KR20020094646A - 자기조합형 세리신 나노입자의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식의 세리신-PEG 결합체의 제조방법에 관한 것으로, 누에고치로부터 추출된 세리신에 2-(O-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-4,6-디클로로-S-트리아진(actPEG1) 또는 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-클로로-S-트리아진 (actPEG2)를 염기성 완충 수용액에서 반응시킨 뒤 투석에 의해 나노입자를 제조하는 것을 특징으로 한다. 여기에서 actPEGn의 분자량은 1,000 내지 40,000이다.

Description

자기조합형 세리신 나노입자의 제조방법{The Preparation Method of Self-Assembled Sericin Nanoparticle}
본 발명은 누에고치로부터 얻어지는 천연단백질인 세리신에 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 화학결합시킨 뒤 투석방법에 의해 얻어지는 세리신 나노입자의 제조에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 제조된 나노입자는 높은 수율로 얻어지며 회합이 잘 일어나지 않고 1㎛ 이하의 크기 및 구형모양을 지니며 또한 생체분해가 잘 일어난다는 장점을 지니고 있다.(M. Yokoyama et. al Journal of Controlled Release 32, 269(1994))
1㎛ 이하 크기를 지닌 입자를 나노입자라고 하는데, 이는 분리기술, 조직학적인 연구, 임상진단 방법, 약물전달, 기능성 화장품 같은 생명과학의 다양한 분야에 활발히 응용된다. 이는 나노입자가 정제, 살균의 용이성과 약물의 목표에 효과적인 작용, 지속적인 약물 방출거동 등의 응용에 대한 이점을 가지고 있기 때문이다(C.Cho et.al, Macromolecularie Chemie, Rapid Communication, 18 361-369(1997))
본 발명에서 사용되는 천연고분자인 실크 세리신은 많은 수산화기를 가지고 있지만 세리신 자체의 물리적인 특성으로 인해 용매에 잘녹지 않는 특성을 가지고 있다. 또한, 세리신은 그 자체로 뛰어난 보습성을 가지고 있지만 물리적 방법에 의해 제조된 세리신은 안정성이 결여(젤형성)되어 있어 약물캐리어나 화장품용 보습제등 여러가지 응용면에서 문제점으로 지적되어져 왔다.(특허출원번호 99-6533, 한국특허공개공보 95-5839, 98-042150)
따라서, 본 발명의 목적은 양친매성 성질을 가지고 있는 합성고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 세리신에 반응시켜 세리신-PEG 결합체를 합성한 후 유기용매에 녹여 투석방법에 의해 기능성화장품 및 의약전달용으로 응용이 가능한 자기조합형 나노입자(self-assembled nanoparticle)를 제조 하는것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 독성이 없고 수용해도가 우수한 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 세리신의 수산기나 아미노기에 결합시켜 세리신의 수용해도 및 안정성을 높여 주름개선제 및보습제로서 이용하기에 적당한 세리신- PEG 결합체를 합성하여 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 의해 합성된 자기조합형 세리신 나노입자의 전자현미경 사진.
상기, 본 발명의 목적은 선별된 누에고치로부터 추출된 세리신 또는 효소처리하여 조절된 분자량을 가지는 세리신 수용액에 활성화된 폴리에틸렌글리콜(actPEGn)을 일정량 첨가한 후 반응시켜 투석막을 사용하여 미반응물질을 제거 시킨 다음 동결건조를 통해 세리신-PEG 결합체를 제조하는 것을 특징으로 하는 제조법에 의해 달성된다.
actPEGn은 그 한가지 일반식으로서
로 표시되며, 여기서 R1과R2은 각각 CH3O(CH2-CH2-O)n-과 CH3O(CH2-CH2-O)n-(actPEG1) 또는 CH3O(CH2-CH2-O)n-과 Cl(actPEG2)이며 분자량 범위는 1,000-40,000 이 사용될수 있다.
또 다른 actPEGn 으로서 다음과 같은 일반식을 가지는 활성화된 PEG가 사용될수 있고,
R3-O-CH2CH2NH2
R4-OSO2-CH2CF3
여기서, R1은 eO-PEG-OCH2CH2-(actPEG3), MeO-PEG-OCH2CH2CH2-(actPEG4), MeO-PEG-O2CNH(CH2)5-(actPEG5), MeO-PEG-S-CH2CH2-(actPEG6), MeO-PEG-NHCOCH2CH2-(actPEG7), MeO-O2(CH2)3-(actPEG8), MeO-PEG-O2CCH2CH2-(actPEG9), MeO-PEG-O-(actPEG10), MeO-PEG-OCH2-(actPEG11)이고 분자량 범위는 1,000-40,000 이 사용될수 있다. R2, R3, R4는 MeO-PEG- (각각 actPEG12, actPEG13, actPEG14)이며 분자량범위는 1,000-40,000이 사용될수 있다.
활성화된 폴리에틸렌글리콜의 양은 세리신의 양에 대해 무게백분율로 10-20배 사용할수 있다.
사용되는 세리신은, 예를 들어 40-120℃ 범위의, 열수에서 추출된 세리신또는 효소처리되어 분자량이 조절된 세리신(분자량범위 1,000-20,000)이 사용될수 있다.
수용액으로서는 pH 8-10사이의 완충 수용액을 사용할수 있고 완충 수용액으로서 붕산염 완충액, 트리스 완충액, AMPSO 완충액, CHES 완충액, CAPSO 완충액, AMP 완충액, CAPS 완충액를 사용할수 있다.
반응온도는 4-40℃, 그리고 반응시간은 3-36시간이 바람직하다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 자세히 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며 본 특허의 내용이 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1
pH 9.4 의 붕산염 완충액 12ml에 12mg의 세리신(분자량 7,000)을 용해 시킨 후 actPEG1(MW 1,000)을 27mg 첨가 하였다. 4℃에서 24시간 반응시킨 다음 동결건조 후 에탄올에 녹여 증류수에서 투석막을 사용하여 24시간 투석 시켰다. 투석액을 동결건조하여 25mg의 세리신-PEG 결합체(Sericin-PEG1)를 얻었다. 수율 64%.
실시예 2-4
actPEG1의 분자량이 각각 5,000, 10,000, 20,000인 actPEG1를 사용하고 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.
표 1
실시예 actPEG1의 분자량 actPEG1의 양(mg) 수율(%)
2 5,000 135 60
3 10,000 270 68
4 20,000 540 70
실시예 5
pH 9.4의 붕산염 완충액 12ml에 24mg의 세리신을 용해 시킨 후 actPEG2, (MW 2,000)을 54mg 첨가 하였다. 4℃에서 24시간 반응시킨 다음 동결건조 후 에탄올에 녹여 증류수에서 투석막을 사용하여 24시간 투석 시켰다. 투석액을 동결건조하여 51mg 의 세리신-PEG 결합체를 얻었다. 수율 65%.
실시예 6-8
actPEG2의 분자량이 각각 10,000, 20,000, 40,000인 actPEG2를 사용하고 실시예 5와 동일한 방법으로 합성하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.
표 2
실시예 actPEG1의 분자량 actPEG1의 양(mg) 수율(%)
6 10,000 270 63
7 20,000 540 68
8 40,000 1080 84
실시예 9-17
분자량이 5,000인 actPEG3 , actPEG4 , actPEG5 , actPEG6 ,actPEG7 , actPEG8 , actPEG9 , actPEG10 , actPEG11 사용하고 그 양은 모두 135mg을 사용하였으며 실시예 5와 동일한 방법으로 합성하여 그 결과를 표 3에 기재한다.
표 3
실시예 actPEGn의 종류 수율(%)
9 n=3 63
10 n=4 68
11 n=5 58
12 n=6 73
13 n=7 65
14 n=8 65
15 n=9 55
16 n=10 60
17 n=11 81
실험예 1
상기 세리신-PEG 결합체들에 대하여 레이저 광산란법에 의해 입자의 크기를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었고 실시예 2에서 합성된 나노입자의 전자현미경 사진을 도 1 에 나타내었다.
표 3
실시예 particle size(nm)
1 182
2 204
3 223
4 198
5 352
6 206
7 294
8 287
9 122
10 245
11 233
12 435
13 110
14 267
15 290
16 355
17 378
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 양친매성 성질을 가지고 있는 합성고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 세리신에 반응시켜 세리신-PEG 결합체를 합성한 후 유기용매에 녹여 투석방법에 의해 기능성화장품 및 의약전달용으로 응용이 가능한 자기조합형 나노입자(self-assembled nanoparticle)의 제조가 가능하게 되었다.
또한, 본 발명에서는 독성이 없고 수용해도가 우수한 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 세리신의 수산기나 아미노기에 결합시킴으로써 세리신의 수용해도 및 안정성을높여 주름개선제 및 보습제로 이용하기에 적당한 세리신- PEG 결합체를 제공할 수 있게 되었다.

Claims (8)

  1. 누에고치로부터 추출된 세리신에 2-(O-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-4,6-디클로로-S-트리아진(actPEG1)또는 2,4-비스(O-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-클로로-S-트리아진(actPEG2)를 염기성 완충 수용액에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 나노입자를 형성할수 있는 세리신-PEG 결합체를 제조하는 방법.
  2. 누에고치로부터 추출된 세리신에 하기의 일반식을 가지는 활성화된 PEG 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 염기성 완충 수용액에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 나노입자를 형성할수 있는 세리신-PEG 결합체를 제조하는 방법:
    R3-O-CH2CH2NH2
    R4-OSO2-CH2CF3
    상기 식에서, R1은 MeO-PEG-OCH2CH2-(actPEG3), MeO-PEG-OCH2CH2CH2-(actPEG4), MeO-PEG-O2CNH(CH2)5-(actPEG5), MeO-PEG-S-CH2CH2-(actPEG6), MeO-PEG-NHCOCH2CH2-(actPEG7), MeO-O2(CH2)3-(actPEG8), MeO-PEG-O2CCH2CH2-(actPEG9), MeO-PEG-O-(actPEG10), 또는 MeO-PEG-OCH2-(actPEG11) 이고, R2, R3, R4는 각각 MeO-PEG(각각 actPEG12, actPEG13, actPEG14)이다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세리신은 40-120℃ 범위의 열수에서 추출된 세리신 또는 효소처리되어 조절된 분자량을 가지는 세리신(분자량범위 1,000-20,000)을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 사용된 actPEGn(n=1-11) 의 분자량범위는 1,000-40,000 인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 반응은 염기성 완충 수용액 존재하에 4-40℃ 범위에서 3-36시간 동안 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서 상기 염기성 완충 수용액은 붕산염 완충액, 트리스 완충액, AMPSO 완충액, CHES 완충액, CAPSO 완충액, AMP 완충액, 및 CAPS 완충액으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, actPEGn(n=1-11) 의 사용량이 세리신에 대해 중량비로 10-20배 인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 염기성 완충 수용액 중에서의 반응 완료 후, 투석단계를 더 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
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