KR20030027570A

KR20030027570A - 프라바스타틴의 전구체 및 그 유도체의 생산 방법

Info

Publication number: KR20030027570A
Application number: KR1020010060922A
Authority: KR
Inventors: 최남희; 탁건태; 이기우; 김남현; 전종창; 공윤정; 이경미
Original assignee: 코바이오텍 (주)
Priority date: 2001-09-29
Filing date: 2001-09-29
Publication date: 2003-04-07
Also published as: KR100450562B1

Abstract

본 발명은 프라바스타틴 전구체(Pravastatin precursor)의 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 공지의 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)을 돌연변이 처리하여 프라바스타틴 전구체 생산능이 우수한 균주를 얻고, 이를 호기적 배양하여 고지혈증 치료제로 유용한 프로바스타틴 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

프라바스타틴의 전구체 및 그 유도체의 생산 방법{Process for preparing pravastatin precursor and its derivatives}

과지방혈증, 특히 고지혈증은 심근경색증 또는 동맥경화증 등과 같은 심장병의 주원인중의 하나로 알려져 있으므로, 콜레스테롤 농도를 저하시킬 수 있는 화합물을 찾고자 노력하였고, 그 결과, 페니실리움속(penicillium sp.)의 미생물로부터 콜레스테롤 농도를 저하시킬 수 있는 물질인 ML-236B를 분리하였다(미국 특허 제 3,983,140호 및 영국특허 제 1,453,425호).

이 ML-236B는 프라바스타틴 전구체로서 콤팍틴(compactin)으로 불리우는데 토양미생물을 이용하거나 화학적 변환작용을 통하여 생산되는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 콤팍틴은 페니실리움 브레비콤팍틴(Penicillium brevicompactin), 페니실마이세스속(Penicilmyses sp.), 트리코데르마 론기브라이아튬(Tricoderma longibraiatum), 트리코데르마 슈도코닝(Tricodedrma pseudokoning), 하이포마이세스 크리소포머스(Hyphomyces chrisopomus) 및 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)를 배양하여 생산할 수 있다는 것이 일본특허공고 평 4-349034호에 개시되어 있고, 글리오클라디움속(Gliocladium sp.) YJ-9515(KCTC 02528BP)를 호기적으로 배양하여 생산할 수 있다는 것이 대한민국 특허 제 186758호에 개시되어 있다.

그러나, 상기한 미생물을 이용한 콤팍틴의 생산 방법은 균주특성상 본 배양시간이 길고, 단위 액량당 생산량이 매우 낮아서 경제성이 낮다.

이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결할 수 있는 방법을 찾기 위하여 연구한 결과,페니실리움 시트리눔ATCC 18199에 돌연변이 처리를 하여 얻어진 균주가 콤팍틴을 고농도로 생산할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 곰팍틴을 고농도로 생산할 수 있는 돌연변이주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 돌연변이주를 이용하여 프라바스타틴 전구체인 콤팍틴과 이의 유도체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 고생산성으로 콤팍틴 및 이의 유도체를 생산하는페니실리움 시트리눔의 돌연변이주인페니실리움 시트리눔KBT 1100(기탁번호 KCCM-10316)를 제공하는 것을 특징으로 한다.

다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 돌연변이주를 호기성 배양하여 콤팍틴 및 이의 유도체를 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 균주는 콤팍틴의 생산성이 약 3,850㎎/ℓ로 높은 돌연변이주로서, 공지의페니실리움 시트리눔ATCC 18199에 돌연변이를 유발하여 제조된다.

즉, 모균주인페니실리움 시트리눔ATCC 18199에 UV를 조사하여 돌연변이 유발한 후, 이를 선별배지(박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈 파우더 10g/ℓ, 질산나트륨 2g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ, 글루코스 30g/ℓ, 글리세롤 70g/ℓ, 콤팍틴 2g, 한천 15g/ℓ)에 도말하고, 배양하여 콤팍틴에 내성을 나타내는 25개의 콜로니들을 우선적으로 선별하고, 다시 이들 액체 배양하여 콤팍틴을 고농도로 생산하는 균주를 선별하였다.

이 균주를페니실리움 시트리눔KBT-1100 균주로 명명하고, 한국종균협회에 2001년 9월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM-10316을 부여받았다

본 발명의페니실리움 시트리눔KBT-1100 균주(KCCM-10316)를 이용하여 콤팍틴을 생산하는 방법은 다음과 같다.

박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈 파우더 20g/ℓ, 질산나트륨 2g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ 및 슈크로스 100g/ℓ의 조성을 갖는 전 배양배지에페니실리움 시트리눔KBT-1100균주(KCCM-10316)를 접종한 후, 이를 150∼200rpm, 25∼28℃인 회전 진탕기에서 1∼2일 동안 배양한 다음, 배양 균주를 박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈 파우더 30g/ℓ, 질산 나트륨 3g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ 및 슈크로스 100g/ℓ의 조성을 갖는본 배양 배지(pH 6.0)에 무균 접종하고, 종배양과 같은 조건에서 3일간 배양하고, 50% 글리세린 용액을 첨가하여 주면서 9일간 더 배양하는 방법으로 콤팍틴을 생산한다.

콤팍틴은 상기한 배양액으로부터 통상의 방법을 이용하여 여과, 정제하므로써 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 콤팍틴에 내성을 갖는 돌연변이 균주의 선발

모균주페니실리움 시트리눔ATCC 18199를 생장 대수기까지 배양하여, 4,000rpm, 15분의 조건으로 원심 분리하여 상등액을 제거한 균체를 얻었다. 이 균체에 0.85% 생리식염수 8㎖를 첨가하여 균체를 현탁시킨 후, 멸균한 글라스 페트리 디쉬에 첨가하고, UV를 조사하여 돌연변이를 유발하였다. 이때, UV는 20초간 조사하였으며, UV 조사 후 광반응을 방지하기 위하여 UV를 조사한 페트리 디쉬를 호일로 감싼 다음, 냉장고에서 두 시간 동안 암반응시켰다.

그런 다음, 페트리 디쉬로부터 시료를 채취한 후, 선별 배지(박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈파우더 10g/ℓ, 질산나트륨 2g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ, 글루코스 30g/ℓ, 글리세롤 70g/ℓ, 콤팍틴 2g, 한천 15g/ℓ)에 백금이로 도말하고, 배양하여 콤팍틴에 내성을 나타내는 25개의 균주들을 우선적으로 선별하였다.

<실시예 2> 고역가 생산 균주 분리

박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈파우더 20g/ℓ, 질산나트륨 2g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ 및 슈크로스 100g/ℓ의 조성을 갖는 전 배양배지(pH 6.0) 50㎖를 250㎖ 베플(Baffle)이 있는 플라스크에 주입하고, 121℃에서 30분간 가압 살균한 후, 여기에 상기 실시예 1에서 분리된 25개의 콤팍틴 내성 균주들을 접종하고, 접종 플라스크를 150~200rpm으로 25~28℃의 회전 진탕기에서 1~2일동안 배양하였다.

그 다음, 박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈파우더 30g/ℓ, 질산나트륨 3g/ℓ, 마그네슘염 1g/ℓ 및 슈크로스 100g/ℓ의 조성을 갖는 본 배양 배지(pH 6.0) 100㎖를 500㎖ 베플 플라스크에 주입하고, 121℃에서 30분간 가압 살균한 것에. 상기 전 배양 배지에서 배양한 각각의 균주들을 5%가 되도록 무균 접종한 후, 종배양과 같은 조건에서 3일간 배양하였다. 그런 다음, 50% 글리세린 용액을 배양액의 20%(v/v)가 되도록 첨가하여 주면서 9일간 더 배양하였다.

각각의 돌연변이 균주의 배양액에 함유되어 있는 콤팍틴 및 유도체의 생산량을 HPLC를 사용하여 정량하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 한편, HPLC 정량은 77% 메탄올, 0.1% 아세트산, 0.1% 트리메틸아민, 22.8% 물의 용매 조건으로 컬럼은 25℃에서 C₁₈(Symetric)을 사용하였으며, 1㎖/min의 유속 및 238nm의 파장에서 분석하였다.

균주	콤팍틴 생산량(㎎/ℓ)	pH	PMV(%)
돌연변이주 1	3850	6.30	36
돌연변이주 2	1280	6.77	34
돌연변이주 3	993	7.14	32
돌연변이주 4	1061	6.22	33
돌연변이주 5	1183	5.98	37
돌연변이주 6	1404	5.64	32
돌연변이주 7	2653	6.50	32
돌연변이주 8	2300	6.10	34
돌연변이주 9	1864	5.84	30
돌연변이주 10	2103	5.90	32
돌연변이주 11	2862	6.30	34
돌연변이주 12	3216	6.87	36
돌연변이주 13	864	6.40	28
돌연변이주 14	2740	6.54	32
돌연변이주 15	1957	5.97	32
돌연변이주 16	3510	6.87	34
돌연변이주 17	2600	6.32	30
돌연변이주 18	3760	6.20	32
돌연변이주 19	3597	6.74	36
돌연변이주 20	2156	6.10	32
돌연변이주 21	3625	6.45	36
돌연변이주 22	3720	6.25	34
돌연변이주 23	2950	6.47	36
돌연변이주 24	2735	6.32	32
돌연변이주 25	3254	6.57	30

그 결과, 콤팍틴에 대한 생산성이 가장 우수한 돌연변이주 1을 선별하여, 이를페니실리움 시트리눔KBT-1100 균주로 명명하고, 한국종균협회에 2001년 9월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM-10316을 부여받았다

<실험예 1> 콤팍틴 생산성 비교

실시예 1과 동일한 방법으로 모균주인페니실리움 시트리눔ATCC 18199의 콤팍틴 생산성을 측정하였다. 그 결과, 모균주의 콤팍틴 생산성은 40㎎/ℓ로 본 발명에 따른 페니실리움 시트리눔 KBT-1100(KCCM-10316)은 모균주보다 콤팍틴에 대한 생산성이 95%이상 향상된 우수한 균주라는 것을 알 수 있다.

<실험예 2> 발효조에서의 콤팍틴 생산량 비교

종균배지(박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈파우더 20g/ℓ, 질산나트륨 2g/ℓ, 마그네슘 설페이트 1g/ℓ, 슈크로스 100g/ℓ) 100㎖을 1000㎖ 플라스크에 넣고, 120℃에서 30분간 살균한 다음, 한천배지에서 배양된페니실리움 시트리눔KBT-1100(KCCM-10316)을 접종하고 25℃, 150rpm에서 회전 진탕 배양하여 종균으로 사용하였다.

그 다음, 본배양 배지(박토 펩톤 10g/ℓ, 소이빈파우더 30g/ℓ, 질산나트륨 3g/ℓ, 마그네슘 설페이트 1g/ℓ, 슈크로스 100g/ℓ)를 7ℓ, 30ℓ 및 500ℓ 발효조에 각각 넣어 살균한 다음, 플라스크에서 배양한 종균을 5%(v/v) 접종하여 25℃, 250rpm에서 9일간 통기 발효시켰다. 한편, 발효도중 당을 단독 또는 다른 영양원을 함유한 당용액을 산을 넣는 용기에 넣고 pH 자동제어장치를 사용하여 이들 당용액이 자동적으로 첨가되면서 pH를 4.5~5.0을 유지케하여 발효시켰다. 발효액 중에 콤팍틴과 그의 유도체의 생산량은 실시예 2와 동일한 방법으로 정량하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

발효조	생산량(㎎/ℓ)
500㎖ 배플 플라스크	3,850
7ℓ	4,900
30ℓ	5,850
500ℓ	5,100

상기 표 2로부터, 본 발명의 균주를 사용하면 발효조에서도 고역가로 콤팍틴을 생산할 수 있으므로, 산업화에 유용한 균주라는 것을 알 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 균주를 사용하여 프라바스타틴 전구체인 콤팍틴을 생산하는 경우 종래 기술에 비하여 생산량이 월등히 증대될 수 있으며, 7ℓ,30ℓ, 500ℓ 발효조에서 역시 고역가로 생산이 가능하므로 곧바로 산업적으로 이용할 수 있는 장점이 있다.

Claims

프라바스타틴 전구체 및 그의 유도체 생산능을 갖는 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum) KBT-1100(KCCM-10316).
제 1항의페니실리움 시트리눔KBT-1100(KCCM-10316) 균주를 배양하여 프라바스타틴 전구체 및 그의 유도체를 생산하는 방법.