KR20030029315A - 신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 균주및 리파제 대량생산방법 - Google Patents

신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 균주및 리파제 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 칼슘 비의존성 신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 균주 및 신규 리파제 대량생산방법에 관한 것이다. 상기 신규 리파제는 40℃까지 열안정성을 보이며, 35℃에서는 최적활성을 보였다. 또한, 칼슘 농도에 영향을 받지 않았으며, pH 8.5에서 높은 활성을 보였다.
상기와 같은 특징을 지닌 리파제는 다양한 각종 시료내의 지방함량을 측정하는 데에 이용할 수 있으며, 세제 및 표백제에 응용하여 사용될 수 있다. 또한, 바실러스는 무독성 균주이기 때문에 식품산업으로의 이용도 가능할 것이다.

Description

신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 균주 및 리파제 대량생산방법{NOVEL ALKALINE LIPASE, STRAIN OF BACILLUS PRODUCING THE SAME, METHOD OF PRODUCING THE LIPASE}
본 발명은 칼슘 비의존성 신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 균주 및 신규 리파제 대량생산방법에 관한 것이다.
리파제(lipase)는 트리글리세리드(triglyceride)를 가수분해하여 디글리세리드 (diglyceride), 모노글리세리드(monoglyceride), 글리세롤(glycerol), 그리고 유리 지방산 (free fatty acid)을 만드는 효소이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 리파제를 생산하는 것으로 알려져 있으며, 리파제의 생화학적 특성에 대한 연구와 리파제 유전자에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
또한, 리파제는 생체내에 존재하여 지방의 대사에 관여할 뿐만 아니라, 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있기 때문에 유리 지방산의 생산, 지방의 트랜스에스테르화, 유용한 에스테르 및 펩타이드의 합성을 촉매하는 등 산업적으로 매우 유용하게 사용되는 중요한 효소이다.
상기와 같이 다양한 산업적 이용가치가 있는 리파제를 고효율로 대량생산하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히, 리파제를 생산하는 미생물에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 리파제를 생산하는 균주로는 페니실리움 속(penicilium sp.), 뮤우코 속(mucor sp.), 라이조푸스 속(rhizopus sp.), 슈우도모나스 속(pseudomonas sp.) 및 스트렙토마이세스 속(streptomyces sp.) 등이 있다.
현재 가장 주목받는 리파제의 산업적 이용 분야는 세제 및 표백제로의 이용인데 기존에 알려진 균주들에서 생산된 리파제는 낮은 pH에서 활성을 보이며, 40℃정도까지의 세탁온도에서 효소가 불안정하다는 단점이 있어 그 사용에 제한이 따른다. 이러한 단점을 극복하기 위해 많은 연구가 이루어져, 높은 pH 및 온도 조건에서의 활성 및 안정성을 보이는 리파제가 바실러스 속 균주로부터 얻어진바 있으나(한국특허 출원번호 10-1999-0044830, 한국특허 출원번호 10-1992-0702509 등) 세제, 세정제 및 표백제 성분에 유용한 첨가제로서 40℃까지 높은 역가를 지니며, 넓은 pH 범위, 특히 중성 및 알카리성에서 사용되기는 어려웠다.
한편, 리파아제는 식품산업에서도 유용하게 이용될 수 있다. 예를들면, 식품산업에서 유리 지방산의 생산에 주로 이용되는 우지(beef tallow) 및 야자유(palm oil)는 통상의 효소 반응 온도에서는 고체 형태이기 때문에 효과적인 효소적 가공을 위해서는 고온에서 안정하며, 인체에 해가 없는 비독성 내열성 리파제가 필요하다.
그러나, 현재까지 효과적인 비독성 내열성 리파제에 대한 개발이 매우 미비한 실정이다.
본 발명은 칼슘 비의존성 신규 알칼리성 리파제, 이를 암호화하는 유전자 및 신규 리파제의 대량생산방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기의 신규 리파제를 생산하는 신규 바실러스 푸밀러스 B26을 제공하는데 목적이 있다.
도 1은 바실러스 푸밀러스 B26 균주로부터 분리한 리파제의 SDS-PAGE 전기영동 사진.
도 2a와 도 2b는 B26 리파제의 물리적 특성을 나타낸 그래프.
도 3a 내지 도 3f는 B26 리파제와 기존의 리파제 효소 특성들을 비교한 그래프.
도 4는 B26 리파제의 세탁 증진효과를 나타낸 그래프.
도 5는 pMB26 벡터의 제작과정을 나타낸 모식도.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 대전시 유성근교 토양에서 채취한 시료로부터 리파제 생산 균주를 분리하였다. 분리된 6개의 균주에서 생산된 리파제의 활성을 측정하여, 가장 활성이 높은 리파제를 생산하는 균주 B26을 선별하였다. 분리된 B26 균주가 생산하는 B26 리파제의 특성을 측정한 결과 신규 리파제임을 확인하고, B26 균주를 동정하여, 신규 바실러스 푸밀러스 균주임을 확인하였다.
상기 신규 리파제 유전자를 클로닝하고, 리파제 유전자가 도입된 pMB26 벡터를 바실러스 서칠러스(Bacillus subtilis) DB104에 형질전환시켜 신규 리파제를 대량 생산한다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
유성근교에서 채취한 토양시료로부터 올리브유를 분해할 수 있는 리파제를 생산하는 균주를 분리하였다. 2차 선별과정을 거쳐 6개의 리파제를 생산하는 균주를 수득하고, 상기의 6개의 균주에서 생산되는 리파제의 활성을 측정하였다. 이 중 가장 높은 활성을 보이는 B26 균주가 생산하는 리파제를 CM-Sepharose 컬럼 또는 Superose 12컬럼을 사용하여 분리·정제한 다음 특성을 측정하였다.
B26 균주가 생산하는 리파제는 알칼리성 효소로서 35℃에서 최적 활성을 보였고, 칼슘 농도에 영향을 받지 않으며, 40℃까지 효소활성이 안정하였다. 또한, pH 8 내지 9 사이에서 효소활성이 안정하였고, 최적 pH는 8.5로 나타났다. 즉, 기존의 리파제와 다른 특성, 칼슘 비의존성, 알칼리성, 열안정성을 보이는 신규 리파제임을 확인하였다.
상기의 신규 리파제를 생산하는 분리균주의 16SrRNA 서열을 분석해 본 결과 바실러스 푸밀러스 균과 99.0%의 상동성을 보임을 확인하였다. 이에 분리 균주를 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) B26으로 명명하고, 2001년 9월 27일에 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10081BP를 부여받았다.
상기의 바실러스 푸밀러스 B26 균주가 생산하는 신규 리파제 유전자를 클로닝하기 위하여 바실러스 푸밀러스 B26 염색체를 제한 효소로 절단하여 pUC19 벡터와 연결시켜 대장균 XL1-Blue에 형질전환 시켰다. 상기 형질전환 균주를 배양하여 콜로니를 선별하였고, 상기 선별된 콜로니를 배양한 후 플라스미드를 분리하여 pB26으로 명명하였다.
신규 리파제를 대량생산하기 위하여 바실러스 푸밀러스 B26 염색체 DNA를 제한 효소로 절단하여 대량생산용 pMA5 벡터와 연결시켜 리파제 대량생산을 위한 재조합 벡터 pMB26을 제작하였다. 상기 pMB26 벡터를 바실러스 서칠리스 DB104에 형질전화시켜 배양한 결과, 원균주인 바실러스 푸밀러스 B26 균주가 생산하는 리파제 효소양 보다 20배 가량 증가함을 확인하였다. 신규 리파제를 대량생산하는 형질전환 균주 바실러스 서칠리스 DB104/pMB26을 2001년 9월 27일에 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10082BP로 기탁하였다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 리파제를 생산하는 균주의 분리
리파제를 생산하는 균주를 토양시료로부터 분리하였다.
대전시 유성근교에서 채취한 토양시료 1g을 10㎖의 생리식염수(0.85% NaCl)가 담긴 플라스크에 넣어 현탁시킨 다음, 1% 트리카프릴린 에멀젼이 첨가된 LB 평판배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1.5% agar)에 도말하였다. 상기 도말된 평판배지를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 트리카프릴린을 분해하여 투명환을 형성하는 100개의 균을 1차로 선별하였다.
선별된 균들을 각각 5㎖의 LB배지에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 올리브유(1%, v/v)와 로다민 B(Rhodamine B, 0.001%, w/v)가 포함된 LB 평판배지에 홀을 뚫고, 여기에 상기의 배양액 0.05㎖을 각각 떨어뜨렸다. 상기의LB 평판배지를 37℃에서 2시간 동안 방치한 후, 오렌지색 형광을 형성하는 6개의 균을 2차로 선별하였다.
상기의 선별된 6개의 균들이 생산하는 리파제의 활성을 측정하였다(표 1).
효소 활성은 pH stat법을 사용하였고, 배양 상층액의 리파제 활성을 측정하였다. 올리브유 5㎖과 495㎖의 gum arabic 현탁액(20mM NaCl, 1mM CaCl2, 0.5% gum arabic)을 혼합한 다음, Waring blendor를 이용하여 에멀젼을 만들었다. 상기 올리브유 에멀젼 50㎖을 온도 조절장치가 장착된 반응조에 넣은 후 10mM NaOH을 떨어드려 pH 8.0으로 적정하였다. 상기 적정액에 배양상층액 10 내지 100㎕을 첨가하였고, 35℃에서 가수분해 반응을 진행하면서 첨가되는 NaOH양을 pH 적정(718 STAT Titrino, Metrohm)을 통하여 측정하였다.
상기와 같은 실험을 수행한 결과, 상기 표 1에서 보이듯이 B26 균주가 생산하는 리파제의 활성이 가장 높았다. 이하, B26 균주가 생산하는 리파제만을 대상으로 실험을 수행하였다.
실시예 2 : B26 균주가 생산하는 B26 리파제의 분리·정제 및 특성 측정
실시예 1에서 수득한 B26 균주가 생산하는 B26 리파제를 분리·정제하여 온도 및 pH에 따른 효소 활성, 열안정성, 칼슘 비의존성 등의 특성을 측정하였다.
(1) B26 리파제의 분리·정제
B26 균주가 생산하는 B26 리파제를 다음과 같이 순수 분리하였다. B26 균주를 30℃, 20시간 동안 LB변형배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 1% K2HPO4, 0.04% MgSO4, 4% 글루코스)에서 배양한 다음, 배양액 1ℓ를 취하여 여기에 황산암모늄분말을 20% 포화되게 가한 후, 12,000g, 20분 동안 원심분리를 수행하여 침전물을 제거하였다. 상기 수득한 상등액에 황산암모늄분말을 70% 포화되게 가하고, 12,000g의 원심력으로 20분 동안 원심분리를 통해 침전물을 회수하였다. 상기의 침전물에 인산 완충액(20 mM, pH 7.0)을 가하여 침전물을 용해시킨 다음, 동일한 인산 완충액을 사용하여 투석을 수행하였다. 투석한 다음 상기 용액을 원심분리를 하고, 상등액을 수득하여 CM-Sepharose 컬럼 및 Superose 12 컬럼을 수행하여 리파제를 분리하였다.
CM-Sepharose 컬럼을 이용한 분리과정은 다음과 같다. 인산 완충액(20mM, pH 7.0)으로 평형화된 CM-Sepharose 컬럼에 황산암모늄 침전 후 투석된 조효소액을 가하고, 동일한 인산 완충액으로 컬럼을 충분히 씻어주었다. 염화칼륨의 농도를 0에서 0.5M까지 점차로 증가시키면서 인산 완충액을 컬럼에 가함으로써 흡착된 단백질들을 순차적으로 용출시켰다. B26 리파제는 0.3M 염화칼륨에 의해 용출되었다.
Superose 12 컬럼을 이용한 분리과정은 다음과 같다. CM-Sepharose 컬럼을 통해서 얻은 B26 리파제 용액을 투석을 통해 트리스 완충액(150mM NaCl, 5mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화시켰다. 동일한 완충액으로 평형화된 Superose 12 컬럼에 리파제 용액을 가하고 동일한 완충액을 계속적으로 컬럼에 가하였다. 단백질을 크기에 따라 용출시켰으며, 최종적으로 B26 리파제를 순수 분리하였다.
(2) 리파제의 효소 활성 측정
상기 (1)의 각각의 정제 단계에서 수득한 시료에서의 B26 리파제 효소 활성을 측정하였다(표 2). B26 리파제의 효소 활성은 일정한 pH에서 올리브유가 효소에 의해 가수분해되어 생성되는 지방산의 양을 NaOH로 적정하는 pH stat 방법에 의해 측정하였고, 효소의 1 unit는 분당 1μ㏖의 지방산을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 최종적으로 순수 분리된 B26 리파제의 올리브유에 대한 비활성 (specific activity)은 138units·㎎-1이었다.
상기 표 2에서 단백질 함량은 Bio-Rad사의 단백질 정량kit를 이용하여 측정하였으며, 이때 표준단백질로 bovine serum albumin을 사용하였다(도 1). 도 1에서 레인 1은 크기를 알고 있는 비교용 단백질들이고, 레인 2는 배양액중의 단백질들이며, 레인 3은 황산암모늄 침전물이고, 레인 4는 CM-Sepharose 컬럼 용출단백질이며, 레인 5는 Superose 12 컬럼 용출단백질을 나타낸 것이다.
Superose 12 컬럼을 통해 최종적으로 분리된 리파제의 활성이 가장 높았으며, 이하 B26 리파제 특성 측정에서는 Superose 12 컬럼을 통해 분리된 B26 리파제를 가지고 수행하였다.
(3) B26 리파제의 온도 및 pH에 따른 효소 활성
상기에서 순수 분리된 B26 리파제의 온도 및 pH 변화에 따른 효소 활성을 조사하였다.
B26 리파제의 온도 및 pH에 대한 영향을 도 2에 표시하였다. 효소의 활성은 (1)에서와 동일한 pH 적정 방법을 사용하여 측정하였다. 도 2a는 온도에 따른 효소의 활성을 나타낸 것으로 35℃에서 가장 높은 활성을 보였으며, 도 2b는 pH에 따른 효소의 활성을 나타낸 것으로 pH 8.5에서 가장 높은 활성을 보였다. 분리된 B26 리파제가 알카리성을 띠고 있음을 확인하였다.
(4) B26 리파제와 기존의 리파제의 특성 비교
기존의 리파제와 B26 리파제의 특성을 비교 실험하였다. 이때 기존의 리파제는 열안정성을 비롯한 효소의 반응 특성이 잘 연구된 스테필로코커스 헤모리티러스 리파제를 사용하였으며 동일한 단백질 농도를 사용하여 실험하였다. B26 리파제의 열안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 30분간 방치한 후 활성을 측정하였고, 활성 측정 방법은 pH stat법을 사용하였다. 상기의 실험결과는 도 3에 정리하였다.
도 3a에 보이듯이 B26 리파제가 40℃까지 열에 대한 안정성을 보인 반면 기존의 리파제는 30℃ 이상에서는 활성이 떨어짐을 확인하였다(도 3b). 상기 도 3b에서 ○는 5mM EDTA를 첨가한 경우이고, ●는 10mM 칼슘을 첨가한 경우를 타나낸 것이다.
또한, 온도에 따른 B26 리파제와 기존 리파제의 효소활성은 B26 리파제는 40℃까지 지속적으로 활성이 증가하는데 비해 기존의 리파제는 온도가 증가할수록 점점 활성이 떨어짐을 확인하였다(도 3a, 3b). 즉, B26 리파제가 40℃까지 열에 안정함을 확인하였다.
도 3c, 3d에서 보이듯이 B26 리파제는 칼슘을 첨가한 경우와 EDTA를 첨가한 경우가차이가 없었으나, 기존의 라파제는 칼슘을 첨가한 경우에서 활성이 더 높았다.
도 3e, 3f에 칼슘의 농도에 따른 B26 리파제 및 기존의 리파제의 활성을 비교하였다. 기존의 리파제는 칼슘의 농도에 영향을 많이 받는 것에 비해 B26 리파제는 칼슘의 농도에 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다.
지금까지 보고된 모든 리파제는 칼슘농도에 따라 효소활성이 크게 변화하여 다양한 시료에서 지방함량을 측정하기 어려웠는데, 상기의 B26 균주를 사용하면 이러한 문제점을 해결 할 수 있을 것으로 예상된다.
(5) B26 리파제의 세탁 증진 효과
세탁효과를 증진시키기 위해 보통 세제에 칼슘 킬레이터를 첨가하는데, 이것에 의해 기존 리파제의 활성이 감소하는 단점이 있었다. 그러나, B26 리파제는 칼슘 킬레이터를 첨가하여도 리파제의 활성이 전혀 감소하지 않는 특성을 보였다.
실제로 B26 리파제가 세탁 증진 효과를 지니는지 실험하였다. 도 4에서 ○,●,■은 각각 리파제 무첨가, B26 리파제 첨가, 기존 리파제 첨가를 나타낸 것이다.
면직을 5×10cm 크기로 오린 후, 클로로포름을 4시간 처리하여 탈지방시켰다. 탈지된 면직포에 올리브유 1㎖ 떨어뜨린 다음, 100㎖의 세탁용액(0.5% Triton X-100, B26 리파제 50unit, 50mM Tris-HCl완충액, pH 8.5, 염화칼슘 일정량)에서 35℃에서 30분간 처리하였다. 상기의 과정을 거쳐 세탁 처리된 면직포를 100㎖의 증류수로 두 차례 씻어 주고, 건조시켰다. 면직포에 남아 있는 올리브유를 30㎖의 에테르를 사용하여 6시간 추출하고 에테르를 증발시킨 후, 올리브유의 무게를 측정하였다. 이때, 스테필로코커스 헤모리티커스 리파제을 이용하여 동일한 방법으로 세탁 실험을 수행하여 B26 리파제와 세탁증진효과를 비교하였다(도 4).
(6) PMSF와 EDTA에 의한 신규 리파제의 활성 변화
신규 리파제의 단백질 가수분해 효소 저해제로 사용되는 페닐메틸썰포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)와 에틸렌디아민테트라아세틱 에시드(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)에 대한 영향을 살펴본 결과 PMSF에 의해 저해를 받았고, EDTA에 의해서는 저해를 받지 않았다.
기존의 효소는 활성부위가 세 개의 아미노산(세린-히스티딘-아스파르트산)으로 구성되어 있기 때문에 PMSF 처리에 의해 효소활성이 저해받으며, 한 개의 칼슘이 효소 활성부위 근처에 결합하여 효소활성을 나타내도록 하기 때문에 EDTA 처리에 의해서도 효소활성이 저해받는 것으로 알려져 있다. 그러나 본 발명에 의한 B26 리파제의 경우, 칼슘이 효소단백질에 결합하지 못하기 때문에 PMSF에 의해서는 저해를 받지만, EDTA에 의해서는 저해를 받지 않음을 알 수 있다.
ⓖ B26 리파제를 이용한 트리글리세리드, 천연지방 및 천연유의 분해
B26 리파제를 이용하여 다양한 종류의 트리글리세롤, 천연지방 및 천연유를 분해하는 가수분해 실험을 수행하였다. 가수분해 활성 측정은 실시예 1에서 설명한 pH stat법을 사용하였으며, 올리브유 대신에 각종 트리글리세롤 및 천연지방을 사용하여 에멀젼을 만든 후에 효소활성을 측정하였다.
상기의 실시예에서 수행한 실험결과 들에서 B26 리파제가 기존의 리파제와 확연하게 다른 특성을 보이는 것으로 측정되었고, 이에 신규 리파제 임을 확인하였다.
실시예 3: 신규 리파제를 생산하는 B26 균주의 동정
실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 리파제를 생산하는 B26 균주를 동정하였다.
B26 균주의 16S rRNA 서열을 분석해 본 결과 바실러스 푸밀러스균과 가장 높은 상동성(99.7%)을 보였다. 이 외에 바실러스속의 서칠러스(98.9%), 아트로페우스(98.9%), 모자벤시스(98.5%), 리체니포르미스(98.2%)와 비교적 높은 상동성을 나타내었다.
표 2에서 정리한 형태학적, 생화학적, 배양학적 및 분자생물학적 특성과 16S rRNA 서열분석결과를 바탕으로 본 발명의 분리균주를 신규 바실러스 푸밀러스로 동정하였다. 상기 균주를 바실러스 푸밀러스 B26으로 명명하고, 2001년 9월 27일에 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10081BP로 기탁하였다.
상기 바실러스 푸밀러스 B26 균주의 특성을 표 4에 기재하였다.
실시예 4: 신규 리파제 유전자의 클로닝 및 염기 서열 분석
실시예 1에서 수득한 바실러스 푸밀러스 B26이 생산하는 신규 리파제의 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다.
(1) 신규 리파제 유전자의 클로닝
바실러스 푸밀러스 B26의 염색체 DNA를EcoRI 제한 효소로 절단한 다음, 포스파타제(calf intestinal phosphatase)를 처리한 pUC19 벡터에 삽입시킨 후 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켰다. 상기 형질전환 균주를 엠피실린(ampicillin)이 첨가된 트리캐프릴린(tricaprylin, TAN) 플레이트(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 1% TCN, 1 mM CaCl2, 0.5% gum arabic, 1.5% agar)에 도말하고, 37℃에서 24시간 배양하여 TCN을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과 3.6 kb 크기의 insert DNA를 포함한 6.3 kb 크기의 플라스미드 임을 확인하고, pB26으로 명명하였다.
pB26을 상기와 동일한 방법으로 대장균 XL1-Blue에 재형질전환시킨 결과 생성된 콜로니의 100%가 리파제 활성을 나타냄을 확인하였다.
(2) 신규 리파제 유전자의 염기 서열 분석
전기 (1)에서 수득된 pB26의 염기 서열을 분석하였다.
염기 서열은 Big Dye DNA Sequencing kit와 ABI PRISM 염기 서열 분석기(Perkin-Elmer)를 이용하여 분석하였다(서열 1). 상기 자동 염기 서열 분석기를 통하여 분석된 아미노산을 DNASTAR 아미노산 서열 분석 프로그램에 입력하여 648개의 염기(215개 아미노산)로 이루어진 리파제의 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다. ORF는 34개의 아미노산으로 이루어진 신호서열과 181개의 아미노산으로 이루어진 활성리파제(서열 2)로 구성되어 있다. 신호서열을 제거한 활성리파제의 분자량은 19,225로 계산되었다.
상기의 과정을 거쳐 분석된 신규 리파제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 바실러스 푸밀리스 DSM5776 및 바실러스 서칠리스(Bacillus subtilis)가 생산하는 리파제와 각각 90.7%와 70.9%의 매우 낮은 상동성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 신규 리파제의 대량생산방법
신규 리파제를 대량으로 생산하기 위해 신규 리파제 유전자가 도입된 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 재조합 벡터를 바시러스 서브칠리스 DB104균에 형질전환시켜 신규 리파제를 대량 수득하였다.
(1) 재조합 벡터의 제작
신규 리파제 유전자를 증폭시키기 위하여, 신규 리파제 유전자가 포함되어 있는 바실러스 푸밀러스 B26 염색체 DNA를 주형 DNA로 하고, 합성된 2개의 프라이머(서열 3, 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
〈PCR의 반응액〉
프라이머 1과 2(농도 100μM) : 각 1μl
dNTP mixture(각 dATP, dTTP, dCTP, dGTP;10mM, 각 2.5mM) : 4μl
10×PCR 완충용액 : 5 μl
Ex TaqDNA 폴리머라제(Takara제품 ) : 0.2μl
주형으로 사용된 DNA : 2μl(200ng)
마지막 부피 : 50μl
PCR의 조건은 Hot 스타트 법으로 하였으며, 95℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, 95℃에서 1분 동안 변성, 41℃에서 1분간 프라이머 어닐링, 72℃에서 1분 동안 중합반응을 하는 것을 1 사이클로 하여 25 사이클을 수행한 다음, 마지막 72℃에서 7분 동안 마무리를 하였다.
상기와 같은 PCR 과정을 거쳐 합성된 DNA 양끝을 제한효소NdeI과BamHI으로 절단한 다음, 대량 생산용 벡터 pMA5와 연결시켜 대량 생산용 재조합 벡터 pMB26을 개발하였다(도 5 참조). 상기 재조합 벡터 pMB26에는 강력한HpaII프로모터 부위가 내재되어 있어서 바실러스 서칠리스 DB104를 숙주로 사용하는 경우 원하는 리파제의 대량 생산이 가능하다.
(2) 형질전환 균주의 제작
신규 리파제를 대량생산하는 형질전환 균주를 다음과 같이 제작하였다.
10% 슈크로스와 0.5mM MgCl2혼합액에 용해되어 있는 바실러스 서칠러스 DB104 competent cell 50㎕와, pMB26의 DNA 0.1㎍을 전기천공 큐벳(electro- phoration cuvette)에 넣었다. 상기의 전기천공 큐벳에 0.7 kV의 전압을 가한 다음, 형성된 형질전환 균주를 카나마이신(50 ㎍·㎕-1)이 함유된 LB평판배지에 도말하고 37℃에서 배양하였다.
상기의 과정을 거쳐 제작된 형질전환 균주, 바실러스 서칠리스 DB104/pMB26균주를 카나마이신(kanamycin, 50㎍·㎕-1)이 함유된 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 1% K2HPO4, 0.04% MgSO4, 4% 포도당)에서 37℃, 20시간 동안 배양하여 배양액 1ℓ당 8000 unit의 효소를 얻었다. 효소의 1 unit는 분당 1μ㏖의 지방산을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 상기의 효소양은 원균주인 바실러스 푸밀러스 B26균이 생산하는 효소양의 20배에 해당되는 양으로 바실러스 서칠리스 DB104/pMB26 균주를 이용하여 신규 리파제의 대량생산이 가능함을 확인하였다.
신규 리파제를 대량생산하는 형질전환 균주 바실러스 서칠리스 DB104/pMB26을 2001년 9월 27일에 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10082BP로 기탁하였다.
본 발명은 칼슘 비의존성 신규 알카리성 리파제, 이를 생산하는 신규 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 균주 및 신규 리파제 대량생산방법에 관한 것이다. 상기 신규 리파제는 40℃까지 열안정성을 보이며, 35℃에서는 최적활성을 보였다. 또한, 칼슘 농도에 영향을 받지 않았으며, pH 8.5에서 높은 활성을 보였다.
상기와 같은 특징을 지닌 리파제는 다양한 각종 시료내의 지방함량을 측정하는 데에 이용할 수 있으며, 세제 및 표백제에 응용하여 사용될 수 있다. 또한, 바실러스는 무독성 균주이기 때문에 식품산업으로의 이용도 가능할 것이다.

Claims (9)

  1. 30 내지 40℃, pH 8 내지 9 사이에서 최적 효소활성을 보이며, 칼슘 농도에 비의존성인 리파제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 리파제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열 1에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 리파제.
  4. 제 2 항에 의한 리파제를 생산하는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) B26 균주(KTCC 10081BP).
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 의한 리파제를 코딩하는 유전자.
  6. 제 5 항에 의한 유전자를 포함하는 벡터
  7. 제 6 항에 있어서,
    도 5에 도시된 개열지도를 가지는 재조합 벡터 pMB26.
  8. 제 6 항에 의한 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    재조합 벡터 pMB26에 의해 형질전환된 형질전환 균주 바실러스 서칠리스 DB101/pMB26 (KTCC 10082BP).
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