KR20030036218A - 아크릴로니트릴 보집제를 이용한 합성올리고뉴클레오티드의 디프로텍팅 - Google Patents

아크릴로니트릴 보집제를 이용한 합성올리고뉴클레오티드의 디프로텍팅 Download PDF

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KR20030036218A
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난다 디. 신하
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아베시아 바이오테크놀러지, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 β-시아노에틸 그룹을 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 제거하는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 개질되는 것을 방지하는 방법에 관한다. 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 t-부틸아민과 같은 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 온도에서 충분한 시간동안 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 제조 방법에 관한다.

Description

아크릴로니트릴 보집제를 이용한 합성 올리고뉴클레오티드의 디프로텍팅 {DEPROTECTION OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES USING ACRYLONITRILE SCAVENGER}
관련된 출원(RELATED APPLICATIONS)
본 출원은 2000. 6. 12에 제출된 미국 예비 출원 60/210,757의 이익을 가지고, 상기 출원의 모든 내용은 이하 본 문헌에 합체되어 있다.
발명의 배경
올리고뉴클레오티드(oligonucleotid)는 고체 지지체 상에서 β-시아노에틸 포스포라미디트 화학(β-cyanoethyl phosphoramidite chemistry)을 사용하여, 안티센스 치료법에 사용하기 위하여 대규모로 또는 진단/분자 생물학에 사용하기 위하여는 소규모로 정해진 순서대로 합성된다. 상기 화학은 디프로텍팅(deprotection)과 정제를 용이하게 하기 위하여 실리카를 주성분으로 하는 CPG 비드를 고체 지지체로 사용하면서 발전되어왔다. 그 후, 상기 화학은 강체(rigid) 폴리스티렌에 기초한 지지체를 사용하면서 올리고뉴클레오티드 합성에 응용되어왔다. 이 밖에도, FDA가 CMV 처리용 올리고뉴클레오티드 유사체를 승인한 이후, 안티센스 및 관련 치료분야에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드의 대규모 합성은 점점 더 중요하게 되었다. 몇몇 다른 올리고뉴클레오티드 유사체가 현재 임상 실험 중이다. 현재, 포스페이트 디에스테르 (phosphate diester) 또는 포스포로티오에이팅된 (phosphorothioated) 디에스테르 결합이 있는 올리고뉴클레오티드는 몇 킬로그램 정도의 다량으로 β-시아노에틸 포스포라미디트 화학을 이용하여 임상 실험용 및 다른 용도로 사용하기 위하여 합성되고 있다.
약제학적 용도에 있어서, 바람직한 올리고뉴클레오티드는 합성 과정에서 생성된 모든 불순물과 실질적으로 분리되어야 한다. 불순물은 역상(reverse phase) 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및/또는 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 일반적으로 제거된다. 그러나, 의도하는 생성물과 구조적으로 유사한 불순물의 제거는 상기 불순물이 의도하는 생성물과 구조적으로 유사하여 불순물의 크로마토그래피 이동도와 의도하는 생성물의 크로마토그래피 이동도가 서로 유사하기 때문에 곤란하다. 따라서, 합성 방법을 개선하여 의도하는 생성물과 구조가 유사한 불순물이 생성되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 β-시아노에틸 포스페이트 프로텍팅 그룹(protecting group)이 분리되는 동안 방출되는 아크릴로니트릴이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 상의 친핵성 그룹과 반응하여 의도하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체와 구조가 유사한 불순물을 생성시킬 수 있다는 발견에 관한다.
본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 개질되는 것을 실질적으로 방지한다. 본 발명은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 내 아크릴로니트릴 보집제(輔集劑)용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 분리에 충분한 조건(예를 들면, 충분한 온도 및 충분한 시간 동안) 하에서서 접촉시키는 것을 포함한다. t-부틸아민이 바람직한 아크릴로니트릴 보집제이다. 적당한 유기 용매에는 피리딘, 테트라하이드로푸란 또는 디옥산과 같은 에테르, 아세토니트릴과 같은 니트릴, 메틸렌 클로라이드와 같은 할로알칸, 에틸 아세테이트, 메틸 프로피오네이트 및 에틸 프로피오네이트와 같은 에스테르, 에탄올 또는 메탄올과 같은 알콜 및 디메틸 포름아미드와 같은 친핵성 용매가 포함된다. 바람직한 용매의 한 그룹에는 할로알칸, 에스테르, 알콜 및 디메틸 포름아미드가 포함된다. 바람직한 용매의 다른 그룹에는 피리딘 및 아세토니트릴이 포함된다.
다른 구체예에 있어서, 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 t-부틸아민과 같은 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 접촉되는 것을 포함한다. 염기성 용액은 수산화암모늄 수용액이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액과 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉된다.
다른 구체예에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 접촉되기 전에 유기 용매 및 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 용액과 접촉된다.
이 밖에도, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 또는 염기성 수용액과 접촉될 때, 하나 이상의 핵염기(nucleobase) 프로텍팅 그룹이 제거될 수 있다. 이 밖에도, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 또는 염기성 수용액과 접촉됨으로써 고체 지지체로부터 동시에 분리될 수 있다.
본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질이 실질적으로 방지되는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 제조 방법에도 관한다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 제조 방법에 있어서, 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 통상적으로 포스포라미디트 화학을 이용하여 합성된다. 합성된 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 이후 유기 용매 내 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제 용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 온도에서 충분한 시간 동안 접촉된다. 이와는 별개인 구체예에서, 합성된 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 온도에서 충분한 시간동안 접촉된다. 다른 구체예에서, 합성된 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 먼저 유기 용매 내 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제 용액에 접촉된 후, 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 온도에서 충분한 시간동안 접촉된다.
통상적으로, β-시아노에틸 포스페이트 프로텍팅 그룹은 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 수산화암모늄 수용액으로 처리함으로써 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리된다. 수산화암모늄으로 처리한 후 크루드(crude) 생성물의 크로마토그램에는 통상적으로 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체와는 달리,추가 피크(peak)가 나타난다. 이러한 비정상은 티민 또는 구아닌 염기 또는 지방족 아민 그룹이 함유되도록 개질된 올리고뉴클레오티드가 많은 서열에서 주로 발견된다. 본원에서 기재되는 바와 같이, 수산화암모늄으로 처리된 크루드 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 생성물의 MALDITOF 질량 스펙트럼에는 주요 불순물이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 의도하는 질량보다 52-54 단위 많은 질량을 가지는 것으로 나타나는데, 상기 주요 불순물은 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹의 분리로부터 생성된 부산물로서, 의도하는 올리고뉴클레오티드가 아크릴로니트릴로 개질됨으로써 유도된 것임을 나타낸다.
어떠한 이론에도 얽매임 없어, 본 발명의 방법은 β-시아니에틸 프로텍팅 그룹을 제거하는 동안 생성된 아크릴로니트릴을 아크릴로니트릴 보집제와 반응시켜 염기성 수용액으로부터 제거하는 이익이 있다고 생각된다. 이로써, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내 하나 이상이 핵염기가 아크릴로니트릴과 반응되는 것과 같은, 의도하는 올리고뉴클레오티드 생성물과 구조가 유사한, 분리하건 또는 디프로텍팅(deprotection)하는 동안 생성된 불순물의 양은 감소된다. 따라서, 의도하는 생성물의 정제가 더욱 용이하게 되어 정제된 생성물을 더욱 많이 수득할 수 있게 된다.
도면 1A, 1B 및 1C 는 하기 기재한 바와 같은 이온 교환 HPLC 크로마토그램이다. 컬럼 종류는 DNA PAC PA-100(컬럼 s/n: 1305)였다. 용리액 A는 pH가 8인 트리스 25mM 였다. 용리액 B 는 25mM 의 트리스, 375mM 의 pH 8의 NaCIO4였다. 상기 시스템의 명칭은 IEX2였다. 유로 등급(Channel Description) 은 260nm 였다. 기울기는(Gredient) 1.5ml/min의 유속 및 45℃의 온도에서 10 - 60% B IN 40분이었다.
도 1A 는 31개의 티민이 있는 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 이온 교환 HPLC 크로마토그램으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로부터 분리되었고 50℃에서 16시간동안 수산화암모늄으로 처리되어 디프로텍팅되었다.
도 1B는 도 1A 에서 포스페이트 디에스테르로 합성된 동일한 재료로부터 얻은 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 이온 교환 HPLC 크로마토그램으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로부터 분리되었고 50℃에서 16시간동안 수산화암모늄 내 10% t-부틸아민으로 처리하여 디프로텍팅되었다.
도 1C는 도 1A 에서 포스페이트 디에스테르로 합성된 동일한 재료로부터 얻은 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 이온 교환 HPLC 크로마토그램으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로부터 분리되었고 50℃에서 16시간동안 수산화암모늄 내 5% DDT로 처리하여 디프로텍팅되었다.
도 2A 는 도 1A 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 MALDITOF 질량 스펙트럼이다. PSINH4OH PIRRED. Method 는 DNA 1이었다. 방식(Mode)는 선형이었다. 가속 전압(Accelerating Voltage)은 25000이었다. 그리드 전압은(Grid Voltage) 92.500%이었다. 규준 철사 전압(Guide Wire Voltage)는 0.150%이었다. 평균 스캔(Scans Averaged)는 156이었다. 압력은 2620에서 3.09e-07.Laser이었다. 음이온(Negative Ion)은 OFF로 하였다. 저 중량 차단(Low Mass Gate)는 500.0이었다. 지연(Delay)은 250 ON이었다.
도 2B 는 도 1B의 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 MALDITOF 질량 스펙트럼이다. PSINH4OH + 10% t-부틸아민 방법은 DNA1이었다. 방식은 선형이었다. 가속 전압은 25000이었다. 그리드 전압은 92.500%이었다. 규준 철사 전압은 0.150%이었다. 평균 스캔은 54였다. 압력은 2620에서 3.05e-07.Laser 이었다. 음이온은 OFF로 하였다. 저 중량 차단은 500.0이었다. 지연은 250 ON이었다.
도 2C 는 도 1C의 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드의 MALDITOF 질량 스펙트럼이다. PSINH4OH +DDT TIPPED. Method는 DNA1이었다. 방식은 선형이었다. 가속 전압은 25000이었다. 그리드 전압은 92.500%이었다. 규준 철사 전압은0.150%이었다. 평균 스캔은 54이었다. 압력은 2620에서 3.05e-07. Laser이었다. 음이온은 OFF로 하였다. 저 중량 차단은 500.0이었다. 지연은 250 ON이었다.
본 발명은 β-시아노에틸 포스페이트 프로텍팅 그룹이 분리되는 동안 생성되는 아크릴로니트릴로 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 개질되는 것은 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 분리시키는데 사용되는 염기성 수용액에 아크릴로니트릴 보집제를 가함으로써 개선되거나 또는 실질적으로 방지될 수 있다는 발견에 관한다. 이와는 별개로, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 내 아크릴로니트릴 보집제로 처리함으로써 방지될 수 있다.
β-시아노에틸 프로텍팅 그룹은 합성동안 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 인 주쇄(phosphorous backbone)에 결합되어 있는 산소 또는 황의 프로텍팅에 통상적으로 사용되어 왔다. β-시아노에틸 프로텍팅 그룹은 하기와 같은 구조식으로 표시될 수 있다:
β-시아노에틸 프로텍팅 그룹은 염기성 용액으로 처리되어 제거될 수 있다.β-시아노에틸 프로텍팅 그룹의 제거에 관한 상세한 조건은 Sinha 등의Nucleic Acids Reasearch(1984), 12(11):4539 및 Sinha의 미국 특허 제4,725,677호에서 볼 수 있는데, 이의 모든 내용은 본 문헌에 합체되어 있다.
본 문헌에서 사용되는 "염기성 수용액"이란 수용액 또는 알콜, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 및 디메틸 포름아미드와 같은 물과 혼화될 수 있는 유기 용매를 함유한 수용액을 말한다. 유기 용매가 수용액 내에 존재하는 경우, 그 농도는 통상적으로 50% 이하이다. 염기는 통상적으로 암모니아, 치환되었거나 치환되지 않은 지방족 아민, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 아민, 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물이다. 수성 수산화암모늄이 바람직한 염기성 용액이다. 바람직한 구체예에 있어서, 핵염기 프로텍팅 그룹도 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액으로 처리함으로써 제거된다.
β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 수산화암모늄과 같은 염기로 처리됨으로써 제거되는 경우, 아크릴로니트릴이 생성된다.(예를 들어, 식 I을 참조하시오)
식 I: β-시아노에틸 프로텍팅 그룹의 디프로텍팅
식 I 에 있어서, X1및 X2는 각각 독립적으로 산소 또는 황이다. β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 제거되는 동안 생성된 아크릴로니트릴은 Michael 수용기이고, 따라서 염기성 반응 조건 하에서는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴틀레오티드 유사체 상의 고리밖(exocyclic) 또는 고리안(endocyclic) 친핵성 그룹과 반응할 수 있다. 예를 들어, 아크릴로니트릴은 식 II 에 나타난 바와 같이 N3에 첨가됨으로써 티미딘 염기와 반응할 수 있다.
식 II : 수산화암모늄 처리 중 핵염기의 시아노에틸화(cyanoethylation)
본 발명의 방법에서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 시아노에틸화는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집게가 있는 용액으로 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 제거함으로 개선되거나 실질적으로는 방지된다. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 제거하는 처리가 된 다음이라면 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 제거하는 동안 올리고뉴클레노티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 아크릴로니트릴로 개질되는 것이 실질적으로 방지되어 의도하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체보다 52-53 질량 단위정도 더 높은 불순물이 존재하지 않거나, 또는 상기 불순물의 감지 가능한 양은 의도하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체에 비하여 0.5% 이하가 된다.
아크릴로니트릴 보집제는 아크릴로니트릴과 반응하여 아크릴로니트릴이 핵염기의 친핵성 그룹과 같은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 친핵성 그룹과 반응할 수 없게 하는 화합물이다. 바람직하게, 아크릴로니트릴 보집제는 또한 β-시아노에틸 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유사체의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 분리하여 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 의도하는 주쇄(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸 포스포네이트 등)를 생성할 수 있다. 아크릴로니트릴 보집제는 바람직하게는 장애를 갖도록 하여(hindered) 핵염기와의 반응이 일어나지 않도록 한다. 예를 들어, 장애를 갖지 않은(unhindered) 1차 아민은 시토신의 N4-아민 및 아데노신의 N6-아민과 교체됨으로써(Hsiung 등의Nucleic Acid Reasarch(1983),11(10):3227) 시토신 및 아데노신과 반응할 수 있다. 따라서, 1차 지방족 아민 또는 1차 방향족 티올인 아크릴로니트릴 보집제는 입체장애를 가져야 한다. 입체장애를 갖고 있는 티올 또는 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민은 지방족 2차 또는 3차 탄소 원자 또는 1차 탄소가 2차 또는 3차 탄소 원자에 결합되어 있는 1차 탄소 또는 방향족 또는 헤테로 방향족 그룹에 결합되어 있는 티올 또는 아민 그룹이다. 사용될 수 있는 아크릴로니트릴 보집제에는 치환되었거나 또는 치환되지 않은 지방족 하이드록실 화합물을 포함된다. 바람직한 아크릴로니트릴 보집제는 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 지방족 티올, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 티올, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 하이드록실(예를 들어, 페놀), 치환되었거나 치환되지 않은 2차 지방족 아민, 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민, 또는 치환되었거나 치환되지 않은 1차 또는 2차 방향족 아민이다. 더욱 바람직하게, 아크릴로니트릴 보집제는 t-부틸아민이다.
아크릴로니트릴 보집제는 바람직하게는 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 분리시키기 때문에, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질은 β-시아노에틸 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 용매로 충분한 시간동안, 바람직하게는 약 0.5 시간 내지 약 2시간 동안, 충분한 온도로, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 30℃로 처리함으로써 하나 이상의 β-시아노에틸 그룹을 제거하여 실질적으로 방지될 수 있다. 아크릴로니트릴 보집제는 유기 용매 내에 약 0.5%(vol/vol) 내지 약 50%(vol/vol), 바람직하게는 약 3%(vol/vol) 내지 약 25%(vol/vol), 더욱 바람직하게는 약 1%(vol/vol) 내지 약 15%(vol/vol)로 종종 존재한다.
다른 구체예에 있어서, 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 있는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 그룹 제거에 충분한 온도에서 충분한 시간동안 접촉된다. 아크릴로니트릴 보집제는 염기성 용액 내에 약 0.5%(vol/vol) 내지 약 50%(vol/vol), 바람직하게는 약 3%(vol/vol) 내지 약 25%(vol/vol), 더욱 바람직하게는 약 1%(vol/vol) 내지 약 15%(vol/vol)의 농도로 종종 존재한다.
올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 핵염기의 아민 그룹이 아미드 프로텍팅 그룹의 생성에 의하는 것과 같이, 불안정한 염기성 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되는 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 접촉될 때, 상기 프로텍팅 그룹은 제거될 수 있다. 이 밖에도, 올리고뉴클레오티드가 숙신아미드 링커(linker) 또는 옥사마이드 링커와 같은 불안정한 염기성 링커에 의하여 고체 지지체와 결합되어 있다면, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 접촉됨으로써 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 이와 유사하게, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 용액에 접촉되는 경우, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 치환되었거나 치환되지 않은 2차 지방족 아민 또는 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민과 같은 아민이라면, 핵염기 프로텍팅 그룹은 제거될 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액에 약 48 이하의 시간동안 통상적으로 접촉된다. 통상적으로, 염기성 수용액은 약 20℃ 내지 약 100℃의 온도이다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 접촉되는 시간의 길이 및 상기 용액의 온도는 존재하는 제거되어어야 할 핵염기 프로텍팅 그룹과 사용된 핵염기 프로텍팅 그룹의 종류에 따라 다르다. 예를 들어, 아데닌 및 시토신의 아민 그룹은 벤조일 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되고, 구아닌의 아민 그룹은 이소부틸 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되는 경우, 올리고뉴클레오티드를 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 접촉시키기에 충분한 시간은 약 6시간 내지 약 16시간이며, 온도는 약 45℃ 내지 약 65℃, 바람직하게는 55℃이다. 그러나, 속 디프로텍팅 그룹(아데닌 및 구아닌의 아민 그룹에 대한 페녹시아세틸, 및 시토신의 아민 그룹에 대한 이소부티릴)이 사용되는 경우, 상온에서 약 2시간 내지 약 4시간이 충분하다. 제거되어야 할 핵염기 프로텍팅 그룹이 없다면, 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃에서 약 0.5시간 내지 약 2시간이 통상적으로 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹을 제거하기에 충분하며, 혹종의 유리한 구체예의 경우에는, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 고체 지지체로부터 제거하기에도 충분하다.
상기 기재한 바와 같이, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 유기 용매 내 아크릴로니트릴 보집제 용액으로 처리되어 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 제거될 수 있고, 아크릴로니트릴 보집제가 2차 지방족 아민 또는 t-부틸아민과 같이 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민일 경우라면, 핵염기 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 제거되고 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 고체 지지체로부터 분리될 수 있다. 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 용액을 핵염기 프로텍팅 그룹을 제거하고 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 고체 지지체로부터 분리하는데 사용하는 경우, β-시아노에틸 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 약 35℃ 내지 약 100℃로 가온된 유기 용액에 약 6시간 내지 약 48시간동안 접촉된다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 유기 용액에 약 6시간 내지 약 16시간 동안 접촉되고, 유기 용액은 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 65℃로 가온된다.
다른 구체예에서, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 먼저 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 용매로 β-시아노에틸 그룹을 분리하기 위하여 상기 기재한 조건 하에서 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 유기 용매에 먼저 접촉될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 이후 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액을 사용하여 β-시아노에틸 그룹을 분리하기 위하여 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 함유된 염기성 수용액과 상기 기재한 조건 하에서 접촉된다.
핵염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실과 같은 본래 존재하는염기와 7-디아자구아닌, 7-디아자-8-아자구아닌, 7-디아자아데닌, 7-디아자-8-아자아데닌, 7-디아자-6-옥소푸린, 6-옥소푸린, 3-디아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 2-옥소-4-메틸티오-5-메틸피리미딘, 2-티오카보닐-4-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-푸린, 5-플루오로우라실, 2,6-디아미노푸린, 8-아미노푸린, 4-트리아졸로-5-메틸티아민, 5-메틸시토신, 5-프로핀시토신, 5-프로핀우라실 및 4-트리아졸로-5-메틸우라실과 같은 개질된 염기를 포함한다.
프로텍팅된 핵염기는 염기의 반응성 관능 그룹이 핵염기 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되어 있는 핵염기이다. 통상적으로, 핵염기는 아민 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅될 수 있는 아민 그룹은 갖는다. 아민 프로텍팅 그룹은 당업제에게 공지되어 있다. 아민 프로텍팅 그룹의 예는 Green 등의Protective Groups in Organic Synthesis(1991), John Wiley & Sons, Inc., 309-405쪽에 나타나 있으며, 상기 내용은 본 문헌에 모두 합체되어 있다. 바람직하게, 아민은 아미드로 프로텍팅된다. 아데닌 및 시토신의 아민 그룹은 벤조일 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅되고, 구아닌의 아민 그룹은 통상적으로 이소부틸 프로텍팅 그룹으로 프로텍팅된다. 그러나, 다른 프로텍팅 식도 사용될 수 있다. 예를 들어, 빠른 디프로텍팅을 위하여, 아데닌 및 구아닌의 아민 그룹은 페녹시아세틸 그룹으로 프로텍팅될 수 있고, 시토신의 아민 그룹은 아세틸 또는 이소부티릴 그룹으로 프로텍팅될 수 있다. 본래의 관능 그룹을 생성하기 위하여 핵염기 프로텍팅 그룹을 제거하는 조건은 사용된 프로텍팅 그룹에 따라 다르다. 아미드 그룹의 생성에 의하여 아미노 그룹이 프로텍팅된 경우, 통상적으로 올리고뉴클레오티드를 농축된 수산화암모늄 용액으로 약 20℃ 내지약 65℃에서 약 2시간 내지 약 48시간동안 처리함으로써 제거될 수 있다.
합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 화학적으로 합성되는 것이지 생명체로부터 추출되는 것이 아니다. 본 발명의 방법은 예를 들어, 약 5%이상의 핵염기가 티민 또는 구아닌인 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체와 같이 티민 및/또는 구아닌 핵염기가 풍부한 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체에 특히 유용하다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 핵염기의 약 10%이상이 구아닌 또는 티민이다. 더욱 바람직하게는, 핵염기의 약 25%이상이 구아닌 또는 티민이다. 훨씬 더 바람직하게 핵염기의 50%이상이 구아닌 또는 티민이다. 가장 바람직하게는 모든 핵염기가 구아닌 또는 티민이다.
올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 고체 지지체는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 제제에 불용성인 유기 또는 무기 중합체이다. 통상적으로, 강체 폴리스티렌 또는 조절된-세공(pore) 유리 실리카가 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서 고체 지지체로서 사용된다. 이 밖에도, 미세공(microporous) 또는 겔 연지지체(soft gel support), 특히 펩티드(peptide)의 고체 상 합성에 매우 일반적으로 사용되는 지지체와 같은 폴리(아크릴아미드) 지지체가 바란다면 사용될 수 있다. 바람직한 폴리(아크릴아미드) 지지체는 아민-관능화된 지지체(amine-funtionalization supports), 특히 PL-DMA 라는 목록 하에 시판되는 (Polymer Laboratories)와 같은, 아크릴로일-사르코사인 메틸 에스테르, N,N-디메틸아크릴아미드 및 비스-아크릴로일에틸렌디아민의 공중합으로 제조된 지지체로부터 유도되는지지체이다. 지지체의 제조 방법은 Atherton, E 및 Sheppard, R. C.가Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,(1984) Oxford University Press의 IRL Press에 기재되어 있는데, 상기 미세공 지지체는 본 문헌에 합체되어 있다. 상기 지지체 상의 관능 그룹은 메틸 에스테르이고 이는 에틸렌 디아민과 같은 알킬 디아민과 반응됨으로써, 1차 아민 관능기로 최초로 전환된다.
본 발명의 방법으로 생산되거나 본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 디에스테르(예를 들어, 디옥시리보핵산 및 리보핵산) 또는 올리고뉴크레오티드 유사체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 화학적으로 개질된 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 분자를 의미하는 것으로 이하 이해된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 유사체는 7-디아자구아닌, 7-디아자-8-아자구아닌, 7-디아자아데닌, 7-디아자-8-아자아데닌, 7-디아자-6-옥소푸린, 6-옥소푸린, 3-디아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 2-옥소-4-메틸티오-5-메틸피리미딘, 2-티오카보닐-4-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-푸린, 5-플루오로우라실, 2,6-디아미노푸린, 8-아미노푸린, 4-트리아졸로-5-메틸티아민, 5-메틸시토신 및 4-트리아졸로-5-메틸우라실과 같은 개질된 핵염기를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 또한 당 부분에서 개질될 수 있다. 예를 들어, 당 부분의 하이드록시 그룹은 2`-O-메틸 그룹의 첨가를 통하여 개질될 수 있거나, 당은 본래의 존재했던 D-리보스 또는 D-디옥시리보스 대신 L-리보스 또는 L-디옥시리보스가 될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 또한 인 주쇄 부분이 개질된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트, 메틸 포스페이트 또는 메틸 포스포네이트가 올리고뉴클레오티드 유사체이다. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성에 사용되는 조건으로, 올리고뉴클레오티드 유사체는 PNA(Egholm 등의J.Am. Chem. Soc.(1992), 114:1895를 참조하시오) 또는 모르폴리노 안티센스 올리고머(Summerton 및 Weller,Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.(1997), 7:187을 참조하시오)와 같은 핵산이 아닌 분자인 올리고뉴클레오티드 부분을 가질 수 있다. 그 밖에도, 올리고뉴클레오티드 유사체는 3`- 또는 5`-말단(end)이 예를 들어 플루오레세인 또는 로다민(rhodamine)과 같은 형광 염료, 알킬 아민 또는 프로텍팅된 티올 알킬 링커와 같은 링커, 아크리딘과 같은 삽입물, 콜레스테린과 같은 세포성 이용이 (cellular uptake)을 증가시키는 그룹, 디니트로페놀과 같은 헵텐, 또는 비오틴 또는 디곡스제닌과 같은 표지 그룹 또는 리포터 그룹으로 개질된 올리고뉴클레오티드가 될 수 있다.
지방족 티올 그룹, 지방족 하이드록실 그룹 또는 지방족 아민 그룹은 치환되거나 치환되지 않은 지방족 그룹과 공유결합된 티올, 하이드록실 또는 아민 그룹이다. 1차 지방족 아민은 하나의 지방족 그룹이 결합된 아민(예를 들면, t-부틸아민)이다. 2차 지방족 아민은 2개의 지방족 그룹이 결합된 아민(예를 들면, 디이소프로필아민, 모르폴린, 또는 피페라진)이다. 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민 또는 입체장애를 갖고 있는 지방족 티올은 지방족 2차 또는 3차 탄소 원자 또는 하나 이상의 2차 또는 3차 탄소 원자 또는 방향족 또는 헤테로 방향족 그룹에 1차 탄소가 결합되어 있다면 상기 1차 탄소와 결합된 아민 또는 티올이다. t-부틸아민은 지방족 3차 탄소 원자에 결합된 아민 그룹의 예이다. s-부틸아민은 지방족 2차 탄소 원자에 결합된 아민 그룹의 예이다. 벤질 머캡탄은 방향족 그룹에도 결합된 1차 탄소에 결합된 티올의 예이다.
본 문헌에 사용된 지방족 그룹은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C18탄화수소를 포함하는데, 상기 탄화수소는 완전히 포화되었거나, 하나 이상의 컨쥬게이팅되지 않은 이중 결합, 또는 완전히 포화된 C3-C18탄화수소를 함유하거나, 또는 티올, 하이드록실 또는 아민 그룹에 결합된 하나 이상의 탄소가 이중 결합의 일부가 아니라는 조건 하에 하나 이상의 컨쥬게이팅된 이중 결합을 함유한다. 저급 알킬 그룹은 완전히 포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8탄화수소 또는 C3-C8고리형 탄화수소이다. 입체 장애인 지방족 티올, 지방족 하이드록실, 2차 지방족 아민 또는 입체 장애인 1차 지방족 아민인 아크릴로니트릴 보집제의 지방족 그룹은 바람직하게는 저급 알킬 그룹이다.
지방족 그룹은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 지방족 그룹의 적당한 치환체에는 치환되거나 치환되지 않은 방향족 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로 방향족 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로 사이클로알킬 그룹, 할로겐화된 방향족 그룹, 할로겐화된 저급 알킬(예를 들면, 트리플루오로메틸 및 트리클로로메틸), -O-(지방족 그룹 또는 치환된 지방족 그룹), -O-(방향족 그룹 또는 치환된 방향족 그룹), 할로, 시아노, 니트로, -S-(지방족 또는 치환된 지방족 그룹), 및 -S-(방향족 또는 치환된 방향족)이 있다.
본 문헌에서 사용된 "할로알칸"이라는 용어는 완전히 포화되고 1 내지 18개의 할로 그룹을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8탄화수소이다. 이 밖에도, "할로알칸"이라는 용어는 완전히 포화되고 1 또는 16개의 할로 그룹을 함유하는 고리형 C3-C8탄화수소를 포함한다. 할로 그룹에는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 아이오도 그룹을 포함된다.
방향족 그룹에는 카복사이클릭 고리(carbocylic ring) 시스템(예를 들면, 페닐) 및 용합된 폴리사이클릭(polycyclic), 카복사이클릭 고리 시스템(예를 들면, 나프틸, 안트라세닐 및 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸)이 포함된다.
에스테르에는 하기 식과 같이 표시되는 그룹이 포함된다.:
[식 중, R 및 R1은 각각, 독립적으로 지방족 그룹, 방향족 그룹 또는 아릴알킬 그룹임]
알콜에는 하기식과 같이 표시되는 그룹이 포함된다.:
[식 중, R2은 지방족 그룹임]
본 문헌에서 사용된 아릴알킬 그룹에는 바람직하게는 1 내지 약 6 개의 탄소 원자를 갖는 지방족 그룹에 의하여 부분과 결합된 방향족 치환체가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 헤테로 방향족 그룹에는 헤테로 아릴 고리 시스템(예를 들면, 티에닐, 피리딜, 피라졸, 이속사졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 인다졸일, 푸란, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 트리아졸, 피리미딘, 피라진, 티아졸, 이속사졸, 이소티아졸, 테트라졸, 또는 옥사디아졸) 및 카복사이클릭 방향족 고리, 카복사이클릭 방향족이 아닌 고리(carbocyclic non-aromatic ring) 또는 헤테로 아릴 고리가 하나 이상의 다른 헤테로아릴 고리(예를 들면, 벤조(b)티에닐, 벤즈이미다졸, 인돌, 테트라하이드로인돌, 아자인돌, 인다졸, 퀴놀린, 이미다조피리딘, 푸린, 피롤[2,3-d]피리미딘, 및 피라졸[3,4-d]피리미딘)과 융합된 헤테로 아릴 고리 시스템이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 헤테로사이클로알킬은 5 내지 7 개의 원자를 갖고 있고 질소, 산소, 또는 황과 같은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 방향족 고리가 아닌 시스템이다. 헤테로사이클로알킬 그룹의 예에는 모르폴린, 피페리딘, 및 피페라진이 포함된다.
방향족 그룹, 헤테로 방향족 그룹 또는 헤테로 사이클로알킬 그룹에 적당한 치환체에는 할로, 니트로, 시아노, 할로겐화된 저급 알킬 그룹, 저급 알킬 에테르 및 저급 알킬 티오에테르가 포함된다.
본 발명의 다른 구체예는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 제조 방법이다. 제조 방법에는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 합성하는 단계, 이후 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 하나 이상의β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 제거되기에 충분한 온도에서 충분한 시간동안 접촉시키는 단계가 포함된다.
올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 혹종의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 합성 방법으로도 합성될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 있다면 고체 상 및 용액 상 방법을 모두 포함한다. 통상적으로 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 포스포라미디트 화학(Caruthers, M. H.,Science(1985), 230:281를 참조하며, 이의 모든 내용은 본 문헌에 합체되어 있음)을 사용하여 합성된다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 합성하는 다른 방법은 포스페이트 디에스테르 및 포스페이트 트리에스테르 연구법(Caruthers, M. H.,Acc. Chem. Res.(1980), 13:155; Itakura 등 의Ann. Rev. Biochem.(1984), 53:323; Khorana 등J. Molecular Biology(1972), 72:209; Khorana 등,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.(1966), 31:39를 참조하며, 이의 모든 내용은 본 문헌에 합체되어 있음), 또는 H-포스포네이트 연구법(Andrus 등,Tetrahedron Lett.(1988), 29:861;Froehler, B.C.,Tetrahedron Lett.(1986a), 27:5565;Froehler,B.C.,Tetrahedron Lett.(1986b), 27:5575;Gregg 등,Tetrahedron Lett.(1987),27:4051를 참조하며, 이의 내용은 모두 본 문헌에 합체되어 있음)을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 부분은 포스포라미디트 화학으로 합성될 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 다른 부분은 포스페이트 디에스테르 연구법, 포스페이트 트리에스테르 연구법또는 H-포스포네이트 연구법와 같은 다른 방법으로 합성될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 모두는 포스포라미디트 화학을 사용하여 합성된다.
실험
실시예 1: 비교 디프로텍팅 결과
각각 31개의 티미딘 염기가 있는 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 두 개의 별도 베취(batch)로 강체 폴리스티렌 고체 지지체 상에서 하기의 포스포라미디트 화학용 표준 프로토콜로 DNA 합성기 8909 Expedite(Biosystmes로부터 제공됨)으로 합성하였다. 5`-디메톡시트리틸 프로텍팅 그룹을 합성 사이클이 종결될 무렵에 두었다. 쇄 신장이 종결되었을 때, 완전히 프로텍팅된 포스페이트 디에스테르 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 있는 고체 지지체를 세 부분으로 나누었다. 각 부분을 50℃에서 16시간 동안 (i)농축된 수산화암모늄, (ii)농축된 수산화암모늄 내 10%(vol/vol)t-부틸아민, 또는 (iii)농축된 수산화암모늄 내 5%(vol/vol) DTT로 각각 처리하였다. 상기 시료를 이온 교환 HPLC 및 MALDITOF 질량 분광기(포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드와 함께 얻어진 결과로서 도 1A-1C 및 2A-2C 를 참조하시오)를 사용하여 분석하였다. 포스페이트 디에스테르 및 포스포로티오에이트 시료에서, HPLC크로마토그램은 수산화암모늄으로 처리된 시료의 일부가 생성물의 피크에 근접한 추가 피크가 존재함을 보이는 것으로 나타났다. 수산화암모늄 및 아크릴로니트릴 보집제로 처리된 시료의 다른 두 부분에서, 추가 피크는 무시할 정도였다.
31mer 폴리티미딘 포스페이트 디에스테르의 MALDITOF 질량 스펙트럼(도 2A를 참고하시오)은 수산화암모늄으로 처리되어 고체 지지체에서 분리되었는데, 의도하는 생성물이 가리키는 9368.32에서 피크를 보였다. 이 밖에도, 9390.56 및 9409.46에서의 피크는 의도하는 생성물의 나트륨 염 및 칼륨 염을 각각 나타내었다. 9423.08의 질량을 갖는 시아노에틸레이팅(cyanoethylated) 포스페이트 디에스테르가 상당량 있다. 반대로, 수산화암모늄 및 10%(vol/vol)t-부틸아민(도2B) 또는 수산화암모늄 및 5%(vol/vol)DTT(도2C)로 고체 지지체로부터 분리된 31mer 폴리티미딘 포스페이트 디에스테르에 있어서, 9423.08에서의 피크는 시아노에틸화된 포스페이트 디에스테르가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 2 단계 디프로텍팅 방법
각각 31개의 티미딘 염기가 있는 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 두 개의 별도 베취(batch) 내에서 강체 폴리스티렌 고체 지지체 상에서 하기의 포스포라미디트 화학용 표준 프로토콜로 DNA 합성기 8909 Expedite(Biosystmes로부터 제공됨)으로 합성하였다. 5`-디메톡시트리틸 프로텍팅 그룹을 합성 사이클의 종결 무렵에 두었다. 쇄 신장이 종결되었을 때, 완전히 프로텍팅된 프스페이트 디에스테르 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 있는 고체 지지체를 15%의 t-부틸아민이 함유된 아세토니트릴 용액으로 45분간 처리하였다. 포스페이트 디에스테르 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 지지체를 이후 각각 50℃에서 16시간 동안 농축된 수산화암모늄 내 10%(vol/vol)t-부틸아민으로 처리한다. 상기 시료를 이온 교환 HPLC 및 MALDITOF 질량 분광기로 분석하여 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드에 대하여 도 1B 및 2B에 나타난 바와 유사한 결과를 얻었다.
등가의 실험(EQUIVALENTS)
본 발명의 본 발명의 바람직한 구체예에 대하여 기재하고 나타내었는 바, 당업자는 후술할 청구항의 범위 내에서 본 발명의 범위에 벗어나지 않게 방식 및 세부사항이 다양하게 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (97)

  1. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제 및 할로알칸, 에스테르, 알콜 또는 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택된 유기 용매가 포함된 용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는 경우 상기 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체 장애를 갖고 있는 방법.
  2. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는경우 상기 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체 장애를 갖고 있는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 염기성 수용액에 접촉시키기 전에, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 및 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 포함된 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 유기 용매는 피리딘, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 할로알칸, 에스테르, 알콜 및 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t-부틸아민이고 유기 용매는 피리딘 또는 아세토니트릴인 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 포스페이트 트리에스테르 올리고뉴클레오티드로부터 제거되는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 고체 지지체에 공유 결합되어 있는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 고체 지지체가 조절된-세공 유리, 폴리스티렌 또는 폴리아크릴아미드인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 용액과 접촉됨으로써 고체 지지체로부터 분리되는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 지방족 티올 그룹, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 티올, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 하이드록실 그룹, 치환되었거나 치환되지 않은 2차 지방족 아민, 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민 또는 치환되었거나 치환되지 않은 1차 또는 2차 방향족 아민인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t-부틸아민인 방법.
  13. 제 2 항에 있어서, 염기성 용액이 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물을 포함하는 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 염기성 용액이 수산화암모늄 용액인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 100℃인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 35℃인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 25℃인 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 48 시간동안 접촉되는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 2 시간동안 접촉되는 방법.
  20. 제 2 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 5% 이상인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 25% 이상인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 50% 이상인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 모든 핵염기가 티민 또는 구아닌인 방법.
  24. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제 및 할로알칸, 에스테르, 알콜 또는 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택된 유기 용매가 포함된 용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는 경우 상기 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체 장애를 갖고 있는 방법.
  25. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액에 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는 경우 상기 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체 장애를 갖고 있는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 염기성 수용액에 접촉시키기 전에, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 및 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 포함된 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 유기 용매는 피리딘, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 할로알칸, 에스테르, 알콜 및 디메틸 포름아미드로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  28. 제 7 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t-부틸아민이고 유기 용매가 피리딘 또는 아세토니트릴인 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 핵염기 프로텍팅 그룹이 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드로부터 제거되는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 핵염기 프로텍팅 그룹이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 고체 지지체에 공유결합되어 있는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 고체 지지체 가 조절된-세공 유리, 폴리스티렌 또는 폴리(아크릴아미드)인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 용액과 접촉됨으로써 고체 지지체로부터 분리되는 방법.
  34. 제 25 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 지방족 티올 그룹, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 티올, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 하이드록실 그룹, 치환되었거나 치환되지않은 2차 지방족 아민, 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민 또는 치환되었거나 치환되지 않은 1차 또는 2차 방향족 아민인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t- 부틸아민인 방법.
  36. 제 25 항에 있어서, 염기성 용액에 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물이 포함되는 방법.
  37. 제 25 항에 있어서, 염기성 용액이 수산화암모늄 용액인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 100℃인 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 45℃ 내지 약 65℃인 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 55℃인 방법.
  41. 제 37 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 48 시간동안 접촉되는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 6 시간 내지 약 16 시간동안 접촉되는 방법.
  43. 제 25 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 5% 이상인 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 25% 이상인 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 50% 이상인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 모든 핵염기는 티민 또는 구아닌인 방법.
  47. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 t-부틸아민 및 할로알칸, 에스테르, 알콜 또는디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택된 유기 용매가 포함된 용액에 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹 및 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  48. 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹이 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 분리되는 동안 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질을 실질적으로 방지하는 방법으로서, 상기 방법은 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 t-부틸아민이 함유된 수산화암모늄 용액에 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹 및 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 염기성 수용액에 접촉시키기 전에, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 및 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 포함된 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 유기 용매는 피리딘, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 할로알칸, 에스테르, 알콜 및 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 유기 용매가 피리딘 또는 아세토니트릴인 방법.
  52. 제 48 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 핵염기 프로텍팅 그룹이 포스페이트 트리에스테르 올리고뉴클레오티드로부터 제거되는 방법.
  53. 제 48 항에 있어서, β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 및 핵염기 프로텍팅 그룹이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 제거되는 방법.
  54. 제 48 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 고체 지지체에 공유 결합되어 있는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 고체 지지체가 조절된-세공 유리, 폴리스티렌 또는 폴리(아크릴아미드)인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 용액과 접촉됨으로써 고체 지지체로부터 분리되는 방법.
  57. 제 48 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 100℃인방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 45℃ 내지 약 65℃인 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 55℃인 방법.
  60. 제 48 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 48 시간 동안 접촉되는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 6 시간 내지 약 16 시간 동안 접촉되는 방법.
  62. 제 48 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 5% 이상인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 25% 이상인 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내에서 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 50% 이상인 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 모든 핵염기가 티민 또는 구아닌인 방법.
  66. β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 제거되는 동안 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질이 실질적으로 방지되는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 제조 방법으로서,
    a)하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 합성하는 단계; 및
    b)β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제 및 할로알칸, 에스테르, 알콜 또는 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택된 유기 용매를 포함하는 용액과 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉되는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는 경우 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체방해를 가지며, 상기 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 실질적으로 개질시키지 않고 제거되는 단계
    를 포함하는 방법.
  67. β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 제거되는 동안 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 개질이 실질적으로 방지되는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 제조 방법으로서,
    a)하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹이 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 합성하는 단계; 및
    b)β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액과 하나 이상의 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹 제거에 충분한 조건 하에서 접촉되는데, 상기 아크릴로니트릴 보집제가 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올을 포함하는 경우 1차 지방족 아민 또는 1차 지방족 티올은 입체방해를 가지며, 상기 β-시아노에틸 프로텍팅 그룹은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 실질적으로 개질시키지 않고 제거되는 단계
    를 포함하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 염기성 수용액에 접촉시키기 전에, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 유기 용매 및 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 포함된 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 유기 용매가 피리딘, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 할로알칸, 에스테르, 알콜 및 디메틸 포름아미드로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t-부틸아민이고 유기 용매는 피리딘 또는 아세토니트릴인 방법.
  71. 제 67 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 포스포라미디트 화학을 이용하여 합성되는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 수용액과 접촉될 때 하나 이상의 핵염기 프로텍팅 그룹이 분리되는 방법.
  73. 제 67 항에 있어서, 제조된 올리고뉴클레오티드가 포스페이트 디에스테르 올리고뉴클레오티드인 방법.
  74. 제 67 항에 있어서, 제조된 올리고뉴클레오티드 유사체가 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체인 방법.
  75. 제 67 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 고체 지지체에 공유 결합되어 있는 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 고체 지지체가 조절된-세공 유리, 폴리스티렌 또는 폴리(아크릴아미드)인 방법.
  77. 제 76 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 하나 이상의 아크릴로니트릴 보집제가 있는 염기성 용액과 접촉됨으로써 고체 지지체고부터 분리되는 방법.
  78. 제 67 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 지방족 티올 그룹, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 티올, 치환되었거나 치환되지 않은 방향족 하이드록실 그룹, 치환되었거나 치환되지 않은 2차 지방족 아민, 치환되었거나 치환되지 않은 입체장애를 갖고 있는 1차 지방족 아민 또는 치환되었거나 치환되지 않은 1차 또는 2차 방향족 아민인 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 아크릴로니트릴 보집제가 t-부틸아민인 방법.
  80. 제 67 항에 있어서, 염기성 용액이 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물을 포함하는 방법.
  81. 제 67 항에 있어서, 염기성 용액이 수산화암모늄 용액인 방법.
  82. 제 81 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 100℃인 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 35℃인 방법.
  84. 제 83 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 25℃인 방법.
  85. 제 81 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 48 시간 동안 접촉되는 방법.
  86. 제 85 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 내지 약 2 시간 동안 접촉되는 방법.
  87. 제 72 항에 있어서, 염기성 용액이 수산화암모늄 용액인 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 20℃ 내지 약 100℃인 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 45℃ 내지 약 65℃인 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 수산화암모늄 용액의 온도가 약 55℃인 방법.
  91. 제 87 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 0.5 시간 동안 내지 약 48 시간 동안 접촉되는 방법.
  92. 제 91 항에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체가 수산화암모늄 용액과 약 6시간 내지 약 16 시간 동안 접촉되는 방법.
  93. 제 72 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내 티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 5% 이상인 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 25% 이상인 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 내티민 및 구아닌인 핵염기의 결합 비율이 약 50% 이상인 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 모든 핵염기가 티민 또는 구아닌인 방법.
  97. 청구항 제 1 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 β-시아노에틸로 프로텍팅된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체로부터 하나 이상의 β-시아노에틸 그룹을 제거하는 것을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 제조 방법.
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