KR20030024763A

KR20030024763A - 골다공증 예방 및 치료용 화합물

Info

Publication number: KR20030024763A
Application number: KR1020030013896A
Authority: KR
Inventors: 김종기; 하주영; 이수영; 신재균
Original assignee: 주식회사 바이오비젠
Priority date: 2003-03-06
Filing date: 2003-03-06
Publication date: 2003-03-26

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움과 하기 화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온의 골다공증 예방 및 치료제로서의 용도에 관한 것으로 골다공증의 원인이 되는 파골세포의 기능 뿐만 아니라 파골세포의 형성 즉 분화 과정을 차단함으로써 파골세포의 형성을 막아 골다공증 예방 및 치료에 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

골다공증 예방 및 치료용 화합물 {Chemical compound for prevention and treatment of osteoporosis}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움과 하기 화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온의 골다공증 예방 및 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

골다공증이란 정상적인 뼈에 비하여 "구멍이 많이 난 뼈"를 말하며, 폐경, 노화, 뼈에 해로운 약물의 사용 등의 여러 가지 원인에 의하여 뼈가 많이 손실되고 약해져 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으키는 질환이다. 골다공증에 의한 골절은 주로 폐경 후 증가하기 시작하여, 노년기가 되면 급격하게 증가한다. 65세 이상인 여성 2명 중 1명, 남성의 경우는 5명 중 1명에서 골다공증에 의한 골절이 발생한다고 알려져 있다. 폐경 후 여성의 경우 2명 또는 3명 중 1명에서 골다공증이 발생한다. 골다공증을 치료하지 않고 방치해두면 요통, 허리가 구부러지게 되는 신체의 변형, 신장의 감소, 쇠약, 무기력 등에 시달리게 된다. 골절이 생기면 정상적인 활동을 위하여 보조기구를 사용하거나, 다른 사람의 간호, 보호를 받아야 하는 등 평생 동안 활동에 많은 지장을 받게 되고, 대퇴관절 골절의 경우에는 사망할 수도 있다.

골은 신체의 물리적 지지체로 우리 몸에서 매우 중요한 장기로 여러 가지 기능을 하고 있다. 즉 집의 기둥처럼 몸의 형태를 유지하고, 중요한 장기를 외부의 충격으로부터 보호하며, 칼슘, 인의 저장소로 이러한 물질들이 부족하거나 증가하는 현상을 방지하는 저수지의 역할을 하는 등 몸에서 없어서는 안 되는 기관이다. 따라서 뼈에서도 다른 장기와 마찬가지로 신진대사가 활발하게 일어나고 있다. 우리 몸이 성장할 때에는 뼈가 길어지고 굵어지며, 성장이 중단된 이후에도 오래된 뼈는 없어지고 새로운 뼈가 없어진 곳을 메우는 과정이 끊임없이 일생동안 일어난다.

따라서 골은 골 흡수와 골 형성의 양자가 활발하게 진행되어 대사적인 면에서 극에 이르는 동적 평형 상태를 유지하여야 한다. 이 골 흡수와 골 형성간의 평형 관계가 파괴되어 골 흡수가 골 형성에 상대적으로 상회하게 되면 골밀도 또는 골질량의 감소를 야기하게 되는 것이다.

골의 대사에 있어서 파골세포와 조골세포는 기능에 있어서 매우 밀접한 관계를 유지하고 있다. 즉 조골세포는 골의 형성에 관여하고 있고 파골세포는 골의 파괴에 관여하고 있다. 이 두 세포의 활성이 적절하게 유지가 되어 골의 항상성을 유지하여야하나 상대적으로 파골세포의 활성이 높게되면 골다공증을 야기하게 되는 것이다. 따라서 파골세포의 분화 및 활성을 조절하는 것이 매우 중요하다고 할 수 있다.

현재 골다공증 연구의 흐름은 골성장 및 재구축 (remodeling)의 기전에 관한 것이다. 특히 생성된 골을 파괴하는 파골세포에 대한 연구는 그동안 분자 생물학 및 신호전달기전 연구의 발달과 더불어 급속하게 발달하고 있는 분야이다. 비가역적인 골 손실이 오기 전에 골다공증을 정지시키거나 파괴된 골의 재형성을 촉진하는 방법 및 약제가 개발되어야 한다.

본 발명자들은 계속하여 골다공증에 대한 효과적인 치료제 개발을 목적으로 약 15,000개의 서로 다른 화합물 (chemical library)을 고속 탐색 기법을 이용하여 파골세포 분화 억제 및 골 흡수 억제 효과를 확인하는 작업을 해 왔으며 이들 중에서 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움 와 화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온이각각 파골세포의 기능 및 분화를 억제하여 파골세포의 형성을 억제하는 것을 확인함으로써 달성되었다.

도 1은 분리된 파골세포 전구세포의 단독 배양에 의한 파골세포의 분화과정의 사진이다.

도 2는 단독배양에 의해 생성된 파골세포를 시료무처리구(A)와 화합물 1 처리구(B)의 TRAP 염색한 사진이다.

도 3은 단독배양에 의해 생성된 파골세포를 시료무처리구(A)와 화합물 2 처리구(B)의 TRAP 염색한 사진이다.

도 4는 공존배양으로 생성된 파골세포에 의해서 생성된 시료 무처리구의 피트 사진(A)과 화합물 1 처리구 (B) 및 화합물 2 처리구 (C)의 피트 사진이다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움과 상기 화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온이 파골세포에 대한 분화 및 기능 억제 효과가 매우 강력하므로 임상적으로 유용한 골다공증 예방 및 치료를 위한 약제로 사용 될 수 있다.

이와 같은 본 발명은 다음의 실시 예에 의해 상세히 설명하였다.

[실시 예 1] 파골 세포 전구 세포의 분화 억제 효과

약 15,000개의 서로 다른 화합물들을 고속탐색기법을 이용하여 파골세포의 형성과 분화과정에 미치는 영향을 파골세포 전구세포 단독배양을 통하여 검색하였다.

1. 세포의 준비

가. 파골세포 전구세포의 분리

5-6주령된 수컷 ddY 마우스를 척추 탈구로 희생시킨 후 무균적으로 대퇴골과 경골을 적출하고 연조직을 제거하고 장골의 양끝을 절단한 후 26게이지 주사기를 이용하여 한쪽 끝의 골수강에 0.1% 코라게네이즈, 0.05% 트립신 및 0.5 mM 이디티에이가 포함된 효소용액 1 mL를 주사하여 골수를 꺼낸 후 30분간 교반하여 골수를 모아 5 ng/mL M-CSF와 10% FBS가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)에 24시간 전 배양후 미부착 세포들을 모았고 이 미부착세포들을 20 ng/mL M-CSF와 10% FBS가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)에 48시간 전 배양후 이번에는 부착세포를 모아 파골세포의 전구세포로 이용하였다.

나. 파골세포 전구세포의 배양

파골 세포의 전구세포를 96-well plate에 well 당 20,000-30,000개의 세포가 되도록 분주한 후 실험하고자 하는 화합물을 각각 첨가하여 단독 배양하였다. 단독 배양하는 동안 20 ng/mL의 M-CSF와 50 ng/mL의 TRANCE와 같은 성장 및 분화인자가 포함된 α-MEM 배지에 실험하고자하는 시료를 넣어 5일간 배양하였다. 2-3일간마다 실험하고자 하는 화합물과 분화 인자가 혼합된 새로운 배지로 교환하여 계속 배양하였다.

2. 파골세포 분화 정도의 측정

배양중에 현미경으로 관찰하여 파골세포의 형성을 확인 하였으며 일반적으로 파골세포를 다른 세포와 구분 할 필요가 있을 때 파골세포의 중요한 특징인 TRAP (Tartrate- resistant acid phosphatase 활성을 이용하여 TRAP 조직 화학 검사를 시행하였다. 도 1은 파골세포 전구세포의 단독 배양에 의한 파골세포의 분화과정을 나타낸 것이다.

가. TRAP (Tartrate- resistant acid phosphatase) 염색액의 조제

TRAP 염색액의 조제는 시그마사에서 구입한 Napthtol AS-MS 포스페이트 5 mg 및 색소 (Fast Red Violet LB salt) 25 mg을 N,N-디메틸포름아마이드 (0.5 mL)에 녹였다. 50 mM 타르타르산을 포함한 0.1 N NaHCO3 완충액 50 mL를 첨가 한 후 냉장 보관하여 염색액으로 이용하였다.

나. TRAP (Tartrate- resistant acid phosphatase) 염색법

5일간 배양한 세포로부터 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 10% 포르말린이 포함된 PBS에 세포를 5분간 고정하였다. 에탄올과 아세톤의 혼합액 (1/1)에 1분간 재차 고정한 후 건조하였다. TRAP 염색액을 실온에서 15분간 처리 후 수세 건조하고 현미경하에서 염색 여부를 판단하여 그 결과를 판정하였다.

다. 결과의 판정

현미경하에서 TRAP 양성 반응을 보이며 3개 이상의 핵을 가진 파골세포만을 관찰하여 그 수를 세었으며 각 실험군에 대해 3회 이상 반복 실험하였다. 상기한 방법에 의한 TRAP 염색 사진을 도 2와 3에 도시하였다. 도 2의 A는 화합물 무처리군의 사진이고 B는 화합물 1을 각각 10 uM, 3,3 uM, 그리고 1,1 uM 처리한 사진이다. 도 3의 A는 화합물 무처리군의 사진이고 B는 화합물 2를 각각 10 uM, 3,3 uM, 그리고 1,1 uM 처리한 사진이다. 도에 도시된 바와 같이 화합 1과 2를 각각 처리한 경우에는 파골세포의 분화를 억제하여 활성 파골세포의 생성을 억제하는 것을 관찰 할 수 있었다.

[실시 예2] 공존배양으로 파골세포의 골 흡수능의 측정 (Pit resorption assay)

1. 조골세포의 분리 및 배양

1-2일된 신생 ICR 마우스로부터 전구골과 두정공을 무균적으로 적출하여 PBS용액으로 세척 한 후 혼합 효소 용액 (0.2% 콜라게네이즈, 0.1%디스페이즈)에 연속적으로 6-7회 (10, 10, 10, 20, 20, 20분)처리하고 조골세포의 특성을 지닌 세포들이 많이 존재하는 3-6회군의 세포를 지중적으로 수집하여 배양액 (serum-free α-MEM)으로 세척하였다. 세척된 세포들을 10% FBS가 포함된 α-MEM에서 2-3일 정도 배양 한 후 1차 계대 배양하여 모은 세포들을 실험에 사용하였고 회수한 세포들을 100,000 cells/mL가 되도록 희석하여 -70℃에 보관하였다.

2. 공존배양으로 파골세포의 골 흡수능의 측정

본 실험을 위하여 상기에서 준비한 조골세포와 파골세포의 전구세포를 공존 배양하였다. 10% FBS가 포함된 α-MEM 배지를 사용하여 칼슘-포스페이트가 피막된 96 well plate에 파골세포 전구세포(25,000 cells/well)와 조골세포 (10,000 cells/well)를 분주하여 넣은 후 실험하고자 하는 화합물 시료를 첨가하여 7일간 배양하였다. 배양동안 덱사메타손 (10-6 M)과 비타민 D3(10-9 M)과 같은 분화 인자를 배양 첫날부터 복합 투여하였으며 2-3일마다 상기 시료와 분화 인자가 혼합된 새로운 배지로 교환하였다.

3. 결과의 판정

골 표면에서 성장하고 있는 파골세포는 골 표면에 골 흡수 흔적 (피트.Pit)을 남기는데 이는 파골세포의 가장 중요한 특성으로 이를 측정함으로써 파골 세포의 분화 및 골 흡수 능력이 있는지를 조사 할 수 있다.

가. 생성된 피트의 확인

분화된 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 칼슘-포스페이트가 피막된 plate에서 세포 배양 후 배양액을 제거하였다. 세포 배양 후 붙어 있는 세포를 제거하기 위하여 5% 소듐하이포클로라이드 요액을 넣어 5분간 방치 한 후 증류수로 수차레 세척한 후 건조하였다. 생성된 피트는 광학 현미경하에서 관찰하였다. 그림 4의 A는 화합물 무처리군의 사진이고 B는 화합물 1을 1uM처리 한 사진이다. 그리고 C는 화합물 2를 1uM 처리한 사진이다. 그림에서 보는바와 같이 골 흡수 억제 능력을 보여줌으로써 매우 탁월한 파골 세포 분화 억제 기능을 가지고 있음을 보여주고 있다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움, 화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온은 파골세포의 분화를 억제하는 기능이 우수하여 골다공증 예방 및 치료용 약제 조성물의 유효 성분으로 유효하므로 의학 산업에 매우 유용하다.

Claims

화학식 1로 표시되는 2-하이드록시-2-(4-메톡시-페닐)-1-p-토릴-2,5,6,7,8,9-헥사하이드로-3H-이미다조[1.2-a]아제핀-1-이움이 유효 성분으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약제 조성물.
화학식 2로 표시되는 6-브로모-3-[1-(4-훌루오로-벤조일)-5-후란-2-일-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일]-4-페닐-1H-퀴놀린-2-온이 유효 성분으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약제 조성물.