-MG임을 확인하였다. 또한, 가스크로마토그래피로 지방산 조성을 측정한 결과, 원료 가다랭이유의 DHA는 27.9%인 것에 대하여, MG의 DHA는 51.5%이었다.
(실시예 2)
정어리유를 원료로 하여, PUFA의 농축을 목적으로 아세톤을 용매로 한 윈터링을 행하여 얻은 기름 1g, 에탄올3g, Novozym 435 0.4g을 혼합하여, 질소기류하 35℃에서 3시간 교반하였다. 반응후, 반응 혼합물의 지질 조성을 이아트로 스캔(iatron scan)으로 측정한 결과, 에틸 에스테르 67.7%, 디글리세리드 1.9%, MG 30.4%이고 TG, 유리지방산은 검출되지 않았다. 박층 크로마토그래피 분석 결과, MG는 2-MG임을 확인하였다. 또한, 가스크로마토그래피로 지방산 조성을 측정한 결과,윈터링유의 DHA는 13.0%인 것에 대하여, MG의 DHA는 28.8%이었다.
(실시예 3)
글리세린 0.184g, 물 0.184g, Novozym 435 0.239g을 혼합하여 30분간 교반후, DHA 1.971g을 가하여 60℃, 3~5mmHg의 감압하에서 하루밤 교반하였다. 효소를 노별하고, 반응혼합물을 실리카겔 컬럼으로 정제한 결과, 트리DHA-TG 1.83g(순도 99%, 수율 89%)를 얻었다.
얻어진 트리DHA-TG 0.102g, 에탄올 0.306g, Novozym 435 0.046g을 혼합하여, 35℃의 질소기류중에서 4시간 교반하였다. 효소를 노별하고, 글리세리드 구획분의 조성을 이아트로 스캔(iatron scan)으로 분석한 결과, MG 92.7%, 디글리세리드 5.35%, TG 1.96%이었다. 박층크로마토그래피에 의하여 MG는 100% 2-MG인 것을 확인하였다.
(실시예 4)
실시예 3과 마찬가지로 조작하여 얻어진 반응 혼합물에서 효소를 노별후 잔존하는 에탄올을 감압하에서 잔류한 것 전량에 옥탄산 에틸0.345g, 물 0.010g, Lipozyme IM 0.050g을 가하여 질소기류하 35℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, 진공 펌프로 반응용기를 3~5mmHg로 감압하고, 35℃에서 3.5시간 교반을 계속하였다. 얻어진 반응혼합물의 글리세리드 구획분의 조성을 가스크로마토그래피 및 은이온 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 의하여 분석한 결과, 2위에 DHA, 1,3위에 옥탄산을 가지는 TG가 81.4% 포함되어 있었다.
(실시예 5)
실시예 3과 마찬가지로 조작하여 얻어진 반응 혼합물에서 분획하여 얻어진 2-DHA-MG 0.040g에 옥탄산 0.289g, 물 0.010g, Lipozyme IM 0.050g을 가하여 질소기류하 35℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, 진공 펌프로 반응용기를 3~5mmHg로 감압하고, 35℃에서 3.5시간 교반을 계속하였다. 얻어진 반응혼합물의 글리세리드 구획분의 조성을 가스크로마토그래피 및 은이온 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 의하여 분석한 결과, 2위에 DHA, 1,3위에 옥탄산을 가지는 TG가 78.8% 포함되어 있었다.
(실시예 6)
글리세린 0.184g, 물 0.184g, Novozym 435 0.239g을 혼합하여 30분간 교반후, EPA 1.815g을 가하여 60℃, 3~5mmHg의 감압하에서 하루밤 교반하였다. 효소를 노별하고, 반응혼합물을 실리카겔 컬럼으로 정제한 결과, 트리EPA-TG 1.74g(순도 99%, 수율 92%)를 얻었다.
얻어진 트리EPA-TG 0.094g, 에탄올 0.283g, Novozym 435 0.038g을 혼합하여, 35℃에서 4시간 교반하였다. 효소를 노별하고, 글리세리드 구획분의 조성을 이아트로 스캔(iatron scan)으로 분석한 결과, MG 98.5%, 디글리세리드 5.35%, TG 0.42%이었다. 박층크로마토그래피에 의하여 MG는 100% 2-MG인 것을 확인하였다.
(실시예 7)
실시예 6과 마찬가지로 조작하여 얻어진 반응 혼합물에서 효소를 노별후 잔존하는 에탄올을 감압하에서 잔류한 것 전량에 데칸산 에틸 0.400g, 물 0.010g, Lipozyme IM 0.050g을 가하여 질소기류하 35℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, 진공 펌프로 반응용기를 3~5mmHg로 감압하고, 35℃에서 3.5시간 교반을 계속하였다. 반응후 얻어진 글리세리드 구획분의 조성을 가스크로마토그래피 및 은이온 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 의하여 분석한 결과, 2위에 EPA, 1,3위에 데칸산을 가지는 TG가 72.7% 포함되어 있었다.
(실시예 8)
실시예 6과 마찬가지로 조작하여 얻어진 반응 혼합물에서 분획하여 얻어진 2-EPA-MG 0.037g에, 데칸산 0.345g, 물 0.010g, Lipozyme IM 0.050g을 가하여 질소기류하 35℃에서 30분간 교반하였다. 이어서, 진공 펌프로 반응용기를 3~5mmHg로 감압하고, 35℃에서 3.5시간 교반을 계속하였다. 반응후 얻어진 글리세리드 구획분의 조성을 가스크로마토그래피 및 은이온 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 의하여 분석한 결과, 2위에 EPA, 1,3위에 데칸산을 가지는 TG가 70.6% 포함되어 있었다.
목적으로 하는 구조의 TG, 특히 sn-2위에 PUFA를 가지는 TG를 아주 고순도이며 고효율로 제조하는 TG의 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 목적으로 하는 구조의 TG제조를 위한 중간체로서 특히 유용한 2-MG를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
Claims (8)
- 원료 트리글리세리드를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 2-모노글리세리드를 제조하는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 원료 트리글리세리드를 제1의 1,3-리파아제로 알콜리시스하여 얻을 수 있는 2-모노글리세리드를 경유하여 제2의 1,3-리파아제로 1,3위에 지방산 잔기를 도입하는 것으로 2위에 원료 트리글리세리드 유래의 지방산 잔기를 가지고, 1,3위에 새롭게 도입한 동일의 지방산 잔기를 가지는 구조의 트리글리세리드를 얻는 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 2 항에 있어서,2위의 지방산 잔기가 DHA, EPA 또는 ARA잔기인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,1,3위에 도입되는 지방산 잔기가 탄소수8, 10 또는 12의 중쇄 포화지방산 잔기인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서,원료 트리글리세리드가 고도 불포화 지방산을 함유하는 유지인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 5 항에 있어서,상기의 유지가 DHA농축유지, EPA농축유지 또는 ARA농축유지인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,상기의 유지가 어유인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,원료 트리글리세리드가 트리DHA-트리글리세리드, 트리EPA-트리글리세리드, 또는 트리ARA-트리글리세리드인 것을 특징으로 하는 글리세리드의 제조방법.
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