KR20030033042A

KR20030033042A - 비오프테린류의 제조방법

Info

Publication number: KR20030033042A
Application number: KR10-2003-7003005A
Authority: KR
Inventors: 야부따마사유끼; 후루까와가즈아끼; 미야모또노부에; 야마모또가쯔히꼬; 오오스예가즈히로
Original assignee: 다이이찌 산토리 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2000-08-31
Filing date: 2001-08-28
Publication date: 2003-04-26
Also published as: CA2420374A1; JP4817590B2; US20040014167A1; WO2002018587A1; IL154530A0; ES2320531T3; EP1314782B1; BR0113411A; US20060008869A1; DE60138029D1; EP1314782A4; AU2001280215B9; CN1449442A; KR100916163B1; AU8021501A; EP1314782A1; JPWO2002018587A1; ATE426021T1; AU2001280215B2; IL154530A

Abstract

본 발명은 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소의 하나 이상의 유전자로 형질전환되어 있는 형질전환세포 및 이를 사용한 비오프테린류의 제조방법을 제공하고, 본 발명에 의하면 비오프테린류를 저렴한 원료로부터 대량으로 공업적으로 유리하게 생산할 수 있다.

Description

비오프테린류의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING BIOPTERINS}

본 명세서에서는 테트라히드로비오프테린 (L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin: 이하 THBP라고 함), 7,8-디히드로비오프테린 (L-erythro-7,8-dihydrobiopterin: 이하 DHBP라고 함) 혹은 비오프테린 (Biopterin: BP라고 함), 또는 이들 임의의 2이상의 조합을 총칭하여 비오프테린류라고 한다.

THBP는 동물에 넓게 분포되어 있는 생체물질로, 1963년에 Kaufman에 의해, 래트의 간의 페닐알라닌 수산화효소의 보조효소인 것이 밝혀졌다. 그 후 THBP는 티로신 수산화효소 및 트립토판 수산화효소에 대해 공통으로 작용하는 보조효소인 것도 밝혀지고, 신경전달물질의 생합성에 관련되는 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 또 최근 일산화질소 (NO) 합성효소의 보조효소로서의 기능도 발견되어, 다양한 생체물질의 생합성계 효소의 보조효소로 되는 것이 주목되고 있다. 인간에게 THBP의 결손은 상기 아미노산 수산화효소의 활성저하를 초래하고, 이형 고페닐케톤요증 및 이형 고페닐알라닌혈증을 일으키는 것이 알려져 있고, THBP는이 선천성 대사이상질환의 치료에 염산 세프로프테린으로 사용되고 있다.

동물에서 THBP는 도 1 에 나타낸 바와 같이 구아노신3인산 (이하 GTP라고 함) 으로부터, GTP시클로히드라아제Ⅰ (이하 GCH라고 함), 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소 (이하 PTPS라고 함) 및 세피아프테린 환원효소 (이하 SPR 이라고 함)의 3단계의 효소반응에 의해 생합성되는 것이 알려져 있다. 한편 동물이외에서는 초파리 (Weisberg, E. P. and O'Donnell, J. M.J. Biol. Chem.261:1453-1458,1996), 누에 (Iino, T., Sawada, H., Tsusue, M. and Takikawa, S.-I.Biochim.Biophys. Acta 1297:191-199,1996),Euglena gracilis, Neurospora crassa및Phycomyces blakesleeanus등의 진핵미생물 (Maier J., Ninnemann H.Photochamistry and Photobilogy61:43-53, 1995) 그리고 원핵미생물인Nocardia sp(Son JK, Rosazza JP.J Bacteriol.182:3644-3648, 2000) 에서 그 존재가 보고되어 있다. 이와 같이 THBP의 존재가 보고되어 있는 생물의 종류는 많지만, 특히 미생물에 대해서는 진화면에서 동물과는 크게 차이가 있는 점에서, 미생물 전반이 갖고 있는 생체물질이 아닌 것으로 추정된다.

THBP는 분자내에 3개의 부제탄소를 갖기 때문에 화학합성이 곤란한 화합물로, 그 주된 합성법으로는 람노오스나 데옥시아라비노오스를 출발원료로 하여 L-에리트로-비오프테린 (BP) 을 합성한 후, 이것을 화학적으로 부제환원함으로써 합성하는 방법이 알려져 있다. 그러나 이들의 화학합성은 반응공정이 많고, 그 반응공정 중에는 반응 수율이 낮은 프로세스도 있다. 또 출발원료인 람노오스나 데옥시아라비노오스가 고가인 것 등의 문제점이 있어, 조작성, 수율, 비용면 등에서 유리한 제조방법이라고는 말하기 어렵다.

이에 대해 카가미야마 등은 효소반응에 의한 THBP 합성에 몰두하여, THBP 합성에 관련된 3종류의 효소를 각각 정제한 후, 이들 3종류의 효소를 사용하여 GTP 및 니코틴아미드디뉴클레오티드인산환원형 (이하 NADPH 라고 약함) 을 함유한 1개의 반응조 내에서 THBP를 합성시키는 것에 성공하였다 (일본 공개특허공보 평4-82888호). 그러나 이 방법을 이용하여 1㎏의 THBP를 얻기 위해서는, 3.12㎏의 GTP와 92㎏의 NADPH가 필요하게 된다. 이들 원료가 매우 고가인 것, 또 3종류의 효소의 정제를 함유한 조작은 매우 번잡해진다는 것을 고려하면, 이 방법을 사용한 비오프테린류의 공업적 생산은 비용면 및 조작면에서 곤란하다.

한편 시로이시 등은 Candida속 효모 (Candida noveiius, Candida rugosa, Candida robsta등)나 몇가지의 Mucor속 사상균 (Mucor javanicus, Mucor alternns, Mucor subtilissimus등) 이 THBP의 산화물인 L-에리트로-비오프테린 (BP) 을 배지에 축적하는 것을 발견하고, 이 성질을 이용하여 배양액으로부터 BP를 생산하는 방법을 보고하고 있다 (일본 공개특허공보 소61-9296, 일본 특허공보 평5-33990). BP는 화학적인 환원에 의해 THBP로의 변환이 가능하기 때문에, 미생물에 BP를 생산시킨 후 THBP로 변환하는 방법은 고가의 GTP나 NADPH를 필요로 하지 않는데다 합성 스텝이 대폭 삭감되므로, 조작면에서는 공업상 유리한 제조방법이라고 할 수 있다. 그러나 어느 균주에서나 BP 생산량이 낮고, 배양액 1ℓ당 BP 생산량은 1㎎ 이하이며, 수율 및 비용면에서는 공업적으로 유리한 제조방법이라고는 할 수 없다.

따라서 상기와 같이 유용한 THBP는 종래 공업적으로 유리한 제조방법이 없기 때문에 연구대상이 되기 어렵고, 또 의약 등으로 일반적으로 공급되기 어렵기 때문에 그 유용성을 반드시 충분히 살리고 있지 못하다. 또 아래에 서술하는 THBP의 산화물인 DHBP나 BP 등의 비오프테린류에도 동등하거나 또는 그 이상의 약리작용이 기대되면서도 충분히 그작용이 해명되어 있지 않다.

본 발명은 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 하나 이상의 효소의 유전자를 도입한 형질전환세포, 및 이를 사용한 비오프테린류의 제조방법에 관한 것이다.

도 1 은 테트라히드로비오프테린의 생합성 경로를 나타낸 도면이다.

도 2 는 테트라히드로비오프테린의 산화ㆍ분해경로를 나타낸 도면이다.

도 3 은 pSTV28-GCH의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P1, P2) 은 센스 프라이머 P1과 안티센스 프라이머 P2를 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P3, P4) 및 PCR (P5, P6) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, Cm은 클로람페니콜 내성 유전자를 나타내며, trc는 trc 프로모터를 나타내고, lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 4 는 pUC18-PTPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P7, P8) 은 센스 프라이머 P7과 안티센스 프라이머 P8 을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P9, P10) 및 PCR (P11, P12) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, trc는 trc 프로모터를 나타내며, lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 5 는 pUC19-PTPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P13, P14) 은 센스 프라이머 P13과 안티센스 프라이머 P14를 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P15, P16) 및 PCR (P17, P18) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. 또 trc는 trc 프로모터를 나타내고, lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 6 은 pYES2-FOL2의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P23,P24) 은 센스 프라이머 P23과 안티센스 프라이머 P24를 사용한 PCR을 나타낸다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, URA3은 효모에서의 선택 마커를 나타낸다.^PGAL1 은 GAL1 프로모터를 나타내고, CYC1 TT는 CYC1 유전자의 전사 종결 시그널을 나타낸다.

도 7 은 pSTV28-GPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P19, P20) 은 센스 프라이머 P19와 안티센스 프라이머 P20을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P21, P22) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, Cm은 클로람페니콜 내성 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다. Ori는 복제기점을 나타낸다.

도 8 은 pYES2-PTPS 및 pYES2-SPR의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P25, P26) 은 센스 프라이머 P25와 안티센스 프라이머 P26을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P27, P28) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, URA3은 효모에 있어서의 선택 마커로 사용한 URA3 유전자를 나타낸다. lac는 lac 프로모터를 나타내고,^PGAL1 은 GAL1 프로모터를 나타내며, CYC1 TT는 CYC1 유전자의 전사 종결 시그널을 나타낸다.

도 9 는 pYES2-FPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P29, P30) 은 센스 프라이머 P29와 안티센스 프라이머 P30을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P31, P32) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, URA3은 효모에서의 선택 마커를 나타낸다. 또^PGAL1 은 GAL1 프로모터를 나타내고, CYC1 TT는 CYC1 유전자의 전사 종결 시그널을 나타낸다.

도 10 은 pSTV28-GCH상에 클로닝된 GCH의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타내는 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 GCH의 아미노말단에 부가되는 pSTV28 유래의 배열을 나타낸다.

도 11 은 pUC18-PTPS상에 클로닝된 PTPS의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타낸 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 PTPS의 아미노말단에 부가되는 pUC18 유래의 배열을 나타낸다.

도 12 는 pUC19-SPR상에 클로닝된 SPR의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타낸 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 SPR의 아미노말단에 부가되는 pUC19 유래의 배열을 나타낸다.

도 13 은 비오프테린류 생산 대장균 JM101/pSTV28-GPS의 배양상청의 C18 역상 컬럼에 의한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 14 는 비오프테린류 생산효모 (FPS주) 의 증식곡선을 나타낸 도면이다.

도 15 는 비오프테린류 생산효모 (FPS주) 의 배양상청의 C18 역상 컬럼에 의한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 16 은 비오프테린류 생산효모 (FPS주) 의 배양상청의 TLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 17 은 비오프테린류 생산 대장균 AG14/pSTV28-GPS의 배양상청의 C18 역상 컬럼에 의한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 18 은 비오프테린류 생산 대장균 AG14/pSTV28-GPS의 배양에서의 OD660 및BP 생산량 및 P생산량의 시간경과에 따른 변화를 나타낸 도면이다.

도 19 는 pMW218-guaBA의 제작공정을 나타낸 도면이다. PCR (P33, P34) 은 센스 프라이머 P33과 안티센스 프라이머 P34를 사용한 PCR을 나타낸다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, km은 카나마이신 내성 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 20 은 pSTV28-MPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P35, P36) 은 센스 프라이머 P35와 안티센스 프라이머 P36을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P37, P38) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, km은 카나마이신 내성 유전자를 나타낸다. 또 Ori는 복제기점을 나타낸다.

도 21 은 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA) 와, AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA) 의 배양시의 OD660과 BP 생산량의 시간경과에 따른 변화를 나타낸 도면이다. 또한 ■는 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA)의 OD660의 시간경과에 따른 변화를 나타내고,는 AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA)의 OD660의 시간경과에 따른 변화를 나타내며, □는 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA)의 BP 생산량의 시간경과에 따른 변화를 나타내고,는 AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA)의 BP 생산량의 시간경과에 따른 변화를 나타낸다.

도 22 는 pUC18SD의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타내고, lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 23 은 pUC18ΔE의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Ap는 암피실린 내성 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 24 는 pUC18ΔESDmtrA의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P43, P44) 은 센스 프라이머 P43과 안티센스 프라이머 P44를 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P45, P46) 및 PCR (P45, P47) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를, mtrA는 mtrA 유전자를, SD는 SD 배열 및 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 함유하는 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 25 는 pUC18SDPTS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P50, P48) 은 센스 프라이머 P50과 안티센스 프라이머 P48을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P50, P49) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를, PTPS는 PTPS 유전자를, SD는 SD 배열 및 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 함유하는 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 26 은 pUC18ΔESDSPR의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 PCR (P53, P51) 은 센스 프라이머 P53과 안티센스 프라이머 P51을 사용한 PCR을 나타낸다. PCR (P53, P52) 도 동일하다. Ap는 암피실린 내성 유전자를, SPR은 SPR 유전자를, SD는 SD 배열 및 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 함유하는 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 27 은 pSL1180PS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Ap는 암피실린 내성 유전자를, PTPS는 PTPS 유전자를, SPR은 SPR 유전자를, SD는 SD 배열 및 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 함유하는 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 28 은 pSL1180MPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Ap는 암피실린 내성 유전자를, PTPS는 PTPS 유전자를, SPR은 SPR 유전자를, mtrA는 mtrA 유전자를, SD는 SD 배열 및 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 함유하는 유전자를 나타낸다. 또 lac는 lac 프로모터를 나타낸다.

도 29 는 pDG148MPS의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Km은 카나마이신 내성 유전자를, Ap는 암피실린 내성 유전자를, PTPS는 PTPS 유전자를, SPR은 SPR 유전자를, mtrA는 mtrA 유전자를, Pspac는spac프로모터를, lacO는 lacO 유전자를, lacI는 lacI 유전자를 나타낸다. Ori는 복제기점을 나타낸다.

도 30 은 pDG148MPSΔI의 제작공정을 나타낸 도면이다. 또한 Km은 카나마이신 내성 유전자를, Ap는 암피실린 내성 유전자를, PTPS는 PTPS 유전자를, SPR은 SPR 유전자를, mtrA는 mtrA 유전자를, Pspac는spac프로모터를, lacO는 lacO 유전자를, lacI는 lacI 유전자를 나타낸다. Ori는 복제기점을 나타낸다.

도 31 은 pUC18ΔESDmtrA상에 클로닝된 mtrA의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 mtrA의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산 배열 (Fujita 등,Microbiology,140:6571-6580, 1998) 및 이것에 대응하는 염기배열을 나타낸다.

도 32 는 pUC18SDPTPS상에 클로닝된 PTPS의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 PTPS의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산 배열 (Fujita 등,Microbiology,140:6571-6580, 1998) 및 이것에 대응하는 염기배열을 나타낸다.

도 33 은 pUC18ΔESDSPR상에 클로닝된 SPR의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다. 또한 밑줄친 부분은 SPR의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산 배열 (Fujita 등,Microbiology,140:6571-6580, 1998) 및 이것에 대응하는 염기배열을 나타낸다.

도 34 는 본 발명에 관련되는 형질전환세포인 1A1/pDG148MPS 및 1A1/pDG148MPSΔI, 및 비교예로서의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 1A1주의 배양상청의 HPLC에 의한 분석결과를 나타낸 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

테트라히드로비오프테린 생합성에 관련될 수 있는 효소로는 도1에 나타낸 바와 같이 구아노신3인산시클로히드라아제Ⅰ (GCH), 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소 (PTPS) 및 세피아프테린 환원효소 (SPR) 등의 효소를 들 수 있다.

숙주세포에 도입하는 유전자는, 전술한 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 구체적으로는 도10에 나타낸 대장균 유래의 GCH 유전자 또는 도31에 나타낸 고초균 유래의 GCH 유전자, 도11 및 도32에 나타낸 래트 유래의 PTPS 유전자, 그리고 도12 및 도33에 나타낸 래트 유래의 SPR 유전자를 함유하는 DNA는 물론이고, 이 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA이어도 된다. 당해 DNA와 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로는 예컨대 도10∼도12 및 도31∼도33에 나타낸 염기배열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기배열을 함유하는 DNA 등을 들 수 있다.

하이브리다이제이션은 자체 공지된 방법 또는 이것에 준하는 방법, 예컨대[Molecular Cloning, 2nd (J. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)]에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 키트를 사용하는 경우, 이들에 첨부한 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 보다 바람직하게는 하이브리다이제이션은 매우 엄격한 조건에 따라 실시할 수 있다. 매우 엄격한 조건이란 예컨대 나트륨농도가 19∼40mM 정도, 바람직하게는 약 19∼20mM 정도이고, 온도가 약 50∼70℃ 정도, 바람직하게는 약 60∼65℃ 정도의 조건을 말한다. 특히 나트륨농도가 약 19mM이고 온도가 약 65℃ 정도의 경우가 가장 바람직하다.

숙주세포에 도입할 때의 DNA는 게놈DNA, 세포ㆍ조직 유래의 cDNA 또는 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다. 유전자도입에 사용하는 벡터는 박테리오파아지, 플라스미드, 코스미드 등 어느 것이어도 된다. 또 cDNA 는 상기의 세포ㆍ조직으로부터 전체 RNA 또는 mRNA 획분을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하 RT-PCR법이라고 약칭함) 에 의해 증폭할 수도 있다. 그리고 또 자체가 공지된 올리고뉴클레오티드의 합성법에 따라 제조된 것을 사용해도 된다. 구체적으로는 예컨대 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392 (파킨ㆍ엘마주식회사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학합성하는 방법을 들 수 있다.

숙주세포에 도입하는 목적유전자를 함유하는 DNA는 보다 구체적으로는 예컨대 이하와 같이 하여 얻을 수 있다.

테트라히드로비오프테린 생합성의 제1 스텝의 반응을 촉매하는 효소인 GCH에 대해서는, 동물 이외에서도 엽산합성에 관련되는 효소로서 대장균 및 효모균 등 대부분의 숙주세포에 존재하고 있기 때문에, GCH를 코딩하는 DNA는, (1) 이 DNA 의 부분염기배열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여, PCR법에 의해 유전자 라이브러리 등으로부터 목적하는 유전자를 함유한 DNA를 증폭하는 방법, 또는 (2) 적당한 유전자 라이브러리와 GCH의 일부 또는 전체영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA를 표식한 것 (프로브)의 하이브리다이제이션에 의해 선별하는 방법 등에 의해 용이하게 얻을 수 있다. 이 방법은 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있고, 그 중에서도 전자가 바람직하다.

하이브리다이제이션의 방법은 예컨대 [Molecular Cloning, 2nd (J. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989] 에 기재된 방법 등에 따라 실시된다. 또 시판되는 라이브러리나 키트를 사용하는 경우, 첨부의 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 하이브리다이제이션의 프로브로 사용하는 부분염기배열을 갖는 DNA는 자체 공지된 올리고뉴클레오티드의 합성법에 따라 제조할 수도 있다.

본 발명에서는 GCH 유전자로서 대장균의 GCH 유전자 (folE 유전자라고도 함), 효모의 GCH 유전자 (FOL2 유전자라고도 함) 또는 고초균의 GCH 유전자 (mtrA 유전자라고도 함) 을 사용하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 고초균의 GCH 유전자를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

테트라히드로비오프테린 생합성의 제2 스텝 및 제3 스텝의 반응을 실시하는 PTPS 및 SPR을 코딩하는 DNA를 얻기 위해서는, 래트의 간에서 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 실시하는 방법이 바람직하다. 이 mRNA를 추출하기 위해서는 자체 공지된 방법을 사용해도 된다. 예컨대 NP-40, SDS, TritonX100, 데옥시콜산 등의 계면활성제를 사용하거나, 호모게나이저나 동결융해 등의 물리적 방법을 이용하여, 세포를 부분적 또는 완전히 파괴한 후 mRNA를 분리한다. 추출시에 RNA 분해효소에 의한 RNA의 분해를 방지하기 위해, 추출액중에 RNA 분해효소저해물질, 예컨대 헤파린, 폴리비닐황산, 벤토나이트, 마카로이드, 디에틸피로카보네이트 또는 바나듐 복합체 등을 첨가해 두는 것이 바람직하다. 또 polyA를 함유하는 mRNA의 정제에 대해서는, 올리고dT-셀룰로오스 또는 세파로오스2B를 담체로 하는 폴리U-세파로오스 등의 어피니티ㆍ컬럼ㆍ크로마토그래피 또는 뱃치법에 의한 정제법, SDG 원심법에 의한 분획 또는 아가로스겔 전기영동법 등에 의해 실시할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 PTPS 및 SPR에 대응하는 mRNA를 함유하는 mRNA 획분으로부터 cDNA를 합성한다. cDNA를 합성하는 방법으로는 자체 공지된 방법을 이용해도 되지만, 예컨대 먼저 mRNA를 주형으로 하고, 올리고dT를 프라이머로 하여, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP의 존재하에서 역전사효소에 의해 mRNA와 상보적인 1개 사슬 DNA를 합성하고, 알칼리처리로 주형 mRNA를 분해, 제거한 후, 이번에는 이 1개 사슬 cDNA를 주형으로 하여 역전사효소 또는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 2개사슬 cDNA를 합성하는 방법을 들 수 있다.

이렇게 하여 작성한 cDNA 라이브러리로부터 GCH, PTPS 또는 SPR 등의 THBP 합성에 관련되는 효소의 유전자를 함유하는 cDNA를 선택하기 위해서는, 당해 효소유전자를 함유하는 DNA 단편을 프로브로 한 하이브리다이제이션법이 이용된다.하이브리다이제이션으로는 상기에 기재한 방법 등 자체 공지된 방법을 이용해도 된다. 선택된 cDNA가 GCH, PTPS 또는 SPR 등의 THBP 합성에 관련되는 효소를 코드하고 있는지 여부를 조사하기 위해서는, cDNA를 예컨대 에쉐리키아ㆍ콜리 또는 COS 세포내에서 복제할 수 있는 벡터에 넣어, 그 벡터를 에쉐리키아ㆍ콜리 또는 COS 세포에 도입하여 효소를 발현시킴으로써 실시할 수 있다.

본 발명에 관련되는 형질전환세포란 통상 상기 THBP 합성에 관련되는 적어도 1종의 효소 유전자를 숙주세포에 도입함으로써 비오프테린류를 생산할 수 있게 된 것 또는 비오프테린류의 생산능이 향상된 것을 말한다.

따라서 숙주세포는 본래 비오프테린류의 생산능력이 없는 것이어도 되고, 비오프테린류의 생산능력을 어느 정도 갖는 것이어도 된다. 즉 숙주세포중에는 원래 상기 THBP 합성에 관련된 효소중 1∼3종의 어느 하나의 유전자를 갖고, 이 1∼3종의 효소를 충분히 발현하는 숙주세포도 있다. 이와 같은 경우, 그 효소에 한해서는 그 효소의 유전자를 숙주세포에 도입하지 않아도 된다. 당연히 비오프테린류 생산능을 높이기 위해 도입해도 된다. 그러나 그렇지 않은 경우, 즉 상기 효소의 유전자가 존재하지 않는 경우는, 그 효소의 유전자를 도입할 필요가 통상적으로는 있고, 또 이 유전자는 존재하지만 충분히 효소가 발현되지 않는 경우는, 그 효소의 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.

숙주세포로는 예컨대 에쉐리키아 (Escherichia)속균, 바실러스 (Bacillus)속균, 액티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목균 등의 원핵생물이어도 되고, 예컨대 효모, 사상균, 곤충세포, 곤충, 동물세포, 식물세포 등의 진핵생물이어도 된다.

에쉐리키아속균의 구체예로는 소위 대장균을 들 수 있고, 그 중에서도 에쉐리키아ㆍ콜리 (Escherichia coli)K12ㆍDH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60권, 160(1968)], JM101, JM103 [Nucleic Acids Research, 9권, 309(1981)], JA221 [J. Mol. Biol.], 120권, 517(1978)], HB101 [J. Mol. Biol., 41권, 459(1969)], C600 [Genetics, 39권, 440(1954)] 등을 들 수 있다. 그 중에서도 본 발명에서는 에쉐리키아ㆍ콜리 (Escherichia coli) JM101 을 사용하는 것이 바람직하다.

바실러스속균으로는 소위 고초균을 들 수 있고, 그 중에서도 예컨대 바실러스ㆍ서브틸스 (Bacillus subtilis) 1A1주 (trpC2) (Fujita 등,Microbiology, 140: 6571-6580, 1998), 또는 MI114 [진 (Gene), 24권, 255(1983)], 207-21 [저널ㆍ오브ㆍ바이오케미스트리 (Journal of Biochemistry), 95권, 87(1984)] 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 그 중에서도 전자를 사용하는 것이 바람직하다.

액티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목균으로는 소위 방사균을 들 수 있고, 그 중에서도 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속 등을 들 수 있다. 스트렙토마이세스속에 속하는 것으로Streptomyces lividans3131 등을 들 수 있다.

효모로는 사카로마이세스속 효모, 메탄올 자화 효모 또는 분열 효모를 사용하는 것이 바람직하다. 메탄올 자화 효모로는Pichia pastoris를 들 수 있고, 또 분열 효모로는Schizosaccharomyce pombe를 들 수 있다. 사카로마이세스속 효모로는 예컨대 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) KA31, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyce pombe) NCYC1913,NCYC2036, 피키어 패스토리스 (Pichia pastoris) KM71 등을 들 수 있다. 그 중에서도 본 발명에서는 사카로마이세스 (Saccharomyces)속 효모가 바람직하고, 특히Saccharomyces cerevisiaeKA31를 사용하는 것이 바람직하다.

사상균으로는 예컨대 아크레모늄 (Acremonium), 아스페르길스 (Aspergillus), 푸사륨 (Fusarium), 휴미콜라 (Humicola), 무콜 (Mucor), 마이세리오프트라 (Myceliophthora), 뉴로스폴라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 티엘라비아 (Thielavia), 톨리포크라듐 (Tolypocladium) 및 트리코데르마 (Trichoderma) 등의 종을 들 수 있다.

곤충세포로는 예컨대 야도충의 유충 유래 주화세포 (Spodoptera frugiperdacell ; Sf 세포),Trichoplusia ni의 중장 유래의 MG1 세포,Trichoplusia ni의 난 유래의 High FiveTM 세포,Mamestrabrassicae유래의 세포 또는Estigmena acrea유래의 세포 등을 들 수 있다. 또 누에 유래 주화세포 (Bombyx moriN;BmN 세포) 등도 사용된다. 상기 Sf 세포로는 예컨대 Sf9세포 (ATCC CRL1711), Sf21세포 (이상 Vaughn, J.L. 등, 인ㆍ비보(in vivo), 13권, 213-217(1977)) 등을 들 수 있다.

곤충으로는 예컨대 누에의 유충 등을 들 수 있다 (마에다 등, 네이처 (Nature), 315권, 592(1985)).

동물세포로는 예컨대 원숭이세포 COS-7, Vero 세포, 차이니즈 햄스터 세포 CHO, dhft 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO, 마우스 L세포, 마우스 AtT-20세포, 마우스 미엘로머세포, 래트 GH3 세포, 인간 FL 세포, 293 세포, C127 세포,BALB/3T3 세포, Sp-2 세포 등을 들 수 있다.

식물세포로는 담배 세포, 당근 세포 등을 들 수 있다.

본 발명에 관련되는 숙주세포는 상기 숙주세포의 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 변이형 세포를 사용할 수 있다. THBP 생합성의 출발물질인 GTP는 퓨린 화합물의 일종이기 때문에, GTP 합성능이 증가된 퓨린 합성경로의 조절변이형 세포를 사용하면, 출발물질인 GTP의 공급량이 증가되고, 그 결과 비오프테린류의 생산량도 향상되기 때문이다. 이 퓨린 합성경로의 조절변이형 세포를 얻기 위해서는 공지된 방법을 사용해도 된다. 예컨대 퓨린 아날로그를 첨가한 배지에서 배양하여, 퓨린 아날로그에 내성을 갖는 돌연변이주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다. 퓨린 아날로그로서는 자체 공지된 물질을 사용하면 되지만, 8-아자구아닌이나 데코이닌 등을 들 수 있고, 이들이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는 바실러스 서브틸리스 (B. Subtilis) 의 경우, 이 변이형세포는 8-아자구아닌이나 데코이닌과 같은 퓨린 유사체 및 메티오닌술폭시드와 같은 다른 길항체에 내성을 갖는 돌연변이주를 얻음으로써 달성할 수 있는 것이 보고되어 있다 (예컨대 Ishii 및 Shiio,Agric. Biol. Chem. 36:1511-1522, 1972;Matsui 등,Agric. Biol. Chem.43:1739-1744, 1979).

또 대장균의 경우에서, 야생형 세포가 갖는 8-아자구아닌 내성 이상의 8-아자구아닌 내성을 갖는 변이형 세포를 얻기 위한 바람직한 태양을 이하에 서술한다. 숙주세포인 대장균 JM101주가 약 100㎍/㎖ 이상의 8-아자구아닌, 약 500㎍/㎖의 데코이닌에 대하여 감수성을 갖기 때문에, 약 100㎍/㎖의 8-아자구아닌 또는 약 500㎍/㎖의 데코이닌을 함유하는 최소 한천배지를 사용하여 N-메틸-N-니트로-니트로소구아니딘 처리에 의한 변이처리를 실시한 대장균 JM101주를 플레이팅하고, 각각의 내성주를 얻을 수 있다.

상기 숙주세포의 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 숙주세포를 유전자공학적으로 작성할 수 있다. 즉 GTP 합성능을 향상시키는 유전자, 예컨대 GTP 생합성계 효소의 유전자를, 야생형 세포 또는 고GTP 합성능을 갖는 변이형 세포 등의 변이형 세포에 도입한 유전자 재조합 세포를 숙주세포로 사용해도 된다. GTP 합성능을 향상시키는 유전자는, 자체 공지된 것을 사용해도 된다. 이 유전자로서 1종을 야생형 또는 변이형 세포에 도입해도 되고, 2종 이상의 유전자를 야생형 또는 변이형 세포에 도입해도 된다. 구체적으로는 GTP 합성능이 향상된 유전자 재조합 세포의 제작방법으로서, 예컨대 이노신산으로부터 구아닌산으로 변환하는 IMP 디히드로게나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자 (Tiedeman, A.A. 등, J. Biol. Chem. 260: 8676-8679, 1985 및 Nucleic Acids Res. 13:1303-1316,1985 [GenBank M10101]) 을 야생형 또는 변이형 세포에 도입하는 방법을 들 수 있다. 야생형 또는 변이형 세포에 guaBA 유전자의 유전자를 도입하는 방법은, 하기하는 방법 등 자체 공지된 방법을 이용하여 용이하게 실시할 수 있다.

본 발명에서는 THBP 합성에 관련되는 적어도 1종의 효소의 유전자를 상기 숙주세포에 도입하면 된다. 즉 THBP 합성에 관련된 효소의 유전자 전부를 도입해도 되고, 이 효소중 일부 효소의 유전자만을 도입해도 된다. 구체적으로는 예컨대 (a) GCH, PTPS 및 SPR 의 유전자, (b) GCH, PTPS 및 SPR 중 임의의 2종의 유전자, (c) GCH, PTPS 및 SPR 중 어느 하나 1종의 유전자를 도입하는 경우를 들 수 있다.

또 동일한 효소의 유전자를 복수회 도입하여 발현량을 늘려도 된다. 특히 GCH 유전자는 복수회 도입하는 것이 바람직하고, GCH 유전자의 유래는 동일해도 이종이어도 된다.

본 발명에서의 바람직한 태양으로는, GCH는 엽산합성에 관련되는 효소로서 대장균 및 효모균 등 대부분의 숙주세포에 존재하기 때문에, PTPS 및 SPR 의 유전자를 도입하는 것을 들 수 있다.

또 다른 바람직한 태양으로는, 예컨대 광합성 그램 음성세균Synechocystis에서는 GCH에 첨가하여 PTPS의 존재도 보고되어 있으며 (Lee, S. W 등, FEMS Microbiology Letter 176:169-176, 1999), 이와 같은 숙주세포에서는 SPR의 유전자만을 도입하는 것을 들 수 있다.

또한 비오프테린류 생산능을 본래부터 갖고 있는 세포에 대해서도 THBP 합성에 관련된 효소의 유전자를 도입할 수 있다. 이렇게 함으로써 효소활성을 높여 비오프테린류 생산능을 높일 수 있기 때문이다.

PTPS 및 SPR의 2종의 효소 유전자를 도입하여 이것을 발현시키고, 한편 GCH에 대해서는 숙주세포가 갖는 것을 사용하여, 비오프테린류를 생산시키고자 할 경우, 숙주세포로는 야생형 세포가 갖는 내재성의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성 이상의 효소활성을 갖는 변이형 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

이와 같은 변이형 세포를 얻기 위한 방법으로는 염색체에 존재하는 GCH 유전자의 프로모터의 변이주를 취득하는 방법이나 염색체중의 GCH 유전자의 상류로 새로운 프로모터를 도입하는 방법, 또는 GCH의 구조유전자의 변이에 의해, 비(比)활성이 야생형 세포의 것에 비하여 상승된 것으로 개변하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 숙주세포에 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련될 수 있는 효소의 유전자를 도입하는 방법으로는, 자체가 공지된 방법을 사용해도 된다. 이와 같은 방법으로 구체적으로는 예컨대 (a) 이 유전자를 숙주세포 염색체에 주입하는 방법, 또는 (b) 벡터를 사용하여 플라스미드로서 세포내에 존재시키는 방법을 들 수 있다. 그 중에서도 효율적으로 DNA를 도입할 수 있다는 관점에서 벡터를 사용하여 실시하는 방법이 바람직하다.

상기 (a) 본 발명에 관련되는 상기 효소의 유전자를 숙주세포 염색체에 주입하는 방법으로는, 유리관의 한쪽을 잡아 그 안에 DNA 를 넣고 세포에 꽂아 전기영동적으로, 또는 공기나 질소가스를 보내 그 압력으로 DNA를 도입하는 방법을 들 수 있다. 또 DNA를 금 또는 은의 매우 가는 입자에 묻히고, 이 DNA가 부착된 입자를 화약 또는 고압가스로 숙주세포에 집어넣어 DNA를 도입한다는 파티클건법도 들 수 있다. 또한 숙주세포와 DNA를 하나의 용기에 넣고 전압을 가함으로써, 숙주세포에 일과성의 천공을 형성하여, DNA를 주입시키는 일렉트로포레이션 [Neumann, E. 등,EMBO J. 1, 841-845(1982)] 등도 들 수 있다.

벡터를 사용하여 본 발명에 관련되는 유전자를 숙주세포에 도입하는 방법으로는 자체 공지된 방법을 사용하여도 된다. 벡터로는 안정된 mRNA를 대량으로만들고, 발생된 mRNA가 숙주세포중에서도 효율적으로 번역되도록 만들어져 있는 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또 복수의 유전자를 도입하는 경우는, 동일 유전자이거나 다른 유전자이더라도, 복제기점 (ori) 이 다른 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 사용하는 벡터로는 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pSTV28), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15, pYES2), λ파지 등의 박테리오파아지, 레트로바이러스, 왁시니아바이러스, 버큐로바이러스 등의 동물 바이러스 등 외에 pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pCDNAI/Neo 등을 들 수 있다.

발현 벡터에는 본 발명에 관련되는 효소를 발현시키기 위해, 또는 발현에 유리해지도록 통상적으로 조절배열을 함유한다. 각각의 조절배열은 그 효소 단백질의 아미노산 배열을 코딩하는 염기배열에 대하여 네티브이거나 외래성이어도 상관없다. 이와 같은 조절배열은 이들에 한정되지 않지만, 프로모터, 리더, 폴리아데닐화 배열, 프로펩티드 배열, 엔헨서, 시그널 배열, 스플라이싱 시그널, 폴리A 부가 시그널, SV40 복제 오리진 (이하 SV40 ori로 약칭하는 경우가 있음) 및 전사 터미네이터를 함유한다. 그 중에서도 조절배열로는 적어도 프로모터 및 전사 그리고 번역 종지 시그널을 함유하는 것이 바람직하다.

프로모터로는 숙주세포에 의해 인식되는 염기배열인 적절한 프로모터 배열이면 어떠한 것이어도 된다. 숙주세포가 에쉐리키아속균인 경우는 trp 프로모터, trc 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등을 들 수 있다. 그 중에서도 trc 프로모터, lac 프로모터가 바람직하다. 숙주세포가 바실러스속균인 경우는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 숙주세포가 액티노마이세탈레스 목균인 경우는 예컨대 항생물질 티오스트렙톤 유도성의 프로모터인 tipA (Murakami, T. 등, (1989)J. Bacteriol., 171, 1459) 등을 들 수 있다.

숙주세포가 효모인 경우는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAL 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, AOX1 프로모터 등을 들 수 있다. 그 중에서도 GAL 프로모터가 바람직하다.

숙주세포가 사상균인 경우는 아스페르길스ㆍ오리자에 (Aspergillus oryzae)의 TAKA 아밀라아제, 리조무콜ㆍ미에헤이 (Rhizomucor miehei)의 아스파라긴산 프로티나아제, 아스페르길스ㆍ니가 (Aspergillus niger)의 중성 α-아밀라아제, 아스페르길스ㆍ니가의 산안정 α-아밀라아제, 아스페르길스ㆍ니가 또는 아스페르길스ㆍ아와모리의 글루코아밀라아제 (glaA), 리조무콜ㆍ미에헤이 (Rhizomucor miehei) 의 리파아제, 아스페르길스ㆍ올리자에의 알칼리프로테아제, 아스페리길스ㆍ올리자에의 트리포스린산이소멜라아제, 아스페르길스ㆍ니쥬란스 (Aspergillus nidulans)의 아세트아미다아제 또는 푸사륨ㆍ옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)의 트립신양 프로테아제를 코딩하는 유전자로부터 얻어지는 프로모터 (미국특허 제4,288,627호, 일본 특허공표공보 2000-507102에 기재) 등을 들 수 있다.

숙주세포가 동물세포인 경우는 SRα프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (사이트메가로바이러스) 프로모터, HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포가 곤충세포인 경우는 폴리헤드린프로모터, P10프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포가 식물세포인 경우는 칼리플라워ㆍ모자이크ㆍ바이러스의 35S 프로모터 등을 들 수 있다.

전사 터미네이터로는 전사를 종결시키기 위해 숙주세포에 의해 인식되는 배열이면 된다.

예컨대 동물세포가 숙주인 경우는 바이러스 유래, 각종 포유동물 및 조류 유래의 각 유전자의 전사 터미네이터 배열을 사용할 수 있고, 구체적으로는 시미안바이러스의 SV40 터미나에터 등이 사용된다.

숙주세포가 효모인 경우는 PHO5 터미네이터, PGK 터미네이터, GAL 터미네이터, GAP 터미네이터, ADH 터미네이터, AOX1 터미네이터 등을 들 수 있다.

숙주세포가 사상균인 경우는 아스페르길스ㆍ올리자에의 TAKA 아밀라아제, 아스페르길스ㆍ니가의 글루코아밀라아제, 아스페르길스ㆍ니쥬란스의 안트라닐레이트합성효소, 아스페르길스ㆍ니가의 α-글루코시다아제 또는 푸사륨ㆍ옥시스포룸의 트립신양 프로테아제를 코딩하는 유전자로부터 얻어지는 터미네이터를 들 수 있다.

발현 벡터에는 단백질의 분비에 관련되는 시그널 배열도 함유할 수 있다.

시그널 배열로는 도입하는 유전자의 시그널 배열을 사용할 수도 있고, 다른 유전자의 시그널 배열을 사용할 수도 있다.

다른 유전자의 시그널 배열로는, 숙주세포가 에쉐리키아속균인 경우는 알칼리포스파타아제ㆍ시그널 배열, OmpAㆍ시그널 배열 등이, 숙주세포가 바실러스속균인 경우는 α-아밀라아제ㆍ시그널 배열 서브틸리신ㆍ시그널 배열 등을 들 수 있다.

숙주세포가 효모인 경우는 MFαㆍ시그널 배열, SUC2ㆍ시그널 배열 등을 들 수 있다.

숙주세포가 사상균인 경우는 아스페르길스ㆍ올리자에 TAKA 아밀라아제 유전자, 아스페르길스ㆍ니겔 중성 아밀라아제 유전자, 리조무콜ㆍ미에헤이아스파라긴산 프로티나아제 유전자, 휴미콜라ㆍ라누기노사셀룰라아제 유전자, 또는 리조무콜ㆍ미에헤이리파아제 유전자로부터의 시그널 펩티드를 코드한 염기배열 등을 들 수 있다.

숙주세포가 동물세포인 경우에는 예컨대 인슐린ㆍ시그널 배열, α-인터로이신ㆍ시그널 배열, 항체분자ㆍ시그널 배열 등을 각각 이용할 수 있다.

발현 벡터에는 선택 마커를 함유할 수 있다. 예컨대 대장균이나 고초균 등의 원핵생물에서는, 각종 약제 내성 유전자 등을, 효모 등의 진핵미생물에서는 숙주의 영양요구성을 상보하는 유전자 등을 선택 마커로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 예컨대 디히드로 엽산 환원효소 유전자 (메소트레키세이트 (MTX) 내성 유전자), 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 (G418 내성), 클로람페니콜 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, URA3 유전자 등을 들 수 있다.

발현벡터에는 본 발명에 관련되는 효소유전자의 발현에 유리한 1 또는 복수의 인자, 예컨대 액티베이터 (예컨대 트랜스 작용인자), 샤페론, SD 배열 및 프로세싱 프로테아제를 코딩하는 1 또는 복수의 핵산배열도 함유할 수 있다.

선택된 숙주세포내에서 기능적인 어느 하나의 인자도 본 발명에 관련되는 발현 벡터에 사용할 수 있다.

본 발명에서 공지된 발현벡터를 사용해도 된다. 예컨대 대장균 숙주세포용으로 PIN-III-ompA₂등을 들 수 있다. 또한 방사균 숙주세포용으로 pIJ702, 효모숙주세포용으로 pNJ1053 등을 들 수 있다. 또 식물세포가 숙주세포의 경우, pBI121 (Nucleic Acids Res.,12, 8771-8721 (1984)) 등을 들 수 있다. 또 셔틀벡터 pDG148(Karmazyn-Campelli 등,Cell,52, 697-704, 1988) 은 대장균 및 고초균에 사용할 수 있고, 본 발명에서 적합하게 사용된다.

본 발명에 관련되는 상기 THBP 생합성에 관련되는 효소의 유전자를 함유하는 cDNA 등을 상기 벡터에 주입하는 방법은, 예컨대 제한효소로 절단하여 DNA 리가아제로 결합하는 등의 자체 공지된 방법을 사용해도 된다. 상기 cDNA 등에 대해서는 상기 벡터에 주입하기 쉽도록, 미리 엑소누클레아제 처리, 화학합성 DNA 단편의 부가, PCR법 또는 링커의 결합에 의한 제한효소절단부위의 부가, 2개사슬 cDNA나 벡터 DNA의 말단에 연결가능한 단말을 붙이기 위해 G,C-쇄를 연장하는 등 각종 처리를 실시해도 된다.

이와 같이 하여 구축된 THBP 합성에 관련될 수 있는 효소의 유전자를 함유하는 벡터를 숙주세포에 도입함으로써 본 발명에 관련되는 형질전환세포를 제조할 수 있다.

이 발현벡터의 숙주세포로 도입하여 형질전환하는 방법으로는 공지된 방법을 사용해도 된다. 에쉐리키아속균 등의 원핵생물이 숙주세포인 경우, 대수증식기에서의 세포를 회수한 후, 잘 알려져 있는 CaCl₂법 (Graham, F. L. and vander Eb, A.J. Virology52, 456-467 (1973)) 에 의해 도입할 수 있다. 형질전환반응액중에 MgCl₂또는 RbCl을 공존시키면 형질전환효율은 향상될 수 있으므로, 본 발명에서 공존시켜도 된다. 또 숙주세포의 프로토플라스트를 조제한 후 형질전환시킬 수도 있다.

사용하는 숙주세포가 진핵생물의 경우, DNA를 인산칼슘 침전으로서 감염시키는 방법, 마이크로인젝션법, 적혈구세포 또는 리포솜에 플라스미드를 포괄하여 도입하는 방법, 리조포스파티딜콜린과 같은 시약에 의한 세포의 처리법, 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법 등 통상의 방법에 의해 도입할 수 있다. 또 숙주세포가 효모인 경우는 아세트산리튬법을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로는 에쉐리키아속균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69권, 2110(1972)] 또는 [Gene, 17권, 107(1982)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

바실러스속균을 형질전환하기 위해서는 예컨대 [Molecular & General Genetics, 168권, 111(1979)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

효모를 형질전한하기 위해서는 문헌 [Methods in Enzymology, 194권, 182-187(1991)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929(1978)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

곤충세포 또는 곤충을 형질전환하기 위해서는 예컨대 [Bio/Technology, 6,47-55 (1988)] 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.

동물세포를 형질전환하기 위해서는 예컨대 세포공학 별책8 신세포공학실험프로토콜.263-267(1995) (슈쥰샤(秀潤社)발행), 비롤로지 (Virology), 52권, 456(1973) 에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

식물세포를 형질전환하기 위해서는 예컨대 아그로박테륨ㆍ쓰메파시언스 (Agrobacterium tumefaciens)법 (Methods in Enzaymol., 118, 627-640(1986)), 고속미립자법 [Plant Molecular Biology, 11, 433-439(1989)], 프로토플라스트법 [Nature, 319, 791-793(1986)] 등에 기재된 방법에 따라 본 발명에 관련되는 유전자를 도입함으로써 실시할 수 있다.

또한 동물세포를 사용하여 본 발명에 관련되는 효소를 안정적으로 발현시키는 방법으로는, 상기 동물세포에 도입된 발현벡터가 염색체에 주입된 세포를 클론 선택에 의해 선택하는 방법이 있다. 구체적으로는 상기 선택 마커를 지표로 하여 형질전환세포를 선택하고, 또한 이와 같이 선택 마커를 사용하여 얻어진 형질전환세포에 대해 반복하여 클론 선택을 실시함으로써 본 발명에 관련되는 효소의 고발현능을 갖는 안정된 형질전환세포를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 상기 형질전환세포를 도입한 GCH, PTPS 또는 SPR 등의 THBP 합성에 관련되는 효소의 유전자가 발현가능한 조건하에서 통상은 배양을 실시한다. 배양시에는 배양온도, 배지 pH, 용존산소레벨을 일정하에 제어하는 것이 바람직하다. 예컨대 배지 pH가 저하되는 등에 의해 세포의 증식이 둔해지는 것을 최대한 억제하고 또한 증식을 촉진시키며, 나아가서는 보다 효율적으로 비오프테린류를생산하기 위해 전술한 바와 같은 배양조건을 일정하게 하는 것이 바람직하기 때문이다.

숙주세포가 에쉐리키아속균, 바실러스속균 또는 액티노마이세탈레스 목균인 형질전환세포를 배양할 때, 배양에 사용되는 배지로서는 액체배지가 바람직하고, 그 중에는 형질전환세포의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 그 이외의 것이 함유되어 있는 배지가 바람직하다. 탄소원으로는 예컨대 글루코오스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스티브ㆍ리카, 펩톤, 카제인, 육엑기스, 대두박, 마령서 추출액 등의 무기 또는 유기물질 등, 무기물로는 예컨대 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또 상기 배지에는 효모액기스, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH는 약 5∼8 정도가 바람직하다.

에쉐리키아속균을 배양할 때의 배지로는 구체적으로는 예컨대 글루코오스, 카자미노산을 함유하는 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 등을 들 수 있지만, LB배지 (실시예4 참조) 에서 전 배양한 후, NUCA 배지 (실시예4 참조) 에서 본 배양하는 것이 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작용시키기 위해, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산, 클로람페니콜과 같은 약제를 첨가할 수 있다. 또 유도성의 프로모터를 사용하는 경우에는, 유도를 일으키는 물질을 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 예컨대 lac 프로모터의 경우는 이소프로필β-티오갈락토피라노시드 (IPTG), GAL 프로모터의 경우는 갈락토오스를 첨가하는것이 바람직하다. 배양은 약 10∼50℃ 정도에서 약 3∼72시간 정도 실시하는 것이 바람직하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시할 수도 있다.

바실러스속균의 배양은 통상 약 30∼40℃에서 약 6∼40시간 정도 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시할 수도 있다. 배지는 공지된 배양을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예컨대 LB 배지 (실시예4 참조) 에서 전 배양한 후, NU 배지 (실시예4 참조) 에서 본 배양하는 것이 바람직하다.

숙주세포가 액티노마이세탈레스 목균인 경우는, 통상 약 20∼40℃에서 약 2∼7일간 정도 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시할 수도 있다. 배지로서는 GP 배지 (글리세롤 0.4 중량%, 펩톤 0.1 중량%, 이스트ㆍ엑기스 0.4 중량%, 황산마그네슘 0.05 중량%, 인산일칼륨 0.2 중량%, 인산이나트륨 0.5 중량%, 글리신 0.1 중량%/1ℓ) 등 공지된 배지를 사용할 수 있다.

효모를 배양할 때의 배지로는 예컨대 버크홀더 (Burkholder) 최소배지 [Bostian, K. L. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505(1980)] 나 0.5% 카자미노산을 함유하는 SD 배지 [Bitter, G. A. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 5330(1984)] 를 들 수 있다. 그 중에서도 SD-Ura^-배지 (실시예5 참조) 가 바람직하다. 배지의 pH는 약 5∼8 정도로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 약 20℃∼40℃ 정도에서 약 24∼84시간 정도 실시하는 것이 바람직하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시할 수 있다.

숙주세포가 사상균인 경우도 자체 공지된 방법에 의해 배양할 수 있다.

숙주세포가 곤충세포 또는 곤충인 형질전환세포를 배양할 때, 배지로서는 예컨대 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C.,Nature, 195,788(1962)) 에 비동화한 10% 소혈청 등의 첨가물을 적당히 첨가한 것 등을 들 수 있다. 배지의 pH는 약 6.2∼6.4 정도로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 약 27℃ 정도에서 약 3∼5일간 정도 실시하는 것이 바람직하고, 필요에 따라 통기나 교반을 실시할 수 있다.

동물세포를 배양할 때의 배지로는 예컨대 약 5∼20%의 소의 태아 혈청을 함유하는 MEM 배지 [Science, 122권, 501(1952)], DMEM 배지 [Virology, 8권, 396(1959)], RPMI 1640배지 [J. Amer. Med. Ass,199권, 519(1967)], 199 배지 [Proc. Soc. Biol. Med., 73권, 1 (1950)] 등이 사용된다. 배지의 pH는 약 6∼8 정도인 것이 바람직하다. 배양은 약 30℃∼40℃ 정도에서 약 15∼72시간 정도 실시하는 것이 바람직하다.

식물세포를 배양할 때의 배지로는 예컨대 무라시게ㆍ스크그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지 등을 들 수 있다.

이하에 본 발명에 관련되는 비오프테린류의 제조방법의 바람직한 태양을 서술한다.

대장균계의 벡터로서 pSTV28을 사용하고, GCH, PTPS, SPR의 각각의 cDNA를 락토오스 프로모터 하류에 배치한 플라스미드, pSTV28-GPS를 제작한다. 이 플라스미드는 IPTG에 의한 유도가 가능한 발현벡터이다. 이 발현벡터를 대장균 JM101주에 도입하고, 0.5mM IPTG를 함유하는 배지에서 약 48시간 배양을 실시한다. 이에 의해 비오프테린류를 제조할 수 있다.

또 벡터로서 효모 pYES2를 사용하고, GCH, PTPS, SPR의 각각의 cDNA를 GAL1 프로모터 하류에 배치한 플라스미드, pYES2-FPS를 제작한다. 이와 같은 플라스미드는 갈락토오스에 의한 발현유도가 가능한 발현벡터이다. 이 발현벡터를 Saccharomyces 효모에 도입하고, 갈락토오스에 의한 유도에 의해 각 효소유전자의 발현을 실시한다. 이에 의해 비오프테린류를 제조할 수 있다.

또 본 발명에 관련되는 비오프테린류의 제조방법으로 다음과 같은 태양도 들 수 있다. 셔틀벡터 pDG148 (Karmazyn-Campelli 등, Cell,52, 697-704, 1988) 을 사용하고, GCH, PTPS 및 SPR의 각각의 cDNA를spac프로모터의 하류에 배치한 플라스미드 pDG148MPS를 제작한다. 이 플라스미드는 IPTG에 의한 유도가 가능한 고초균용 발현 플라스미드이다. 이 발현벡터를 Bacillus Subtilis 1A1주 (trpC2) 에 도입하여 형질전환세포를 제작한다. 이와 같은 형질전환세포를 약 5㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 약 3시간 전 배양을 실시하고, 이어서 약 1mM의 IPTG 및 약 5㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 NU 배지에서 약 20시간, 약 37℃에서 진탕 배양한다. 이에 의해 비오프테린류를 제조할 수 있다.

또 상기 셔틀벡터 pDG148 부터 lacⅠ 유전자를 결실시킴으로써, IPTG의 유무에 관계없이 GCH, PTPS 및 SPR을 항상적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터 pDG148MPSΔI를 작성할 수 있다. 이와 같은 발현벡터는 본 배양시에 IPTG가 필요없는 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 배양하면 된다.

숙주세포중에 원래 존재하는 GTP 로부터, 형질전환세포내에서 발현된 GCH, PTPS 또는 SPR 등의 THBP 합성에 관련될 수 있는 효소에 의해 THBP가 생산된다.산출된 THBP는 세포내에서 또는 세포막을 통과하여 세포외, 예컨대 배양액 등의 배지중에 배출되어, 도2에 나타낸 바와 같이 산화되어 DHBP가 되고, 다시 산화되어 BP로 될 수 있다 (Takikawa 등,Eur.J. Biochem. 161:295-302, 1986). 즉 형질전환세포의 종류나 예컨대 배양조건 등의 세포외의 환경 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로 말할 수 없지만, 형질전환세포내에서 THBP만이 산출되는 경우도 있고, 이것의 일부 또는 전부가 산화되어 DHBP 또는 BP 또는 이들의 혼합물로 되어 있는 경우도 있다. 또한 형질전환세포내에서 산출된 THBP가 세포막을 통과하여 세포외로 배출되는 경우도 있다. 이 경우, 배양액의 조성에 따라 다르기 때문에 일률적으로 말할 수 없지만, 배출된 THBP가 배양약중에서 DHBP 또는 BP로 산화되는 경우도 있다.

본 발명에서는 배양액 또는 그 배양상청 등의 처리물 중의 비오프테린류를 이하의 방법으로 정제 단리하여도 된다. 또 필요에 따라 배양액 또는 그 배양상청 등의 처리물에 산화제를 첨가하여 산화한 후, 비오프테린류를 정제단리해도 된다. 비오프테린류 중에서도 THBP는 산화되기 쉬운 물질이므로, 배양액 또는 그 배양상청 등의 처리물을 산화하고, THBP 또는 DHBP를 BP로 산화한 후, 화학적으로 보다 안정된 BP를 정제단리하는 것이 바람직하다.

배양액 또는 그 배양상청 등의 처리물 중의 비오프테린류를 산화시키는 방법은 자체 공지된 방법을 사용해도 되지만, 배양액 또는 그 배양상청 등의 처리물에 공지된 산화제를 첨가하면 된다. 산화제로는 요오드화칼륨 등의 과요오드산염, 이크롬산칼륨 또는 나트륨, 과망간산칼륨, 니트로소디술폰산칼륨, 질산 등을 들 수있고, 그 중에서도 요오드화칼륨을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 배양액으로부터 본 발명에 관련되는 비오프테린류를 분리정제하기 위해서는 자체 공지된 방법을 이용할 수 있다.

구체적으로는 예컨대 본 발명에 관련되는 비오프테린류를 형질전환세포인 배양균체 또는 세포로부터 배출할 때에, 배양후, 공지된 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 라이소자임 또는 동결융해 등의 방법, 또는 이들 방법의 조합에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과 등 자체 공지된 방법으로 형질전환세포와 배양상청을 분리하고, 배양상청을 모아 본 발명에 관련되는 비오프테린류의 용해액을 얻는 방법 등을 적절히 이용할 수 있다.

형질전환세포내에서 산출된 THBP가 세포막을 통과하여 세포외로 배출되는 경우는 형질전환세포를 파괴하지 않고, 원심분리나 여과 등 자체 공지된 방법으로 형질전환세포와 배양상청을 분리하고, 배양상청을 모아 본 발명에 관련되는 비오프테린류의 용해법을 얻는 방법 등을 적절히 이용할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 배양액 또는 배양상청 등의 배양액의 처리물에 함유되는 본 발명에 관련되는 비오프테린류의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제방법을 적절히 조합하여 실시할 수 있다.

이들 공지된 분리, 정제방법으로는 염석이나 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법 또는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차를 이용하는 방법 ; 이온교환 크로마토그래피 등의 하전의 차를 이용하는 방법 ; 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법 ; 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법 ; 등전점 전기영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 사용된다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명에 관련되는 비오프테린류가 유리체로 얻어진 경우에는 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 염으로 변환할 수도 있고, 반대로 염으로 얻어지는 경우에는 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수도 있다.

본 발명에 관련되는 비오프테린류의 정제의 바람직한 태양으로는 배양액을 산성조건하에서 요오드화칼륨용액에 의해 산화하여 BP로 변환한 후, 침전조작, Dowex 1×8 크로마토그래피, 프롤리딜크로마토그래피를 거쳐, 정제 BP를 얻는 방법을 들 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 비오프테린류는 필요에 따라 공지된 수단을 사용하여 THBP로 변환할 수 있다. 예컨대 BP 또는 DHBP 는 화학적인 수소부가반응에 의해 THBP로 변환할 수 있다. 화학적인 수소부가반응은 자체 공지된 방법을 이용해도 되고, 예컨대 수소화알루미늄리튬, 수소화트리에틸붕소리튬, 수소화붕소나트륨, 디보란, 알킬디보란 등과 반응시키는 방법, 또는 Raney-Ni 촉매에 의한 환원 등의 방법을 들 수 있다. 이들의 반응조건은 공지된 방법에 따르면 된다. 또 환원조건에 따라서는 BP로부터 DHBP를 얻을 수도 있다.

THBP는 전술한 바와 같이 각종 효소의 보조효소인 것이 알려져 있고, 그 약리작용물질로서 기대되는 물질이다. 또한, DHBP 또는 BP는 이와 같은 THBP의공급체로서 유용할 뿐만 아니라 약리작용을 나타낼 가능성도 있는 유용물질이다.

본 발명의 목적은 비오프테린류를 유전자공학적 수법을 이용하여 저렴한 원료로부터 대량으로 공업적으로 유리하게 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련될 수 있는 1개 이상의 효소의 유전자를 도입한 형질전환세포, 또는 이와 같은 형질전환세포를 작성하기 위해 사용하는 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련될 수 있는 1개 이상의 효소의 유전자를 갖는 발현 벡터를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 테트라히드로비오프테린의 생산에 유리한, 야생형 세포의 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 유전자 재조합 세포 등의 변이형 숙주세포, 또는 야생형 세포가 갖는 내재성의 GCH 활성 이상의 GCH 활성을 갖는 변이형 숙주세포 또는 형질전환세포를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 대량 배양이 가능한 미생물 등의 숙주세포에 THBP의 생합성에 관여하는 효소의 유전자를 도입함으로써, 본 물질을 저렴하고 또한 대량으로 생합성시키는 것을 발견하였다. 즉 THBP 생합성의 출발물질인 GTP는 생물에 보편적으로 존재하는 생체물질이기 때문에, 동물 또는 그 이외의 생물이 갖는 THBP 생합성계 효소의 유전자를 유전자 재조합 기술에 의해 숙주세포에 도입함으로써, 본래 THBP의 생산능력이 없는 숙주세포도 THBP를 생산할 수 있게 되는 것을 발견하고, 이와 같은 형질전환세포의 제작을 예의검토하였다.

그러나 한편으로 THBP의 대량 합성은 숙주세포에 유해하게 되는 것도 생각할 수 있어, 본 방법에 의한 THBP의 생산은 곤란한 것도 예측되었다. 즉 THBP는 프테리딘환을 갖는 점에서 엽산과 구조가 유사하기 때문에, 엽산아날로그의 일종으로 간주할 수도 있다. 실제로 대장균의 디히드로엽산 환원효소는 THBP의 산화체인 7,8-디히드로비오프테린 (DHBP) 에 작용하고, DHBP로부터 THBP로의 변환을 실시할 수 있는 것이 보고되어 있다 (와따나베 등, 생화학, 제 53권 제 8호, p1008(1981)). 엽산은 생체 내에서 각종 탄소전이반응에 관여하는 보조효소로 세포의 생육에 필수 물질이기 때문에, THBP가 세포내에서 현저한 양으로 합성되는 경우, 엽산이 관여하는 효소반응을 저해하여, 세포의 증식저해 나아가서는 사멸을 일으키는 것이 예상되었다.

또한 THBP 합성의 중간물질인 7,8-디히드로네오프테린3인산으로부터 생성되는 7,8-디히드로네오프테린은 라디칼을 형성하는 것 (Oetti, K. 등,Biochem Biophys Res Commun.264:262-7,1999), 또는 그 산화체인 네오프테린은 과산화수소나 아질산과 공존하면, 과산화수소나 아질산이 갖는 세포독성을 더욱 증강시키는 것이 보고되어 있다 (Wede, I. 등,Free Radic Res. 1999 Nov;31(5):381-8). 따라서 THBP를 대량으로 생성시킨 경우, 중간체로서 7,8-디히드로네오프테린3인산이 축적되고, 이것이 세포내의 포스파타아제에 의해 7,8-디히드로네오프테린으로변환되어 라디칼을 형성하여 세포에 상해를 입힐 가능성 및 산화되어 발생하는 네오프테린이 세포내에서 발생하는 과산화수소나 아질산과 공존함으로써 세포독성을 나타낼 가능성을 생각할 수 있었다.

나아가서는 THBP의 대량 합성은 기질인 GTP와 보조효소인 NADPH 의 세포내 풀(pool)을 감소시켜 증식저해를 일으킬 가능성도 우려되었다. 또 세포내에서 THBP의 생합성에 필요한 효소를 고발현시킨 경우에는 새포증식저해를 일으킨다는 문제도 우려되었다. 또한 세포내에서 고생산된 THBP가 과연 효율적으로 배지로 이행하는지의 여부에 대해서는 완전히 밝혀지지 않았다.

본 발명자들은 이와 같은 숙주세포에 대한 독성도 고려하여 THBP 합성에 관련되는 효소의 유전자를, 본래 그 합성능이 없는 대장균 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 효모에 도입하여 비오프테린류 생산능을 조사하였다. 그 결과 제작된 이들 형질전환세포는 우려되었던 증식저해를 일으키지 않고, 비오프테린류를 대량으로 생산하고, 배지중에 이 비오프테린류를 효율적으로 이행시킬 수 있는 것을 발견하였다. 또한 검토를 거듭하여 THBP 합성에 관련된 효소의 유전자를 도입한 형질전환세포에 의한 비오프테린류의 생산이 가능한 것을 발견하였다.

본 발명자들은 또한 대장균을 예로 비오프테린류의 생산량을 상승시키는 검토를 하였다. 먼저 처음에 THBP 합성의 출발물질은 GTP 이므로, 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 숙주세포 (이하 GTP 고합성능 숙주세포라고 함) 의 제작을 검토하였다.

GTP는 퓨린 화합물의 일종이기 때문에, 퓨린 생합성 경로의 조절변이주를 스크리닝함으로써, GTP 합성능이 증가된 변이형 숙주세포를 취득할 수 있는 것을 발견하였다. 이와 같은 퓨린 합성의 조절변이주는 고초균의 경우, 8-아자구아닌이나 데코이닌과 같은 퓨린아날로그에 내성을 갖는 변이주 중에서 얻을 수 있는 것이 보고되어 있지만 (예컨대 Ishii 및 Shiio,Agric. Biol. Chem.36(9):1511-1522, 1972;Matsui 등,Agric. Biol. Chem.43(8):1739-1744, 1979), 대장균에서 이들의 퓨린아날로그가 GTP 고합성능 숙주세포의 취득에 유효한지 여부는 밝혀져 있지 않았다.

본 발명자들은 대장균에서도 8-아자구아닌이나 데코이닌과 같은 퓨린아날로그를 사용한 GTP 고합성 숙주세포의 취득에 성공하였다. 또한 이와 같은 GTP 합성능이 증가된 퓨린 합성의 조절변이주를 숙주세포로 한 경우는, 야생주를 숙주세포로 한 경우에 대하여 약 10배의 비오프테린류 생산능을 갖고, 또한 DHBP도 저량 생산된다는 놀랄만한 지견을 얻었다.

또 GTP 고합성능 숙주세포의 제작방법으로서 이노신산으로부터 구아닐산으로의 변환을 실시하는 IMP 데히드로게나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 세포에 도입하고, 당해 양 효소의 활성을 상승시키는 것을 검토하였다. 그 결과, 전술한 퓨린 합성의 조절변이주인 대장균에 guaBA 유전자를 도입하고, 이와 같은 유전자 재조합 세포를 숙주세포로 함으로써, 비오프테린류의 생산이 상기 퓨린 합성의 조절변이주에 비하여 더욱 증가된다는 지견도 얻었다.

본 발명자들은 더욱 비오프테린류의 생산성을 높이기 위해 예의검토한 결과, THBP 합성에 관련되는 효소의 유전자를 숙주세포에 복수회 도입한 발현량을 증가시킨 결과, 비오프테린류 생산능이 향상되는 것을 발견하였다. 특히 THBP 합성의 제 1 단계의 반응을 촉매하는 효소인 GCH 유전자를 복수회 숙주세포에 도입하고, GCH의 발현량을 증가시키면 비오프테린류 생산능이 현저하게 향상된다는 뜻밖의 지견을 얻었다.

GCH 유전자를 복수회 숙주세포에 도입하면, 비오프테린류 생산이 현저하게 향상된다는 상기 지견에 의거하여 고초균의 GCH 유전자 (mtrA 유전자라고도 함)를 사용하는 것을 검토한 결과, 비오프테린류의 생산량이 더욱 향상된다는 뜻밖의 지견도 얻었다.

이상과 같이 본 발명은 THBP 등의 비오프테린류의 공업적으로 유리한 제조방법, 그리고 그 제조에 유용한 형질전환세포 및 숙주세포를 제공할 수 있다.

본 발명자들은 더욱 검토를 거듭하여 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은,

(1) 형질전환된 세포에 의해 비오프테린류를 제조하는 방법으로, (a) 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소의 유전자 1 개 이상으로 숙주세포를 형질전환하고, (b) 얻어진 형질전환세포를 배양하여 테트라히드로비오프테린을 생산하고, (c) 필요에 따라 생산된 테트라히드로비오프테린을 산화하고, (d) 생산된 테트라히드로비오프테린, 그리고 이 테트라히드로비오프테린이 산화된 디히드로비오프테린 및 비오프테린으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비오프테린류를 채취하는 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법,

(2) 상기 (1) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법에 있어서, 배양액 중 또는그 처리물 중의 비오프테린류를 산화한 후, 비오프테린을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법에 있어서, 채취한 디히드로비오프테린 및/또는 비오프테린을 환원시켜 테트라히드로비오프테린을 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(4) 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소가 GTP 시클로히드라아제Ⅰ, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소 및 세피아프테린 환원효소로 이루어지는 군에서 선택되는 1∼3 종류의 효소인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(3) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(5) 형질전환을 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소의 유전자 및 세피아프테린 환원효소의 유전자를 갖는 발현벡터에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(3) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(6) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 내재성의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성 이상의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (5) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(7) 숙주세포에 도입하는 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 유전자가 고초균 유래의 mtrA 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (4) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(8) 숙주세포가 원핵생물세포인 상기 (1)∼(7) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(9) 원핵생물이 대장균, 고초균 또는 방선균인 상기 (8) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(10) 숙주세포가 진핵생물세포인 상기 (1)∼(7)에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(11) 진핵생물이 효모 또는 사상균인 상기 (10) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(12) 효모가 메탄올 자화 효모 또는 분열 효모인 상기 (11) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(13) 효모가 사카로마이세스 효모인 상기 (11) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(14) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(13)에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(15) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 8-아자구아닌 내성 이상의 8-아자구아닌 내성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (14) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(16) 숙주세포가 IMP 데히드로데나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 도입한 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (14) 또는 (15) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(17) 숙주세포에 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소의 유전자를 도입한 상기 (1)∼(16) 에 기재된 비오프테린류의 제조에 사용하는 형질전환세포,

(18) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (17) 에 기재된 형질전환세포,

(19) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 8-아자구아닌 내성 이상의 8-아자구아닌 내성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (18) 에 기재된 형질전환세포,

(20) 숙주세포가 IMP 데히드로데나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 도입한 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 형질전환세포,

(21) 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 내재성의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성 이상의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성을 갖는 변이형 세포로, 이 숙주세포에 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소의 유전자 및 세피아프테린 환원효소의 유전자를 도입한 상기 (18) 에 기재된 형질전환세포 및

(22) 숙주세포에 도입하는 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 유전자가, 고초균 유래의 mtrA 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (17)∼(21) 에 기재된 형질전환세포,

(23) IMP 데히드로데나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 숙주세포에 도입한 형질전환세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (14) 또는 (15) 에 기재된 비오프테린류의 제조방법,

(24) 숙주세포에 IMP 데히드로데나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA유전자를 도입한 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 형질전환세포,

에 관한 것이다.

본 발명의 실시예를 이하에 나타낸다. 또한 이하의 유전자공학 또는 생물공학의 기본조작에 대해서는 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)], [Molecular Cloning, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], [Method in Enzymol, vol 194(1991)], [실험의학별책ㆍ효모에 의한 유전자실험법 요도샤(羊土社) (1994)] 등에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 또 시판되는 키트를 사용하는 경우에는 첨부되어 있는 사용설명서의 지시에 따랐다.

[실시예 1 GCH 유전자, PTPS 유전자 및 SPR 유전자의 취득]

1. 대장균 유래의 GCH (GTP 시클로히드라아제Ⅰ) 유전자의 클로닝

보고되어 있는 방법 (생물공학실험서 [바이후깐(培風館), p97-98])에 의해, 대장균 (W3110주) 으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이것을 주형으로 하여 센스 프라이머 P1 (배열번호1) 및 안티센스 프라이머 P2 (배열번호2) 를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR을 실시하고, GCH 유전자 (folE) [Katzenmeier, G. 등,Biol Chem Hoppe Seyler 372: 991-997, 1991, [Genbank x63910]] 을 취득하였다. 다음에 얻어진 GCH 유전자를 함유하는 DNA를 주형에 센스 프라이머 P3 (배열번호3) 및 안티센스 프라이머 P4 (배열번호4) 를 사용한 PCR을 실시하고, GCH 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역에 각각 제한효소EcoRⅠ 및SpeI의 절단부위를 부가하였다. 이 PCR 산물을EcoRⅠ 및SpeI로 잘라내고, pProEX HTa 벡터 (GIBCO BRL)의EcoRⅠ 및SpeI 부위에 도입하고, pProEX-GCH를 제작하였다. 또한 PCR의 조건, 제한효소처리 및 라이게이션반응은 통상적인 방법에 따랐다.

다음에 pProEX-GCH에 클로닝된 대장균 GCH 유전자를 플라스미드 pSTV28 (타까라주조) 에 클로닝하기 위해, pProEX-GCH를 주형에 센스 프라이머 P5 (배열번호5) 및 안티센스 프라이머 P6 (배열번호6) 를 사용하여 PCR을 실시하고, 5'측 및 3'측의 말단에 각각 제한효소EcoRⅠ 및SalI 절단부위를 가진 GCH 유전자를 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 제한효소EcoRⅠ 및SalI로 절단한 후, pSTV28의EcoRⅠ 및SalI 단편 (3.0kb) (이하EcoRⅠ 및SalI 단편 또는EcoRⅠ,SalI 단편으로 표기할 수도 있음. 그 이외도 동일함) 과 연결하고, 대장균 GCH 발현 플라스미드 pSTV28-GCH를 얻었다 (도3). pSTV28-GCH에 함유되는 GCH 유전자 (folE)는 대장균 락토오스 (lac) 프로모터에 의해 전사되고, 발현한 GCH는 아미노말단에 pSTV28 유래의 7아미노산 (도10의 밑줄친 부분) 이 부가된 아미노산 배열을 갖는다 (도 10).

2. 래트 유래의 PTPS (6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소) 유전자의 클로닝

래트에서 적출한 간장을 콜라게나아제 처리하여 취득한 간세포로부터, TRIzol 시약 (GIBCO BRL) 을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. DNase I 처리한 래트의 간의 전체 RNA 를 Super Script Preamplification System (GIBCO BRL) 을 사용한 RT-PCR 에 넣고, PTPS 유전자 (Inoue, Y.등,J. Biol. Chem.266:20791-20796, 1991:[GenBank NM 017220]) 를 함유하는 cDNA 를 취득하였다. 여기에서역전사에는 올리고 dT 프라이머를 사용하여, PTPS 유전자를 함유하는 1개 사슬 DNA의 PCR 에 의한 증폭에는 센스 프라이머 P7 (배열번호 7) 및 안티센스 프라이머 P8 (배열번호 8) 을 사용하였다. 취득한 PTPS 유전자를 함유하는 cDNA를 주형에, 센스 프라이머 P9 (배열번호 9) 및 안티센스 프라이머 P10 (배열번호 10) 을 사용한 PCR 를 실시하여, PTPS 유전자를 함유하는 cDNA의 5'측 및 3'측의 비번역영역에, 각각 제한효소EcoRⅠ 및SpeI 의 절단부위를 부가하였다. 이 PCR 산물을EcoRⅠ 및SpeI로 잘라내고, pProEX HTc 벡터 (GIBCO BRL) 의EcoRⅠ 및SpeI 부위에 삽입하여, pProEX-PTPS를 제작하였다 (도 4).

다음에 pProEX-PTPS를 주형에 센스 프라이머 P11 (배열번호 11) 및 안티센스 프라이머 P12 (배열번호 12) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, 제한효소EcoRⅠ 및SalI 절단부위를 가진 PTPS 를 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 제한효소EcoRⅠ 및SalI로 절단한 후, pUC18 (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J.Gene,33:103-119, 1985) 의EcoRⅠ 및SalI 단편 (2.7kb) 과 연결하고, 래트 PTPS 발현 플라스미드 pUC18-PTPS를 얻었다 (도 4). pUC18-PTPS에 함유되는 PTPS 유전자는 대장균 lac 프로모터에 의해 전사되고, 발현된 PTPS는 아미노말단에 pUC18 유래의 7 아미노산 (도 11 의 밑줄친 부분) 이 부가된 아미노산 배열을 갖는다 (도 11).

3. 래트 유래의 SPR (세피아프테린 환원효소) 유전자의 클로닝

PTPS 유전자를 함유하는 cDNA 와 동일한 방법으로 SPR 유전자 (Citron,B.A.등Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:6436-6440 1990, [GenBank M36410]) 을 함유하는 cDNA를 취득하였다. 단 SPR 유전자를 함유하는 1 개 사슬 DNA의 PCR에 의한 증폭에는 센스 프라이머 P13 (배열번호 13) 및 안티센스 프라이머 P 14 (배열번호 14) 를 사용하였다. SPR 유전자를 함유하는 cDNA를 주형에, 센스 프라이머 P15 (배열번호 15) 및 안티센스 프라이머 P16 (배열번호 16) 을 사용한 PCR을 실시하고, SPR 유전자를 함유하는 cDNA의 5'측 및 3'측의 비번역영역에, 각각 제한효소BamHI 및SpeI의 절단부위를 부가하였다. 이 PCR 산물을BamHI 및SpeI로 잘라내고, pProEX HTb 벡터 (GIBCO BRL)의BamHI 및SpeI 부위에 삽입하고, pProEX-SPR 을 제작하였다 (도 5).

다음에 래트 SPR 유전자에 대해 pProEX-SPR을 주형에 센스 프라이머 P17 (배열번호 17) 및 안티센스 프라이머 P18 (배열번호 18) 을 사용하여 PCR 을 실시하고, 5' 측 및 3' 측의 말단에 각각 제한효소HindⅢ 절단부위를 갖는 SPR 유전자를 얻은 후, 얻어진 PCR 산물을 제한효소HindⅢ로 절단하고, pUC19 (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J.Gene,33:103-119, 1985)의HindⅢ 단편 (2.7kb) 과 연결하여 래트 SPR 발현 플라스미드 pUC19-SPR 을 제작하였다 (도 5). pUC19-SPR에 코드된 SPR 유전자에 대해서도 대장균 lac 프로모터에 의해 전사되고, 발현된 SPR 은 아미드말단에 pUC19 유래의 8 아미노산 (도 12 의 밑줄친 부분) 이 부가된 아미노산 배열을 갖는다 (도 12).

4. 효모 유래의 GCH 유전자 (FOL2) 의 클로닝

FOL2는 GCH의 호모로그이다. 효모 (Saccharomyces cerevisiae, KA31 주)의 게놈 DNA를 주형에, 센스 프라이머 P23 (배열번호 23) 및 안티센스 프라이머P24 (배열번호 24) 를 사용하여 PCR을 실시하고, 5'측 및 3'측의 비번역영역에 각각 제한효소BamHI 및XhoI 절단부위를 가진 FOL2 유전자 (Tettelin,H.등Nature 387:81-84, 1997, [GenBank NC 001139]) 를 함유하는 DNA를 취득하였다. 이 PCR 산물을BamHI 및XhoI로 잘라내고, pYES2/CT 벡터 (Invitrogen)의BamHI 및XhoI 부위에 삽입하고, pYES2-FOL2를 제작하였다 (도 6).

[실시예 2 대장균용 비오프테린류 생산 플라스미드 pSTV28-GPS의 제작]

대장균의 THBP 합성효소발현 플라스미드인 pSTV28-GPS는 이하의 방법으로 제작하였다. 먼저 실시예 1 에 기재된 pUC18-PTPS를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, lac 프로모터로부터 PTPS 유전자의 종지 코돈까지 함유하는 DNA를 증폭하였다. PCR의 프라이머를 설계하는데 있어서, 센스 프라이머에SalI 부위를, 안티센스 프라이머에BamHI 부위를 형성시켜, 나중의 클로닝이 용이해지도록 하였다. 각각의 프라이머는 센스 프라이머 P19 (배열번호 19), 안티센스 프라이머 P20 (배열번호 20)의 배열을 갖는다. 얻어진 PCR 산물은 에탄올 침전처리를 한 후, TE 버퍼 (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA)에 용해하고, 제한효소SalI 및BamHI로 절단하였다.

다음에 실시예 1 에 기재된 pUC19-SPR을 주형으로 하여 PCR을 실시하고, lac 프로모터로부터 SPR 유전자의 종결 코돈까지를 함유하는 DNA를 증폭하였다. PCR의 프라이머에는 센스 프라이머에BamHI 부위를, 안티센스 프라이머에SphI 부위를 형성하였다. 각각의 프라이머는 센스 프라이머 P21 (배열번호 21), 안티센스 프라이머 P22 (배열번호 22) 의 배열을 갖는다. 얻어진 PCR 산물은 에탄올침전처리를 한 후, TE 버퍼 (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA)에 용해하고, 제한효소BamHI 및SphI로 절단하였다.

이와 같이 하여 얻어진 PTPS 유전자를 함유하는SalI-BamHI 단편 및 SPR 유전자를 함유하는BamHI-SphI 단편을 pSTV28-GCH의Xhol 및SphI 의 절편 (3.9kb) 과 연결시키고, pSTV28GPS를 제작하였다 (도 7). pSTV28-GPS는 GCH, PTPS, SPR 유전자 (도 10∼도 12 에 기재) 각각이 lac 프로모터에 의해 전사되는 구조를 갖는다.

[실시예 3 효모용 비오프테린류 생산플라스미드 pYES2-FPS의 제작]

pUC18-PTPS를 주형에, 센스 프라이머 P25 (배열번호 25) 및 안티센스프라이머 P26 (배열번호 26) 을 사용하여 PCR을 실시하고, PTPS 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역에 각각 제한효소BamHI 및Xhol 절단부위를 부가하였다. 이 PCR 산물을BamHI 및Xhol로 잘라내고, pYES2/CT 벡터의BamHI 및Xhol 부위에 삽입하고, pYES2-PTPS를 제작하였다 (도 8).

이어서 pUC19-SPR을 주형에, 센스 프라이머 P27 (배열번호 27) 및 안티센스 프라이머 P28 (배열번호 28) 을 사용하여 PCR 을 실시하고, SPR 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역에 각각 제한효소BamHI 및Xhol 절단부위를 가진 SPR 유전자를 함유하는 cDNA를 취득하였다. 이 PCR 산물을BamHI 및Xhol로 잘라내고, pYES2/CT 벡터 (Invitrogen) 의BamHI 및Xhol 부위에 삽입하여 pYES2-SPR을 제작하였다 (도 8).

다음에 pYES2-PTPS를 주형에, 센스 프라이머 P29 (배열번호 29) 및 안티센스프라이머 P30 (배열번호 30) 을 사용하여 PCR 을 실시하고, PTPS 유전자의 상류에SphI 절단부위를 부가한 GAL1 프로모터 및 하류에SpeI 절단부위를 부가한 CYC1 전사 종결 시그널을 갖는 DNA 단편을 얻었다. 또한 이 DNA 단편은 사용한 DNA 폴리머라아제 (pyrobestDNA Polymerase [타까라주조])의 성질로부터 평활한 말단으로 되어 있다. 5' 말단을 인산화한 이 DNA 단편을,SpeI 로 잘라낸 후 말단이 평활화된 pYES2-SPR 에 삽입하고, pYES2-PS를 제작하였다. 이어서 pYES2-FOL2를 주형으로 하여, 센스 프라이머 P31 (배열번호 31) 및 안티센스 프라이머 P32 (배열번호 32) 를 사용하여 PCR을 실시하고, FOL2 유전자의 상류에SpeI 절단부위를 부가한 GAL1 프로모터, 및 하류에SpeI 절단부위를 부가한 CYC1 전사 종결 시그널을 갖는 DNA 단편을 얻었다. 이 단편을SpeI 절단 후, pYES2-PS의SpeI 절단부위에 삽입하여 pYES2-FPS를 제작하였다. pYES2-FPS에서는 S. cerevisiae 유래의 GCH 유전자, 래트 유래의 PTPS 유전자 및 래트 유래 SPR 유전자가 각각 GAL1 프로모터에 의해 전사되는 구조를 갖고 있고, 천연형 효소와 동일한 아미노산배열을 갖는 효소가 발현된다 (도 9).

[실시예 4 대장균에 의한 비오프테린류의 생산]

대장균 JM101주를 염화칼슘법 (Mandel and Higa, J. Mol. Biol., 53, 159-162 1970)에 의해 pSTV28-GPS로 형질전환하여 JM101/pSTV28-GPS를 얻은 후, 이것을 배양하여 비오프테린류의 생산능을 조사하였다. 먼저 LB 배지에서 하룻밤 배양한 JM101/pSTV28-GPS를 전배양액으로 하고, 그 50㎕을 0.5mM IPTG (이소프로필티오갈락토피라노시드) 를 함유하는 NUCA 배지 3㎖에 접종하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 또한 LB 배지 및 NUCA 배지는 이하의 조성으로 이루어진다. [LB 배지 1ℓ중의 조성:10 g 트립톤, 5 g 효모엑기스, 5g NaCl], [NUCA 배지 1ℓ중의 조성: 20 g 글리세롤, 4 g 효모엑기스, 10 g 카자미노산, 4g K₂HPO₄, 2.7 g Na₂HPO₄, 1.2 g Na₂HPO₄, 1.2 g (NH₄)₂SO₄, 0.2 g NH₄Cl, 2 g MgSO₄ㆍ7H₂O, 40 mg FeSO₄ㆍ7H₂O, 40 mg CaCl₂ㆍ2H₂O, 10 mg MnSO₄ㆍnH₂O, 10 mg AlCl₃ㆍ6H₂O, 4 mg CoCl₂ㆍ6H₂O, 2 mg ZnSO₄ㆍ7H₂O, 2 mg Na2MoO₄ㆍ2H₂O, 1mg CuCl₂ㆍ7H₂O, 0.5 mg H₃BO₄, 30 mg 클로람페니콜].

생산된 THBP는 수용액으로 용이하게 산화되고, DHBP 및 BP가 되기 때문에, JM101/pSTV28-GPS가 THBP를 생산했는지 여부에 대해서는 배양액을 요오드산화하고, BP로 변환하여 생산량을 측정하였다. 배양액을 원심분리하고, 균체를 제거한 후, 배양액에 대해 10분의 1량의 요오드화칼륨액 (0.9% I₂, 1.8% KI를 함유하는 1규정 염산액) 을 첨가하고, 차광하여 1시간 방치하였다. 다음에 이 배양액을 탈이온수로 20배 희석하고, 이것을 10mM 나트륨인산완충액으로 평형화한 4.6㎜×250㎜의 C18 역상 컬럼 (COSMOSIL 5C18-AR, 나카라이테스크) 에 유속 0.8㎖/분으로 인젝트하고, 350 ㎚ 여기, 440 ㎚ 형광검출기를 사용하여 BP를 정량하였다. 그 결과 배양상청에는 BP 표준품 및 P (프테리딘) 표준품에 일치하는 피크가 검출되고 (도 13), JM101/pSTV28-GPS가 비오프테린류를 생성한 것이 밝혀졌다. 피크 에어리어로부터 생상된 비오프테린류의 양을 산출한 결과, 배양액 1ℓ당의 생산량은약 20 ㎎ 이었다.

[실시예 5 효모에 의한 비오프테린류의 생산]

S. cerevisiae KA31주 (MATαura3 leu2 his3 trp1) 를 아세트산리튬법에 의해 pYES2-FPS로 형질전환하였다. SD-Ura^-배지에 의해 형질전환세포를 선택하고, FPS 주를 얻었다. [SD-Ura^-배지 1ℓ중의 조성:글루코오스 20 g, Yeast nitrogen base (아미노산ㆍ황산암모늄 불포함) 1.7g, 황산암모늄 5 g, 아데닌황산염 20 ㎎, Arg 20 mg, Asp 100 mg, Glu 100 mg, Ile 30 mg, Lys 30 mg, Met 20 mg, Phe 50 mg, Ser 400 mg, Thr 200 mg, Tyr 30 mg, Val 150 mg, His 20 mg, Leu 100 mg, Trp 20 mg]

또 동일하게 벡터 (pYES2/CT) 에 의한 형질전환세포를 컨트롤 (Mock) 로서 제작하였다.

얻어진 형질전환세포를 OD_600nm=0.4가 될 때까지 5㎖의 SCD-Ura^-배지에서 배양한 후, 등량의 SCGal-Ura^-배지로 치환하여 발현유도를 실시하였다. 또한 배양온도는 30℃로 하였다.

SCD-Ura^-배지 1ℓ중의 조성 ; Yeast nitrogen base (아미노산ㆍ황산암모늄 불포함) 1.7g, 황산암모늄 5g, 카자미노산 5g, 글루코오스 20g, 아데닌황산염 20㎎, Trp 20㎎

SCGal-Ura^-배지 1ℓ중의 조성 ; Yeast nitrogen base (아미노산ㆍ황산암모늄 불포함) 1.7g, 황산암모늄 5g, 카자미노산 5g, 갈락토오스 20g, 아데닌황산염 20㎎, Trp 20㎎

발현유도후 24시간 이후에 FPS주의 배양액에 프테리딘 화합물에서 특징적인 황색의 착색을 볼 수 있고, 발현시킨 3종의 효소가 균체내에서 기능하고 있는 것을 외관으로부터 알 수 있었다.

유도후의 균체의 증식은 FPS주, Mock주 모두 양호하였다 (도 14). THBP 또는 그 산화체의 생산을 확인하기 위해, 유도후 72시간에서의 배양상청을 실시예4 와 동일하게 산화처리하고, HPLC 분석 및 TLC 분석에 사용하였다.

또한 HPLC 분석은 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였다. TLC 분석에 대해서는, 박층 크로마토그래피용 실리카겔 박층판 (실리카겔 60F₂₅₄, 층두께 0.25㎜, 10㎝×20㎝)를 사용하여, 전개용매로서 클로롤포름ㆍ메탄올ㆍ아세트산ㆍ물 혼액 (45:10:5:2) 을 사용하였다. 박층판에 샘플을 20㎕, BP 및 P 표준품을 각각 100ng 스폿하고, 풍건후 경사 상승법에 의해 전개하였다. 전개거리가 약 12㎝로 된 시점에서 전개를 종료하고, 박층판을 풍건한 후, 자외선 (주파장 254㎚) 을 조사하여 흡수 스폿을 검출하였다.

HPLC 분석결과를 도 15 에 나타낸다. FPS주에서만 BP에 상당하는 피크가 보이고, 피크 에어리어의 면적비로부터 FPS주는 유도 72 시간에 0.76㎍/㎖의 BP에 상당하는 비오프테린류를 배양상청중에 생산한 것을 알 수 있었다.

도 16 에 배양상청의 TLC 분석결과를 나타낸다. FPS 주의 배양상청중에 BP 표준품과 동등한 이동도를 나타낸 스폿이 확인되었다. TLC 분석은 실시예 5에 기재한 바와 같이 요오드화칼륨액으로 산화된 배양상청 20㎕을 분석하여, BP의 스폿의 자외선 흡수강도로부터 배양상청 20㎕당 13.7㎍의 BP를 생산한 것을 알 수 있었으나, 이 값은 HPLC 분석 결과로부터 산출되는 배양상청 1㎖당 0.76㎍의 값과 일치한다.

[실시예 6 비오프테린류 생산대장균의 제작]

THBP의 전구체인 GTP를 야생주보다도 다량으로 생산할 수 있는 숙주균을 제작하기 위해 퓨린합성의 조절변이주를 다음과 같이 하여 취득하였다.

먼저 20, 50, 100 및 500㎍/㎖의 8-아자구아닌 및 데코이닌을 함유하는 M9 최소한천배지에서 대장균 JM101에 대한 이들 약제의 감수성을 조사한 결과, 100㎍/㎖ 이상의 8-아자구아닌, 500㎍/㎖ 이상의 데코이닌에 대해 감수성을 갖는 것이 명확해졌다.

M9 최소한천배지의 조성 ; 글루코오스 2 g/L, Na₂HPO₄6 g/L, KH₂PO₄3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH₄Cl 1 g/L, MgSO₄2 mM, CaCl₂0.1 mM, 한천 15 g/L, pH 7.4

따라서 N-메틸-N-니트로-니트로소구아닌에 의한 변이처리 (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) 를 실시한 대장균 JM101을 100㎍/㎖의 8-아자구아닌, 또는 500㎍/㎖의 데코이닌을 함유하는 M9 최소한천배지의 플레이트에 파종하여, 37℃에서배양하여 내성변이주를 얻었다. 얻어진 각각의 내성변이주로부터 50주씩을 선택하여, 염화칼슘법에 의해 발현플라스미드 pSTV28-GPS를 도입하였다. 이와 같이 하여 얻어진 주를 앞의 NUCA 배지에서 48시간 배양하고, 각각의 주의 비오프테린류의 생산량을 비교하였다.

그 결과, 8-아자구아닌 내성주 중으로부터 친주(親株) (JM101/pSTV28-GPS) 에 대해, 약 10배의 비오프테린류 생산능을 갖는 AG14/pSTV28-GPS주가 얻어졌다. 즉 대장균에서 8-아자구아닌 내성을 부여함으로써, 비오프테린류 생산능이 상승된 주를 취득할 수 있는 것이 밝혀졌다 (표 1). 또한 본 균주에 대해서는 배양액에는 BP에 첨가하여 DHBP가 검출되고, 생산된 THBP의 일부는 자연산화되어 DHBP 또는 BP로서 존재하는 것이 밝혀졌다 (도 17).

[실시예 7 쟈 퍼멘터 (Jar fermentor) 를 사용한 비오프테린류 생산 대장균의 배양과 BP의 정제]

비오프테린류 생산균 AG14/pSTV28-GPS주에 대해, 3ℓ쟈 퍼멘터를 사용한 배양을 실시하였다. 쟈 퍼멘터의 배지는 0.5mM IPTG를 함유하는 전술한 NUCA 배지를 사용하였다. 먼저 AG14/pSTV28-GPS주를 LB 배지에서 하릇밤 배양하고, 그 10㎖를 0.5mM IPTG를 함유하는 2ℓ의 NUCA 배지에 접종하고, 37℃에서 용존산소 레벨을 30%로 유지하면서 배양하였다. 배양 초기에 첨가한 2% 글리세롤이 고갈된 후는, 80% 글리세롤을 순차적으로 첨가하여 48 시간 배양하였다.

배양액의 일부에 대해 HPLC 분석을 실시하였다. 즉 생산된 THBP를 실시예 4 와 동일하게 요오드화 칼륨액으로 산화하여 BP로 변환한 후, HPLC를 사용한형광분석에 의해 분석하였다. HPLC 분석은 실시예5와 동일하게 실시하였다. 그 결과 피크에어리어로부터 산출되는 BP의 생산량으로부터 환산하면 배양 48시간에 350㎎/ℓ의 THBP가 생산된 것을 알 수 있었다.

또 얻어진 배양액으로부터 BP를 얻기 위해, 상기 배양액 200㎖를 원심분리하여 균체를 제거하고, 배양상청에 10분의 1의 요오드화칼륨액 (0.9% I₂, 1.8% KI를 함유하는 1규정염산액) 을 첨가하여 BP로의 산화를 실시하였다. 그 후 차광하여 1시간 방치하고, 5M 수산화나트륨용액을 첨가하여 pH7.0으로 조정하였다. 다음에 본 용액을 빙랭하여 BP를 석출ㆍ침전시켜 얻어진 침전물을 원심분리에 의해 회수하고, 이것에 순수를 첨가한 후 염산으로 pH2로 조정하고 침전을 용해시켰다. 이 액을 Dowex 1×8 컬럼 (10㎜×100㎜) 에 채우고, 순수 20㎖로 세정한 후, 0.5M NaCl을 사용하여 유속 1㎖/분으로 용출시켰다. 얻어진 용출액은 2㎖씩 채취하고, 8번째부터 16번째의 획분을 추출하였다. 다음에 이 추출획분의 절반량을 0.5M 포름산으로 평형화한 프롤리딜 컬럼 (10㎜×100㎜) 에 채우고, 0.5M 포름산 20㎖로 세정한 후, 2N HCl에 의해 용출시켰다. 얻어진 용출액은 1.8㎖씩 채취하고, 4번째부터 16번째의 획분을 추출하였다. 이에 의해 순도 98%의 BP를 2㎎ 얻었다.

[실시예 8 배양조건의 최적화와 비오프테린류 생산량의 상승]

실시예17에 기재된 3ℓ쟈 퍼멘터를 사용한 배양에 있어서, 배양온도, 배지 pH, 용존산소레벨을 일정하에 제어한 배양을 실시하였다. 각 조건은 배양온도37℃, pH6.5, 용존산소레벨 30%로 하고, 배지 pH는 28% 암모니아수의 첨가에 의해, 또 용존산소 레벨은 교반회전수의 상승에 의해 제어하였다. 탄소원인 글리세롤은 배양을 시작할 때에 2%를 첨가하고, 이것이 고갈된 후에는 80% 글리세롤을 10㎖/시간의 유속으로 연속적으로 첨가하였다. 그 결과 HPLC 분석의 피크에어리어로부터 산출되는 BP의 생산량으로부터 환산하면, 배양 48시간에 2g/ℓ의 THBP가 생산된 것을 알 수 있었다 (도 18).

[실시예 9 guaBA 유전자의 증폭효과에 의한 비오프테린류 생산량의 상승]

PCR에 의해 대장균 (W3110 주) 게놈 DNA 로부터 guaBA 유전자 (Tiedeman, A.A 등J. Biol. Chem.260: 8676-8679, 1986 및Nucleic Acids Res.13:1303-1316, 1985[GenBank M10101]) 의 클로닝을 실시하였다. 대장균 (W3110 주) 게놈 DNA는 보고되어 있는 방법 (생물공학실험서 [바이후깐, p97-98]) 에 의해 조제하였다. 센스 프라이머 P33 (배열번호 33) 및 안티센스 프라이머 P34 (배열번호 34) 를 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR 를 실시하고, 대장균 guaBA 유전자를 함유하는 DNA를 취득하였다. 다음에 얻어진 guaBA 유전자를 벡터 pCR2.1 (Invitrogen) 로 서브클로닝하고, pCR2.1-guaBA를 제작하였다. 다음에 pCR2.1-guaBA를BamHI 및XhoI로 절단한 후, guaBA 유전자를 함유하는 3kb 의 단편을 pMW218 (닛뽕진) 의BamHI 및XhoI 단편 (3.9kb) 과 삽입하여 pMW218-guaBA 를 제작하였다 (도 19). 이 플라스미드를 염화칼슘법에 의해 AG14/pSTV28-GPS 주에 도입하여, AG14(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA) 를 제작하였다. 형질전환주의 선택 및 배양은, 카나마이신 (25㎍/㎖) 및 클로람페니콜 (25㎍/㎖) 을 함유하는 배지에서 실시하였다. 제작된 균주를 실시예 4에 나타낸 방법에 의해 배양하고, HPLC 분석의 피크 에어리어로부터 생산량을 측정한 결과 580㎎/ℓ의 BP가 생산된 것을 알 수 있었다 (표 1).

[실시예 10 GCH의 발현량 증가에 의한 비오프테린류 생산량의 상승]

pSTV28-GCH 및 pUC18-PTPS를EcoRⅠ 및SalI로 처리하여 folE 유전자 및 래트 PTPS 유전자를 단리하고, 각각을 pTWV228 (타까라주조) 의 멀티클로닝 부위에 존재하는EcoRⅠ 및SalI 부위에 삽입하여, pTWV228-GCH 및 pTWV228-PTPS 를 제작하였다. 동일하게 pUC19-SPR을HindⅢ를 처리하여 래트 SPR 유전자를 단리하고, pTWV229 (타까라주조) 의 멀티클로닝 부위에 존재하는HindⅢ에 삽입하여, pTWV229-SPR을 제작하였다. 제작된 3종의 플라스미드의 각각을 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA) 주에 도입하여, 실시예4에 나타낸 방법에 의해 비오프테린류 생산량을 측정하였다. 형질전환주의 선택 및 배양에는 암피실린 (25㎍/㎖), 카나마이신 (25㎍/㎖) 및 클로람페니콜 (25㎍/㎖) 을 함유하는 배지에서 실시하였다.

제작된 각 균의 생산량은 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA, pTWV228-GCH) 가 524㎎/ℓ, AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA, pTWV228-PTPS) 가 337㎎/ℓ, AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA, pTWV228-SPR) 가 465㎎/ℓ이었다. 또 SDS-PAGE에 의한 분석에서는, 새로 플라스미드의 도입으로 각 효소의 발현량이 상승되고 있는 것이 확인되었다.

이상의 결과로부터, THBP 생산에 관련되는 3종의 효소유전자에 대해서는 그 발현량을 증가시킴으로써 비오프테린류 생산량을 개선할 수 있고, 특히 GCH 유전자의 발현량을 증가시킴으로써 비오프테린류 생산량을 더욱 개선할 수 있는 것을 알 수 있었다.

[실시예11 고초균 GCH 유전자 (mtrA)의 이용에 의한 비오프테린류 생산의 상승]

PCR에 의해 고초균 (Bacillus subtilis 1A1주) 게놈 DNA 로부터 고초균 GCH 유전자인 mtrA (Gollnick,P.등Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:8726-8730, 1990, [GenBank M37320]) 의 클로닝을 실시하였다. 고초균 게놈 DNA는 보고되어 있는 방법 (유전자 발현 실험 매뉴얼 [고우담샤 사이언티픽, p31-33]) 에 의해 조제하였다. 센스 프라이머 P35 (배열번호 35) 및 안티센스 프라이머 P36 (배열번호 36) 을 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR을 실시하여, 고초균 mtrA 유전자를 함유하는 DNA를 취득하였다. 이후, 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하여, 센스 프라이머 P37 (배열번호 37) 및 안티센스 프라이머 P38 (배열번호 38) 을 사용하여 다시 한번 PCR 을 실시한 후,EcoRⅠ및XbaI로 절단한 후, pUC18의EcoRⅠ-XbaI 의 절편과 연결하여 pUC18-mtrA를 제작하였다.

다음에 pUC18-mtrA로부터 mtrA 유전자를EcoRⅠ 및XbaI로 잘라내고, 이것을 pSTV28-GPS의EcoRⅠ-SphI 절편 (3.0kb) 및 pSTV28-GPS의XbaI-SphI 절편 (1.4kb) 과 연결하여 pSTV28-MPS를 제작하였다 (도 20). 다음에 얻어진 pSTV28-MPS로 AG14/pMW218-guaBA를 형질전환하고, AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA) 를 제작하고, 실시예4에 나타낸 방법에 의해 THBP 생산량을 측정하였다. 또한 배양은 카나마이신 (25㎍/㎖) 및 클로람페니콜 (25㎍/㎖) 을 함유하는 배지에서 실시하였다.그 결과 고초균의 GCH 유전자를 갖는 주 [AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA)] 는 높은 THBP 생산량 (770㎎/ℓ) 을 나타내고, 고초균의 GCH 유전자 (mtrA) 를 사용함으로써, 비오프테린류 생산량이 더욱 향상되는 것이 나타났다 (표 1).

균주	THBP 생산 [BP로서 검출]
JM101/pSTV28-GPS	23 mg/L
AG14/pSTV28-GPS	250 mg/L
AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA)	580 mg/L
AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA)	770 mg/L

[실시예 12 guaBA 증폭주 및 고초균 GCH 유전자 도입주의 쟈 퍼멘터에 의한 배양]

guaBA 증폭주인 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA) 와 고초균 GCH 유전자 도입주인 AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA) 에 대해 실시예7 및 8의 방법에 따라 2ℓ스케일의 배양을 실시하였다. 그 결과 배양 42시간에서 HPLC 분석의 피크 에어리어로부터 산출되는 BP가 AG14/(pSTV28-GPS, pMW218-guaBA) 에서는 2.4g/ℓ 및 AG14/(pSTV28-MPS, pMW218-guaBA) 에서는 4g/ℓ생산되었다 (도 21).

[실시예13 고초균용 발현벡터 pDG148MPS 및 pDG148MPSΔI의 제작]

고초균용 발현 벡터 pDG148MPS 및 pDG148MPSΔI 는 이하의 절차에 의해 제작하였다.

(1) pUC18SD의 제작 (도 22 참조)

상보적인 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 P39 (배열번호 39) 와 P40 (배열번호 40) 을, 한쪽에서 P41 (배열번호 41) 과 P42 (배열번호 42) 를 혼합하여 2개사슬의 DNA 단편을 2개 제작하였다. 각각의 단편을 T4 폴리뉴클레오티드키나아제에 의해 각 5' 말단에 인산기를 부가하는 반응을 실시한 후, pUC18의HindⅢ-EcoRⅠ의 사이트에 클로닝하였다.

얻어진 플라스미드 pUC18SD의HindⅢ-EcoRⅠ간의 약 45bp의 배열은 고초균의 유전자발현에 적합한 SD 배열 (샤인ㆍ달가노 배열) 및 MSNITNS (메티오닌-세린-아스파라긴-이소류신-트레오닌-아스파라긴-세린)의 아미노산배열에서 시작되는 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 포함한다 (Fujita등, Microbiology, 140:6571-6580, 1998)

(2) pUC18ΔE 의 제작 (도 23 참조)

pUC18을EcoRⅠ로 완전히 절단하고, 추가로 녹두 (Mung Bean) 뉴클레아제 (Nuclease) 를 첨가하여 37℃에서 15분간 인큐베이트하고, 에탄올 침전으로 정제하고, 라이게이션 반응을 실시하여 pUC18ΔE를 제작하였다. 얻어진 플라스미드는EcoRⅠ로 절단되지 않는 것을 확인하였다. DNA 시퀀싱에 의해EcoRⅠ의 인식배열 5'-GAATTC-3'는 5'-GATT-3'로 변화되어 있는 것을 확인하였다.

(3) pUC18ΔESDmtrA 의 제작 (도 24 참조)

mtrA 유전자의 클로닝을 위해 고초균 게놈 DNA를 주형에 P43 (배열번호 43) 및 P44 (배열번호 44) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, 다음에 증폭된 DNA를 주형으로 하여, P45 (배열번호 45) 및 P46 (배열번호 46), P45 (배열번호 45) 및 P47 (배열번호 47) 을 사용하여 PCR 을 실시하여 제한효소부위를 도입하였다. 얻어진 DNA 단편의 말단을EcoRⅠ 및PstⅠ로 절단한 후, pUC18SD로 조제한HindⅢ-EcoRⅠ단편 (SD 배열) 과 pUC18ΔE 유래의 2.6kbHindⅢ-PstⅠ DNA 단편을 연결하고,pUC18ΔESDmtrA를 제작하였다. 도 31 은 pUC18ΔESDmtrA 상에 클로닝된 mtrA의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타낸다. 또한 밑줄 부분은 mtrA의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산배열 (Fujita 등, Microbiology,140:6571-6580, 1998) 을 나타낸다.

(4) pUC18SDPTPS 의 제작 (도 25 참조)

pUC18SD를 주형으로 하고, 프라이머 P50 (배열번호 50) 과 P48 (배열번호 48) 을 사용하여 PCR을 실시한 후, 얻어진 DNA 단편의 말단을XbaⅠ 및EcoRⅠ로 절단하고, SD 배열을 함유하는 DNA 단편을 조제하였다. 동일하게 실시예 1 에서 도 4 에 나타낸 공정으로 제작한 pUC18-PTPS를 주형으로 하여 프라이머 P50 (배열번호 50) 과 P49 (배열번호 49) 를 사용하여 PTPS 유전자를 함유하는 0.45kb의EcoRⅠ-SalⅠ 단편을 조제하였다. 이들을 pUC18 유래의 2.6kbXbaⅠ-SalⅠDNA 단편과 연결하여 pUC18SDPTPS를 제작하였다. 도 32 는 pUC18SDPTPS 상에 클로닝된 PTPS의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타낸다. 또한 하선부는 PTPS의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산배열 (Fujita 등, Microbiology,140:6571-6580, 1998) 을 나타낸다.

(5) pUC18ΔESDSPR의 제작 (도 26 참조)

pUC18SD를 주형으로 하고, 프라이머 P51 (배열번호 51) 과 P53 (배열번호 53) 을 사용하여 PCR을 실시한 후, 얻어진 DNA 단편의 말단을SalⅠ및EcoRⅠ로 절단하고, SD 배열을 함유하는 DNA 단편을 조제하였다. 동일하게 실시예1에서 도 5 에 나타내는 공정으로 제작한 pUC19-SPR을 주형으로 하여 프라이머 P52 (배열번호 52) 와 P53 (배열번호 53) 을 사용하여 SPR 유전자를 함유하는 0.8kb의EcoRⅠ-SphⅠ단편을 조제하였다. 이들을 pUC18ΔE 유래의 2.6kbSalⅠ-SphⅠDNA 단편을 연결하여 pUC18ΔESDSPR을 제작하였다. 도 33 은 pUC18ΔESDSPR 상에 클로닝된 SPR의 DNA 염기배열과 대응하는 아미노산배열을 나타낸다. 또한 밑줄친 부분은 SPR의 아미노말단에 부가되는 CcpA 단백 유래의 아미노산배열 (Fujita 등, Microbiology,140:6571-6580, 1998) 을 나타낸다.

(6) pSL1180PS의 제작 (도 27 참조)

전술한 바와 같이 도 25 에서 나타낸 공정으로 제작한 pUC18SDPTPS를XbaⅠ및SalⅠ로 절단하고, 0.5kb의 단편 (SD 배열+PTPS) 을 조제하였다. 다음에, 전술한 바와 같이 도 26 에 나타낸 공정으로 제작한 pUC18ΔESDSPR을SalⅠ 및SphⅠ로 절단하고, 0.85kb의 단편 (SD 배열+SPR) 을 정제하였다. 이들 단편을 pSL1180의XbaⅠ,SphⅠ 절편 (3.4kb) 과 연결하여 pSL1180PS를 제작하였다.

(7) pSL1180MPS의 제작 (도 28 참조)

전술한 바와 같이 도 24 에서 나타낸 공정으로 제작한 pUC18ΔESDmtrA를HindⅢ 및XbaⅠ로 절단하고, 0.63kb 단편을 조제하고, 이것을 pSL1180PS의HindⅢ 및XbaⅠ로 절단하여 얻어지는 4.7kb 단편과 연결하여 pSL1180MPS를 제작하였다.

(8) 고초균용 발현벡터 pDG148MPS의 제작 (도 29 참조)

전술한 바와 같이 도 28 에서 나타낸 공정으로 제작한 pSL1180MPS를HindⅢ 및SphⅠ로 절단하고, mtrA, PTPS, SPR 유전자가 순서대로 배치된 2.0kb의 DNA 단편을 조제하였다. 한편 대장균 및 고초균에 사용할 수 있는 셔틀 벡터 pDG148(Karmazyn-Campelli 등,Cell,52, 697-704, 1988) 을HindⅢ 및SphⅠ로 절단하여 8.2kb의 DNA 단편을 조제하고, 앞의 2.0kb의 DNA 단편과 연결하여 고초균용 발현 벡터 pDG148MPS를 제작하였다. 또한 도 29 에서 Pspac는spac프로모터를lacⅠ는lacⅠ유전자를,lac0는lacⅠ단백에 의한 발현조절영역을, Km은 카나마이신 내성유전자를, Ap는 암피실린 내성유전자를, ori는 플라스미드의 복제개시점을 나타낸다.

이 발현벡터 pDG148MPS는spac프로모터 (Pspac)의 하류에lac0 배열을, 또 멀티클로닝사이트의 하류에 고초균내에서 발현이 유도되는lacⅠ유전자가 코드되어 있다. 따라서 고초균내에서는lacⅠ단백에 의해spac프로모터에 의한 전사가 억제되고 있다. 그러나 배지중에 유도물질인 IPTG를 첨가함으로써,spac프로모터에 의한 전사가 활성화되고 하류의 유전자의 발현이 유도된다. mtrA, PTPS, SPR 유전자의 상류에는 각각 고초균의 유전자발현에 적합한 SD 배열 및 MSNITNS (메티오닌-세린-아스파라긴-이소류신-트레오닌-아스파라긴-세린)의 아미노산배열로 시작되는 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 배치하고 있다. 오페론처럼 배치된 이들 세 유전자는spac프로모터에 의해 전사가 유도된다.

(9) 고초균용 발현벡터 pDG148MPSΔⅠ의 제작 (도 30 참조)

전술한 바와 같이 도 28 에 나타낸 공정으로 제작한 pSL1180MPS를 제한효소HindⅢ 및BamHⅠ로 절단하고, mtrA, PTPS, SPR 유전자를 순서대로 배치한 2.0kb의 DNA 단편을 조제하였다. 이것을 전술한 pDG148의HindⅢ 및BamHⅠ절편물 (6.9kb) 와 연결시켜 고초균용 발현벡터 pDG148MPSΔⅠ를 제작하였다. 또한 도30 에서 Pspac는spac프로모터를,lac0은lacⅠ단백에 의한 발현조절영역을, Km은 카나마이신 내성유전자를, Ap는 암피실린 내성유전자를, ori는 플라스미드의 복제개시점을 나타낸다.

이 발현벡터 pDG148MPSΔⅠ는,spac프로모터 (Pspac)의 하류에lac0 배열을 갖고 있으나, pDG148 내지lacⅠ 유전자 부분을 결실시키고 있기 때문에, 고초균내에서는spac프로모터에 대한 억제는 발생하지 않는다. 따라서 하류의 유전자의 발현은 항상적으로 유도되고 있다. mtrA, PTPS, SPR 유전자의 상류에는 각각 고초균의 유전자발현에 적합한 SD 배열 및 MSNITNS의 아미노산배열로 시작되는 번역개시영역을 코딩하는 DNA 배열을 배치하고 있다. 오페론처럼 배치된 이들 세 유전자는spac프로모터에 의해 전사가 유도된다.

[실시예 14Bacillus subtilis에 의한 비오프테린류의 생산]

바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)1A1주 (trpC2) (Fujita 등, Microbiology, 140:6571-6580, 1998) 을 이하의 방법에 의해 pDG148MPS 또는 pDG148MPSΔⅠ로 형질전환하였다. 형질전환에 사용한 pDG148MPS 및 pDG148MPSΔⅠ의 각 플라스미드는, 대장균과 고초균의 양쪽으로 형질전환가능한 셔틀벡터 pDG148 (Karmazyn-Dampelli등,Cell,52, 697-704, 1988) 유래의 벡터이고, 대장균에서는 암피실린 내성을, 고초균에서는 카나마이신 내성을 선택 마커로서 이용할 수 있다.

TBABG 플레이트에 고초균 1A1주를 스트리크하고, 12시간의 전배양을 실시하였다. [TBABG 플레이트 1ℓ중의 조성:트립톤 10g, Beef Extract 3g, NaCl 5g,한천말 15g, 글루코오스 1.8g]

플레이트로부터 균체를 긁어내 2㎖ 의 CI 배지에 현탁하였다. [CI 배지의 조성:(NH₄)₂SO₄0.2%, K₂HPO₄1.4%, KH₂PO₄0.6%, Na₃시트레이트ㆍ2H₂O 0.1%, MgSO₄5mM, 글루코오스 0.5%, 카자미노산 (casamino acid) 0.02%, 트립토판 (trp) 50㎍/㎖]

얻어진 현탁액을 OD_600nm=0.08이 되도록 CI 배지에서 희석하고, 37℃에서 진탕배양을 실시하였다. 배양중 적절히 OD_600nm값을 측정하고, 증식이 정상기에 들어가는 것을 확인하였다.

2.5㎖의 배양액을 원심분리 (2500rpm, 10분, 실온(RT)) 하고, 집균한 것을 5㎖의 CⅡ 배지에 현탁하고, 30분 정도 진탕배양을 실시하여, 컨피텐트셀로 하였다. [CⅡ 배지의 조성:(NH₄)₂SO₄0.2%, K₂HPO₄1.4%, KH₂PO₄0.6%, Na₃Citrateㆍ2H₂O 0.1%, MgSO₄5mM, 글루코오스 0.5%, 카자미노산 (casamino acid) 0.01%, 트립토판 (trp) 5㎍/㎖].

컨피텐트셀 1㎖에 대해 recA⁺주인 대장균 JM101주로 조제한 pDG148MPS 또는 pDG148MPSΔⅠ를 1㎍ 혼합하고, 37℃에서 2시간 서서히 진탕배양을 실시하였다. 그 후 배양액을 5㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 TBABG 플레이트에 스트리크하고, 37℃에서 약 12시간 배양하고, 1A1/pDG148MPS, 1A1/pDG148MPSΔⅠ의 각 형질전환체를 얻었다.

얻어진 각 형질전환체 콜로니를 3㎖의 5㎍/㎖의 카나마이신 (Km)을 함유하는 LB 배지에서 약 3시간 전배양을 실시하였다. 그 후 2% 글루코오스, 1mM IPTG, 5㎍/㎖ km을 함유하는 NU 배지 (3.5㎖) 에 접종하고, 20시간 진탕배양을 37℃에서 실시하였다. 동일하게 각 주의 컨트롤로서 고초균 1A1주에 대해서도 카나마이신을 함유하지 않은 배지에서 동일한 배양을 실시하였다. [NU 배지의 조성 (1ℓ당):효모엑기스 4g, KH₂PO₄4g, K₂HPO₄4g, Na₂HPO₄2.8g, NH₄Cl 0.2g, MgSO₄ㆍ7H₂O 2g, FeSO₄0.04g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.04g, MnSO₄ㆍ5H₂O 0.01g, AlCl₃ㆍ6H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.004g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.002g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.002g, CuCl₂ㆍ2H₂O 0.001g, H₃BO₃0.0005g]

그 결과 컨트롤의 주를 포함하여 모든 주에 있어서, OD_600nm값은 10-12를 나타냈다. 균체의 증식은 양호하고, 형질전환 및 IPTG 첨가에 의한 발현유도의 영향은 볼 수 없었다. 배양개시후 20시간에서의 배양 상청을 실시예4에 기재된 방법으로 산화처리하여 HPLC 분석에 사용하였다.

HPLC 분석결과를 도 34 에 나타낸다. 플라스미드를 도입하지 않은 1A1주 (우단) 에서는 표준품 BP의 용출위치에서 피크를 볼 수 없었지만, 다른 2주 (1A1/pDG148MPS, 1A1/pDG148MPSΔⅠ) 에 대해서는 BP 표준품의 용출위치에서 피크를 볼 수 있고, 제작한 고초균이 BP 생산능을 갖는 것이 밝혀졌다. 피크 에어리어의 면적비로부터 계산하면, BP의 생산량은 모두 약 0.45㎍/㎖ 이었다.

본 발명은 약리효과가 기대되는 비오프테린류를 저가의 배지원료를 기초로 하여 대량으로 공업적으로 생산할 수 있다는 효과가 있다. 그 결과 비오프테린류, 특히 그 약리작용에 대한 연구를 용이하게 실시할 수 있으므로, 신규의약의 개발을 촉진시킬 수 있다.

또 본 발명은 THBP의 산화물인 DHBP 및 BP의 생산이 가능해진다는 효과를 나타낸다. 그 결과 비오프테린류의 대사에 대한 연구를 용이하게 실시할 수 있다.

Claims

형질전환된 세포에 의해 비오프테린 (biopterin) 류를 제조하는 방법으로, (a) 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소의 하나 이상의 유전자로 숙주세포를 형질전환하고, (b) 얻어진 형질전환세포를 배양하여 테트라히드로비오프테린을 생산하고, (c) 필요에 따라, 생산된 테트라히드로비오프테린을 산화하고, (d) 생산된 테트라히드로비오프테린, 그리고 이 테트라히드로비오프테린이 산화된 디히드로비오프테린 및 비오프테린으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비오프테린류를 채취하는 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 배양액 중 또는 그 처리물 중의 비오프테린류를 산화한 후, 비오프테린을 채취하는 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 채취한 디히드로비오프테린 및/또는 비오프테린을 환원시켜 테트라히드로비오프테린을 제조하는 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소가 GTP 시클로히드라아제Ⅰ, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소 및 세피아프테린 (sepiapterin) 환원효소로 이루어지는 군에서 선택되는1∼3 종류의 효소인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환을 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소의 유전자 및 세피아프테린 환원효소의 유전자를 갖는 발현벡터에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 내재성의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성 이상의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 4 항에 있어서, 숙주세포에 도입하는 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 유전자가 고초균 유래의 mtrA 유전자인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포가 원핵생물세포인 비오프테린류의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 원핵생물이 대장균, 고초균 또는 방선균인 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포가 진핵생물세포인비오프테린류의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 진핵생물이 효모 또는 사상균인 비오프테린류의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 효모가 메탄올 자화 효모 또는 분열 효모인 비오프테린류의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 효모인 비오프테린류의 제조방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 14 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 8-아자구아닌 내성 이상의 8-아자구아닌 내성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 숙주세포가 IMP 디히드로게나아제 및 GMP합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 도입한 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 비오프테린류의 제조방법.
숙주세포에 테트라히드로비오프테린 생합성에 관련되는 효소의 유전자를 도입한, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 비오프테린류의 제조에 사용하는 형질전환세포.
제 17 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 GTP 합성능 이상의 GTP 합성능을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
제 18 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 8-아자구아닌 내성 이상의 8-아자구아닌 내성을 갖는 변이형 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 숙주세포가 IMP 디히드로게나아제 및 GMP 합성효소를 코딩하는 guaBA 유전자를 도입한 유전자 재조합 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
제 18 항에 있어서, 숙주세포가 야생형 세포가 갖는 내재성의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성 이상의 GTP 시클로히드라아제Ⅰ 활성을 갖는 변이형 세포로, 이 숙주세포에 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소의 유전자 및 세피아프테린 환원효소의 유전자를 도입한 형질전환세포.
제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포에 도입하는 GTP 시클로히드라아제Ⅰ유전자가, 고초균 유래의 mtrA 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.