KR20030033006A - 내츄럴 킬러 세포 증식법 - Google Patents
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Abstract
인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재하에서 증식 배양하기 위해 사용하는 앵커리지 의존성 증식 자극용 세포로서, 검출수단이 도입된 것을 특징으로 하는 세포 및 이 세포를 사용하여 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 배양하는 방법. 이 세포는 예를 들면, 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 그 전구세포에 대한 증식 자극작용을 가지고 있고, 또한 증식 배양된 인간 내츄럴 킬러 세포에 대해 고감수성이다.
Description
기술분야
본 발명은 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식 배양방법에 관한 것이다.
배경기술
내츄럴 킬러(이하, 「NK」로 약칭하는 경우가 있다)세포는 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포이다. 이 세포에는 여러 기능이 있지만, 특히 종양세포를 죽이는 강한 활성이 있기 때문에, 체내에서는 종양화된 또는 종양화하고 있는 이상이 있는 세포를 제거하는 면역 감시기구의 중요 멤버로 생각되고 있다. 따라서, 이 세포를 종양치료나, 종양의 발생원이 되는 것으로 상정되고 있는 바이러스 감염세포의 제거에 유효하게 이용하고자 하는 연구는 옛부터 행해지고 있었다.
본 발명자 등은 앵커리지 의존성 인간 빌름스종양 세포주 HFWT(anchorage-dependent human Wilms' tumor cell line HFWT)가, 부유성 세포주 K562와 동일하게 NK 세포의 살상작용에 고감수성이고, 또한 인간 말초혈 단핵세포(이하, 「PBMC」로 약칭하는 경우가 있다)를 배양하여 NK 세포를 증식시키고자 하는 경우, 기지의 NK 고감수성 세포주인 K562 이상으로 강하게 NK 세포증식을 자극하는 것을 발견하였다(일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서). PBMC에는 NK 세포와 NK 전구세포가 포함되어 있기 때문에, HFWT 세포를 증식 자극용 세포로서 사용함으로써 종래의 방법에 비해 효율이 좋은 NK 세포증식법으로서 이용할 수 있다. 또한, 기본적으로 부유성인 NK 세포와 부착성 HFWT 세포를 배양액 교환에 의해 간단하게 분리할 수 있기 때문에, 살아 있는 HFWT 세포가 혼입될 위험성이 낮은 배양 NK 세포에 의한 인간 종양의 세포요법이 실현 가능해졌다.
더욱이, NK 세포의 세포 상해활성 측정시에 HFWT 세포를 표적세포로서 사용하면, 생존해 있는 HFWT 세포는 부착되어 있기 때문에, 부유성인 NK 세포로부터 간단히 분리할 수 있다. 이러한 성질을 이용하여, 종래부터 표준적으로 사용되고 있는 표적세포 표지용 방사성 물질 Cr-51을 사용하지 않고, 생존 HFWT 세포를 크리스탈 바이올렛 색소로 염색 정량하는 방법에 의한 안전성이 높은 인간 NK 세포의 세포 상해활성 측정법을 제공하였다(Watanabe, S., et al., 2000 World Congress on In Vitro Biology, 2000.6.10, San Diego).
특히, HFWT 세포를 증식 자극 세포로 해서 PBMC로부터 NK 세포를 선택적으로 배양하여, 살아 있는 부착된 HFWT 세포로부터 부유된 NK 세포를 분리하고자 할 때, 활성화되어 있는 NK 세포로서 배양면에 가볍게 부착되어 있는 것도 있기 때문에, 그들을 회수할 때, 일부의 HFWT 세포가 NK 세포와 함께 배양면으로부터 박리 부유하여 NK 세포에 혼입될 가능성이 높다는 문제가 있었다. HFWT 세포는 종양세포로, 배양 NK 세포를 의료에 사용하는 경우를 상정하면, 그 생세포의 혼입은 엄중히 경계해야만 한다. 그러나, 종래에는 부유상태로 되어 혼입되고 있는 살아 있는 HFWT 세포를 간편하게 검출할 수 있는 방법은 없었다.
발명의 개시
본 발명의 과제는 상술한 바와 같은 배양 NK 세포에 혼입될 가능성이 있는 증식 자극용 종양세포를 고감도로 간편하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 상기의 검출방법을 사용하여 생존해 있는 종양세포가 혼입될 위험성이 매우 낮고, 또한 효율이 좋은 인간 NK 세포의 제조방법 및 이 제조방법으로 얻어진 인간 NK 세포를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 또한, 방사성 표지물질을 사용하지 않고, 안전성이 높고, 또한 색소염색법 보다도 고감도의 인간 NK 세포의 세포 상해활성 측정법을 제공하는 것도 본 발명의 과제이다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 증식 자극용 세포에 검출수단을 도입하여 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식배양에 사용하면, 배양물 중에 생존하여 혼재하는 증식 자극용 세포를 용이하고 또한 고감도로 검출할 수 있는 것 및 이 수단을 사용하여 실질적으로 증식 자극용 세포를 포함하지 않는 내츄럴 킬러 세포를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자 등은 검출수단의 하나로서 해파리(Aequorea) 유래의 그린 형광 단백을 코드하는 유전자를 도입한 증식 자극용 세포를 지극히 고감도로 간편하게 형광현미경으로 검출할 수 있는 것, 낭주(daughter cell line) 중에서 인간 PBMC로부터 NK 세포를 증식 배양할 때, PBMC 중의 NK 세포/NK 전구세포에 대한 증식 자극 능력이 높은 세포주를 미리 선택하여, 이것을 인간 NK 증식 배양시에 증식 자극용 세포로서 공존 배양하면 효율적인 배양이 가능해지는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 사실을 토대로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재 하에서 증식 배양하기 위해 사용하는 앵커리지 의존성 증식 자극용 세포로서, 검출수단이 도입된 것을 특징으로 하는 세포를 제공하는 것이다. 상기 세포는 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식 배양에 적합하도록 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 인간 내츄럴 킬러 세포 전구세포에 대한 증식 자극작용을 가지고 있고, 바람직하게는 증식 배양된 인간 내츄럴 킬러 세포에 대해 고감수성이다. 바람직한 세포는, 인간 빌름스종양 세포주 HFWT에 검출수단을 도입한 세포이다. 검출수단으로서는 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식 중 또는 배양 후에 생존해 있는 세포를 고감도로, 또한 간편하게 검출할 수 있는 수단이 선택된다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면 상기 검출수단이 유전자 재조합 수단에 의해 도입된 상기 세포가 제공된다. 유전자 재조합 수단으로서는 예를 들면, 외래유전자의 도입 또는 유전자의 개변 등을 예시할 수 있다. 검출수단의 도입은 예를 들면, 색소 대사효소, 형광 단백질, 항원 단백질, 항체 등을 생산하는 외래유전자 도입 또는 유전자 개변에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, 해파리 유래의 그린 형광 단백(green fluorescent protein)(이하, 「GFP」로 약칭하는 경우가 있다)을 생산하는 유전자를 도입하는 수단이 바람직하다. 또한, 다른 바람직한 태양에 따르면 상기 검출수단이 비유전자 재조합 수단에 의해 도입된 상기 세포가 제공된다. 비유전자 재조합 수단으로서는 형광색소의 도입 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 세포의 바람직한 예로서는 세포주 GHINK-1을 들 수 있다. 이 세포는 인간 빌름스종양 세포주 HFWT에 대해 유전자 재조합에 그린 형광단백 유전자를 도입함으로써 새롭게 만들어진 세포로, 검출수단으로서 그린 형광 단백을 이용할 수 있다. 이 세포는 2000년 7월 27일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6)에 기탁번호 FERM P-17978로서 기탁되고, 2001년 7월 17일자로 부다페스트조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되었다(기탁번호 FERM BP-7668).
다른 관점에서는, 본 발명에 의해 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재 하에서 증식배양하는 방법으로서, 상기 증식 자극용 세포가 앵커리지 의존성(anchorage dependent)이고, 또한 상기 세포에 검출수단이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다. 이 방법으로는 증식 후의 인간 내츄럴 킬러 세포에 상기 증식 자극용 세포가 혼입되어 있는지의 여부를 상기 검출수단을 사용하여 용이하게 확인할 수 있어, 생존해 있는 상기 증식 자극용 세포를 실질적으로 포함하지 않는 인간 내츄럴 킬러 세포를 제조할 수 있다. 이 방법으로는 바람직하게는 인간 말초혈로부터 분리한 인간 말초혈 단핵세포로부터 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식시킬 수 있다.
또한, 다른 관점에서는, 본 발명에 의해 인간 내츄럴 킬러 세포의 제조방법으로서, 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재 하에서 증식 배양할 때에, 상기 증식 자극용 세포가 앵커리지 의존성이고, 또한 상기 세포에 검출수단이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 상기 방법에 의해 증식 배양된 인간 내츄럴 킬러 세포가 제공된다. 바람직하게는 상기의 증식 배양 후, 상기 검출수단을 이용함으로써 배양물로부터 생존해 있는 상기 증식 자극용 세포를 제거할 수 있다. 이 인간 내츄럴 킬러 세포는 생존해 있는 상기 증식 자극용 세포를 실질적으로 포함하지 않아, 인간 종양의 세포요법에 안전하게 사용할 수 있다. 본 발명에 의해 상기 인간 내츄럴 킬러 세포를 포함하는 인간 종양의 세포요법을 위한 의약 및 상기 인간 내츄럴 킬러 세포를 인간 종양환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 인간 종양의 치료방법이 제공된다.
더욱이 다른 관점에서는, 본 발명에 의해 상기 증식 자극용 세포를 표적세포로서 사용하는 인간 내츄럴 킬러 세포의 세포 상해활성 측정법이 제공된다. 상기 증식 자극용 세포를 사용한 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식방법에 의해 얻어져, 실질적으로 상기 세포자극용 세포의 혼입이 없고, 또한 증식 자극용 세포를 표적세포로서 세포 상해활성이 증명된 인간 내츄럴 킬러 세포는 인간 종양의 세포요법을 위해 특히 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 인간 개체로부터 채취한 혈액 중의 내츄럴 킬러 세포의 세포 상해활성을 측정하는 방법으로서, 상기 증식 자극용 세포를 표적세포로서 사용하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 CV 염색법을 사용하여 NK 세포의 세포 상해활성을 측정한 경우의 표적세포의 감수성의 차이를 나타낸다.
도 2는 GHINK-1 세포를 표적세포로서 사용한 형광강도 측정법과 CV 염색법에 의한 NK 세포의 세포 상해활성을 4시간 어세이한 경우의 비교를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
일본 특허출원 제2000-230551호 명세서(2000년 7월 31일 출원)의 개시된 모든 것을 참조로 하여 본 명세서의 개시에 포함시킨다.
본 발명에 의해 제공되는 세포는 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재 하에서 증식 배양하기 위해 사용하는 앵커리지 의존성 증식 자극용 세포로서, 상기 세포의 검출을 위한 수단이 도입되어 있는 것을 특징으로 하고 있다. 상기 세포는 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식 배양에 적합하도록 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 인간 내츄럴 킬러 세포 전구세포에 대한 증식 자극작용을 가지고 있고, 바람직하게는 증식 배양된 인간 내츄럴 킬러 세포에 대해 고감수성이다. 검출수단은, 바람직하게는 인간 내츄럴 킬러 세포의 증식 배양 중 또는 배양 후에 생존해 있는 증식 자극 세포의 검출을 용이하고 또한 고감도로 행할 수 있도록 선택된다. 본 발명의 인간 내츄럴 킬러 세포의 제조방법은 상기 증식 자극용 세포를 사용하는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 검출수단은 유전자 재조합 수단 또는 비유전자 재조합 수단에 의해 세포에 도입할 수 있다. 유전자 재조합 수단으로서는 예를 들면, 외래유전자의 도입 또는 유전자의 개변 등을 예시할 수 있고, 검출수단의 도입은 예를 들면, 색소 대사효소, 형광 단백질, 항원 단백질, 항체 등을 생산하는 외래유전자 도입 또는 유전자 개변에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, 해파리 유래의 그린 형광 단백질을 생산하는 유전자를 도입하는 수단이 바람직하다. 유전자 재조합에 세포 중의 특정유전자를 녹아웃하여 특정 유전자산물을 생산할 수 없도록 한 세포를 이용하는 것도 가능하다. 비유전자 재조합 수단으로서는, 형광색소의 도입 등을 예시할 수 있다.
상기 증식 자극용 세포는 일반적으로는,
(1) (a) 인간 NK 세포 및/또는 NK 전구세포에 대해 증식 자극작용이 있는 앵커리지 의존성 세포 및 인간 내츄럴 킬러 세포의 세포 상해작용에 감수성이 있는 앵커리지 의존성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를, 유전자 재조합 수단에 의해 생존세포의 검출을 고감도로 용이하게 행할 수 있는 세포로 개변하는 공정; 및
(b) 상기 공정 (a)에서 얻어진 세포주로부터, 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 NK 전구세포에 대해 증식 자극작용이 있는 앵커리지 의존성 세포를 선택하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
또한, 비유전자 재조합 수단을 사용하여 검출수단을 세포에 도입하는 경우에는, 미리 증식 자극작용을 갖는 세포를 선택하여 그 세포에 검출수단을 도입할 수 있다.
예를 들면,
(2) 인간 NK 세포 및/또는 NK 전구세포에 대해 증식 자극작용이 있는 앵커리지 의존성 세포로부터 유래하는 세포에 대해, 형광색소 등에 의한 표지처리를 행하여 고감도로 용이하게 검출할 수 있는 세포로 개변하는 공정을 포함하는 방법
에 의해 증식 자극용 세포를 얻을 수 있다.
세포의 검출을 고감도로 용이하게 하기 위해 선택되는 검출수단의 종류는 특별히 한정되지 않고, 통상은 당업자에게 기지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 조작대상으로 하는 세포에 대해 도입 전 세포에서는 생산되지 않고, 또한 도입 후의 세포에 있어서 고감도로 용이하게 검출할 수 있는 산물을 생산할 수 있는 유전자를 유전자 재조합 수단에 의해 세포 내에 도입하는 방법을 들 수 있다. 배양 중 또는 배양 후에 생존해 있는 증식 자극용 세포는, 그 유전자산물을 검출함으로써 용이하고 또한 고감도로 검출할 수 있다. 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 형광 단백질을 코드하는 유전자를 사용할 수 있다. 형광 단백질을 코드하는 유전자로서는 예를 들면, 해파리 유래의 GFP 유전자를 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면 대장균 유래의 베타-글루쿠로니다아제 유전자(β-Glucuronidase protein)(lac Z)를 사용하는 것도 가능하다.
이들 유전자 도입법 및 유전자산물의 검출법은 당업자에게 주지로, 당업자는 적절한 방법을 선택하거나 또는 2종 이상의 방법을 조합하여 유전자도입 및 유전자산물의 검출을 행할 수 있다. 예를 들면, GFP 유전자를 도입한 경우에는 형광현미경으로 관찰함으로써 생존해 있는 증식 자극용 세포를 용이하고 또한 고감도로 검출할 수 있다. 도입 전 세포에는 존재하지 않는 도입유전자 자체를 검출대상으로 할 수도 있다. 도입유전자의 간편한 검출방법으로서는 당업자에게 주지의 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면, 폴리머라아제 체인 리액션법(polymerase chain reaction method)이나, 그것과 형광검출법을 조합시킨 방법 (Heid, A. C., et al., Genome Res., 6: 995-1001, 1996), LAMP법(Notomi, T., et al., Nucleic Acid Res., 28: e63, 2000) 등을 사용할 수 있다.
생존해 있는 증식 자극용 세포의 검출시 NK 세포 증식 배양 중인 경우에는, 부유하고 있는 NK 세포를 제거하여 부착되어 있는 세포군에 대해 검출을 행하면 된다. NK 세포 증식 배양 후, 회수한 부유 NK 세포에 혼재하는 증식 자극용 종양세포를 검출하기 위해서는, NK 세포의 회수시에 생존세포를 분리 회수하는 방법으로 회수하여, 그 속의 세포군에 대해 검출을 행하면 좋다. 생존세포를 분리 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 시판되고 있는 림포프레프 (Lymphoprep)(Nycomed사제)를 사용하여 인간 림프구 분획을 회수하는 방법을 채용할 수 있다.
세포에 적용하는 유전자 재조합 조작에 의해, 대상세포의 원래의 특징 또는 성질이 손실되는 경우가 있다. 이 때문에 대상세포의 개변 낭주 중 적절한 낭주를 선택하는 공정(상기(1) 공정(b))을 채용하는 것이 바람직하다. 상기 공정(b)에서 인간 NK 세포 및/또는 NK 전구세포에 대해 증식 자극작용이 있는 앵커리지 의존성 세포주를 선택하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, PBMC로부터 NK 세포를 선택적으로 증식시키는 능력을 지표로 하여 NK 세포/NK 전구세포에 대한 증식 자극작용을 보유하고, 획득하며, 또는 증강하고 있는 세포주를 클로닝하는 방법을 채용할 수 있다. 클로닝방법은 당업자에게 주지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 한계희석법을 사용하여 선택대상이 되는 세포군으로부터 낭주를 클로닝할 수 있고, 이 딸세포를 증가시켜 인간 PBMC로부터 NK 세포가 선택적으로 증식하는지의 여부를 검사하여, 증식 자극효과가 높은 적절한 딸세포를 선택하면 된다.
본 발명 방법의 바람직한 태양에 의하면, 인간 말초혈로부터 분리한 인간 말초혈 단핵세포로부터 내츄럴 킬러 세포를 증식시킬 수 있다. 인간 말초혈 단핵세포로부터 NK 세포가 선택적으로 증식하는지의 여부를 검사하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 이 경우, HFWT 세포 대신에 검사대상이 되는 딸세포를 사용하면 된다.
비유전자 재조합 수단에 의해 검출수단을 도입하는 방법을 행하기 위해서는 예를 들면, 미리 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법에 준하여, 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 NK 전구세포에 대해 증식 자극작용이 있는 앵커리지 의존성 세포군을 선택해 두고, 이 세포군을 검출용 물질로 표지하면 된다. 검출용 물질의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 저세포 독성으로 세포의 생존률을 저하시키는 작용이 적은 형광색소 PKH26(Chang, I-K., et al., Cell Biol. Intern., 19, 569-576, 1995) 등을 사용할 수 있다. 세포독성이 낮은 형광색소를 사용함으로써 PBMC로부터 NK 세포를 선택적으로 증식시키는 과정이 저해되지 않아, 효율적인 NK 세포의 취득이 가능해진다. 상기 형광색소에 의해 세포를 표지하는 방법은 당업자에게 기지의 방법을 사용할 수 있어, 이들 방법에 의해 개변처리한 세포는 그대로 인간 NK 세포/NK 전구세포의 증식 배양에 적용할 수 있다.
인간 NK 세포/NK 전구세포로부터의 NK 세포 증식 배양에 있어서 증식 자극용 세포를 사용하는 방법 자체는 당업자에게 이용되고 있어, 예를 들면, 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서의 방법에 준해서 HFWT 세포 대신에 본 발명의 증식자극용 세포를 사용하여, 예를 들면 인간 PBMC와 함께 공존 배양하면 PBMC 중의 NK 세포를 선택적으로 증식시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서는 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법과는 달리, 인간 PBMC로부터 NK 세포를 증식 배양할 때 증식 자극용 세포의 증식능을 반드시 미리 손실시켜 둘 필요는 없다. NK 증식 배양 중에 증식 자극용 세포가 증식되어, 최종적으로 회수된 부유 NK 세포에 혼입되더라도 용이하게 검출할 수 있고, 또한 혼입세포는 기본적으로 부착성이기 때문에, 당업자에게는 주지의 배양면으로의 부착조작에 의해 부유성인 배양 NK 세포로부터 용이하게 제거할 수 있다. 특히, 배양 NK 세포를 증식 자극용 세포로부터 분리하는 경우, 증식 자극용 세포가 혼입될 가능성을 가능한 한 적게 하기 위해서는, 증식 자극용 세포의 증식능을 미리 손실시켜 두는 것이 바람직하다. 증식능을 손실시키는 처리방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 방사선 조사나 마이토마이신 C 처리 등 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 이 처리에 의해 NK 증식 배양 중에 증식 자극용 세포가 증식하는 경우는 없어지고, 또한 증식 자극용 종양세포가 앵커리지 의존성이기 때문에, NK 세포분리 후의 증식 자극용 세포가 혼입될 가능성을 크게 감소시키는 것이 가능해진다.
본 발명의 방법에 의하면 신체 건강한 정상인의 말초혈로부터 분리한 PBMC를 배양하여, 말초혈 제공자 본인의 NK 세포를 높은 세포 상해활성을 유지한 채 대량으로 증식시킬 수 있고, 또한 혼입된 증식 자극용 세포를 고감도로 간편하게 검출할 수 있으며, 증식 자극용 세포와 NK 세포와의 분리도 용이하기 때문에, 실질적으로 증식 자극용 세포를 포함하지 않는 NK 세포를 효율적으로 조제할 수 있다. 종양환자나 감염증 환자로부터 분리한 PBMC를 사용할 수도 있어, 그 환자에게 특이적인 NK 세포를 효율적으로 증식 배양할 수 있다.
또한, 본 발명의 증식 자극용 세포를 사용하여 NK 세포 증식 배양 중 및 배양 후에도 생존해 있는 증식 자극용 세포의 정도를 고감도로 용이하게 검출할 수 있다. 더욱이, 증식 자극용 세포로부터 배양 NK 세포를 분리한 후, 상기 NK 세포에 혼입되는 증식 자극용 세포를 고감도로 용이하게 검출할 수 있다. 이들의 구체적인 수법은 본 명세서의 실시예에 상세하게 설명되어 있다.
본 발명의 인간 NK 세포의 세포 상해활성 측정방법에서는, 상기 증식 자극용 세포를 인간 NK 세포의 세포 상해활성 측정시에 표적세포로서 사용하는 것을 특징으로 하고 있다. 상기 표적세포는 앵커리지 의존성으로 부유성 NK 세포로부터 간단하게 분리할 수 있고, 또한 고감도로 용이하게 검출할 수 있기 때문에, 종래의 염색방법(일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기술된 HFWT 세포를 표적세포로서 사용하여, 크리스탈 바이올렛 색소로 생존 HFWT 세포수를 정량하는 것에 의한 NK 세포의 세포 상해활성의 측정방법) 보다도 고감도이다. 또한 방사성 물질을 사용하지 않기 때문에 안전한 NK 세포의 세포 상해활성의 측정방법으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, NK 세포가 유래한 혈액세포 중의 내츄럴 킬러활성의 정도를 알 수 있어, 실험 대상자 개인의 건강상태의 하나의 지표로 할 수 있다. 또한, 종양치료 등의 목적으로 NK 활성을 유효하게 이용하는 것을 목적으로 한 수혈이 가능해진다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기의 실시예에 한정되지는 않는다.
실시예 1: GFP 유전자를 도입한 HFWT 세포의 낭주 GHINK-1의 작성
(A) 방법
(1) GFP 유전자의 HFWT 세포로의 도입법
소태아혈청을 포함하지 않는 100 ㎕의 HamF12 배지에 3 ㎕의 트랜스펙션 시약(Fugene 5, 베링거 만하임사제)을 첨가하여 실온에서 5분간 정치(靜置)하였다. 더욱이 GFP 유전자를 포함하는 2 ㎍의 플라스미드 벡터(pEGFP. N1, Clontech사제)를 첨가하여 실온에서 15분간 정치하였다. 이것을 미리 하룻밤 배양한 HFWT 세포(2 ×105개/35 mm 플라스틱 접시)에 첨가하였다.
(2) GFP 유전자 도입 HFWT 세포의 클로닝
상기 (1)의 조작 후, 2일 후에 500 ㎍/ml의 항생물질 G418을 첨가하여, 이 항생물질에 대한 내성 유전자를 갖는 플라스미드 벡터를 포함하지 않은 세포를 사멸시켰다. 살아 남은 세포군은 대부분이 GFP를 발현하고 있었던 것을 형광현미경을 사용하여 관찰할 수 있었다. 더욱이, 약간 혼입되어 있는 GFP를 발현하지 않는 세포를 배제하기 위해, 상기 세포군을 트립신처리에 의해 단개세포로 하여 배지에 현탁한 후에, 단계적으로 희석하여 96웰 플레이트의 1웰당 평균 1개가 되도록 세포를 파종하였다. 1주일 배양 후, 형광현미경 하에서 1웰 중의 증식된 모든 세포가 GFP를 발현하고 있는 웰을 선별하여, 거기에서 적절히 계대배양을 거듭하여 배양 스케일을 증가시켰다. 그 후, 형광현미경 및 플로우 사이토미터(flow cytometer)로 증식된 모든 세포가 형광을 갖는 것을 확인하였다. 이상의 조작으로 10주의 GFP 유전자산물을 발현하고 있는 HFWT 세포의 낭주를 얻을 수 있었다. 이들을 GHINK-1~GHINK-10이라 명명하였다.
(3) NK 세포의 유도 배양
인간 NK 세포 및/또는 인간 NK 세포 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있는 PBMC로부터의 NK 세포 유도 배양법은, 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법에 따랐다. 약술하면, 미리 하룻밤 배양해 둔 10주의 GHINK 시리즈 세포(각각 웰당 1 ×105개)를 X선 처리하여, 이것에 신체 건강한 정상인 또는 제대혈 유래의 PBMC를 1웰당 1 ×106개 가하고, NK 유도 배양용 배지에 200 U/ml의 인터류킨 2(IL-2)를 첨가하여, 탄산가스 인큐베이터 속 37℃에서 배양하였다.
(4) 플로우 사이토메트리(Flow cytometry)
상기 (3)에 있어서 배양한 림프구는 배양 6 내지 10일째에, T 세포의 표면 마커인 CD3 및 NK 세포의 표면 마커인 CD56에 특이적으로 결합하는 형광 표지한 단일클론항체를 사용하여 형광염색하였다. 염색 후, 당업자에게는 주지의 플로우 사이토메트리법에 의해, NK 세포 즉 CD56 양성이며 또한 CD3 음성인 세포의 비율을측정하였다.
(5) GHINK 시리즈 세포의 계수와 상대 형광강도의 측정
GFP 유전자를 도입함으로써 GHINK 시리즈 세포의 증식성의 손실 여부를 조사하기 위해, 96웰 플레이트에 1 ×104개의 GHINK 시리즈 세포 또는 친주 HFWT 세포(patent HFWT cell)를 파종하였다. 배양 2, 6 및 9일째에 트립신처리에 의해 세포를 분산하고, 타타이식 혈구계수판(Tatai hemocytometer)을 사용하여 세포수를 계측하여 1 ml당 세포수를 구하였다. 또한, 계수 전에 각 웰의 형광강도를 96웰 플레이트용 형광광도계(형광 플레이트 리더)로 측정하여, 각 웰의 세포수로 나눈 값을 편의상 세포 1개당 상대 형광강도로 하였다.
(B) 결과
상기 방법으로 얻어진 10주의 GHINK 시리즈 세포를 NK 증식 자극용 세포로서 사용한 경우, 제대혈 유래의 PBMC로부터 유도 배양된 NK 세포(CD56 양성이며 또한 CD3 음성인 세포)의 비율(%)과 1웰당 총 세포수를 표 1에 나타냈다.
본 실시예의 결과, GHINK-1 세포를 표적세포로 한 경우는 PBMC로부터 유도 증식한 NK 세포의 비율이 배양 6일 후에 74.6%에 달하고, 1웰당 총 세포수도 친주 HFWT 세포 보다는 증식이 느리지만 23.8 ×105개로 낭주 중에서는 최대로 증가하고 있으며, 또한 배양 10일 후에는 NK 세포의 비율이 최고인 92.0%에 달한다고 하는 우수한 NK 세포 증식 자극효과를 나타냈다. 또한, 이 때, NK 세포의 증식에 따라 잔존하는 GHINK-1 세포가 림프구 수의 증가와 함께 소실되는 것을 형광현미경 하에서 확인할 수 있었다. 이것은 NK 세포 유도시에 증식 자극용 종양세포주가 잔존하고 있는지의 여부를, 형광관찰에 의해 용이하게 검출할 수 있는 것을 나타내고 있다.
일반적으로, 외래 유전자를 도입한 세포는 증식성이 저하되는 경우가 있지만, 본 실시예에서는 GHINK-5 세포를 제외하고, 낭주 사이에 커다란 증식능력의 저하는 인정되지 않았다. 또한, 배양개시 직후의 세포수가 1 ×105개/ml가 되도록 조제하여 각 웰에 균일하게 1 ml의 세포현탁액을 파종했지만, 배양 2일째의 세포수는 GHINK-1, GHINK-6, GHINK-9 이외의 낭주에 있어서는 1 ×105개/ml 이하로 오히려 감소하였다. 친주인 HFWT 세포의 접착성이 약한 것과 함께 생각하면, GFP 도입세포주의 클로닝에서 GHINK-1, GHINK-6, GHINK-9 세포주는 접착성이 비교적 높다. 이 때문에, PBMC로부터 증식되는 NK 세포와는 분리하기 쉽다는 특징이 있었다. 더욱이, 세포 1개당 상대 형광강도를 세포주끼리 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2에 명백한 바와 같이 GHINK-1 세포주가 세포 1개당 상대 형광강도가 가장 높아, 다른 GHINK 시리즈 세포주에 비해 약 2~5배의 상대 형광강도를 나타냈다. 1세포당 형광강도가 높으면, 검출감도도 올라가기 때문에, 잔존하고 있는 증식 자극용 세포의 검출 시에, 유리한 것은 명백하다.
실시예 2: NK 세포의 세포 상해활성 측정에 있어서의 표적세포의 CV 염색법과 형광측정법의 비교
일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법에 있어서, 본 발명자 등은 NK 세포의 표적세포 상해활성의 측정시에 크리스탈 바이올렛 염색법(이하, CV 염색법)을 사용하여, 죽여지지 않고 살아남은 표적세포를 정량해 왔다. 상기의 실시예 1에서 얻어진 10주의 GHINK 시리즈 세포주 중, GHINK-1 세포주가 NK 증식 자극용 세포로서 가장 유용한 세포주인 것이 명백해졌다. 따라서, GHINK-1 세포 자신이 발하는 형광을 이용한 NK 세포 상해활성의 측정을 행하여 CV 염색법과 비교 검토하였다.
(A) 방법
(1) 세포 상해활성의 측정
HFWT 세포를 증식 자극용 세포로서 사용하여 PBMC로부터 유도 배양된 림프구군의 상해활성 측정방법은, 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법에 따랐다. 약술하면, 96웰 플레이트의 각 웰에 1 ×104개의 GHINK-1 세포 또는 HFWT 세포를 파종하여 하룻밤 배양하였다. 여기에, 미리 PBMC로부터 유도 배양한 NK 세포를 포함하는 림프구군을 웰당 0, 1, 2, 4, 8 ×104개가 되도록 첨가하였다. 이 때 주효세포(effector cell)(림프구군)와 표적세포(GHINK-1 세포 또는 HFWT 세포)와의 비를 E/T비로서 나타냈다. 즉 E/T비는 0, 1, 2, 4, 8로 되었다. 4시간 배양 후(이하, 「4시간 어세이」라고 한다)에, 각 웰을 칼슘 ·마그네슘 불함유 달벡코 인산완충 생리식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, 이하, PBS(-)로약칭한다)로 한번 세척하고, 죽여지지 않아 배양면에 부착 잔존하고 있는 표적세포를 CV 염색법에 의해 염색하여 세포 상해활성을 구하였다.
GHINK-1 세포 만을 표적세포로서 사용한 세포 상해성 시험에서는, 4시간 어세이 후, 배양상청을 제거하여 PBS(-)로 한 번 세척한 후, 죽여지지 않아 배양면에 부착 잔존하고 있는 표적세포의 형광강도를 측정하였다. 즉, 이들 표적세포를 일정량의 5% 나트륨 도데실 설페이트를 PBS(-)에 용해한 액으로 균일하게 용해한 후, 형광 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광강도를 측정하여 세포 상해활성을 구하였다. 또한, 4시간 어세이의 경우에 있어서는, 이 어세이하는 동안의 표적세포 자체의 증식은 무시할 수 있기 때문에, 림프구군을 첨가하지 않은 대조 표적세포가 4시간 배양 후에 나타내는 값을 100%로 정의하여 계산에 사용하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.
CV 염색법에 의해 정량한 경우, 4시간 어세이에서는 친주 HFWT 세포에 대한 NK 세포를 포함하는 림프구군의 세포상해 활성값이 50%를 나타내는 E/T비가 약 0.5인데 대해, GHINK-1 세포에 대해서는 약 1로, GHINK-1 세포는 NK 세포에 대해 감수성이 약간 낮다. 그러나, 이 정도의 감수성의 차이라면 실제상의 세포 상해활성 측정에 문제는 없다고 생각된다. 더욱이, GHINK-1 세포를 사용하여 형광강도와 CV 염색성의 두가지 측정법으로 NK 세포의 세포 상해활성을 측정하여 GFP의 형광강도와 CV 염색법의 정량성능을 비교하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
형광강도 측정법과 CV 염색법 사이에서는 4시간 어세이에서, 어떤 E/T비에서도 거의 차이는 보이지 않아, 정량성능에 있어서 높은 데이터 호환성이 있어, GFP의 형광강도를 측정함으로써 NK 세포의 세포 상해활성을 구하는 것이 가능한 것이 명백해졌다. 또한, 종래 본 발명자 등이 행하여 온 CV 염색법에서는 표적세포 뿐 아니라, 배양면에 약간 부착되어 있는 NK 세포도 비선택적으로 염색해 버리기 때문에, 잔존 표적세포의 흡광값으로부터 림프구군 만인 대조의 흡광값을 뺄 필요가 있었다. 이 방법에서는 세포 상해활성이 0% 이하가 된다고 하는 실험오차를 낳고 있었다. 한편, 본 발명의 방법에서는 GFP의 형광강도에 의한 세포 상해활성의 측정을 행함으로써 표적세포에만 형광 단백이 발현하고 있는 것에 대해, 림프구에는 전혀 형광물질이 존재하지 않기 때문에 표적세포 만을 특이적으로 측정할 수 있어, 종래의 CV 염색법과 비교하여 정밀도가 높다.
실시예 3: GHINK-1 세포를 표적세포로 사용한 유리 형광측정법에 의한 NK 세포의 세포 상해활성의 측정
상기 실시예 2의 경우는, NK 세포에 죽여지지 않고 살아 남은 표적세포를 정량하였다. 그 때문에, E/T비가 낮은 경우는 표적세포 전체의 약간의 비율 밖에 죽여지지 않기 때문에 잔존 표적세포의 비율이 압도적으로 많아져, 정량 오차가 생기기 쉽다. 따라서, 죽여진 표적세포로부터 유리되어 오는 GFP의 형광을 측정하는 방법을 개발하였다.
(A) 방법
(1) 세포 상해활성의 측정
HFWT 세포를 증식 자극용 세포로서 사용하여 PBMC로부터 유도 배양된 림프구군의 상해활성 측정방법은 일본 특허출원 제(평)11-336079호 명세서에 기재된 방법에 따랐다. 약술하면, 96웰 플레이트의 각 웰에 5 ×104개의 GHINK-1 세포를 파종하여 하룻밤 배양하였다. 여기에서 배양배지를 페놀레드를 포함하지 않고 10% 소태아혈청을 포함하는 MEM 배지 200 ㎕로 교환하였다. 여기에, 미리 PBMC로부터 유도 배양한 NK 세포를 포함하는 림프구군을 웰당 0, 1, 2, 4, 8 ×104개가 되도록 첨가하였다. 이 때 주효세포(림프구군)와 표적세포(GHINK-1 세포)와의 비를 E/T비로서 나타냈다. 즉 E/T비는 0, 1, 2, 4, 8로 되었다. 4시간 배양 후에, 각 웰로부터 100 ㎕의 배양상청을 취하여 다른 마이크로플레이트의 웰에 옮겼다. 형광 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광강도를 측정하여, 세포 상해활성을 구하였다. 세포 상해활성은 형광 플레이트 리더의 형광강도로 나타냈다. 결과를 표 3에 나타낸다.
형광강도차를 보면 E/T비가 2까지는 거의 직선적으로 수치가 증가하고 있어, E/T비가 1로 낮은 경우에도 E/T비가 0인 경우 보다도 67%나 높은 4자리 수치를 낼 수 있다. 이 결과로부터, 더욱 낮은 E/T비에서도 충분히 높은 감도로 NK 세포의 세포 상해활성이 정량 가능한 것이 판명되었다.
산업상이용가능성
본 발명의 증식 자극용 세포를 사용하여 인간 NK 세포를 증식 배양함으로써, 배양하여 회수한 NK 세포 중에 생존하여 혼재하는 증식 자극용 세포를 용이하게 검출할 수 있고, 또한 증식 자극용 세포와 NK 세포와의 분리도 용이하기 때문에, 실질적으로 증식 자극용 세포를 포함하지 않는 인간 NK 세포를 효율적으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 악성 종양환자의 PBMC를 재료로 하여 NK 세포를 증식시킨 경우는, 생존해 있는 증식 자극용 세포를 실질적으로 포함하지 않는 환자 본인의 배양 NK 세포를 제조하여, 악성 종양의 치료를 위한 의약으로서 사용하는 것이 가능해진다.
Claims (11)
- 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재하에서 증식 배양하기 위해 사용하는 앵커리지 의존성 증식 자극용 세포로서, 검출수단이 도입된 것을 특징으로 하는 세포.
- 제1항에 있어서, 인간 내츄럴 킬러 세포 및/또는 인간 내츄럴 킬러 세포 전구세포에 대한 증식 자극작용을 가지고 있고, 또한 증식 배양된 인간 내츄럴 킬러 세포에 대해 고감수성인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 빌름스종양 세포주 HFWT에 검출수단을 도입한 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검출수단이 유전자 재조합 수단에 의해 도입된 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 해파리 유래의 그린 형광 단백을 생산하는 유전자를 도입한 세포.
- 제1항에 있어서, 세포주 GHINK-1(FERM BP-7668)인 세포.
- 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식 자극용 세포의 존재하에서 증식 배양하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포를 증식 자극용 세포로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 인간 말초혈로부터 분리한 인간 말초혈 단핵세포로부터 인간 내츄럴 킬러 세포를 증식시키는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 검출수단을 이용하여 배양물로부터 생존해 있는 상기 증식 자극용 세포를 제거하는 공정을 더욱 포함하는 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 인간 내츄럴 킬러 세포.
- 인간 내츄럴 킬러 세포의 세포 상해활성 측정방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 증식 자극용 세포를 표적세포로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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